引用本文： 干昌平, 邱旭, 張靜漪, 安琪, 石應康. 抗VCAM-1靶向超聲微泡對體外循環相關骨髓中性粒細胞釋放的可逆性影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(2): 146-150. doi: 10.7507/1007-4848.20150041 復制
體外循環（extracorporeal circulation，ECC）是心臟外科中一項重要的輔助手段。ECC時外周循環中激活的中性粒細胞釋放促炎因子，進一步擴大炎癥反應，并刺激骨髓中性粒細胞快速釋放入外周循環[1]。中性粒細胞是一把“雙刃劍”，其在炎癥反應中直接介導了組織損傷，卻也參與了創傷后的組織修復[2]，同時作為體內免疫防御的組成部分，在術后抗感染的過程中發揮重要作用[3]。這就促使我們去思考是否存在一種針對炎癥狀態下骨髓中性粒細胞釋放的可控辦法。已有研究表明，骨髓竇狀內皮細胞表面的血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和骨髓中性粒細胞表面的CD49d的相互作用是骨髓中性粒細胞釋放的關鍵因素，使用CD49d的抗體或拮抗劑可減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放[4]。但全身使用CD49d的抗體或拮抗劑不僅用量大，而且缺乏靶向性，可能損害外周循環中的中性粒細胞功能。目前尚無文獻報道利用抗VCAM-1抗體干預炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放。雖然在炎癥早期，VCAM-1仍主要表達在骨髓竇狀內皮細胞表面，使用抗VCAM-1抗體具有一定的靶向性，但其抗原-抗體間的結合不具備可控性，可能引起骨髓中性粒細胞較長時間的釋放障礙。
超聲微泡技術已在多個臨床領域嶄露頭角。因其具備連接特定抗體形成靶向投放的功能，和其在特定聲壓環境下可控性破裂的特點，通常被用作靶向藥物投放的載體。基于這一原理，本實驗擬利用大鼠并行ECC后分離血漿模擬ECC相關炎癥反應，通過大鼠股骨骨髓原位灌注模型，探究抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向超聲微泡對該炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放的影響，以及高聲壓超聲輻射下微泡破裂對該影響的可逆性作用。
1 資料與方法
1.1 實驗材料和分組
1.1.1 實驗材料
本研究所使用實驗動物選擇雄性成年SD大鼠（由四川省動物實驗中心提供），體重250～300 g。抗VCAM-1靶向超聲微泡為使用商品化注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡及生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗體（eBioscience）自行制備。
1.1.2 實驗分組
36只SD雄性大鼠隨機分為6組，每組6只，各組大鼠體重平均值無明顯差異。6組分別為抗體組（A組）：利用EEC后血漿模擬炎癥反應，給予0.5 ml（33.3μg）抗VCAM-1抗體；抗體+超聲組（AU組）：模擬炎癥反應后，注入與A組等量的抗VCAM-1抗體后，再給予高聲壓超聲輻射；靶向微泡組（T組）：模擬炎癥反應后，給予0.5 ml抗VCAM-1靶向超聲微泡；靶向微泡破裂組（TU組）：模擬炎癥反應后，給予與T組等量的抗VCAM-1靶向超聲微泡后，再給予與AU組相同的高聲壓超聲輻射擊破微泡；體外循環后血漿刺激對照組（MC組）：僅灌注體外循環后血漿，模擬炎癥反應；空白對照組（C組）：僅使用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，作空白對照。
1.2 實驗方法和標本檢測
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
參照Grocott等[5]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右側頸總動脈及左側股靜脈插管，預充6 ml平衡鹽溶液，以大鼠平均心輸出量1/5流量[32 ml/(kg.min)]行并行ECC 1 h。魚精蛋白中和肝素后抽取全血分離血漿。本實驗使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分離所得血漿均分為3份，作為炎性反應刺激源分別用于后續實驗分組后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
參照Burdon等[4]的方法改良，全身麻醉大鼠解剖顯露髂外動、靜脈，5-0絲線結扎尾腹動脈（caudal abdominal artery）、髂淺旋動脈（superficial iliac circumflex artery）和陰部腹壁動脈干（pudendoepigastric trunk）及其伴行靜脈。處死大鼠后立即以24G留置針導管由近心端向遠心端行股動脈置管，并以22G留置針導管由近心端向遠心端行股靜脈置管，以微量泵經股動脈插管灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液（北京邁晨科技）或實驗干預物質，收集靜脈插管灌出液。
1.2.3 抗VCAM-1靶向超聲微泡制備
注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡以白色凍干粉末和SF6氣體的形式封裝于安培瓶中。以5 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液注入安培瓶中用力振搖20秒至凍干粉末完全分散溶解。取5 ml新配制的超聲微泡混懸液，加入450μg生物素化的DSPE-PEG（2000）（Avanti），37℃恒溫輕搖混合反應1 h。在200 g、4℃下離心5 min，棄去下層澄清液體后，漂浮法洗滌2次。加入66.7μg鏈霉親和素（Sigma-Aldrich），4℃下避光孵育30 min。以同前條件離心5 min，棄下清液，漂浮法洗滌2次。加入33.3μg生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗體（eBioscience），4℃下避光孵育30 min，同樣方法離心、棄液、洗滌后，完成抗VCAM-1靶向超聲微泡的制備。
1.2.4 灌注策略及細胞檢測
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后動脈插管連接微量輸液泵，先以100 ml/h的速度灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液10 min沖洗殘存血液。C組設定4個灌注周期，每周期10 min，每周期內用微量輸液泵以100 ml/h的速度勻速灌入Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，每周期灌注液總量為16.6 ml。其余各組各5個灌注周期，灌注速度、每周期時間和灌注液體量同C組；第1周期勻速灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液；第2～5周期勻速灌注用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液配制的ECC血漿。
第2周期灌注結束后，A組和AU組經股動脈插管推注0.5 ml抗VCAM-1抗體，T組和TU組推注0.5 ml抗VCAM-1靶向超聲微泡。AU組和TU組在第3周期灌注的同時以PHILIPS iu22超聲診斷儀的L12-5探頭的Flash功能于右下肢股骨及脛腓骨處給予高聲壓超聲輻射10 min。各組均在股靜脈插管端完整收集每個周期灌出液，計數中性粒細胞。
1.3 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 抗VCAM-1抗體減少骨髓中性粒細胞釋放的有效性
經過5個灌注周期，A組大鼠骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 393 750.0±252 580.4）個，AU組骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 566 543.2±201 577.2）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個。A組和AU組組間差異無統計學意義（P > 0.05），但與MC組差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 1。表明抗VCAM-1抗體可以減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放，但高聲壓超聲輻射對抗VCAM-1抗體增加或減少骨髓中性粒細胞釋放的作用無明顯影響。
圖1
A組、AU組與MC組中性粒細胞總數比較
2.2 抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向超聲微泡減少骨髓中性粒細胞釋放的差異
經過5個灌注周期，A組大鼠骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 393 750.0±252 580.4）個，T組骨髓灌出液含中性粒細胞（1 975 000.0±184 729.5）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個，各組間差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 2。表明抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向微泡均能減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放，且抗VCAM-1靶向超聲微泡的效果更加顯著。
圖2
A組、T組與MC組中性粒細胞總數比較
2.3 抗VCAM-1靶向超聲微泡減少骨髓中性粒細胞釋放的可逆性
經過5個灌注周期，T組大鼠骨髓灌出液含中性粒細胞（1 975 000.0±184 729.5）個，TU組骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 962 500.0±238 353.7）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個，各組間差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3。可見高聲壓超聲輻射擊破抗VCAM-1靶向超聲微泡后，炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放顯著增加。
圖3
T組、TU組與MC組中性粒細胞總數比較
3 討論
Burdon等[4]發現在炎癥刺激下，在給予CD49d抗體或拮抗劑后，骨髓釋放的中性粒細胞顯著減少，據此推斷骨髓竇狀內皮表達的VCAM-1和其由中性粒細胞表達的配體CD49d的相互作用是炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放的關鍵。炎癥早期是骨髓循環池內的中性粒細胞釋放入外周循環的最快增速階段，這提示該時期可能也是炎癥條件下骨髓竇狀內皮VCAM-1表達上調的高峰期[6]。在這一時期給予抗VCAM-1抗體，觀察到骨髓灌出液中中性粒細胞的顯著減少。說明抗VCAM-1抗體也可以阻斷骨髓竇狀內皮細胞表面VCAM-1與中性粒細胞表面CD49d的結合，減少炎癥條件下中性粒細胞的釋放。而給予高聲壓超聲輻射后，灌出液中中性粒細胞數量與未使用超聲輻射的組差異無統計學意義，說明高聲壓超聲輻射對骨髓中性粒細胞的釋放無明顯影響。抗原-抗體的結合和解離始終處于可逆性轉換的動態過程中，可以推測隨著抗VCAM-1抗體分解代謝的消耗，其阻斷作用才會逐步消除，但這可能會引起骨髓中性粒細胞較長時間的釋放障礙。而目前尚未見到有關VCAM-1抗原-抗體間動態結合與游離的時間相關性定量分析的研究。由于VCAM-1的表達在炎癥早期具有明顯的骨髓靶向性，利用抗VCAM-1抗體為減少ECC相關骨髓中性粒細胞快速釋放的研究提供了探索途徑。
Kaufmann等[7]和Behm等[8]通過在超聲微泡表面加載抗VCAM-1抗體在動脈粥樣硬化和缺血動物模型上實現了外周循環炎癥部位的靶向超聲顯影，結果證實抗VCAM-1抗體可以靶向引導微泡濃聚于VCAM-1高表達的組織。受此啟發，我們將抗VCAM-1靶向超聲微泡引入骨髓。超聲微泡借助其表面的抗VCAM-1抗體與骨髓竇狀內皮細胞的VCAM-1靶向結合而黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面，而密集分布于骨髓竇狀內皮細胞表面的微泡是否會對骨髓儲存池內的中性粒細胞穿竇狀內皮細胞釋放的過程有阻擋作用呢？目前國內外尚未見到相關研究。本研究發現在模擬的ECC炎癥條件下，相比單純使用抗VCAM-1抗體（A組），利用抗VCAM-1靶向超聲微泡（T組）減少骨髓中性粒細胞釋放的效果更加顯著。分析并推測可能的原因為靶向微泡通過其表面的特異性抗體識別并與骨髓竇狀內皮細胞表達的VCAM-1相結合時，引導微泡黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面形成了密集分布于竇狀內皮表面的“微泡層”，進一步阻擋了中性粒細胞的游出。抗VCAM-1靶向超聲微泡提供了抗體封閉的生物學屏障和微泡阻擋的物理學屏障的雙重作用，更有效地減少了骨髓中性粒細胞的快速釋放；而微泡與其表面抗體的特殊關系也為進一步研究骨髓中性粒細胞釋放的可控性調節提供了新的思路。
已廣泛應用于臨床檢查的超聲微泡造影劑也可以作為一種可控性的藥物或基因運載手段。一些研究顯示利用高聲壓超聲擊破微泡產生的空化效應釋放微泡攜帶的藥物或基因，提高局部藥物濃度或基因轉載率，起到靶向治療的作用。這些研究多集中在心血管疾病、神經系統疾病和腫瘤疾病等領域[8-10]。本研究設計利用抗VCAM-1靶向超聲微泡阻斷炎癥刺激下骨髓中性粒細胞的快速釋放后，求證施加高聲壓超聲輻射擊破微泡可否解除微泡阻擋的物理學屏障作用，恢復骨髓中性粒細胞的釋放功能。通過抗VCAM-1靶向超聲微泡干預炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放，并施加高聲壓超聲輻射擊破微泡，結果發現擊破微泡后骨髓釋放的中性粒細胞明顯增多，逐漸接近炎癥對照組骨髓灌出液中中性粒細胞的濃度。說明靶向黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面的微泡被高聲壓超聲輻射擊破后，解除了微泡在骨髓竇狀內皮表面的物理阻擋作用，骨髓儲存池內的中性粒細胞恢復穿竇狀內皮細胞釋放入外周循環的功能。實現了利用可控性的手段可逆性地減少骨髓中性粒細胞釋放的目的。
炎癥反應的早期是調控中性粒細胞釋放的重要“時間窗”，在這一時段給予有效干預將最大限度地減少外周循環中中性粒細胞的數量。本研究證實了在炎癥早期給予抗VCAM-1抗體阻斷骨髓竇狀內皮VCAM-1與中性粒細胞CD49d的結合，同樣可以減少骨髓中性粒細胞的快速釋放；而利用抗VCAM-1靶向超聲微泡不僅可以起到抗體封閉的生物學阻斷作用，同時抗VCAM-1抗體引導微泡黏附于骨髓竇狀內皮表面，對骨髓中性粒細胞的穿內皮釋放具有物理性阻擋作用，起到了雙重屏障作用；給予高聲壓超聲擊破微泡解除物理學屏障的同時，微泡破裂的空化效應可以使VCAM-1抗原-抗體間的結合分離，解除了抗體阻斷的生物學屏障，骨髓中性粒細胞的釋放得以恢復，最終實現了可逆性阻斷炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放。可以看出利用抗VCAM-1靶向超聲微泡可逆性阻斷體外循環相關骨髓中性粒細胞釋放的策略確有一定的臨床應用潛力。
體外循環（extracorporeal circulation，ECC）是心臟外科中一項重要的輔助手段。ECC時外周循環中激活的中性粒細胞釋放促炎因子，進一步擴大炎癥反應，并刺激骨髓中性粒細胞快速釋放入外周循環[1]。中性粒細胞是一把“雙刃劍”，其在炎癥反應中直接介導了組織損傷，卻也參與了創傷后的組織修復[2]，同時作為體內免疫防御的組成部分，在術后抗感染的過程中發揮重要作用[3]。這就促使我們去思考是否存在一種針對炎癥狀態下骨髓中性粒細胞釋放的可控辦法。已有研究表明，骨髓竇狀內皮細胞表面的血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和骨髓中性粒細胞表面的CD49d的相互作用是骨髓中性粒細胞釋放的關鍵因素，使用CD49d的抗體或拮抗劑可減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放[4]。但全身使用CD49d的抗體或拮抗劑不僅用量大，而且缺乏靶向性，可能損害外周循環中的中性粒細胞功能。目前尚無文獻報道利用抗VCAM-1抗體干預炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放。雖然在炎癥早期，VCAM-1仍主要表達在骨髓竇狀內皮細胞表面，使用抗VCAM-1抗體具有一定的靶向性，但其抗原-抗體間的結合不具備可控性，可能引起骨髓中性粒細胞較長時間的釋放障礙。
超聲微泡技術已在多個臨床領域嶄露頭角。因其具備連接特定抗體形成靶向投放的功能，和其在特定聲壓環境下可控性破裂的特點，通常被用作靶向藥物投放的載體。基于這一原理，本實驗擬利用大鼠并行ECC后分離血漿模擬ECC相關炎癥反應，通過大鼠股骨骨髓原位灌注模型，探究抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向超聲微泡對該炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放的影響，以及高聲壓超聲輻射下微泡破裂對該影響的可逆性作用。
1 資料與方法
1.1 實驗材料和分組
1.1.1 實驗材料
本研究所使用實驗動物選擇雄性成年SD大鼠（由四川省動物實驗中心提供），體重250～300 g。抗VCAM-1靶向超聲微泡為使用商品化注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡及生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗體（eBioscience）自行制備。
1.1.2 實驗分組
36只SD雄性大鼠隨機分為6組，每組6只，各組大鼠體重平均值無明顯差異。6組分別為抗體組（A組）：利用EEC后血漿模擬炎癥反應，給予0.5 ml（33.3μg）抗VCAM-1抗體；抗體+超聲組（AU組）：模擬炎癥反應后，注入與A組等量的抗VCAM-1抗體后，再給予高聲壓超聲輻射；靶向微泡組（T組）：模擬炎癥反應后，給予0.5 ml抗VCAM-1靶向超聲微泡；靶向微泡破裂組（TU組）：模擬炎癥反應后，給予與T組等量的抗VCAM-1靶向超聲微泡后，再給予與AU組相同的高聲壓超聲輻射擊破微泡；體外循環后血漿刺激對照組（MC組）：僅灌注體外循環后血漿，模擬炎癥反應；空白對照組（C組）：僅使用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，作空白對照。
1.2 實驗方法和標本檢測
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
參照Grocott等[5]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右側頸總動脈及左側股靜脈插管，預充6 ml平衡鹽溶液，以大鼠平均心輸出量1/5流量[32 ml/(kg.min)]行并行ECC 1 h。魚精蛋白中和肝素后抽取全血分離血漿。本實驗使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分離所得血漿均分為3份，作為炎性反應刺激源分別用于后續實驗分組后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
參照Burdon等[4]的方法改良，全身麻醉大鼠解剖顯露髂外動、靜脈，5-0絲線結扎尾腹動脈（caudal abdominal artery）、髂淺旋動脈（superficial iliac circumflex artery）和陰部腹壁動脈干（pudendoepigastric trunk）及其伴行靜脈。處死大鼠后立即以24G留置針導管由近心端向遠心端行股動脈置管，并以22G留置針導管由近心端向遠心端行股靜脈置管，以微量泵經股動脈插管灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液（北京邁晨科技）或實驗干預物質，收集靜脈插管灌出液。
1.2.3 抗VCAM-1靶向超聲微泡制備
注射用六氟化硫（sulphur hexafluoride，SF6，SonoVue）微泡以白色凍干粉末和SF6氣體的形式封裝于安培瓶中。以5 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液注入安培瓶中用力振搖20秒至凍干粉末完全分散溶解。取5 ml新配制的超聲微泡混懸液，加入450μg生物素化的DSPE-PEG（2000）（Avanti），37℃恒溫輕搖混合反應1 h。在200 g、4℃下離心5 min，棄去下層澄清液體后，漂浮法洗滌2次。加入66.7μg鏈霉親和素（Sigma-Aldrich），4℃下避光孵育30 min。以同前條件離心5 min，棄下清液，漂浮法洗滌2次。加入33.3μg生物素化的小鼠抗大鼠VCAM-1抗體（eBioscience），4℃下避光孵育30 min，同樣方法離心、棄液、洗滌后，完成抗VCAM-1靶向超聲微泡的制備。
1.2.4 灌注策略及細胞檢測
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后動脈插管連接微量輸液泵，先以100 ml/h的速度灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液10 min沖洗殘存血液。C組設定4個灌注周期，每周期10 min，每周期內用微量輸液泵以100 ml/h的速度勻速灌入Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，每周期灌注液總量為16.6 ml。其余各組各5個灌注周期，灌注速度、每周期時間和灌注液體量同C組；第1周期勻速灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液；第2～5周期勻速灌注用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液配制的ECC血漿。
第2周期灌注結束后，A組和AU組經股動脈插管推注0.5 ml抗VCAM-1抗體，T組和TU組推注0.5 ml抗VCAM-1靶向超聲微泡。AU組和TU組在第3周期灌注的同時以PHILIPS iu22超聲診斷儀的L12-5探頭的Flash功能于右下肢股骨及脛腓骨處給予高聲壓超聲輻射10 min。各組均在股靜脈插管端完整收集每個周期灌出液，計數中性粒細胞。
1.3 統計學分析
采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 抗VCAM-1抗體減少骨髓中性粒細胞釋放的有效性
經過5個灌注周期，A組大鼠骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 393 750.0±252 580.4）個，AU組骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 566 543.2±201 577.2）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個。A組和AU組組間差異無統計學意義（P > 0.05），但與MC組差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 1。表明抗VCAM-1抗體可以減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放，但高聲壓超聲輻射對抗VCAM-1抗體增加或減少骨髓中性粒細胞釋放的作用無明顯影響。
圖1
A組、AU組與MC組中性粒細胞總數比較
2.2 抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向超聲微泡減少骨髓中性粒細胞釋放的差異
經過5個灌注周期，A組大鼠骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 393 750.0±252 580.4）個，T組骨髓灌出液含中性粒細胞（1 975 000.0±184 729.5）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個，各組間差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 2。表明抗VCAM-1抗體和抗VCAM-1靶向微泡均能減少炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放，且抗VCAM-1靶向超聲微泡的效果更加顯著。
圖2
A組、T組與MC組中性粒細胞總數比較
2.3 抗VCAM-1靶向超聲微泡減少骨髓中性粒細胞釋放的可逆性
經過5個灌注周期，T組大鼠骨髓灌出液含中性粒細胞（1 975 000.0±184 729.5）個，TU組骨髓灌出液約含中性粒細胞（2 962 500.0±238 353.7）個，MC組灌出液約含中性粒細胞（4 100 000.0±126 984.3）個，各組間差異均有統計學意義（P < 0.05），見圖 3。可見高聲壓超聲輻射擊破抗VCAM-1靶向超聲微泡后，炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放顯著增加。
圖3
T組、TU組與MC組中性粒細胞總數比較
3 討論
Burdon等[4]發現在炎癥刺激下，在給予CD49d抗體或拮抗劑后，骨髓釋放的中性粒細胞顯著減少，據此推斷骨髓竇狀內皮表達的VCAM-1和其由中性粒細胞表達的配體CD49d的相互作用是炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放的關鍵。炎癥早期是骨髓循環池內的中性粒細胞釋放入外周循環的最快增速階段，這提示該時期可能也是炎癥條件下骨髓竇狀內皮VCAM-1表達上調的高峰期[6]。在這一時期給予抗VCAM-1抗體，觀察到骨髓灌出液中中性粒細胞的顯著減少。說明抗VCAM-1抗體也可以阻斷骨髓竇狀內皮細胞表面VCAM-1與中性粒細胞表面CD49d的結合，減少炎癥條件下中性粒細胞的釋放。而給予高聲壓超聲輻射后，灌出液中中性粒細胞數量與未使用超聲輻射的組差異無統計學意義，說明高聲壓超聲輻射對骨髓中性粒細胞的釋放無明顯影響。抗原-抗體的結合和解離始終處于可逆性轉換的動態過程中，可以推測隨著抗VCAM-1抗體分解代謝的消耗，其阻斷作用才會逐步消除，但這可能會引起骨髓中性粒細胞較長時間的釋放障礙。而目前尚未見到有關VCAM-1抗原-抗體間動態結合與游離的時間相關性定量分析的研究。由于VCAM-1的表達在炎癥早期具有明顯的骨髓靶向性，利用抗VCAM-1抗體為減少ECC相關骨髓中性粒細胞快速釋放的研究提供了探索途徑。
Kaufmann等[7]和Behm等[8]通過在超聲微泡表面加載抗VCAM-1抗體在動脈粥樣硬化和缺血動物模型上實現了外周循環炎癥部位的靶向超聲顯影，結果證實抗VCAM-1抗體可以靶向引導微泡濃聚于VCAM-1高表達的組織。受此啟發，我們將抗VCAM-1靶向超聲微泡引入骨髓。超聲微泡借助其表面的抗VCAM-1抗體與骨髓竇狀內皮細胞的VCAM-1靶向結合而黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面，而密集分布于骨髓竇狀內皮細胞表面的微泡是否會對骨髓儲存池內的中性粒細胞穿竇狀內皮細胞釋放的過程有阻擋作用呢？目前國內外尚未見到相關研究。本研究發現在模擬的ECC炎癥條件下，相比單純使用抗VCAM-1抗體（A組），利用抗VCAM-1靶向超聲微泡（T組）減少骨髓中性粒細胞釋放的效果更加顯著。分析并推測可能的原因為靶向微泡通過其表面的特異性抗體識別并與骨髓竇狀內皮細胞表達的VCAM-1相結合時，引導微泡黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面形成了密集分布于竇狀內皮表面的“微泡層”，進一步阻擋了中性粒細胞的游出。抗VCAM-1靶向超聲微泡提供了抗體封閉的生物學屏障和微泡阻擋的物理學屏障的雙重作用，更有效地減少了骨髓中性粒細胞的快速釋放；而微泡與其表面抗體的特殊關系也為進一步研究骨髓中性粒細胞釋放的可控性調節提供了新的思路。
已廣泛應用于臨床檢查的超聲微泡造影劑也可以作為一種可控性的藥物或基因運載手段。一些研究顯示利用高聲壓超聲擊破微泡產生的空化效應釋放微泡攜帶的藥物或基因，提高局部藥物濃度或基因轉載率，起到靶向治療的作用。這些研究多集中在心血管疾病、神經系統疾病和腫瘤疾病等領域[8-10]。本研究設計利用抗VCAM-1靶向超聲微泡阻斷炎癥刺激下骨髓中性粒細胞的快速釋放后，求證施加高聲壓超聲輻射擊破微泡可否解除微泡阻擋的物理學屏障作用，恢復骨髓中性粒細胞的釋放功能。通過抗VCAM-1靶向超聲微泡干預炎癥條件下骨髓中性粒細胞釋放，并施加高聲壓超聲輻射擊破微泡，結果發現擊破微泡后骨髓釋放的中性粒細胞明顯增多，逐漸接近炎癥對照組骨髓灌出液中中性粒細胞的濃度。說明靶向黏附于骨髓竇狀內皮細胞表面的微泡被高聲壓超聲輻射擊破后，解除了微泡在骨髓竇狀內皮表面的物理阻擋作用，骨髓儲存池內的中性粒細胞恢復穿竇狀內皮細胞釋放入外周循環的功能。實現了利用可控性的手段可逆性地減少骨髓中性粒細胞釋放的目的。
炎癥反應的早期是調控中性粒細胞釋放的重要“時間窗”，在這一時段給予有效干預將最大限度地減少外周循環中中性粒細胞的數量。本研究證實了在炎癥早期給予抗VCAM-1抗體阻斷骨髓竇狀內皮VCAM-1與中性粒細胞CD49d的結合，同樣可以減少骨髓中性粒細胞的快速釋放；而利用抗VCAM-1靶向超聲微泡不僅可以起到抗體封閉的生物學阻斷作用，同時抗VCAM-1抗體引導微泡黏附于骨髓竇狀內皮表面，對骨髓中性粒細胞的穿內皮釋放具有物理性阻擋作用，起到了雙重屏障作用；給予高聲壓超聲擊破微泡解除物理學屏障的同時，微泡破裂的空化效應可以使VCAM-1抗原-抗體間的結合分離，解除了抗體阻斷的生物學屏障，骨髓中性粒細胞的釋放得以恢復，最終實現了可逆性阻斷炎癥條件下骨髓中性粒細胞的釋放。可以看出利用抗VCAM-1靶向超聲微泡可逆性阻斷體外循環相關骨髓中性粒細胞釋放的策略確有一定的臨床應用潛力。
