引用本文： 張洪宇, 莊建. 不同停搏時間下HTK液對幼兔未成熟心肌的保護作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(3): 234-240. doi: 10.7507/1007-4848.20150065 復制
外科手術目前仍是先天性心臟病的主要治療手段，大部分心內手術需要體外循環的支持，心臟停搏提供近乎無血的術野，便于手術操作。手術結束，主動脈開放，血流重新灌注心肌，心臟復跳。此過程是一把雙刃劍，停搏為外科醫生提供時間矯正心內畸形，同時也造成心肌缺血再灌注損傷（MIRI），這是影響心血管外科手術效果的主要難點，術后大多數并發癥及死亡與心肌保護的不充分密切相關[1]。胎兒及嬰幼兒心肌，不同于兒童或者成人，其細胞內蛋白及功能均具不成熟的特點，使成人心臟手術的經驗和理論不能完全適用[2]。在成人心臟外科中取得良好心肌保護效果的HTK心臟停搏液（組氨酸-色氨酸-酮戊二酸液）在先心病的治療實踐中仍有不少爭議，先心病手術仍廣泛采用冷晶體心臟停搏液及其改良液。本實驗以MIRI發生、發展機制為評估基礎，探討不同停搏時間下，HTK液對未成熟心肌的保護效果。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、實驗動物及分組
1.1.1 實驗材料
HTK液由德國克勒化學制藥提供，分析純試劑（廣州化學試劑廠）配置Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液（KH液）與St.ThomasⅡ心臟停搏液（STH液），上述三種溶液成分見表 1。心肌酶[肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）]、心肌組織內丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、Ca2+-ATP酶（Ca2+-ATPase）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）的檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；生理數據采集分析采用PCLAB-US生物醫學信號采集處理系統（北京微信斯達科技發展有限責任公司）。
表1
三種溶液成分表（mmol/L）
1.1.2 實驗動物和分組
將32只2～3周齡[3]的純種新西蘭大耳兔（南方醫科大學動物中心提供）隨機分為4組，每組各8只，其中采用STH液停搏1 h組為SO組，停搏2 h組為ST組；采用HTK液停搏1 h組為HO組，停搏2 h組為HT組。
1.2 實驗方法
全組實驗用兔以10%水合氯醛4 ml/kg經腹腔注射麻醉。腹腔注射肝素（500 IU/kg）抗凝，剪開胸腔，暴露心臟，保留大部分主動脈弓，取出心臟，浸入KH液中（冰上操作），排除殘血，主動脈略加修剪，連于Langendorff灌注裝置上。以37℃的KH液從主動脈開始灌注，灌注壓為80 cmH2O，預先以2 L/min將混合氣體（O2:CO2=95%:5%，廣州氣體廠有限公司）通入KH液，去除心包及附帶組織，剪開肺動脈根部及右心耳以保證冠狀動脈回流通暢，心臟置37℃保溫缸內[4-6]。
心臟跳動穩定后，剪開左心耳，將連有測壓管的水囊插入左心室，連接壓力換能器，水囊內注入適量的37℃生理鹽水，調整左心室舒張期末壓（LVEDP）為5～10 mm Hg。連續記錄左心室收縮期峰壓（LVPSP）、LVEDP、心率（HR），于穩定灌注15 min時收集2 min內的冠狀動脈引流液，此階段為平衡灌注期。然后使用蠕動泵（2 ml/min）經主動脈根部灌注4℃的STH液（15 ml/kg，每30 min重復灌注1次）或HTK液（30 ml/kg，只灌注1次）停搏，分別浸入4℃相應停搏液中，停搏時間分別為SO組1 h，ST組2 h，HO組1 h，HT組2 h，然后將心臟重新置于37℃保溫缸內，37℃KH液復灌15 min，數據記錄及冠狀動脈流量（CF）計算同前。快速取下心臟，濾紙吸凈心脼?表面水分，取左心室心尖部組織，部分置于4%多聚甲醛內固定，用于HE染色，其余置于液氮中轉運至-80℃冰箱中保存，采用分光光度法測定CK、CK-MB、LDH、MDA、SOD、Ca2+-ATPase、NOS、NO含量。
1.3 監測指標
采用PCLAB-US系統分析得到左心室發展壓（LVDP）、左心室收縮壓隨時間變化率最大值（+dp/dtmax）、HR，記錄2 min內冠狀動脈引流量，計算CF及復灌期間血流動力學指標（LVPSP、LVDP、HR、+dp/dtmax、CF）恢復率。
1.4 統計學分析
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所有數據均以均數±標準差（
2 結果
根據篩選條件（心臟離體至恢復灌注間隔時間 > 1 min，LVPSP < 50 mm Hg，或HR < 160次/分，或CF < 8 ml/min），共30只幼兔實驗成功，其中SO組8只，ST組7只，HO組8只，HT組7只。
2.1 血流動力學參數
平衡灌注期間各組血流動力學參數差異無統計學意義（P > 0.05，表 2），各組平衡灌注期心臟功能基線水平一致，具有可比性。
表2
平衡灌注期間各組血流動力學指標對比（復灌期間各組血流動力學參數恢復率見表 3，析因分析結果見表 4。復灌期間，除+ dp/dtmax恢復率以外，其余指標隨停搏時間延長均呈下降趨勢。
表3
復灌期間各組血流動力學指標恢復率對比（%）
表4
復灌期間各組血流動力學指標2×2析因分析結果
HO組HR恢復率（94.2%±4.3%）最高，ST組HR恢復率最低（70.2%±5.8%），且HT組HR恢復率（92.4%±4.4%）仍高于SO組（90.9%±2.8%），整體上HTK液組HR恢復率高于STH組。HR恢復率對比分析結果示，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間差異有統計學意義（P=0.000），兩因素間存在交互作用（P=0.000）。
HO組CF恢復率（91.0%±7.8%）最高，HT組CF恢復率（73.4%±11.6%）最低，且低于ST組（75.5%±4.9%）。CF恢復率的對比分析結果提示，不同停搏液之間CF恢復率差異無統計學意義（P=0.064），不同停搏時間之間差異有統計學意義（P=0.010），時間越長，恢復越差；兩因素之間存在交互作用（P=0.015）。
LVPSP、LVDP、+ dp/dtmax三者恢復率分析結果提示，不同停搏液之間、不同停搏時間之間各項恢復率差異無統計學意義，且兩因素之間無交互作用。但是，從數值上看，LVPSP恢復率、LVDP恢復率、+dp/dtmax恢復率整體上STH液停搏組高于HTK液停搏組，且ST組均優于HT組。
2.2 心肌酶測定結果
結果提示不同停搏液、不同停搏時間之間心肌酶（CK-MB、LDH）差異無統計學意義，且兩因素無交互作用，但不同停搏時間之間心肌酶CK差異有統計學意義（P=0.031），不同停搏液之間差異無統計學意義，兩因素無交互作用。從數值上看，隨著停搏時間延長，三種酶活性水平均有不同程度上升，ST組最高，HTK液組上升幅度較小，其中SO組CK-MB含量、LDH活性最低，HO組CK活性最低。各組心肌組織測量數據見表 5，2×2析因分析結果見表 6。
表5
各組心肌酶含量對比（
表6
各組心肌酶含量2×2析因分析結果
2.3 MDA、SOD、Ca2+-ATPase、NOS、NO測定結果
各組心肌組織檢測結果如表 7所示，2×2析因分析結果見表 8。
表7
各組MDA、NOS、NO、SOD、Ca2+-ATPase含量對比
表8
各組MDA、NOS、NO、SOD、Ca2+-ATPase含量2×2析因分析結果
MDA分析結果示，兩處理因素存在交互作用（P=0.033），兩處理因素主效應差異無統計學意義。從數值上看，隨著停搏時間延長，STH液停搏組MDA含量升高，HTK液停搏組反而有所下降。
NOS活性和NO含量的聯合分析提示，NOS活性主效應、兩因素交互作用差異無統計學意義，各組NOS活性處于同一水平。但是從NO含量的統計結果來看，停搏時間延長，NO含量升高，但HTK液組升高幅度小，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間（P=0.013）的差異有統計學意義，兩因素之間存在交互作用（P=0.046），HO組NO含量最低，ST組含量最高，HTK液停搏組NO含量維持低水平，且不同停搏時間下無較大差異。
從Ca2+-ATPase活性的分析結果提示，不同停搏液（P=0.000）差異有統計學意義，而不同停搏時間差異無統計學意義（P=0.176），兩因素之間有交互作用（P=0.002）。從數值上看SO組Ca2+-ATP酶活性最低，而HO組Ca2+-ATPase活性最高，HTK液組Ca2+-ATPase活性高于STH液組。
SOD活性的分析結果提示，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間（P=0.019）差異有統計學意義，隨著停搏時間延長，SOD活性有不同程度下降，兩因素之間無交互作用（P=0.542）。從數值上看，ST組SOD活性最低，而HO組SOD活性最高，HTK液組SOD活性高于STH液組。
2.4 HE染色結果
圖 1～4為各組HE染色結果，SO組表現為心肌細胞輕度腫脹，排列尚正常，細胞間質內少量炎癥細胞浸潤，微血管管壁完整、光滑；ST組心肌細胞腫脹明顯，細胞排列紊亂，細胞漿嗜伊紅均質濃染，橫紋模糊不清，部分細胞內細胞核溶解消失，心肌纖維斷裂，細胞間質有多量炎癥細胞浸潤，微血管管壁欠光滑；HO組與HT組心肌細胞形態正常，腫脹不明顯，排列整齊，細胞漿染色均勻，極少量細胞核消失，微血管管壁光滑完整，細胞間質內少量炎癥細胞浸潤。
圖1
SO組心肌組織HE×40?圖 2?ST組心肌組織HE×40?圖 3?HO組心肌組織HE×40?圖 4?HT組心肌組織HE×40
3 討論
3.1 HTK液對幼兔未成熟心肌血流動力學的影響
平衡灌注期結果表明，Langendorff離體心臟灌注模型效果穩定。復灌期間血流動力學指標的對比分析提示，長時間（2 h）的停搏造成MIRI程度重，血流動力學指標呈下降趨勢，對未成熟心肌有負性效果[7]。從停搏液的角度分析，STH液與HTK液之間差異無統計學意義，效果相當，與Aarsaether等[8]的研究結論一致。HR恢復率、CF恢復率對比結果表明，不同停搏時間之間差異有統計學意義，兩處理因素存在交互作用，HTK液停搏組的恢復率高于STH液停搏組，表明HTK液可減輕長時間停搏造成的損傷，這可能與STH液停搏是多次灌注，造成冠狀動脈損傷較大有關，亦有研究持相同觀點[9]。
3.2 HTK液對幼兔未成熟心肌MIRI的保護作用
在正常情況下，自由基的產生和消除處于動態平衡。發生MIRI時，此動態平衡被打破，大量自由基生成，攻擊細胞膜引發脂質過氧化作用，產生脂質過氧化物[10]，例如MDA、羥基等，MDA能反映機體受自由基損傷的嚴重程度。
在自由基清除系統中，SOD最具有代表性，其活性越強，自由基清除率越高，對MIRI有保護作用，MIRI發生時，由于心肌缺血缺氧以及酸中毒，SOD活性往往下降。其次，MIRI時，由于酸中毒、ATP生成不足、心肌細胞膜受損，通透性增高，Ca2+泵（Ca2+-ATP酶）的活性受到抑制，Na+-Ca2+交換增加，Ca2+大量內流，導致心肌細胞內Ca2+超載，對心肌細胞造成一系列損傷[11]。
另外，生理狀態下，eNOS（內皮型）催化產生少量NO，擴張血管，調節器官血流量，清除自由基，抑制炎癥反應，抑制血管內皮細胞增殖、減輕鈣超載、抗細胞凋亡，保護細胞。在MIRI時，iNOS（誘導型）大量表達，催化產生大量NO，同時催化生成超氧負離子，與NO反應生成活性更強的自由基，是體內造成氧化應激損傷的重要因素[12-13]。
最后，心肌發生急性心肌梗死或MIRI時，心肌細胞受損，心肌酶合成增加、漏出，有診斷意義[14]。
從實驗結果看來。HE染色下，隨著停搏時間延長，細胞損傷逐漸加重，以STH液停搏組表現最為明顯。
不同停搏液、不同停搏時間之間心肌酶譜（CK-MB、LDH）的差異無統計學意義，不同停搏時間之間心肌酶CK差異有統計學意義，但從數值上看來，隨著停搏時間延長，三種酶活性水平均有不同程度上升，且HTK液停搏組上升幅度小，尚不能認為STH液在心肌酶漏出方面較HTK液差。
MDA含量的對比分析提示，兩處理因素主效應差異無統計學意義，兩處理因素存在交互作用，但是HTK液組MDA含量低于STH液組，說明HTK液可能減輕細胞損傷，減輕脂質過氧化作用。
NOS及NO對比分析結果提示，各組NOS活性均升高，但差異無統計學意義，同時停搏時間延長，NO含量升高，但HTK液組升高幅度小，不同停搏液、不同停搏時間之間差異有統計學意義，兩因素之間存在交互作用，HTK液組NO含量維持低水平，且不同停搏時間下差異無統計學意義，減輕了NO對心肌組織的損傷。
從Ca2+-ATP酶活性的分析結果提示，不同停搏液差異有統計學意義，而不同停搏時間差異無統計學意義。整體上看，HTK液組Ca2+-ATP酶活性高于STH液組，且不同停搏時間下差異無統計學意義，保證了心肌組織有較強清除Ca2+交換能力，對細胞有保護作用。
SOD活性的分析結果提示，不同停搏液、不同停搏時間差異有統計學意義，隨著停搏時間延長，SOD活性有不同程度下降，HTK液組SOD活性高于STH液組，保證了心肌組織有較強自由基清除的能力，保護心肌細胞。
結合HTK液與STH液的特點，分析可能機制如下。
HTK液是細胞內液型停搏液，加入了組氨酸、α-酮戊二酸、色氨酸、甘露醇等，其特點在于低Na+、微量Ca2+、相對低K+。Jellinek等[15]報道高K+液保存心肌會引起心肌及冠狀動脈內皮損傷，同時造成反常性細胞Ca2+超載，HTK液相對低K+（10 mmol/L），保證了良好的心臟停搏效果，同時低Na+可抑制Na+-Ca2+交換，減少Ca2+內流，減輕細胞損傷。MIRI時，Ca2+內流增加，細胞內Ca2+超載，促進自由基大量產生，造成細胞損傷[16]。而未成熟心肌對細胞外Ca2+依賴性大。HTK液含微量Ca2+（0.015 mmol/L），減少Ca2+超載，同時含Mg2+（4 mmol/L），是高能磷酸鍵的重要成分、細胞酶的輔助因子，競爭性抑制Ca2+內流的同時，能為細胞供能、穩定酶系統功能[17-18]。
HTK液中的組氨酸緩沖對能減少H+的堆積，維持穩定的pH環境，緩解對糖酵解的抑制，心肌耗能得以保障[19]。HTK液含有的α-酮戊二酸及色氨酸可作為高能磷酸化合物的底物，促進心肌在缺血再灌注期間ATP的產生[20]，提高SOD、Ca2+-ATP酶活性，保持良好的清除自由基、泵出細胞內Ca2+的能力，維持良好的心功能。HTK液中含甘露醇，作為脫水劑及氧自由基清除劑，減輕細胞水腫及自由基損傷[21]。這些途徑不單一存在，相互促進，進一步加強對未成熟心肌的短時間及長時間的保護[22]。
STH液為經典的細胞外液成分為基礎的高鉀停搏液，其優點為能確實保護心肌，操作方便、實用，且價格低廉。一般需要每20～30 min灌注一次來維持心肌的有效停搏，間斷灌注以沖走心肌代謝產物來控制酸中毒的同時，會使冠狀動脈受到損傷，使未成熟心肌受損[23]。STH液缺乏供能的物質以及緩沖體系，不利于心肌保護。但在短時間停搏的條件下，在部分指標上有著良好的表現，例如血流動力學指標、心肌酶的含量等，仍有著一定的應用價值。
綜上，HTK液對未成熟心肌的保護作用確切，隨停搏時間延長，保護效果仍有所下降，但其效果穩定，優于STH液。STH液在一定程度上能保護未成熟心肌，使其收縮功能穩定，短時間停搏（1 h）時，表現仍然良好。
在臨床應用上，HTK液單次灌注即能取得良好的未成熟心肌保護效果，且能提供干凈無血的手術視野，特別是在涉及大血管的手術中，如大動脈轉位、右心室雙出口等，有較高應用價值。而STH液在短時間停搏的條件下，能維持心臟血流動力學穩定，有一定的應用價值，現目前，以STH液為基礎的改良灌注液，如加入磷酸肌酸、左旋精氨酸等，業已取得了良好的基礎及臨床效果[24-25]，同時其價格低廉、方便實用等特點仍然不失為一個亮點。
外科手術目前仍是先天性心臟病的主要治療手段，大部分心內手術需要體外循環的支持，心臟停搏提供近乎無血的術野，便于手術操作。手術結束，主動脈開放，血流重新灌注心肌，心臟復跳。此過程是一把雙刃劍，停搏為外科醫生提供時間矯正心內畸形，同時也造成心肌缺血再灌注損傷（MIRI），這是影響心血管外科手術效果的主要難點，術后大多數并發癥及死亡與心肌保護的不充分密切相關[1]。胎兒及嬰幼兒心肌，不同于兒童或者成人，其細胞內蛋白及功能均具不成熟的特點，使成人心臟手術的經驗和理論不能完全適用[2]。在成人心臟外科中取得良好心肌保護效果的HTK心臟停搏液（組氨酸-色氨酸-酮戊二酸液）在先心病的治療實踐中仍有不少爭議，先心病手術仍廣泛采用冷晶體心臟停搏液及其改良液。本實驗以MIRI發生、發展機制為評估基礎，探討不同停搏時間下，HTK液對未成熟心肌的保護效果。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、實驗動物及分組
1.1.1 實驗材料
HTK液由德國克勒化學制藥提供，分析純試劑（廣州化學試劑廠）配置Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩沖液（KH液）與St.ThomasⅡ心臟停搏液（STH液），上述三種溶液成分見表 1。心肌酶[肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）]、心肌組織內丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、Ca2+-ATP酶（Ca2+-ATPase）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）的檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；生理數據采集分析采用PCLAB-US生物醫學信號采集處理系統（北京微信斯達科技發展有限責任公司）。
表1
三種溶液成分表（mmol/L）
1.1.2 實驗動物和分組
將32只2～3周齡[3]的純種新西蘭大耳兔（南方醫科大學動物中心提供）隨機分為4組，每組各8只，其中采用STH液停搏1 h組為SO組，停搏2 h組為ST組；采用HTK液停搏1 h組為HO組，停搏2 h組為HT組。
1.2 實驗方法
全組實驗用兔以10%水合氯醛4 ml/kg經腹腔注射麻醉。腹腔注射肝素（500 IU/kg）抗凝，剪開胸腔，暴露心臟，保留大部分主動脈弓，取出心臟，浸入KH液中（冰上操作），排除殘血，主動脈略加修剪，連于Langendorff灌注裝置上。以37℃的KH液從主動脈開始灌注，灌注壓為80 cmH2O，預先以2 L/min將混合氣體（O2:CO2=95%:5%，廣州氣體廠有限公司）通入KH液，去除心包及附帶組織，剪開肺動脈根部及右心耳以保證冠狀動脈回流通暢，心臟置37℃保溫缸內[4-6]。
心臟跳動穩定后，剪開左心耳，將連有測壓管的水囊插入左心室，連接壓力換能器，水囊內注入適量的37℃生理鹽水，調整左心室舒張期末壓（LVEDP）為5～10 mm Hg。連續記錄左心室收縮期峰壓（LVPSP）、LVEDP、心率（HR），于穩定灌注15 min時收集2 min內的冠狀動脈引流液，此階段為平衡灌注期。然后使用蠕動泵（2 ml/min）經主動脈根部灌注4℃的STH液（15 ml/kg，每30 min重復灌注1次）或HTK液（30 ml/kg，只灌注1次）停搏，分別浸入4℃相應停搏液中，停搏時間分別為SO組1 h，ST組2 h，HO組1 h，HT組2 h，然后將心臟重新置于37℃保溫缸內，37℃KH液復灌15 min，數據記錄及冠狀動脈流量（CF）計算同前。快速取下心臟，濾紙吸凈心脼?表面水分，取左心室心尖部組織，部分置于4%多聚甲醛內固定，用于HE染色，其余置于液氮中轉運至-80℃冰箱中保存，采用分光光度法測定CK、CK-MB、LDH、MDA、SOD、Ca2+-ATPase、NOS、NO含量。
1.3 監測指標
采用PCLAB-US系統分析得到左心室發展壓（LVDP）、左心室收縮壓隨時間變化率最大值（+dp/dtmax）、HR，記錄2 min內冠狀動脈引流量，計算CF及復灌期間血流動力學指標（LVPSP、LVDP、HR、+dp/dtmax、CF）恢復率。
1.4 統計學分析
采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，所有數據均以均數±標準差（
2 結果
根據篩選條件（心臟離體至恢復灌注間隔時間 > 1 min，LVPSP < 50 mm Hg，或HR < 160次/分，或CF < 8 ml/min），共30只幼兔實驗成功，其中SO組8只，ST組7只，HO組8只，HT組7只。
2.1 血流動力學參數
平衡灌注期間各組血流動力學參數差異無統計學意義（P > 0.05，表 2），各組平衡灌注期心臟功能基線水平一致，具有可比性。
表2
平衡灌注期間各組血流動力學指標對比（復灌期間各組血流動力學參數恢復率見表 3，析因分析結果見表 4。復灌期間，除+ dp/dtmax恢復率以外，其余指標隨停搏時間延長均呈下降趨勢。
表3
復灌期間各組血流動力學指標恢復率對比（%）
表4
復灌期間各組血流動力學指標2×2析因分析結果
HO組HR恢復率（94.2%±4.3%）最高，ST組HR恢復率最低（70.2%±5.8%），且HT組HR恢復率（92.4%±4.4%）仍高于SO組（90.9%±2.8%），整體上HTK液組HR恢復率高于STH組。HR恢復率對比分析結果示，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間差異有統計學意義（P=0.000），兩因素間存在交互作用（P=0.000）。
HO組CF恢復率（91.0%±7.8%）最高，HT組CF恢復率（73.4%±11.6%）最低，且低于ST組（75.5%±4.9%）。CF恢復率的對比分析結果提示，不同停搏液之間CF恢復率差異無統計學意義（P=0.064），不同停搏時間之間差異有統計學意義（P=0.010），時間越長，恢復越差；兩因素之間存在交互作用（P=0.015）。
LVPSP、LVDP、+ dp/dtmax三者恢復率分析結果提示，不同停搏液之間、不同停搏時間之間各項恢復率差異無統計學意義，且兩因素之間無交互作用。但是，從數值上看，LVPSP恢復率、LVDP恢復率、+dp/dtmax恢復率整體上STH液停搏組高于HTK液停搏組，且ST組均優于HT組。
2.2 心肌酶測定結果
結果提示不同停搏液、不同停搏時間之間心肌酶（CK-MB、LDH）差異無統計學意義，且兩因素無交互作用，但不同停搏時間之間心肌酶CK差異有統計學意義（P=0.031），不同停搏液之間差異無統計學意義，兩因素無交互作用。從數值上看，隨著停搏時間延長，三種酶活性水平均有不同程度上升，ST組最高，HTK液組上升幅度較小，其中SO組CK-MB含量、LDH活性最低，HO組CK活性最低。各組心肌組織測量數據見表 5，2×2析因分析結果見表 6。
表5
各組心肌酶含量對比（
表6
各組心肌酶含量2×2析因分析結果
2.3 MDA、SOD、Ca2+-ATPase、NOS、NO測定結果
各組心肌組織檢測結果如表 7所示，2×2析因分析結果見表 8。
表7
各組MDA、NOS、NO、SOD、Ca2+-ATPase含量對比
表8
各組MDA、NOS、NO、SOD、Ca2+-ATPase含量2×2析因分析結果
MDA分析結果示，兩處理因素存在交互作用（P=0.033），兩處理因素主效應差異無統計學意義。從數值上看，隨著停搏時間延長，STH液停搏組MDA含量升高，HTK液停搏組反而有所下降。
NOS活性和NO含量的聯合分析提示，NOS活性主效應、兩因素交互作用差異無統計學意義，各組NOS活性處于同一水平。但是從NO含量的統計結果來看，停搏時間延長，NO含量升高，但HTK液組升高幅度小，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間（P=0.013）的差異有統計學意義，兩因素之間存在交互作用（P=0.046），HO組NO含量最低，ST組含量最高，HTK液停搏組NO含量維持低水平，且不同停搏時間下無較大差異。
從Ca2+-ATPase活性的分析結果提示，不同停搏液（P=0.000）差異有統計學意義，而不同停搏時間差異無統計學意義（P=0.176），兩因素之間有交互作用（P=0.002）。從數值上看SO組Ca2+-ATP酶活性最低，而HO組Ca2+-ATPase活性最高，HTK液組Ca2+-ATPase活性高于STH液組。
SOD活性的分析結果提示，不同停搏液（P=0.000）、不同停搏時間（P=0.019）差異有統計學意義，隨著停搏時間延長，SOD活性有不同程度下降，兩因素之間無交互作用（P=0.542）。從數值上看，ST組SOD活性最低，而HO組SOD活性最高，HTK液組SOD活性高于STH液組。
2.4 HE染色結果
圖 1～4為各組HE染色結果，SO組表現為心肌細胞輕度腫脹，排列尚正常，細胞間質內少量炎癥細胞浸潤，微血管管壁完整、光滑；ST組心肌細胞腫脹明顯，細胞排列紊亂，細胞漿嗜伊紅均質濃染，橫紋模糊不清，部分細胞內細胞核溶解消失，心肌纖維斷裂，細胞間質有多量炎癥細胞浸潤，微血管管壁欠光滑；HO組與HT組心肌細胞形態正常，腫脹不明顯，排列整齊，細胞漿染色均勻，極少量細胞核消失，微血管管壁光滑完整，細胞間質內少量炎癥細胞浸潤。
圖1
SO組心肌組織HE×40?圖 2?ST組心肌組織HE×40?圖 3?HO組心肌組織HE×40?圖 4?HT組心肌組織HE×40
3 討論
3.1 HTK液對幼兔未成熟心肌血流動力學的影響
平衡灌注期結果表明，Langendorff離體心臟灌注模型效果穩定。復灌期間血流動力學指標的對比分析提示，長時間（2 h）的停搏造成MIRI程度重，血流動力學指標呈下降趨勢，對未成熟心肌有負性效果[7]。從停搏液的角度分析，STH液與HTK液之間差異無統計學意義，效果相當，與Aarsaether等[8]的研究結論一致。HR恢復率、CF恢復率對比結果表明，不同停搏時間之間差異有統計學意義，兩處理因素存在交互作用，HTK液停搏組的恢復率高于STH液停搏組，表明HTK液可減輕長時間停搏造成的損傷，這可能與STH液停搏是多次灌注，造成冠狀動脈損傷較大有關，亦有研究持相同觀點[9]。
3.2 HTK液對幼兔未成熟心肌MIRI的保護作用
在正常情況下，自由基的產生和消除處于動態平衡。發生MIRI時，此動態平衡被打破，大量自由基生成，攻擊細胞膜引發脂質過氧化作用，產生脂質過氧化物[10]，例如MDA、羥基等，MDA能反映機體受自由基損傷的嚴重程度。
在自由基清除系統中，SOD最具有代表性，其活性越強，自由基清除率越高，對MIRI有保護作用，MIRI發生時，由于心肌缺血缺氧以及酸中毒，SOD活性往往下降。其次，MIRI時，由于酸中毒、ATP生成不足、心肌細胞膜受損，通透性增高，Ca2+泵（Ca2+-ATP酶）的活性受到抑制，Na+-Ca2+交換增加，Ca2+大量內流，導致心肌細胞內Ca2+超載，對心肌細胞造成一系列損傷[11]。
另外，生理狀態下，eNOS（內皮型）催化產生少量NO，擴張血管，調節器官血流量，清除自由基，抑制炎癥反應，抑制血管內皮細胞增殖、減輕鈣超載、抗細胞凋亡，保護細胞。在MIRI時，iNOS（誘導型）大量表達，催化產生大量NO，同時催化生成超氧負離子，與NO反應生成活性更強的自由基，是體內造成氧化應激損傷的重要因素[12-13]。
最后，心肌發生急性心肌梗死或MIRI時，心肌細胞受損，心肌酶合成增加、漏出，有診斷意義[14]。
從實驗結果看來。HE染色下，隨著停搏時間延長，細胞損傷逐漸加重，以STH液停搏組表現最為明顯。
不同停搏液、不同停搏時間之間心肌酶譜（CK-MB、LDH）的差異無統計學意義，不同停搏時間之間心肌酶CK差異有統計學意義，但從數值上看來，隨著停搏時間延長，三種酶活性水平均有不同程度上升，且HTK液停搏組上升幅度小，尚不能認為STH液在心肌酶漏出方面較HTK液差。
MDA含量的對比分析提示，兩處理因素主效應差異無統計學意義，兩處理因素存在交互作用，但是HTK液組MDA含量低于STH液組，說明HTK液可能減輕細胞損傷，減輕脂質過氧化作用。
NOS及NO對比分析結果提示，各組NOS活性均升高，但差異無統計學意義，同時停搏時間延長，NO含量升高，但HTK液組升高幅度小，不同停搏液、不同停搏時間之間差異有統計學意義，兩因素之間存在交互作用，HTK液組NO含量維持低水平，且不同停搏時間下差異無統計學意義，減輕了NO對心肌組織的損傷。
從Ca2+-ATP酶活性的分析結果提示，不同停搏液差異有統計學意義，而不同停搏時間差異無統計學意義。整體上看，HTK液組Ca2+-ATP酶活性高于STH液組，且不同停搏時間下差異無統計學意義，保證了心肌組織有較強清除Ca2+交換能力，對細胞有保護作用。
SOD活性的分析結果提示，不同停搏液、不同停搏時間差異有統計學意義，隨著停搏時間延長，SOD活性有不同程度下降，HTK液組SOD活性高于STH液組，保證了心肌組織有較強自由基清除的能力，保護心肌細胞。
結合HTK液與STH液的特點，分析可能機制如下。
HTK液是細胞內液型停搏液，加入了組氨酸、α-酮戊二酸、色氨酸、甘露醇等，其特點在于低Na+、微量Ca2+、相對低K+。Jellinek等[15]報道高K+液保存心肌會引起心肌及冠狀動脈內皮損傷，同時造成反常性細胞Ca2+超載，HTK液相對低K+（10 mmol/L），保證了良好的心臟停搏效果，同時低Na+可抑制Na+-Ca2+交換，減少Ca2+內流，減輕細胞損傷。MIRI時，Ca2+內流增加，細胞內Ca2+超載，促進自由基大量產生，造成細胞損傷[16]。而未成熟心肌對細胞外Ca2+依賴性大。HTK液含微量Ca2+（0.015 mmol/L），減少Ca2+超載，同時含Mg2+（4 mmol/L），是高能磷酸鍵的重要成分、細胞酶的輔助因子，競爭性抑制Ca2+內流的同時，能為細胞供能、穩定酶系統功能[17-18]。
HTK液中的組氨酸緩沖對能減少H+的堆積，維持穩定的pH環境，緩解對糖酵解的抑制，心肌耗能得以保障[19]。HTK液含有的α-酮戊二酸及色氨酸可作為高能磷酸化合物的底物，促進心肌在缺血再灌注期間ATP的產生[20]，提高SOD、Ca2+-ATP酶活性，保持良好的清除自由基、泵出細胞內Ca2+的能力，維持良好的心功能。HTK液中含甘露醇，作為脫水劑及氧自由基清除劑，減輕細胞水腫及自由基損傷[21]。這些途徑不單一存在，相互促進，進一步加強對未成熟心肌的短時間及長時間的保護[22]。
STH液為經典的細胞外液成分為基礎的高鉀停搏液，其優點為能確實保護心肌，操作方便、實用，且價格低廉。一般需要每20～30 min灌注一次來維持心肌的有效停搏，間斷灌注以沖走心肌代謝產物來控制酸中毒的同時，會使冠狀動脈受到損傷，使未成熟心肌受損[23]。STH液缺乏供能的物質以及緩沖體系，不利于心肌保護。但在短時間停搏的條件下，在部分指標上有著良好的表現，例如血流動力學指標、心肌酶的含量等，仍有著一定的應用價值。
綜上，HTK液對未成熟心肌的保護作用確切，隨停搏時間延長，保護效果仍有所下降，但其效果穩定，優于STH液。STH液在一定程度上能保護未成熟心肌，使其收縮功能穩定，短時間停搏（1 h）時，表現仍然良好。
在臨床應用上，HTK液單次灌注即能取得良好的未成熟心肌保護效果，且能提供干凈無血的手術視野，特別是在涉及大血管的手術中，如大動脈轉位、右心室雙出口等，有較高應用價值。而STH液在短時間停搏的條件下，能維持心臟血流動力學穩定，有一定的應用價值，現目前，以STH液為基礎的改良灌注液，如加入磷酸肌酸、左旋精氨酸等，業已取得了良好的基礎及臨床效果[24-25]，同時其價格低廉、方便實用等特點仍然不失為一個亮點。
