引用本文： 干昌平, 邱旭, 安琪, 石應康. 上調大鼠骨髓中性粒細胞CXCR4表達對減少其在體外循環中釋放的作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(1): 66-70. doi: 10.7507/1007-4848.20150019 復制
體外循環（extracorporeal circulation，ECC）是心臟外科等領域一項重要的治療和輔助手段。ECC過程中血液不可避免地與異物表面接觸將導致白細胞，特別是中性粒細胞的激活并引起全身炎性反應和器官功能障礙[1-2]。ECC后外周血中性粒細胞數量的快速增加主要緣自骨髓儲備的快速釋放。釋放入血的中性粒細胞又能進一步維持和擴大炎性反應。以往的研究[3-4]提示中性粒細胞表面表達的趨化因子受體4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]和骨髓基質細胞廣泛表達的基質細胞獲得因子-1α（stromal cell-derived factor，SDF-1α）之間的連接是控制和調節骨髓中性粒細胞釋放的重要因素，CXCR4/SDF-1α的連接活性降低或CXCR4的表達減少，均能導致中性粒細胞的快速釋放。既然CXCR4/SDF-1α連接的破壞可以導致骨髓中性粒細胞快速釋放，那如果通過上調骨髓中性粒細胞CXCR4表達，加強其連接是否就可以阻止體外循環中骨髓中性粒細胞的大量釋放呢？目前尚未見相關研究。
L-選擇素的天然配體硫苷脂（sulfatide，3-sulfated galactosylceramide）和巖藻依聚糖（fucoidan）可在體外培養中上調淋巴細胞表面CXCR4表達，并增加淋巴細胞與SDF-1α的親和力[5]，但其在體內環境中的作用尚未得到驗證。如果可以實現體內的上調，這種體內的上調作用和體外循環相關的骨髓中性粒細胞快速釋放又有怎樣的關系呢？基于這些問題，本文擬通過大鼠股骨骨髓原位灌注模型研究體內使用巖藻依聚糖上調骨髓內中性粒細胞CXCR4表達的可能性，并探索其對體外循環相關骨髓中性粒細胞快速釋放的調節作用。
1 資料與方法
1.1 材料和分組
1.1.1 實驗材料
本研究所使用實驗動物選擇雄性成年SD大鼠（由四川省動物實驗中心提供），體重250～300 g。實驗中炎性反應刺激源為ECC后大鼠血漿，巖藻依聚糖（sigma）溶液濃度為250 μg/ml，自行配制。
1.1.2 實驗分組
灌注巖藻依聚糖對大鼠骨髓中性粒細胞CXCR4表達的影響實驗（實驗一）中12只大鼠隨機分為2 組，每組6只，每組大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（見實驗方法），其中實驗組（F組）以巖藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓，對照組（C組）以Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液灌注骨髓。兩組灌注后均收集靜脈端灌出液。
灌注巖藻依聚糖對大鼠體外循環相關骨髓中性粒細胞釋放的影響實驗（實驗二）中18只大鼠隨機分為3組，每組6只，每組大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（見實驗方法），其中F’組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予巖藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓；F+AMD3100組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予巖藻依聚糖（sigma）溶液和CXCR4抗體拮抗劑AMD-3100灌注骨髓，對照組C’組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液灌注骨髓。各組灌注后收集靜脈端灌出液。
1.2 實驗方法和標本檢測
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
參照Grocott等[6]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右側頸總動脈及左側股靜脈插管，預充平衡鹽溶液6 ml，以大鼠平均心輸出量1/5流量[32 ml/（kg·min）]并行ECC 1 h。魚精蛋白中和肝素后抽取全血分離血漿。本實驗使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分離所得血漿均分為3份，作為炎性反應刺激源分別用于后續實驗分組后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
參照Burdon等[7] 的方法改良，全身麻醉大鼠解剖顯露髂外動靜脈，5-0絲線結扎尾腹動脈（caudal abdominal artery）、髂淺旋動脈（superficial iliac circumflex artery）和陰部腹壁動脈干（pudendoepigastric trunk）及其伴行靜脈。處死大鼠后立即以24 G留置針導管由近心端向遠心端行股動脈置管，并以22 G留置針導管由近心端向遠心端行股靜脈置管，以微量泵經股動脈插管灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液（北京邁晨科技）或實驗干預物質，收集靜脈插管灌出液。
1.2.3 實驗一灌注策略、標本收集和檢測
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后動脈端接入微量注射泵，先以1 ml/min的速度灌注5 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液沖洗血管中殘留血液。實驗開始后，F組（n=6）采用巖藻依聚糖（sigma）溶液，C組（n=6）采用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，以0.1 ml/min的速度分別灌入6 ml巖藻依聚糖溶液或緩沖液，持續1 h。灌入巖藻依聚糖溶液濃度為250 μg/ml。
灌注完成后解剖分離大鼠股骨，剪開股骨兩端骨骺暴露骨髓腔，以5 ml Hanks平衡鹽溶液（HyClone）輕柔沖洗股骨一端，自另一側斷端收集沖洗液。沖洗液在200 g、4℃下離心10 min，棄去上清液，沉淀以低張法（以1 ml 0.2% NaCl溶液清洗30 s，立即繼以等體積1.6% NaCl溶液清洗30 s，重復一次）去除殘留紅細胞。剩余白細胞重懸于PBS緩沖液中。獲取的F組和C組重懸白細胞樣本中分別加入兔抗大鼠CXCR4多克隆抗體（一抗）（abcam）和兔單克隆抗體IgG同型對照抗體（cell signaling），4℃下孵育30 min，清洗兩次后避光環境中加入FITC標記山羊抗兔IgG二抗（millipore corporation），4℃下孵育30 min，細胞清洗兩次后重懸于PBS緩沖液，流式細胞儀檢測中性粒細胞表面CXCR4表達。
1.2.4 實驗二灌注策略、標本收集和檢測
沖洗血管中殘留血液后F’組先以0.1 ml/min的速度灌入濃度為250 μg/ml的巖藻依聚糖溶液6ml，持續1 h；繼以0.1 ml/min的速度灌入1 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，共10 min；最后以0.1 ml /min的速度灌入ECC后大鼠血漿1 ml，共10 min。F+AMD3100組以0.1 ml/min灌入6 ml巖藻依聚糖溶液后再以0.1 ml/min的速度灌入1 ml濃度12.5 μg/ml的AMD-3100溶液，共10 min；最后同樣灌入ECC后大鼠血漿。C’組先以0.1 ml/min的速度灌入7 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，共70 min，繼以0.1 ml/min的速度灌入ECC后大鼠血漿1 ml，共10 min。
以上灌注完成后每組均以1 ml/min的速度灌入Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液共計40 min并收集灌出液。3組灌注總時間均為120 min。收集股靜脈灌出液于離心管中并記錄體積，灌出液在200 g、4℃下離心10 min，棄去上清液，沉淀以低張法去除殘留紅細胞。剩余白細胞重懸于500 μl PBS緩沖液中，充分混勻后取該重懸液10 μl加入40 μl 1%冰醋酸中并于顯微鏡下多次計數白細胞總數，求得灌注液樣本中白細胞總數平均值。剩余重懸白細胞經流式細胞儀檢測，在前向光散射/側向光散射（FSC/SSC）散點圖中分別劃出白細胞和中性粒細胞門，結合前述計數值求得樣本骨髓釋放或灌入中性粒細胞總數。
1.3 統計學分析
采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 一般結果
實驗中6只SD大鼠建立ECC并采集分離血漿，6只大鼠平均體重為（292.2±15.4）g。實驗一中F組6只大鼠平均體重為（268.7±9.5）g，對照組（C組）6只大鼠平均體重為（269.3±13.0）g，兩組大鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。實驗二中F’組、F+AMD3100組和C’組大鼠平均體重分別為（270.7±10.8）g、（267.2±15.7）g和（273.7±9.7）g，三組間大鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 灌注巖藻依聚糖對大鼠骨髓中性粒細胞CXCR4表達的影響
經流式細胞儀檢測，F組（巖藻依聚糖灌注組）骨髓沖出中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例平均為4.71%±0.21%，中性粒細胞CXCR4平均熒光強度為（161.3±7.8）（圖 1A）；C組（緩沖液對照組）沖出中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例平均為1.11%±0.11%，中性粒細胞CXCR4平均熒光強度為（58.4±6.5）（圖 1B）。與對照組相比，巖藻依聚糖灌注后大鼠骨髓中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例（圖 2）和CXCR4平均熒光強度均較高（圖 3），差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
F組與C組骨髓CXCR4（+）中性粒細胞比例
注：A為F組，B為C組
圖2
F組與C組骨髓CXCR4（+）中性粒細胞比例比較 ? ?圖 3 F組與C組骨髓中性粒細胞CXCR4平均熒光強度比較
注：*
2.3 灌注巖藻依聚糖對大鼠體外循環相關骨髓中性粒細釋放的影響
在40 min的灌注中，F’組（巖藻依聚糖灌注組）共收集到骨髓中性粒細胞（261 393.7±12 470.6）個，遠小于對照組的（818 675.2±10 708.8）個，兩組差異有統計學意義（P<0.05）；使用巖藻依聚糖的同時加用CXCR4抗體拮抗劑可取消巖藻依聚糖對骨髓中性粒細胞釋放的抑制作用，明顯增加釋放，釋放總數不僅遠高于F’組，甚至超過對照組達到（872 635.2±10 430.6）個，F+AMD3100組（巖藻依聚糖+AMD3100灌注組）骨髓釋放中性粒細胞總數與F’組和C’組（緩沖液對照組）相比差異均有統計學意義（P<0.05）（圖 4）。
圖3
各組骨髓釋放中性粒細胞總數比較
注：*
3 討論
在ECC相關炎性反應過程中，骨髓釋放的中性粒細胞起著重要作用，釋放的中性粒細胞不僅直接參與炎性損害，激活后還能通過各種機制再次促進骨髓釋放更多的中性粒細胞，形成瀑布式的連鎖反應。既然骨髓中性粒細胞CXCR4的表達下降，或其與SDF-1α之間連接的減弱均可導致骨髓中性粒細胞的釋放增加。反之，如果上調其表達或增強其與SDF-1α之間的連接關系就能減少骨髓中性粒細胞的釋放也是符合邏輯的。事實上，在先天性髓樣粒細胞缺乏癥（WHIM綜合征）中，正是因為CXCR4對SDF-1α的敏感性增加造成了骨髓釋放中性粒細胞的減少[8]。這樣類似的機理能否應用于減少ECC相關的骨髓中性粒細胞釋放正是本研究的目的。
穩態下骨髓儲備中成熟的中性粒細胞表達著較低但能夠檢測出的CXCR4，但中性粒細胞胞內CXCR4表達卻很高，這使得在需要的時候中性粒細胞可以通過出胞作用快速上調細胞表面CXCR4的表達[3, 9]。目前已有的關于粒細胞CXCR4表達上調的研究都局限在體外分離細胞的實驗中[5, 10]，應用100 μg/ml的硫苷脂和巖藻依聚糖體外培養分離所得人淋巴細胞1 h可將其CXCR4陽性率分別提升至之前的近1.5倍和2倍。這種作用來自于L-選擇素介導的酪氨酸激酶相關的胞內信號通路的激活，以及繼而發生的胞內CXCR4向細胞外動員的增加和內化作用的減少。本實驗發現，這種L-選擇素的天然配體在體內環境中也能有效上調中性粒細胞表面CXCR4的表達。經過1 h灌注，骨髓中性粒細胞CXCR4陽性細胞比例和中性粒細胞CXCR4熒光強度均增加至基礎值的3倍左右，這和以前報道的體外實驗結果基本吻合。這也是第一次通過實驗的方法證實了在體內環境中上調骨髓中性粒細胞CXCR4的表達是完全可行和有效的。
解決了骨髓中性粒細胞在原位表達CXCR4上調的問題，就等于打下了減少其釋放的基礎。針對這一問題本研究也進行了進一步的探索。利用大鼠股骨骨髓原位灌注模型我們發現，面對ECC后血漿的刺激，巖藻依聚糖的處理很好地抑制了骨髓中性粒細胞的大量釋放，而這一效果能夠被CXCR4的拮抗劑AMD3100所取消。這一實驗結果很好地證明了，也是首次發現CXCR4的上調劑能夠在體內環境中明顯抑制ECC相關的骨髓中性粒細胞快速釋放。
這一發現對ECC相關全身炎性反應的預防和治療有著較大的啟發意義，如果能夠通過改變骨髓內中性粒細胞趨化因子受體的表達，減少其在ECC中的釋放，就能在很大程度上阻斷這一瀑布式的鏈式反應，減輕全身炎性反應，改善臨床預后。但是這樣的實驗室結果要能夠完全應用于臨床也還面臨著一些問題。
本研究僅驗證了巖藻依聚糖在大鼠股骨局部的使用效果，但在臨床實踐中，僅針對骨髓組織的給藥是很難實現的。雖然有研究在動物實驗中經靜脈全身使用硫苷脂[11-12]，但僅是研究了其作為選擇素配體的減輕炎性細胞粘附的作用，并未對其在炎性反應中的全面效應作出評價，而通過推斷可知硫苷脂或巖藻依聚糖的全身用藥勢必會帶來一些新的挑戰。首先，在ECC過程中，中性粒細胞不僅存在于骨髓之中。如全身用藥，外周血激活的中性粒細胞也會和骨髓中性粒細胞一樣上調其CXCR4的表達。無選擇性地上調CXCR4將促使激活的中性粒細胞利用CXCR4/SDF-1α連接更多地粘附于同樣表達SDF-1α的肺、肝臟、腦和心肌等重要組織器官，加重炎性反應中的組織損傷。有研究發現，外周血中性粒細胞表面CXCR4的表達上調可增加其在急性肺損傷時與肺上皮細胞間的粘附，而這樣的作用正是通過CXCR4與SDF-1α間的相互作用實現的[13]。其次，近年來的研究[14-15]還發現骨髓干細胞對受損組織有一定的修復能力，而干細胞的募集過程也與骨髓中CXCR4與SDF-1α間的聯系有關。如上調骨髓中性粒細胞的同時也上調了這部分干細胞的CXCR4表達，抑制了其向受損組織的遷移作用，將會帶來一定的負面效果。由此看出，利用上調骨髓中性粒細胞CXCR4減少ECC相關骨髓中性粒細胞釋放的策略的確有巨大的臨床應用潛力，但也還需要向靶向和可控的方向努力。
體外循環（extracorporeal circulation，ECC）是心臟外科等領域一項重要的治療和輔助手段。ECC過程中血液不可避免地與異物表面接觸將導致白細胞，特別是中性粒細胞的激活并引起全身炎性反應和器官功能障礙[1-2]。ECC后外周血中性粒細胞數量的快速增加主要緣自骨髓儲備的快速釋放。釋放入血的中性粒細胞又能進一步維持和擴大炎性反應。以往的研究[3-4]提示中性粒細胞表面表達的趨化因子受體4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4，CXCR4]和骨髓基質細胞廣泛表達的基質細胞獲得因子-1α（stromal cell-derived factor，SDF-1α）之間的連接是控制和調節骨髓中性粒細胞釋放的重要因素，CXCR4/SDF-1α的連接活性降低或CXCR4的表達減少，均能導致中性粒細胞的快速釋放。既然CXCR4/SDF-1α連接的破壞可以導致骨髓中性粒細胞快速釋放，那如果通過上調骨髓中性粒細胞CXCR4表達，加強其連接是否就可以阻止體外循環中骨髓中性粒細胞的大量釋放呢？目前尚未見相關研究。
L-選擇素的天然配體硫苷脂（sulfatide，3-sulfated galactosylceramide）和巖藻依聚糖（fucoidan）可在體外培養中上調淋巴細胞表面CXCR4表達，并增加淋巴細胞與SDF-1α的親和力[5]，但其在體內環境中的作用尚未得到驗證。如果可以實現體內的上調，這種體內的上調作用和體外循環相關的骨髓中性粒細胞快速釋放又有怎樣的關系呢？基于這些問題，本文擬通過大鼠股骨骨髓原位灌注模型研究體內使用巖藻依聚糖上調骨髓內中性粒細胞CXCR4表達的可能性，并探索其對體外循環相關骨髓中性粒細胞快速釋放的調節作用。
1 資料與方法
1.1 材料和分組
1.1.1 實驗材料
本研究所使用實驗動物選擇雄性成年SD大鼠（由四川省動物實驗中心提供），體重250～300 g。實驗中炎性反應刺激源為ECC后大鼠血漿，巖藻依聚糖（sigma）溶液濃度為250 μg/ml，自行配制。
1.1.2 實驗分組
灌注巖藻依聚糖對大鼠骨髓中性粒細胞CXCR4表達的影響實驗（實驗一）中12只大鼠隨機分為2 組，每組6只，每組大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（見實驗方法），其中實驗組（F組）以巖藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓，對照組（C組）以Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液灌注骨髓。兩組灌注后均收集靜脈端灌出液。
灌注巖藻依聚糖對大鼠體外循環相關骨髓中性粒細胞釋放的影響實驗（實驗二）中18只大鼠隨機分為3組，每組6只，每組大鼠均建立股骨骨髓原位灌注模型（見實驗方法），其中F’組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予巖藻依聚糖（sigma）溶液灌注骨髓；F+AMD3100組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予巖藻依聚糖（sigma）溶液和CXCR4抗體拮抗劑AMD-3100灌注骨髓，對照組C’組刺激骨髓中性粒細胞釋放前給予Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液灌注骨髓。各組灌注后收集靜脈端灌出液。
1.2 實驗方法和標本檢測
1.2.1 SD大鼠并行ECC模型的建立
參照Grocott等[6]的方法改良，全身麻醉大鼠全身肝素化后行右側頸總動脈及左側股靜脈插管，預充平衡鹽溶液6 ml，以大鼠平均心輸出量1/5流量[32 ml/（kg·min）]并行ECC 1 h。魚精蛋白中和肝素后抽取全血分離血漿。本實驗使用6只SD大鼠接受ECC，每只大鼠分離所得血漿均分為3份，作為炎性反應刺激源分別用于后續實驗分組后使用。
1.2.2 SD大鼠股骨骨髓原位灌注模型的建立
參照Burdon等[7] 的方法改良，全身麻醉大鼠解剖顯露髂外動靜脈，5-0絲線結扎尾腹動脈（caudal abdominal artery）、髂淺旋動脈（superficial iliac circumflex artery）和陰部腹壁動脈干（pudendoepigastric trunk）及其伴行靜脈。處死大鼠后立即以24 G留置針導管由近心端向遠心端行股動脈置管，并以22 G留置針導管由近心端向遠心端行股靜脈置管，以微量泵經股動脈插管灌注Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液（北京邁晨科技）或實驗干預物質，收集靜脈插管灌出液。
1.2.3 實驗一灌注策略、標本收集和檢測
大鼠股骨骨髓原位灌注模型建立后動脈端接入微量注射泵，先以1 ml/min的速度灌注5 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液沖洗血管中殘留血液。實驗開始后，F組（n=6）采用巖藻依聚糖（sigma）溶液，C組（n=6）采用Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，以0.1 ml/min的速度分別灌入6 ml巖藻依聚糖溶液或緩沖液，持續1 h。灌入巖藻依聚糖溶液濃度為250 μg/ml。
灌注完成后解剖分離大鼠股骨，剪開股骨兩端骨骺暴露骨髓腔，以5 ml Hanks平衡鹽溶液（HyClone）輕柔沖洗股骨一端，自另一側斷端收集沖洗液。沖洗液在200 g、4℃下離心10 min，棄去上清液，沉淀以低張法（以1 ml 0.2% NaCl溶液清洗30 s，立即繼以等體積1.6% NaCl溶液清洗30 s，重復一次）去除殘留紅細胞。剩余白細胞重懸于PBS緩沖液中。獲取的F組和C組重懸白細胞樣本中分別加入兔抗大鼠CXCR4多克隆抗體（一抗）（abcam）和兔單克隆抗體IgG同型對照抗體（cell signaling），4℃下孵育30 min，清洗兩次后避光環境中加入FITC標記山羊抗兔IgG二抗（millipore corporation），4℃下孵育30 min，細胞清洗兩次后重懸于PBS緩沖液，流式細胞儀檢測中性粒細胞表面CXCR4表達。
1.2.4 實驗二灌注策略、標本收集和檢測
沖洗血管中殘留血液后F’組先以0.1 ml/min的速度灌入濃度為250 μg/ml的巖藻依聚糖溶液6ml，持續1 h；繼以0.1 ml/min的速度灌入1 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，共10 min；最后以0.1 ml /min的速度灌入ECC后大鼠血漿1 ml，共10 min。F+AMD3100組以0.1 ml/min灌入6 ml巖藻依聚糖溶液后再以0.1 ml/min的速度灌入1 ml濃度12.5 μg/ml的AMD-3100溶液，共10 min；最后同樣灌入ECC后大鼠血漿。C’組先以0.1 ml/min的速度灌入7 ml Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液，共70 min，繼以0.1 ml/min的速度灌入ECC后大鼠血漿1 ml，共10 min。
以上灌注完成后每組均以1 ml/min的速度灌入Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液共計40 min并收集灌出液。3組灌注總時間均為120 min。收集股靜脈灌出液于離心管中并記錄體積，灌出液在200 g、4℃下離心10 min，棄去上清液，沉淀以低張法去除殘留紅細胞。剩余白細胞重懸于500 μl PBS緩沖液中，充分混勻后取該重懸液10 μl加入40 μl 1%冰醋酸中并于顯微鏡下多次計數白細胞總數，求得灌注液樣本中白細胞總數平均值。剩余重懸白細胞經流式細胞儀檢測，在前向光散射/側向光散射（FSC/SSC）散點圖中分別劃出白細胞和中性粒細胞門，結合前述計數值求得樣本骨髓釋放或灌入中性粒細胞總數。
1.3 統計學分析
采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（
2 結果
2.1 一般結果
實驗中6只SD大鼠建立ECC并采集分離血漿，6只大鼠平均體重為（292.2±15.4）g。實驗一中F組6只大鼠平均體重為（268.7±9.5）g，對照組（C組）6只大鼠平均體重為（269.3±13.0）g，兩組大鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。實驗二中F’組、F+AMD3100組和C’組大鼠平均體重分別為（270.7±10.8）g、（267.2±15.7）g和（273.7±9.7）g，三組間大鼠體重差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2 灌注巖藻依聚糖對大鼠骨髓中性粒細胞CXCR4表達的影響
經流式細胞儀檢測，F組（巖藻依聚糖灌注組）骨髓沖出中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例平均為4.71%±0.21%，中性粒細胞CXCR4平均熒光強度為（161.3±7.8）（圖 1A）；C組（緩沖液對照組）沖出中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例平均為1.11%±0.11%，中性粒細胞CXCR4平均熒光強度為（58.4±6.5）（圖 1B）。與對照組相比，巖藻依聚糖灌注后大鼠骨髓中性粒細胞中CXCR4（+）細胞比例（圖 2）和CXCR4平均熒光強度均較高（圖 3），差異有統計學意義（P<0.05）。
圖1
F組與C組骨髓CXCR4（+）中性粒細胞比例
注：A為F組，B為C組
圖2
F組與C組骨髓CXCR4（+）中性粒細胞比例比較 ? ?圖 3 F組與C組骨髓中性粒細胞CXCR4平均熒光強度比較
注：*
2.3 灌注巖藻依聚糖對大鼠體外循環相關骨髓中性粒細釋放的影響
在40 min的灌注中，F’組（巖藻依聚糖灌注組）共收集到骨髓中性粒細胞（261 393.7±12 470.6）個，遠小于對照組的（818 675.2±10 708.8）個，兩組差異有統計學意義（P<0.05）；使用巖藻依聚糖的同時加用CXCR4抗體拮抗劑可取消巖藻依聚糖對骨髓中性粒細胞釋放的抑制作用，明顯增加釋放，釋放總數不僅遠高于F’組，甚至超過對照組達到（872 635.2±10 430.6）個，F+AMD3100組（巖藻依聚糖+AMD3100灌注組）骨髓釋放中性粒細胞總數與F’組和C’組（緩沖液對照組）相比差異均有統計學意義（P<0.05）（圖 4）。
圖3
各組骨髓釋放中性粒細胞總數比較
注：*
3 討論
在ECC相關炎性反應過程中，骨髓釋放的中性粒細胞起著重要作用，釋放的中性粒細胞不僅直接參與炎性損害，激活后還能通過各種機制再次促進骨髓釋放更多的中性粒細胞，形成瀑布式的連鎖反應。既然骨髓中性粒細胞CXCR4的表達下降，或其與SDF-1α之間連接的減弱均可導致骨髓中性粒細胞的釋放增加。反之，如果上調其表達或增強其與SDF-1α之間的連接關系就能減少骨髓中性粒細胞的釋放也是符合邏輯的。事實上，在先天性髓樣粒細胞缺乏癥（WHIM綜合征）中，正是因為CXCR4對SDF-1α的敏感性增加造成了骨髓釋放中性粒細胞的減少[8]。這樣類似的機理能否應用于減少ECC相關的骨髓中性粒細胞釋放正是本研究的目的。
穩態下骨髓儲備中成熟的中性粒細胞表達著較低但能夠檢測出的CXCR4，但中性粒細胞胞內CXCR4表達卻很高，這使得在需要的時候中性粒細胞可以通過出胞作用快速上調細胞表面CXCR4的表達[3, 9]。目前已有的關于粒細胞CXCR4表達上調的研究都局限在體外分離細胞的實驗中[5, 10]，應用100 μg/ml的硫苷脂和巖藻依聚糖體外培養分離所得人淋巴細胞1 h可將其CXCR4陽性率分別提升至之前的近1.5倍和2倍。這種作用來自于L-選擇素介導的酪氨酸激酶相關的胞內信號通路的激活，以及繼而發生的胞內CXCR4向細胞外動員的增加和內化作用的減少。本實驗發現，這種L-選擇素的天然配體在體內環境中也能有效上調中性粒細胞表面CXCR4的表達。經過1 h灌注，骨髓中性粒細胞CXCR4陽性細胞比例和中性粒細胞CXCR4熒光強度均增加至基礎值的3倍左右，這和以前報道的體外實驗結果基本吻合。這也是第一次通過實驗的方法證實了在體內環境中上調骨髓中性粒細胞CXCR4的表達是完全可行和有效的。
解決了骨髓中性粒細胞在原位表達CXCR4上調的問題，就等于打下了減少其釋放的基礎。針對這一問題本研究也進行了進一步的探索。利用大鼠股骨骨髓原位灌注模型我們發現，面對ECC后血漿的刺激，巖藻依聚糖的處理很好地抑制了骨髓中性粒細胞的大量釋放，而這一效果能夠被CXCR4的拮抗劑AMD3100所取消。這一實驗結果很好地證明了，也是首次發現CXCR4的上調劑能夠在體內環境中明顯抑制ECC相關的骨髓中性粒細胞快速釋放。
這一發現對ECC相關全身炎性反應的預防和治療有著較大的啟發意義，如果能夠通過改變骨髓內中性粒細胞趨化因子受體的表達，減少其在ECC中的釋放，就能在很大程度上阻斷這一瀑布式的鏈式反應，減輕全身炎性反應，改善臨床預后。但是這樣的實驗室結果要能夠完全應用于臨床也還面臨著一些問題。
本研究僅驗證了巖藻依聚糖在大鼠股骨局部的使用效果，但在臨床實踐中，僅針對骨髓組織的給藥是很難實現的。雖然有研究在動物實驗中經靜脈全身使用硫苷脂[11-12]，但僅是研究了其作為選擇素配體的減輕炎性細胞粘附的作用，并未對其在炎性反應中的全面效應作出評價，而通過推斷可知硫苷脂或巖藻依聚糖的全身用藥勢必會帶來一些新的挑戰。首先，在ECC過程中，中性粒細胞不僅存在于骨髓之中。如全身用藥，外周血激活的中性粒細胞也會和骨髓中性粒細胞一樣上調其CXCR4的表達。無選擇性地上調CXCR4將促使激活的中性粒細胞利用CXCR4/SDF-1α連接更多地粘附于同樣表達SDF-1α的肺、肝臟、腦和心肌等重要組織器官，加重炎性反應中的組織損傷。有研究發現，外周血中性粒細胞表面CXCR4的表達上調可增加其在急性肺損傷時與肺上皮細胞間的粘附，而這樣的作用正是通過CXCR4與SDF-1α間的相互作用實現的[13]。其次，近年來的研究[14-15]還發現骨髓干細胞對受損組織有一定的修復能力，而干細胞的募集過程也與骨髓中CXCR4與SDF-1α間的聯系有關。如上調骨髓中性粒細胞的同時也上調了這部分干細胞的CXCR4表達，抑制了其向受損組織的遷移作用，將會帶來一定的負面效果。由此看出，利用上調骨髓中性粒細胞CXCR4減少ECC相關骨髓中性粒細胞釋放的策略的確有巨大的臨床應用潛力，但也還需要向靶向和可控的方向努力。
