引用本文： 吳炳群, 柳明亮, 段新春, 崔永. 非小細胞肺癌中TS、ERCC1、TUBB3、RRM1的表達及臨床意義. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(6): 813-816. doi: 10.7507/1007-4848.20140233 復制
肺癌是全世界發病率和病死率最高的腫瘤，其中約有80%為非小細胞肺癌(NSCLC) [1-2]。化療在NSCLC的臨床治療中占有重要的地位，但化療的有效率低[3]加上毒副作用[4]使得總體療效并不樂觀，5年生存率仍很低[5-6]。近年來，隨著基因組學和蛋白質組學的發展，與化療療效相關的基因發現，結合病理分型，使得化療個體化逐步成為可能。如何制定個體化化療方案，通過輔助化療使更多患者從中獲益，以及如何降低醫療成本，成為近年來肺癌領域關注的熱點之一。2010年2月至2012年10月我院收治94例NSCLC完全切除的患者，對其腫瘤標本進行免疫組織化學法檢測，包括胸苷酸合成酶(TS)、切除修復交叉互補基因1 (ERCC1)、β微管蛋白3 (TUBB3)、核苷酸還原酶亞基1 (RRM1)基因信使核糖核酸(mRNA)表達水平，并對檢測結果進行分析，探討NSCLC個體化化療中對上述基因表達水平的檢測策略。
1 材料與方法
1.1 病例選擇
納入確診并施行腫瘤完全切除術的94例NSCLC患者，年齡42~78歲，男54例、女40例。鱗癌26例，腺癌67例，肺癌肉瘤部分鱗癌小部分腺癌1例。
1.2 方法
1.2.1 樣本采集及檢測
術中取腫瘤中心區標本，用10%甲醛固定16~24 h后，送至空軍航空醫學研究所附屬醫院分子病理中心。用免疫組織化學法檢測ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達。
1.2.2 樣本檢測的主要試劑和儀器
主要試劑：乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(pH 8.0)、RRM1一抗、tubulin β一抗、ERCC1一抗、PV6000免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)底物顯色劑、中性樹膠(北京中杉金橋生物技術有限公司)，蘇木素染液、磷酸鹽緩沖液(PBS)/三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)。
主要儀器：3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)防脫玻片(北京中杉金橋生物技術有限公司)、AS-325型石蠟切片機(華駿醫療器械有限公司)、LK-3組織切片撈烤機(航天航空部三十五所)、電熱恒溫干燥箱(天津時泰斯特儀器公司)、1820不銹鋼六保險直型高壓鍋(浙江愛仕達電器股份有限公司)、普通電冰箱(青島海爾集團)、U-b130光學顯微鏡(日本奧林巴斯)、小型培養皿(orange公司)。
1.2.3 檢測方法
檢測方法：(1)組織切片脫蠟和水化；(2)PBS液沖洗標本；(3)抗原熱修復；(4)H2O2去離子水孵育；(5)滴加單克隆抗體；(6)PBS再次沖洗；(7)滴加試劑1 (Polymer Helper，來自中杉金橋PV6000：辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體)、PBS或TBS沖洗；(8)滴加試劑2 (poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG，來自中杉金橋PV6000：辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體)、PBS或TBS沖洗；(9)DAB染色；(10)PBS或自來水沖洗；(11)蘇木精復染，自來水沖洗返藍；(12)脫水；(13)用中性樹膠封片；(14)鏡檢。
1.3 統計學分析
采用SPSS 21.0統計軟件進行統計處理，ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達數據的比較采用相關分析和卡方檢驗。
2 結果
TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達結果分析：TS基因mRNA低表達91例(96.81%)，ERCC1基因mRNA低表達90例(95.74%)；而TUBB3基因mRNA低表達59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表達48例(51.06%)。腺癌組織TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達與非腺癌組織的差異無統計學意義(P > 0.05)，但腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表達的比率明顯低于非腺癌患者(58.21% vs.74.07%)；見表 1。
表1
TS、ERCC1、TUBB3和RRM1基因mRNA的表達結果(例)
相同病理類型的NSCLC患者TS、ERCC1、TUBB3基因mRNA表達與RRM1基因mRNA表達均呈正相關(相關系數均大于0.80)；見表 2。
表2
ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達結果的相關性分析(相關系數值)
3 討論
目前NSCLC患者推薦采用輔助化療的標準為使用以鉑類為基礎和第三代抗腫瘤藥物(吉西他濱、多西他賽、長春瑞濱、紫杉醇)的兩藥聯合用藥方案[7-8]。化療在NSCLC的綜合治療中占據重要的地位。但化療有效率低，毒副作用和治療成本限制了其應用。主要由于腫瘤的異質性，同一種病理類型和分期的肺癌患者，對標準化療敏感性差異較大，因此，近年來提出針對不同患者進行個體化治療的概念，與CT引導下的射頻消融相比，后者遠期效果尚需觀察[9]。隨著對化療分子機制的認識不斷進展，目前已發現一些腫瘤分子標記物的改變與化療敏感性有關。針對不同的分子標記物制定不同的個體化化療方案對于改善NSCLC患者的生存期具有重要的意義。通過檢測TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達，來指導個體化化療方案的制定，為臨床提供了一種選擇，同時也增加了相關的成本。
TS是多靶點抗葉酸藥培美曲塞的靶酶之一[10]，培美曲賽的耐藥與其高表達相關[11]，多項研究表明，在療效和無進展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表達者明顯優于高水平表達者[12-13]，但有少數研究表明培美曲賽的耐藥與其表達無關[14]。ERCC1是核苷酸切除修復系統家族中的標志基因，是細胞存活必須的脫氧核糖核酸(DNA)修復基因，高表達的ERCC1蛋白能使停滯在細胞周期G2/M期的肺癌細胞得以迅速修復。ERCC1表達蛋白的下調可減少腫瘤細胞雙脫氧核糖核苷酸(DDP-DNA)加合物的修復[15]。多項權威研究[16-18]證實，在以順鉑為基礎的輔助化療中，低水平表達的ERCC1蛋白與患者長期生存有關。微管蛋白不僅是細胞骨架和紡錘體的主要成分，而且是紫杉醇作用的位點，與紫杉醇的獲得性耐藥密切相關[19]。Zhang等[20]對10個臨床研究的薈萃分析和Vilmar等[21]一項前瞻性臨床隨機對照研究均證實TUBB3低表達者有效率高于高表達者，低表達可以作為選擇長春瑞濱和紫杉醇化療藥物的指標。核苷酸還原酶(RR)作為一種限速酶在DNA的合成和損傷修復中必不可少，其酶的活性是細胞存活的關鍵。RRM1是核苷酸結合位點，是控制RR活性最關鍵的部分，同時也是核苷類藥物的結合位點，RRM1的表達水平與腫瘤細胞對吉西他濱耐藥密切相關[22]，已發布的數據[23-25]表明低RRM1表達水平的肺癌患者對吉西他濱治療獲益較大。
本研究通過對NSCLC患者手術切除標本ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達水平的檢測，結合病理分型，經過一系列統計學分析，發現ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達的一些規律，為臨床基因檢測策略及化療藥物選擇提供一定的幫助。TS基因mRNA低表達者91例，占96.81% (91/94)，表達水平低，在療效和無進展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表達者明顯優于高水平表達者，且在不同病理類型患者中TS基因mRNA低表達率均非常高，可在未進行TS mRNA表達水平檢測的情況下，常規選用培美曲塞作為化療藥物(即常規不檢測TS mRNA表達水平，認為其為低表達)。ERCC1基因mRNA低表達90例，占95.74% (90/94)，在以順鉑為基礎的輔助化療中，低水平表達的ERCC1蛋白與患者長期生存有關，即也可在未進行ERCC1 mRNA表達水平檢測的情況下，常規選用鉑類藥物作為化療藥物。基于上述兩基因mRNA的表達水平，對于晚期及病理獲得困難的NSCLC患者，應考慮選擇對TS、ERCC1 mRNA低水平表達敏感的藥物，即鉑類藥物和培美曲塞。TUBB3、RRM1基因mRNA低表達的患者較少，TUBB3基因mRNA低表達59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表達48例(51.06%)，低TUBB3表達可以選擇長春瑞濱和紫杉醇化療藥物，低RRM1表達的肺癌患者對吉西他濱治療獲益較大，在選擇長春瑞濱和紫杉醇及吉西他濱化療藥物前，應常規檢測TUBB3、RRM1基因mRNA表達水平。
考慮到相同病理類型NSCLC患者各個基因表達水平之間存在相關性，如TUBB3、RRM1基因mRNA為低表達，即可認為TS、ERCC1基因mRNA為低表達，但是如前兩者表達水平較高，建議檢測TS或ERCC1基因mRNA水平，為準確選擇化療藥物提供保障。在肺腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表達的比率明顯低于非腺癌患者(58.21% vs. 74.07%)，即對于非腺癌患者，無法檢測其表達水平時，推薦使用長春瑞濱和紫杉醇化療。
本研究為較初步的研究，但對指導臨床用藥，選擇合理的基因表達水平檢測，在減少和避免不必要的醫療負擔的情況下，盡量不影響個體化化療療效，有較大的臨床應用價值。但本研究結果僅是一種趨勢，且入組病例數較少，要想明確TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA在不同病理類型NSCLC患者中的表達規律，還需大樣本、多中心的研究。以此為基礎的NSCLC個體化化療是否可以真正提高患者的5年生存率則需要前瞻性、隨機臨床對照研究進一步證實。
肺癌是全世界發病率和病死率最高的腫瘤，其中約有80%為非小細胞肺癌(NSCLC) [1-2]。化療在NSCLC的臨床治療中占有重要的地位，但化療的有效率低[3]加上毒副作用[4]使得總體療效并不樂觀，5年生存率仍很低[5-6]。近年來，隨著基因組學和蛋白質組學的發展，與化療療效相關的基因發現，結合病理分型，使得化療個體化逐步成為可能。如何制定個體化化療方案，通過輔助化療使更多患者從中獲益，以及如何降低醫療成本，成為近年來肺癌領域關注的熱點之一。2010年2月至2012年10月我院收治94例NSCLC完全切除的患者，對其腫瘤標本進行免疫組織化學法檢測，包括胸苷酸合成酶(TS)、切除修復交叉互補基因1 (ERCC1)、β微管蛋白3 (TUBB3)、核苷酸還原酶亞基1 (RRM1)基因信使核糖核酸(mRNA)表達水平，并對檢測結果進行分析，探討NSCLC個體化化療中對上述基因表達水平的檢測策略。
1 材料與方法
1.1 病例選擇
納入確診并施行腫瘤完全切除術的94例NSCLC患者，年齡42~78歲，男54例、女40例。鱗癌26例，腺癌67例，肺癌肉瘤部分鱗癌小部分腺癌1例。
1.2 方法
1.2.1 樣本采集及檢測
術中取腫瘤中心區標本，用10%甲醛固定16~24 h后，送至空軍航空醫學研究所附屬醫院分子病理中心。用免疫組織化學法檢測ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達。
1.2.2 樣本檢測的主要試劑和儀器
主要試劑：乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液(pH 8.0)、RRM1一抗、tubulin β一抗、ERCC1一抗、PV6000免疫組織化學試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)底物顯色劑、中性樹膠(北京中杉金橋生物技術有限公司)，蘇木素染液、磷酸鹽緩沖液(PBS)/三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)。
主要儀器：3-氨丙基-乙氧基甲硅烷(APES)防脫玻片(北京中杉金橋生物技術有限公司)、AS-325型石蠟切片機(華駿醫療器械有限公司)、LK-3組織切片撈烤機(航天航空部三十五所)、電熱恒溫干燥箱(天津時泰斯特儀器公司)、1820不銹鋼六保險直型高壓鍋(浙江愛仕達電器股份有限公司)、普通電冰箱(青島海爾集團)、U-b130光學顯微鏡(日本奧林巴斯)、小型培養皿(orange公司)。
1.2.3 檢測方法
檢測方法：(1)組織切片脫蠟和水化；(2)PBS液沖洗標本；(3)抗原熱修復；(4)H2O2去離子水孵育；(5)滴加單克隆抗體；(6)PBS再次沖洗；(7)滴加試劑1 (Polymer Helper，來自中杉金橋PV6000：辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體)、PBS或TBS沖洗；(8)滴加試劑2 (poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG，來自中杉金橋PV6000：辣根酶標記羊抗兔/小鼠IgG多聚體)、PBS或TBS沖洗；(9)DAB染色；(10)PBS或自來水沖洗；(11)蘇木精復染，自來水沖洗返藍；(12)脫水；(13)用中性樹膠封片；(14)鏡檢。
1.3 統計學分析
采用SPSS 21.0統計軟件進行統計處理，ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達數據的比較采用相關分析和卡方檢驗。
2 結果
TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達結果分析：TS基因mRNA低表達91例(96.81%)，ERCC1基因mRNA低表達90例(95.74%)；而TUBB3基因mRNA低表達59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表達48例(51.06%)。腺癌組織TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達與非腺癌組織的差異無統計學意義(P > 0.05)，但腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表達的比率明顯低于非腺癌患者(58.21% vs.74.07%)；見表 1。
表1
TS、ERCC1、TUBB3和RRM1基因mRNA的表達結果(例)
相同病理類型的NSCLC患者TS、ERCC1、TUBB3基因mRNA表達與RRM1基因mRNA表達均呈正相關(相關系數均大于0.80)；見表 2。
表2
ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達結果的相關性分析(相關系數值)
3 討論
目前NSCLC患者推薦采用輔助化療的標準為使用以鉑類為基礎和第三代抗腫瘤藥物(吉西他濱、多西他賽、長春瑞濱、紫杉醇)的兩藥聯合用藥方案[7-8]。化療在NSCLC的綜合治療中占據重要的地位。但化療有效率低，毒副作用和治療成本限制了其應用。主要由于腫瘤的異質性，同一種病理類型和分期的肺癌患者，對標準化療敏感性差異較大，因此，近年來提出針對不同患者進行個體化治療的概念，與CT引導下的射頻消融相比，后者遠期效果尚需觀察[9]。隨著對化療分子機制的認識不斷進展，目前已發現一些腫瘤分子標記物的改變與化療敏感性有關。針對不同的分子標記物制定不同的個體化化療方案對于改善NSCLC患者的生存期具有重要的意義。通過檢測TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA表達，來指導個體化化療方案的制定，為臨床提供了一種選擇，同時也增加了相關的成本。
TS是多靶點抗葉酸藥培美曲塞的靶酶之一[10]，培美曲賽的耐藥與其高表達相關[11]，多項研究表明，在療效和無進展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表達者明顯優于高水平表達者[12-13]，但有少數研究表明培美曲賽的耐藥與其表達無關[14]。ERCC1是核苷酸切除修復系統家族中的標志基因，是細胞存活必須的脫氧核糖核酸(DNA)修復基因，高表達的ERCC1蛋白能使停滯在細胞周期G2/M期的肺癌細胞得以迅速修復。ERCC1表達蛋白的下調可減少腫瘤細胞雙脫氧核糖核苷酸(DDP-DNA)加合物的修復[15]。多項權威研究[16-18]證實，在以順鉑為基礎的輔助化療中，低水平表達的ERCC1蛋白與患者長期生存有關。微管蛋白不僅是細胞骨架和紡錘體的主要成分，而且是紫杉醇作用的位點，與紫杉醇的獲得性耐藥密切相關[19]。Zhang等[20]對10個臨床研究的薈萃分析和Vilmar等[21]一項前瞻性臨床隨機對照研究均證實TUBB3低表達者有效率高于高表達者，低表達可以作為選擇長春瑞濱和紫杉醇化療藥物的指標。核苷酸還原酶(RR)作為一種限速酶在DNA的合成和損傷修復中必不可少，其酶的活性是細胞存活的關鍵。RRM1是核苷酸結合位點，是控制RR活性最關鍵的部分，同時也是核苷類藥物的結合位點，RRM1的表達水平與腫瘤細胞對吉西他濱耐藥密切相關[22]，已發布的數據[23-25]表明低RRM1表達水平的肺癌患者對吉西他濱治療獲益較大。
本研究通過對NSCLC患者手術切除標本ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達水平的檢測，結合病理分型，經過一系列統計學分析，發現ERCC1、TS、TUBB3、RRM1基因mRNA表達的一些規律，為臨床基因檢測策略及化療藥物選擇提供一定的幫助。TS基因mRNA低表達者91例，占96.81% (91/94)，表達水平低，在療效和無進展生存期(PFS)方面，TS mRNA低水平表達者明顯優于高水平表達者，且在不同病理類型患者中TS基因mRNA低表達率均非常高，可在未進行TS mRNA表達水平檢測的情況下，常規選用培美曲塞作為化療藥物(即常規不檢測TS mRNA表達水平，認為其為低表達)。ERCC1基因mRNA低表達90例，占95.74% (90/94)，在以順鉑為基礎的輔助化療中，低水平表達的ERCC1蛋白與患者長期生存有關，即也可在未進行ERCC1 mRNA表達水平檢測的情況下，常規選用鉑類藥物作為化療藥物。基于上述兩基因mRNA的表達水平，對于晚期及病理獲得困難的NSCLC患者，應考慮選擇對TS、ERCC1 mRNA低水平表達敏感的藥物，即鉑類藥物和培美曲塞。TUBB3、RRM1基因mRNA低表達的患者較少，TUBB3基因mRNA低表達59例(62.77%)，RRM1基因mRNA低表達48例(51.06%)，低TUBB3表達可以選擇長春瑞濱和紫杉醇化療藥物，低RRM1表達的肺癌患者對吉西他濱治療獲益較大，在選擇長春瑞濱和紫杉醇及吉西他濱化療藥物前，應常規檢測TUBB3、RRM1基因mRNA表達水平。
考慮到相同病理類型NSCLC患者各個基因表達水平之間存在相關性，如TUBB3、RRM1基因mRNA為低表達，即可認為TS、ERCC1基因mRNA為低表達，但是如前兩者表達水平較高，建議檢測TS或ERCC1基因mRNA水平，為準確選擇化療藥物提供保障。在肺腺癌患者中TUBB3基因mRNA低水平表達的比率明顯低于非腺癌患者(58.21% vs. 74.07%)，即對于非腺癌患者，無法檢測其表達水平時，推薦使用長春瑞濱和紫杉醇化療。
本研究為較初步的研究，但對指導臨床用藥，選擇合理的基因表達水平檢測，在減少和避免不必要的醫療負擔的情況下，盡量不影響個體化化療療效，有較大的臨床應用價值。但本研究結果僅是一種趨勢，且入組病例數較少，要想明確TS、ERCC1、TUBB3、RRM1基因mRNA在不同病理類型NSCLC患者中的表達規律，還需大樣本、多中心的研究。以此為基礎的NSCLC個體化化療是否可以真正提高患者的5年生存率則需要前瞻性、隨機臨床對照研究進一步證實。
