引用本文： 陳蘇峰, 張亞偉, 胡鴻, 張杰, 孫藝華, 王龍富, 陳穎, 王彥麗, 相加慶, 陳海泉. 經支氣管鏡超聲引導針吸活檢術標本確診肺腺癌患者表皮生長因子受體突變分析. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(1): 44-47. doi: 10.7507/1007-4848.20150013 復制
晚期非小細胞肺癌的治療策略包括明確非小細胞肺癌病理組織學分型及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變情況。對于晚期非小細胞肺癌患者來說，EGFR基因酪氨酸激酶結構域的突變是應用酪氨酸激酶抑制劑治療的可靠指標，但此類患者就醫時大多已失去通過手術獲取標本的機會，因此通過非外科手術方式獲取腫瘤組織標本檢測EGFR基因突變情況就變得非常必要。Kimura[1]曾報導采集非小細胞肺癌患者胸液進行EGFR基因突變檢測，Shih[2]與Horiike[3]也曾分別報導使用細針穿刺腫瘤及經支氣管鏡穿刺縱隔淋巴結獲取組織進行分子病理學檢測。近年來，經支氣管鏡超聲引導針吸活檢術（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）在肺癌的診斷和分期中得到廣泛應用，越來越多的學者嘗試使用EBUS-TBNA術收集標本進行EGFR基因突變檢測，探索晚期非小細胞肺癌獲取標本及進行分子病理學檢測的新途徑。
本研究采用EBUS-TBNA術獲取非小細胞肺癌患者縱隔淋巴結標本，經組織或細胞塊免疫組織化學檢測明確非小細胞肺癌亞型，確診為肺腺癌者再行EGFR基因突變檢測，分析晚期肺腺癌患者EGFR基因突變情況。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2009年4月至2013年9月復旦大學附屬腫瘤醫院胸外科連續施行EBUS-TBNA術964例，經細胞學或組織學HE染色及免疫組織化學染色檢查確診為肺腺癌并行EGFR基因突變檢測患者77例，其中男48例、女29例，中位年齡61 （33～78）歲。全組患者均無重要臟器功能障礙等手術禁忌證，患者或其家屬均被告知檢查程序并簽署知情同意書。
EBUS-TBNA術所用設備包括超聲支氣管鏡（BF-UC206F-OL8，Olympus，Japan）、超聲圖像處理設備（EU-C2000，Olympus，Japan）、EBUS-TBNA專用22G穿刺活檢針（NA-201SX-4022，Olympus，Japan）及20 ml可調負壓注射器(Merit Medical Systems，Inc，South Jordan，Utah，U.S.A.)。
1.2 方法
全組患者采用靜脈全身麻醉聯合局部麻醉（保留自主呼吸）或靜脈靶控（target controlled infusion,TCI）輸注丙泊酚全身麻醉下置入喉罩機械通氣，部分患者采用氣管內插管全身麻醉。術中監測心率、血壓及脈搏血氧飽和度，對于一般情況較差的患者同時監測有創動脈壓。
EBUS-TBNA穿刺過程及標本獲取方法如文獻所述[4]。免疫組織化學檢測使用細胞塊或穿刺組織，原發性肺腺癌、鱗癌鑒別使用CK7、TTF-1、NapsinA、PE10、P63、34βE12、CK56、CK10/13等標記物，不同病理醫師及其它疾病的鑒別診斷則按需求增加相應標記物。
采用細胞塊標本或組織標本檢測EGFR基因突變。6～10片標本切片脫蠟處理，QIAamp DNA MiniKit （Qiagen）抽提DNA，經PCR擴增EGFR基因的第18、19、20和21號外顯子基因片段，然后純化并測序（博尚生物技術有限公司，上海）。Chromas和Seqman軟件分析測序圖譜，并與GeneBank中EGFR基因序列比對，明確突變及缺失位點。
1.3 統計學分析
采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行處理，χ2檢驗分析吸煙、性別因素與EGFR基因突變的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
77例原發性肺腺癌患者EGFR基因突變檢測發現，EGFR基因突變患者31例，突變率為40.26%。19號外顯子突變14例，包括746～750密碼子雜合性缺失（E746-A750del）11例（圖 1），其中單純746～750密碼子雜合性缺失3例、合并有745密碼子同義突變8例，752～759密碼子雜合性缺失（S752-I759del）1例，746～751密碼子雜合性缺失并插入GCA及747～753密碼子雜合性缺失并插入TCG各1例；20號外顯子點突變（H773L）1例；21號外顯子點突變（L858R）13例（圖 2）；18號外顯子點突變（G719A）與20號外顯子點突變（S768I）同時存在1例；18號外顯子點突變（S720F）與21號外顯子點突變（L858R）同時存在1例；18號外顯子點突變（E709K及G719A）合并21號外顯子點突變（L858R）1例。
圖1
表皮生長因子受體（EGFR）基因19外顯子測序圖譜
注：A：EGFR基因19號外顯子野生型測序圖譜（紅色細箭頭為突變時缺失堿基），B：EGFR基因19外顯子編碼746~750氨基酸的讀碼框缺失（紅色粗箭頭為編碼第746位谷氨酸至第750位丙氨酸密碼子缺失部位）
圖2
EGFR基因21號外顯子測序圖譜
注：A：EGFR基因21號外顯子野生型測序圖譜，B：EGFR基因21號外顯子第858位密碼子出現了T→G轉換，引起EGFR蛋白該位點的氨基酸由亮氨酸轉變成精氨酸（簡稱L858R，紅色箭頭）
本組EGFR基因突變患者性別差異無統計學意義（P=0.088）；與吸煙的患者相比較，不吸煙的患者EGFR基因突變率較高，差異有統計學意義（P=0.032）。見表 1。
表1
患者臨床資料及EGFR基因突變（例）
3 討論
目前，肺癌的個體化、規范化、多學科綜合治療模式已成為共識。在制定合適的治療方案前，必須獲取腫瘤的準確信息，如病理學分型、臨床分期、腫瘤細胞的分子生物學特點等，而腫瘤組織標本是獲取腫瘤信息的主要及重要來源。肺癌發病隱匿，大部分患者確診肺癌時已是疾病晚期，對于此類無法通過手術獲取腫瘤組織標本的晚期肺癌患者，支氣管鏡活檢，經皮肺穿刺及胸腔積液等是獲取標本的常用方法，而對于縱隔淋巴結轉移或是病變鄰近大氣道的患者，EBUS-TBNA術是取得細胞學和組織學標本的較好手段。
2003年國外學者[5-6]通過大規模臨床試驗證實，使用酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼）治療晚期非小細胞肺癌可以獲得較好療效，2004年兩組學者[7-8]進一步研究發現吉非替尼治療的有效率與EGFR基因突變明顯相關，此后Shepherd[9]報導使用另一酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼也可以延長一、二線化療失敗的非小細胞肺癌患者生存時間。而Krawczyk等[10]應用厄洛替尼作為二線和三線藥物治療非小細胞肺癌患者時發現EGFR基因沒有突變是疾病進展的最大危險因素。最近又有研究發現[11]，作為一線治療方案，隨機選擇erbB受體家族抑制劑阿法替尼或是化療藥物吉西他濱聯合順鉑治療存在EGFR基因突變的亞裔晚期非小細胞肺癌患者，兩組相比較，阿法替尼治療組中位無進展生存期明顯高于吉西他濱聯合順鉑治療組，而與治療相關嚴重不良事件的發生率阿法替尼治療組要低于吉西他濱聯合順鉑治療組。綜合文獻中大量數據，EGFR基因突變信息對于治療晚期非小細胞肺癌重要性是不言而喻的。
在2011年2月國際肺癌研究學會、美國胸科學會、歐洲呼吸學會聯合于《胸部腫瘤學雜志》上公布了關于肺腺癌的國際多學科分類新標準[12]之前，本研究中部分非小細胞肺癌患者活檢標本僅為形態學診斷而未經免疫組織化學檢查進一步準確分類，同時，由于細針穿刺獲取組織有限，部分患者所取組織無法完成免疫組織化學檢測或是EGFR基因突變檢測，還有小部分患者因無法承擔后期靶向治療藥物費用而未行EGFR基因突變檢測。本組所有77例肺腺癌患者標本均經細胞學和/或組織學HE染色形態學診斷且同時經免疫組織化學確診并行EGFR基因突變檢測。
近年來，越來越多的研究者發現，通過EBUS-TBNA微創穿刺方法獲取的肺癌患者腫瘤標本進行分子病理學檢測是有效、可行的。Schmid-Bindert等 [13]比較了支氣管鏡活檢、EBUS-TBNA術和CT引導空心針穿刺三種微創方法，三種方法取得的標本提取腫瘤細胞RNA的量存在差異，EBUS-TBNA術與支氣管鏡活檢為[（37.74±41.09）ng vs. （13.74±15.53）ng，P=0.005]，而與CT引導空心針穿刺比較為[（37.74±41.09）ng vs. （28.72±44.27）ng，P=0.244]，他們認為EBUS-TBNA術取得的標本提取的腫瘤細胞RNA量最高。而Folch等[14]使用EBUS-TBNA術獲取的標本進行EGFR、KRAS和ALK基因突變檢測的成功率超過90%。最近，Reynolds等[15]應用等位基因特異聚合酶鏈式反應（allele specific polymerase chain reaction，ASPCR）技術可靠地檢測到EBUS-TBNA術取得的細胞學標本EGFR基因突變。他們的研究結果表明，使用微創的EBUS-TBNA獲取的非小細胞肺癌標本完全可以滿足分子病理學檢測的要求。本研究中77例原發性肺腺癌患者EBUS-TBNA獲取的標本均成功地進行了EGFR基因突變檢測。在實際操作中，就標本獲取方面我們也與國內同行達成共識，即應盡可能多地采集細胞和組織學標本[16]。
文獻報導女性、腺癌、不吸煙的肺癌患者中EGFR基因具有較高的突變率[17-18]，肺腺癌為最常見的非小細胞肺癌組織學亞型[19]，就其而言，東亞人群中EGFR基因突變率為41%～55%[20-24]。在原發性肺癌中，EGFR基因突變多見于18～21號外顯子。最常見的突變包括19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變，約占EGFR基因突變的90%[3]，以及20號外顯子編碼框重復和/或插入突變，上述三種突變約占所有EGFR基因突變的95%[25]。本研究77例肺腺癌患者中，共檢測出EGFR基因突變31例，突變率為40.26%，其中27例為EGFR基因19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變，1例為20號外顯子點突變，另3例為雙突變，分別為18號外顯子點突變與20號外顯子點突變1例，18號外顯子點突變與21號外顯子點突變2例。本研究中，EGFR基因19號外顯子和21號外顯子突變共占所有EGFR基因突變的93.55% （29/31），提示EGFR基因19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變在原發性肺腺癌EGFR基因突變中占有較高的比例。
本研究中EGFR基因突變在不吸煙的患者中具有較高比例（20/34，58.82%），與吸煙患者相比（11/43，25.58%），差異有統計學意義（P=0.032），說明吸煙與EGFR基因突變密切相關。Thu等[26]研究發現在肺腺癌患者中，不吸煙的患者基因組變化的比例要高于吸煙患者，而且在不吸煙患者中一些染色體的基因拷貝數變化更為頻繁。本組女性患者EGFR基因突變比例為（15/29，51.72%），男性為（16/48，33.33%），雖然女性患者有較高的EGFR基因突變比例，但兩者差異無統計學意義（P=0.088）。本組中縱隔淋巴結轉移的肺腺癌患者以男性居多，性別偏倚可能為其原因，OR值為2.14，女性患者EGFR基因突變發生的機率為男性的2.14倍。
總之，EBUS-TBNA術取得的標本可以用于EGFR基因突變檢測并獲得準確的基因突變信息。EGFR基因突變檢測結果可以幫助臨床醫師選擇適宜分子靶向治療的患者，針對存在EGFR基因突變的患者，可能會改變其治療模式，從而改善疾病預后使患者獲得較長的生存時間。
晚期非小細胞肺癌的治療策略包括明確非小細胞肺癌病理組織學分型及表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突變情況。對于晚期非小細胞肺癌患者來說，EGFR基因酪氨酸激酶結構域的突變是應用酪氨酸激酶抑制劑治療的可靠指標，但此類患者就醫時大多已失去通過手術獲取標本的機會，因此通過非外科手術方式獲取腫瘤組織標本檢測EGFR基因突變情況就變得非常必要。Kimura[1]曾報導采集非小細胞肺癌患者胸液進行EGFR基因突變檢測，Shih[2]與Horiike[3]也曾分別報導使用細針穿刺腫瘤及經支氣管鏡穿刺縱隔淋巴結獲取組織進行分子病理學檢測。近年來，經支氣管鏡超聲引導針吸活檢術（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration，EBUS-TBNA）在肺癌的診斷和分期中得到廣泛應用，越來越多的學者嘗試使用EBUS-TBNA術收集標本進行EGFR基因突變檢測，探索晚期非小細胞肺癌獲取標本及進行分子病理學檢測的新途徑。
本研究采用EBUS-TBNA術獲取非小細胞肺癌患者縱隔淋巴結標本，經組織或細胞塊免疫組織化學檢測明確非小細胞肺癌亞型，確診為肺腺癌者再行EGFR基因突變檢測，分析晚期肺腺癌患者EGFR基因突變情況。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2009年4月至2013年9月復旦大學附屬腫瘤醫院胸外科連續施行EBUS-TBNA術964例，經細胞學或組織學HE染色及免疫組織化學染色檢查確診為肺腺癌并行EGFR基因突變檢測患者77例，其中男48例、女29例，中位年齡61 （33～78）歲。全組患者均無重要臟器功能障礙等手術禁忌證，患者或其家屬均被告知檢查程序并簽署知情同意書。
EBUS-TBNA術所用設備包括超聲支氣管鏡（BF-UC206F-OL8，Olympus，Japan）、超聲圖像處理設備（EU-C2000，Olympus，Japan）、EBUS-TBNA專用22G穿刺活檢針（NA-201SX-4022，Olympus，Japan）及20 ml可調負壓注射器(Merit Medical Systems，Inc，South Jordan，Utah，U.S.A.)。
1.2 方法
全組患者采用靜脈全身麻醉聯合局部麻醉（保留自主呼吸）或靜脈靶控（target controlled infusion,TCI）輸注丙泊酚全身麻醉下置入喉罩機械通氣，部分患者采用氣管內插管全身麻醉。術中監測心率、血壓及脈搏血氧飽和度，對于一般情況較差的患者同時監測有創動脈壓。
EBUS-TBNA穿刺過程及標本獲取方法如文獻所述[4]。免疫組織化學檢測使用細胞塊或穿刺組織，原發性肺腺癌、鱗癌鑒別使用CK7、TTF-1、NapsinA、PE10、P63、34βE12、CK56、CK10/13等標記物，不同病理醫師及其它疾病的鑒別診斷則按需求增加相應標記物。
采用細胞塊標本或組織標本檢測EGFR基因突變。6～10片標本切片脫蠟處理，QIAamp DNA MiniKit （Qiagen）抽提DNA，經PCR擴增EGFR基因的第18、19、20和21號外顯子基因片段，然后純化并測序（博尚生物技術有限公司，上海）。Chromas和Seqman軟件分析測序圖譜，并與GeneBank中EGFR基因序列比對，明確突變及缺失位點。
1.3 統計學分析
采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行處理，χ2檢驗分析吸煙、性別因素與EGFR基因突變的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
77例原發性肺腺癌患者EGFR基因突變檢測發現，EGFR基因突變患者31例，突變率為40.26%。19號外顯子突變14例，包括746～750密碼子雜合性缺失（E746-A750del）11例（圖 1），其中單純746～750密碼子雜合性缺失3例、合并有745密碼子同義突變8例，752～759密碼子雜合性缺失（S752-I759del）1例，746～751密碼子雜合性缺失并插入GCA及747～753密碼子雜合性缺失并插入TCG各1例；20號外顯子點突變（H773L）1例；21號外顯子點突變（L858R）13例（圖 2）；18號外顯子點突變（G719A）與20號外顯子點突變（S768I）同時存在1例；18號外顯子點突變（S720F）與21號外顯子點突變（L858R）同時存在1例；18號外顯子點突變（E709K及G719A）合并21號外顯子點突變（L858R）1例。
圖1
表皮生長因子受體（EGFR）基因19外顯子測序圖譜
注：A：EGFR基因19號外顯子野生型測序圖譜（紅色細箭頭為突變時缺失堿基），B：EGFR基因19外顯子編碼746~750氨基酸的讀碼框缺失（紅色粗箭頭為編碼第746位谷氨酸至第750位丙氨酸密碼子缺失部位）
圖2
EGFR基因21號外顯子測序圖譜
注：A：EGFR基因21號外顯子野生型測序圖譜，B：EGFR基因21號外顯子第858位密碼子出現了T→G轉換，引起EGFR蛋白該位點的氨基酸由亮氨酸轉變成精氨酸（簡稱L858R，紅色箭頭）
本組EGFR基因突變患者性別差異無統計學意義（P=0.088）；與吸煙的患者相比較，不吸煙的患者EGFR基因突變率較高，差異有統計學意義（P=0.032）。見表 1。
表1
患者臨床資料及EGFR基因突變（例）
3 討論
目前，肺癌的個體化、規范化、多學科綜合治療模式已成為共識。在制定合適的治療方案前，必須獲取腫瘤的準確信息，如病理學分型、臨床分期、腫瘤細胞的分子生物學特點等，而腫瘤組織標本是獲取腫瘤信息的主要及重要來源。肺癌發病隱匿，大部分患者確診肺癌時已是疾病晚期，對于此類無法通過手術獲取腫瘤組織標本的晚期肺癌患者，支氣管鏡活檢，經皮肺穿刺及胸腔積液等是獲取標本的常用方法，而對于縱隔淋巴結轉移或是病變鄰近大氣道的患者，EBUS-TBNA術是取得細胞學和組織學標本的較好手段。
2003年國外學者[5-6]通過大規模臨床試驗證實，使用酪氨酸激酶抑制劑（吉非替尼）治療晚期非小細胞肺癌可以獲得較好療效，2004年兩組學者[7-8]進一步研究發現吉非替尼治療的有效率與EGFR基因突變明顯相關，此后Shepherd[9]報導使用另一酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼也可以延長一、二線化療失敗的非小細胞肺癌患者生存時間。而Krawczyk等[10]應用厄洛替尼作為二線和三線藥物治療非小細胞肺癌患者時發現EGFR基因沒有突變是疾病進展的最大危險因素。最近又有研究發現[11]，作為一線治療方案，隨機選擇erbB受體家族抑制劑阿法替尼或是化療藥物吉西他濱聯合順鉑治療存在EGFR基因突變的亞裔晚期非小細胞肺癌患者，兩組相比較，阿法替尼治療組中位無進展生存期明顯高于吉西他濱聯合順鉑治療組，而與治療相關嚴重不良事件的發生率阿法替尼治療組要低于吉西他濱聯合順鉑治療組。綜合文獻中大量數據，EGFR基因突變信息對于治療晚期非小細胞肺癌重要性是不言而喻的。
在2011年2月國際肺癌研究學會、美國胸科學會、歐洲呼吸學會聯合于《胸部腫瘤學雜志》上公布了關于肺腺癌的國際多學科分類新標準[12]之前，本研究中部分非小細胞肺癌患者活檢標本僅為形態學診斷而未經免疫組織化學檢查進一步準確分類，同時，由于細針穿刺獲取組織有限，部分患者所取組織無法完成免疫組織化學檢測或是EGFR基因突變檢測，還有小部分患者因無法承擔后期靶向治療藥物費用而未行EGFR基因突變檢測。本組所有77例肺腺癌患者標本均經細胞學和/或組織學HE染色形態學診斷且同時經免疫組織化學確診并行EGFR基因突變檢測。
近年來，越來越多的研究者發現，通過EBUS-TBNA微創穿刺方法獲取的肺癌患者腫瘤標本進行分子病理學檢測是有效、可行的。Schmid-Bindert等 [13]比較了支氣管鏡活檢、EBUS-TBNA術和CT引導空心針穿刺三種微創方法，三種方法取得的標本提取腫瘤細胞RNA的量存在差異，EBUS-TBNA術與支氣管鏡活檢為[（37.74±41.09）ng vs. （13.74±15.53）ng，P=0.005]，而與CT引導空心針穿刺比較為[（37.74±41.09）ng vs. （28.72±44.27）ng，P=0.244]，他們認為EBUS-TBNA術取得的標本提取的腫瘤細胞RNA量最高。而Folch等[14]使用EBUS-TBNA術獲取的標本進行EGFR、KRAS和ALK基因突變檢測的成功率超過90%。最近，Reynolds等[15]應用等位基因特異聚合酶鏈式反應（allele specific polymerase chain reaction，ASPCR）技術可靠地檢測到EBUS-TBNA術取得的細胞學標本EGFR基因突變。他們的研究結果表明，使用微創的EBUS-TBNA獲取的非小細胞肺癌標本完全可以滿足分子病理學檢測的要求。本研究中77例原發性肺腺癌患者EBUS-TBNA獲取的標本均成功地進行了EGFR基因突變檢測。在實際操作中，就標本獲取方面我們也與國內同行達成共識，即應盡可能多地采集細胞和組織學標本[16]。
文獻報導女性、腺癌、不吸煙的肺癌患者中EGFR基因具有較高的突變率[17-18]，肺腺癌為最常見的非小細胞肺癌組織學亞型[19]，就其而言，東亞人群中EGFR基因突變率為41%～55%[20-24]。在原發性肺癌中，EGFR基因突變多見于18～21號外顯子。最常見的突變包括19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變，約占EGFR基因突變的90%[3]，以及20號外顯子編碼框重復和/或插入突變，上述三種突變約占所有EGFR基因突變的95%[25]。本研究77例肺腺癌患者中，共檢測出EGFR基因突變31例，突變率為40.26%，其中27例為EGFR基因19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變，1例為20號外顯子點突變，另3例為雙突變，分別為18號外顯子點突變與20號外顯子點突變1例，18號外顯子點突變與21號外顯子點突變2例。本研究中，EGFR基因19號外顯子和21號外顯子突變共占所有EGFR基因突變的93.55% （29/31），提示EGFR基因19號外顯子的缺失突變和21號外顯子的點突變在原發性肺腺癌EGFR基因突變中占有較高的比例。
本研究中EGFR基因突變在不吸煙的患者中具有較高比例（20/34，58.82%），與吸煙患者相比（11/43，25.58%），差異有統計學意義（P=0.032），說明吸煙與EGFR基因突變密切相關。Thu等[26]研究發現在肺腺癌患者中，不吸煙的患者基因組變化的比例要高于吸煙患者，而且在不吸煙患者中一些染色體的基因拷貝數變化更為頻繁。本組女性患者EGFR基因突變比例為（15/29，51.72%），男性為（16/48，33.33%），雖然女性患者有較高的EGFR基因突變比例，但兩者差異無統計學意義（P=0.088）。本組中縱隔淋巴結轉移的肺腺癌患者以男性居多，性別偏倚可能為其原因，OR值為2.14，女性患者EGFR基因突變發生的機率為男性的2.14倍。
總之，EBUS-TBNA術取得的標本可以用于EGFR基因突變檢測并獲得準確的基因突變信息。EGFR基因突變檢測結果可以幫助臨床醫師選擇適宜分子靶向治療的患者，針對存在EGFR基因突變的患者，可能會改變其治療模式，從而改善疾病預后使患者獲得較長的生存時間。
