微衛星（microsatellite，MS）是指以少數幾個核苷酸（多為2～4個）為單位多次串聯重復的DNA序列。肺重復癌（肺多原發癌，multiple primary lung cancer）是指一側肺或兩側肺的不同部位發生兩個或兩個以上原發癌，其組織類型相同或不同，但各腫瘤之間無從屬關系，每個腫瘤的發生有著各自獨立的成瘤因素。微衛星異常與肺重復癌的發生及發展密切相關。本文主要綜述：①微衛星的概念及產生機制；②微衛星異常；③肺重復癌的概念及分類；④微衛星對肺重復癌的早期診斷和預后治療的影響。
引用本文： 王鑫, 沈誠, 田龍, 車國衛. 微衛星與肺重復癌的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(5): 670-674. doi: 10.7507/1007-4848.20140193 復制
隨著肺癌發病率升高，肺癌手術得到推廣。患者若術后復查發現肺內新生結節或磨玻璃影，難以通過影像學結果判斷其究竟是既往肺癌的復發、轉移還是第二原發癌（肺重復癌）。但這個問題和患者的后續治療密切相關，并常使肺重復癌患者失去合理治療的機會，這種誤診對患者的身心健康產生了極大的傷害并可能危及患者生命。近年來，基因研究日漸深入，使得在亞臨床病灶狀態下診斷肺重復癌變為可能，而與肺重復癌的發生、發展、診斷有密切關系的微衛星DNA受到廣泛關注。本文對微衛星DNA與肺重復癌的研究進展進行綜述。
1 微衛星DNA
1.1 微衛星DNA的概念
微衛星DNA （微衛星，microsatellite，MS）是指以少數幾個核苷酸（多為2～4個）為單位多次串聯重復的DNA序列，又稱短串聯重復序列（short tandem repeats，STRs）、簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs）或簡單序列長度多態性（simple sequence length polymorphism） [1]。微衛星DNA廣泛分布于原核、真核生物基因組中，約占人類基因組的5%。一般由1～6個核苷酸組成的重復單元串聯排列而成，如（CA）n、（TG）n、（TTA）n、（CAG）n。在人類基因組中以兩個核苷酸組成的（CA）n重復序列最為豐富，共約50 000～100 000個，n一般為15～60次，且重復單元相同。
1.2 微衛星的多態性
1988年Weber等[2]用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的方法，鑒定了12種微衛星DNA，發現它們全部具有長度多態性。目前認為串聯重復序列的不同重復次數產生微衛星的多態性。由于微衛星等位基因的差異主要由其重復單元的重復次數決定，因此微衛星等位基因數目較大，有些位點多達數十個。微衛星呈高度多態且呈孟德爾式遺傳，變異率很低[3]。后續研究進一步證實了微衛星DNA所含有的多態性信息量大，這極大地滿足了人們對高度多態性遺傳標記的需要，能廣泛應用于人種學、動植物學、法醫學個體鑒定和親子鑒定及醫學各領域。目前已發現微衛星標記5 000多個，其數目還在不斷增加[4]，雜合性超過0.5的占93%，超過0.7的占58%；已用它們制成了迄今最完善的遺傳圖譜，成為人類基因組計劃的一個里程碑。
1.3 微衛星DNA的產生機制與功能
一般認為，重復序列的產生是遺傳復制過程中DNA滑動或有絲分裂、減數分裂期染色體的不對等交換所致。Pearson等[5]認為，三體重復的不穩定可能取決于重復序列的內容，而且不同的滑動鏈結構起著中介作用。因此，該重復序列多存在于不經嚴格選擇的基因組區域。微衛星DNA的功能至今尚不完全清楚，目前普遍認為其充當基因重組的熱點，可能與基因重排和變異、基因表達調控、維持基因組穩定等多種生命活動有關。微衛星DNA通過改變DNA結構或與特異性蛋白質結合而發揮其基因調控作用，是多態信息容量高的分子標志。
1.4 微衛星異常
腫瘤中微衛星異常主要表現為微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）和微衛星的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH） [6]。
1.4.1 微衛星不穩定性
微衛星不穩定性是指同一個體腫瘤組織與相應正常上皮細胞中微衛星DNA長度存在差異，表現為重復單元的增加或丟失。與正常組織DNA相比，存在MSI的DNA電泳時出現等位帶移動、帶強度增加或獲得額外帶型。關于MSI的產生機制，現階段認為是由于錯配修復基因的突變引起的。正常情況下，錯配修復基因通過特異性修復由DNA聚合酶造成的錯誤摻入進而保持DNA修復的真實性。錯配修復基因的缺陷導致復制后錯配修復功能喪失，進而增加細胞自發突變的頻率使細胞出現所謂的突變子表型。突變子表型被認為是多步癌變過程所需的多個突變子的總和。最為常見的突變子表型為微衛星的復制錯誤，即出現所謂的粗面內質網（rough endoplasmic reticulum，RER），而后者成為MSI的基礎。微衛星不穩定所形成的錯配核苷酸經過一輪DNA復制和細胞分裂后被保留在基因組中，MSI導致基因組中其它基因不穩定，即出現基因組不穩定性。研究發現在胃癌、肺癌等疾病中均有不同程度的MSI出現，故MSI被認為是腫瘤性疾病中普遍存在的現象。
1.4.2 微衛星的雜合性缺失
微衛星的雜合性缺失是指同一個體的正常細胞DNA中存在兩個等位基因，而其腫瘤組織DNA中一個等位基因消失，這種改變稱為雜合性缺失（LOH）。在DNA電泳時LOH表現為多態性條帶的缺失或帶強度減弱。LOH產生原因是腫瘤細胞單條染色體中一個等位基因缺失。微衛星的缺失是相應區域DNA缺失的標志。由于許多微衛星都與基因緊密連鎖甚至位于基因內部，因此LOH常表示其連鎖基因的缺失。
2 肺重復癌
肺重復癌（dual primary bronchogenic carcinoma）是指一側肺或兩側肺的不同部位發生兩個或兩個以上原發癌，其組織類型相同或不同，但各腫瘤之間無從屬關系。在臨床上肺重復癌也稱為多原發性肺癌。根據腫瘤發生時間可分為兩種：同時性和異時性。
2.1 同時性肺重復癌
現在應用較多的是2003年Detterbeck等[7]在總結Warrant Gates和Martini標準的基礎上推薦的新標準，同時性肺重復癌診斷標準為： （1）腫瘤大體檢查見兩個或兩個以上腫瘤之間有明顯差異并相互分開； （2）腫瘤的組織學檢查發現有以下特點：①腫瘤的組織學類型不同；②腫瘤的組織學類型相同，但腫瘤位于不同的肺段、肺葉或肺，同時滿足以下條件：腫瘤起源于原位癌；二者共有的淋巴管內無癌細胞；患者在進行診斷時無肺外轉移。
2.2 異時性肺重復癌
異時性肺重復癌的組織細胞類型可以相同，也可以不同。主要包括以下幾個特點： （1）患者的無瘤間隔時間至少在2年以上； （2）腫瘤起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）； （3）第2個腫瘤在不同的肺葉或肺，必須滿足二者共有的淋巴管內無癌細胞且患者在進行診斷時無肺外轉移。
3 微衛星與肺重復癌
近來研究發現，肺癌患者手術治療后發生肺重復癌的風險相對較高，肺重復癌發病率有升高的趨勢。最初臨床上根據影像學資料將肺部出現的第2個腫瘤作為轉移癌處理，然而Osaki等[8]提出這些被診斷為轉移癌的肺腫瘤也表現為孤立的腫塊，其可能是一個異時性的原發性肺癌。而對于同一肺葉內同時出現的多個病灶，影像學及傳統的組織病理學診斷方法不能準確地區分腫塊是肺癌的轉移灶還是同時性肺重復癌[9]。
肺癌的發生、發展過程中有多種復雜遺傳學和表觀遺傳學改變逐步發生，常常涉及等位基因缺失、染色體不穩定和不平衡、抑癌基因和原癌基因的突變[10]。在蛋白質層面上，Ono等[11]通過檢測癌相關蛋白表達的改變來區分肺重復癌及轉移癌；在DNA層面上，Garnis[12]通過基因芯片技術對肺鱗癌和腺癌細胞系進行高分辨率全基因組分析，發現其常出現5p、7號染色體、8q、11q13、19q和20q的區域性擴增，也常出現3p、4q、9p、10p、10q及18和21號染色體某些區域的缺失。基于此，相關研究提示可以從分子層面尋找對肺重復癌與轉移癌起到真正鑒別作用的方法。與此同時，和肺癌的發生、發展、診斷有密切關系的微衛星DNA引起了大家的高度關注[13]。
3.1 微衛星異常與肺重復癌的早期診斷
3.1.1 以基因點突變
為檢測靶點Reichel等[14]發現，位于17p染色體上的p53在腫瘤發生時出現了典型突變。在他們所研究的78%的樣本中，每一對樣本，即肺癌原發灶與轉移灶，都在p53上表現為相同的點突變，這說明p53的突變可以作為肺癌發生及轉移過程的一個早期診斷的指標；Chung [15]和Gasparotto等[16]都提出，當同一患者的兩個腫塊上都檢測到p53出現相同點突變時，可說明第二個腫塊與原發灶是轉移的關系；相反，若兩個腫塊的p53檢測表現出不同的點突變，則說明兩個腫塊之間沒有關系，是相互獨立的[17-19]。除了p53基因，K-ras基因也可作為檢測靶點輔助肺重復癌的鑒別診斷[20-21]。Wu等 [22]結合檢測腫瘤的EGFR基因和p53基因突變情況使其對肺重復癌的檢出率達到了77.3% （75/97）。然而使用點突變鑒別原發癌和轉移癌存在局限性，隨著腫瘤細胞的進展、演進，其基因也可呈現出新突變。例如，臨床上常見的易瑞沙獲得性耐藥現象，約52%是因為T790M出現新突變[23]。
3.1.2 以微衛星變化
為檢測靶點Geurts等[24]提出，通過檢測微衛星的雜合性缺失來說明肺部腫瘤之間的關系。他們應用12個微衛星標記檢測了44例患者的LOH，同時評價患者臨床評分，并比較二者鑒別頭頸部癌灶與肺部癌灶是轉移癌還是肺重復癌的情況。結果在用臨床評分鑒別時轉移癌為38例，肺重復癌為6例；而應用LOH分析時轉移癌為19例，肺重復癌為24例（另有1例LOH分析未得出結論）。近50%的患者通過LOH檢測方法都診斷為肺重復癌，這些患者因此可以進行手術治療。這表明微衛星的雜合性缺失可以作為肺重復癌早期診斷的一個方法。
然而，Mercer等[25]提出，雖然這個方法可以有效地區別腫瘤之間的關系，但是它的不足之處在于試驗時必須以正常組織作為對照。這種方法在通過細針穿刺活組織檢查獲得腫瘤組織時不太適用。因此，通過比較兩個癌灶之間的等位基因變化，他們發現轉移癌和肺重復癌的微衛星改變有著各自特異的變化趨勢，而這些不同的變化趨勢可以幫助鑒別診斷肺重復癌。Mercer等[25]選擇了20個微衛星標記，10例患者臨床病理診斷為肺重復癌，1例患者臨床病理診斷為肺轉移癌。10例肺重復癌患者中等位基因變化陽性率為10%～80%。在肺轉移癌中，所有的微衛星標記都與原發灶中的等位基因變化一致，均為原發灶中等位基因的變化多于轉移灶。而在肺重復癌中，原發癌灶與第二個癌灶之間有獨立的等位基因變化趨勢，即同時出現原發灶的某些等位基因變化多于第二個癌灶以及第二個癌灶的某些等位基因變化多于原發灶。這種判定方法既不用依賴于收集正常組織，又能在肺重復癌的早期診斷中發揮重要作用。Mercer的研究方法雖然對鑒別肺重復癌提供了良好的方案，但其涉及的患者均為肺鱗癌，且病例數較少，其方法是否適用于所有非小細胞肺癌仍待驗證。
Shen等 [26]在此基礎上增加病例數，結合位點的敏感性，篩選了其中6組位點（D2S1363，D6S1056，D7S1824，D10S1239，D15S822，D22S689），將肺腺癌及肺鱗癌患者同時納入研究，進一步驗證肺內多癌灶間的微衛星關系，此外通過比較不同病理類型與同病理類型的肺內多癌灶的微衛星變化，有效地鑒別了同時性肺內多癌灶是轉移所致還是多原發性肺癌。
3.2 微衛星異常與肺重復癌的預后診斷
微衛星DNA不僅可以很好地用于肺癌的早期基因診斷，而且由于分化低、進展快、分期晚的肺癌病理組織的LOH和MSI的陽性率更高，提示微衛星異常有判斷預后的意義。
Huang等[27]應用12個微衛星標記檢測6例肺轉移癌患者和9例肺重復癌患者中LOH情況。結果6例轉移癌患者原發灶和轉移灶有相同的LOH，同時隨著癌灶分化越低，分期越晚，LOH陽性率越高。這種趨勢提示區分轉移癌和肺重復癌以及肺重復癌的同時性與異時性對患者的治療和預后有重要意義，這個結果與Deschamps等[28]的研究相似。Deschamps等[28]選擇了80例肺重復癌患者進行預后研究，其中同時性肺重復癌36例，異時性肺重復癌44例。44例異時性肺重復癌患者第一次癌灶切除術后5年生存率與10年生存率分別為55.2%和27.0%，第二次癌灶切除術后5年生存率與10年生存率分別為41.0%和31.5%。而36例同時性肺重復癌患者癌灶切除術后5年生存率和10年生存率較異時性肺重復癌患者明顯降低，分別為15.7%和13.8%。由此可見，微衛星異常及其鑒別原發性肺癌與第二個癌灶關系所產生的對治療選擇和預后的影響有重要意義[29]。
3.3 外周血游離DNA的微衛星異常與肺重復癌
通過獲取肺癌組織行微衛星檢測不能完全滿足臨床需要，是否能通過血液學檢測了解微衛星的改變從而判斷肺重復癌、評估預后、監測病情變化？早在1977年，就有研究發現腫瘤患者的游離DNA濃度高于健康對照人群[30]。盡管血液中腫瘤相關游離DNA產生的具體機制仍未詳細闡明，但是很多研究提示通過抽血檢測腫瘤相關DNA可以實現早期診斷、評估預后、發現腫瘤亞臨床復發、甚至檢測到表皮生長因子受體（EGFR）基因的突變情況[31-34]。Beau-Faller等[35]選擇了12個位點進行檢測，34例肺癌患者（包括小細胞和非小細胞肺癌）中有30例可以通過血漿DNA檢測到微衛星不穩定性，其發生微衛星不穩定的位點常常不固定，分析數據發現檢測到D9S171和D9S179微衛星不穩定性的患者總體生存期明顯少于未檢測到的患者。對于小細胞肺癌，位于3p、17p13的微衛星位點敏感性較高；對于非小細胞肺癌，位于染色體5q、9p、9q和20q的位點則更加敏感。血漿與腫瘤組織中的微衛星改變通常較為一致，尤其隨著定量PCR的普遍使用，血漿中微量的DNA也可被敏感地測定[35-36]。眾所周知，腫瘤細胞存在異質性，一些研究發現了這樣的現象，同一患者的血漿DNA可以檢測到微衛星改變，而在腫瘤樣本中卻沒有，這種概率常常小于10% [31, 35-38]，目前認為這個現象是取材誤差所致，主要見于細針穿刺、刷片取得的少量腫瘤細胞，不能代表腫瘤整體，這個誤差可以通過增加取材樣本數量、多點取材來避免。
結合Mercer與Shen的研究，提示我們或許可以使用血漿游離DNA檢測微衛星來幫助鑒別肺重復癌與轉移癌。其可行性基于，一方面血液和腫瘤組織的變化較為一致，對于既往癌癥術后患者隨訪見肺內新生物，可抽血檢查微衛星情況，同時與手術標本進行微衛星比較，若血漿微衛星PCR見新的微衛星改變則考慮肺內新生物為第二原發癌；另一方面，對于同時性肺內多結節患者，可通過穿刺、纖維支氣管鏡獲得至少一個結節的標本，并抽取血液樣本，同時行微衛星PCR進行比較以幫助診斷。由于腫瘤內部異質性的存在，對抽血檢查的特異性存在一定影響，其臨床意義有待更多研究驗證。
4 現存問題與展望
雖然Mercer與Shen的微衛星DNA序列分析應用于臨床仍存在一些問題，比如分析位點的選擇與腫瘤生物學特性密切相關，因此位點的選擇對檢測的敏感性、特異性有重要影響，但隨著微衛星DNA檢測技術的漸趨完備，如能通過基因芯片篩查驗證更好的位點，微衛星異常分析在基因診斷領域有可能成為腫瘤早期診斷及預后判斷的有效手段。
配合特異性的微衛星檢測，血漿中的游離DNA將成為有相當應用前景的檢測途徑，然而血漿游離DNA因其產生機制機理仍未完全闡明，較大片段DNA（>200～300 bp）常常無法成功進行PCR[35, 37]，更適合于血液標本的微衛星位點還需更多研究探索驗證，但其具有無創、早期、快速等優點，可達到早期診斷、早期治療、最終提高肺重復癌患者存活率的目的；此外，按目前診療方案不適合手術的肺重復癌患者或許可通過檢測血漿游離DNA這種無創檢測方法，得到更可靠的診斷，減少肺重復癌的誤診誤治。
隨著肺癌發病率升高，肺癌手術得到推廣。患者若術后復查發現肺內新生結節或磨玻璃影，難以通過影像學結果判斷其究竟是既往肺癌的復發、轉移還是第二原發癌（肺重復癌）。但這個問題和患者的后續治療密切相關，并常使肺重復癌患者失去合理治療的機會，這種誤診對患者的身心健康產生了極大的傷害并可能危及患者生命。近年來，基因研究日漸深入，使得在亞臨床病灶狀態下診斷肺重復癌變為可能，而與肺重復癌的發生、發展、診斷有密切關系的微衛星DNA受到廣泛關注。本文對微衛星DNA與肺重復癌的研究進展進行綜述。
1 微衛星DNA
1.1 微衛星DNA的概念
微衛星DNA （微衛星，microsatellite，MS）是指以少數幾個核苷酸（多為2～4個）為單位多次串聯重復的DNA序列，又稱短串聯重復序列（short tandem repeats，STRs）、簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs）或簡單序列長度多態性（simple sequence length polymorphism） [1]。微衛星DNA廣泛分布于原核、真核生物基因組中，約占人類基因組的5%。一般由1～6個核苷酸組成的重復單元串聯排列而成，如（CA）n、（TG）n、（TTA）n、（CAG）n。在人類基因組中以兩個核苷酸組成的（CA）n重復序列最為豐富，共約50 000～100 000個，n一般為15～60次，且重復單元相同。
1.2 微衛星的多態性
1988年Weber等[2]用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增的方法，鑒定了12種微衛星DNA，發現它們全部具有長度多態性。目前認為串聯重復序列的不同重復次數產生微衛星的多態性。由于微衛星等位基因的差異主要由其重復單元的重復次數決定，因此微衛星等位基因數目較大，有些位點多達數十個。微衛星呈高度多態且呈孟德爾式遺傳，變異率很低[3]。后續研究進一步證實了微衛星DNA所含有的多態性信息量大，這極大地滿足了人們對高度多態性遺傳標記的需要，能廣泛應用于人種學、動植物學、法醫學個體鑒定和親子鑒定及醫學各領域。目前已發現微衛星標記5 000多個，其數目還在不斷增加[4]，雜合性超過0.5的占93%，超過0.7的占58%；已用它們制成了迄今最完善的遺傳圖譜，成為人類基因組計劃的一個里程碑。
1.3 微衛星DNA的產生機制與功能
一般認為，重復序列的產生是遺傳復制過程中DNA滑動或有絲分裂、減數分裂期染色體的不對等交換所致。Pearson等[5]認為，三體重復的不穩定可能取決于重復序列的內容，而且不同的滑動鏈結構起著中介作用。因此，該重復序列多存在于不經嚴格選擇的基因組區域。微衛星DNA的功能至今尚不完全清楚，目前普遍認為其充當基因重組的熱點，可能與基因重排和變異、基因表達調控、維持基因組穩定等多種生命活動有關。微衛星DNA通過改變DNA結構或與特異性蛋白質結合而發揮其基因調控作用，是多態信息容量高的分子標志。
1.4 微衛星異常
腫瘤中微衛星異常主要表現為微衛星不穩定性（microsatellite instability，MSI）和微衛星的雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH） [6]。
1.4.1 微衛星不穩定性
微衛星不穩定性是指同一個體腫瘤組織與相應正常上皮細胞中微衛星DNA長度存在差異，表現為重復單元的增加或丟失。與正常組織DNA相比，存在MSI的DNA電泳時出現等位帶移動、帶強度增加或獲得額外帶型。關于MSI的產生機制，現階段認為是由于錯配修復基因的突變引起的。正常情況下，錯配修復基因通過特異性修復由DNA聚合酶造成的錯誤摻入進而保持DNA修復的真實性。錯配修復基因的缺陷導致復制后錯配修復功能喪失，進而增加細胞自發突變的頻率使細胞出現所謂的突變子表型。突變子表型被認為是多步癌變過程所需的多個突變子的總和。最為常見的突變子表型為微衛星的復制錯誤，即出現所謂的粗面內質網（rough endoplasmic reticulum，RER），而后者成為MSI的基礎。微衛星不穩定所形成的錯配核苷酸經過一輪DNA復制和細胞分裂后被保留在基因組中，MSI導致基因組中其它基因不穩定，即出現基因組不穩定性。研究發現在胃癌、肺癌等疾病中均有不同程度的MSI出現，故MSI被認為是腫瘤性疾病中普遍存在的現象。
1.4.2 微衛星的雜合性缺失
微衛星的雜合性缺失是指同一個體的正常細胞DNA中存在兩個等位基因，而其腫瘤組織DNA中一個等位基因消失，這種改變稱為雜合性缺失（LOH）。在DNA電泳時LOH表現為多態性條帶的缺失或帶強度減弱。LOH產生原因是腫瘤細胞單條染色體中一個等位基因缺失。微衛星的缺失是相應區域DNA缺失的標志。由于許多微衛星都與基因緊密連鎖甚至位于基因內部，因此LOH常表示其連鎖基因的缺失。
2 肺重復癌
肺重復癌（dual primary bronchogenic carcinoma）是指一側肺或兩側肺的不同部位發生兩個或兩個以上原發癌，其組織類型相同或不同，但各腫瘤之間無從屬關系。在臨床上肺重復癌也稱為多原發性肺癌。根據腫瘤發生時間可分為兩種：同時性和異時性。
2.1 同時性肺重復癌
現在應用較多的是2003年Detterbeck等[7]在總結Warrant Gates和Martini標準的基礎上推薦的新標準，同時性肺重復癌診斷標準為： （1）腫瘤大體檢查見兩個或兩個以上腫瘤之間有明顯差異并相互分開； （2）腫瘤的組織學檢查發現有以下特點：①腫瘤的組織學類型不同；②腫瘤的組織學類型相同，但腫瘤位于不同的肺段、肺葉或肺，同時滿足以下條件：腫瘤起源于原位癌；二者共有的淋巴管內無癌細胞；患者在進行診斷時無肺外轉移。
2.2 異時性肺重復癌
異時性肺重復癌的組織細胞類型可以相同，也可以不同。主要包括以下幾個特點： （1）患者的無瘤間隔時間至少在2年以上； （2）腫瘤起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）； （3）第2個腫瘤在不同的肺葉或肺，必須滿足二者共有的淋巴管內無癌細胞且患者在進行診斷時無肺外轉移。
3 微衛星與肺重復癌
近來研究發現，肺癌患者手術治療后發生肺重復癌的風險相對較高，肺重復癌發病率有升高的趨勢。最初臨床上根據影像學資料將肺部出現的第2個腫瘤作為轉移癌處理，然而Osaki等[8]提出這些被診斷為轉移癌的肺腫瘤也表現為孤立的腫塊，其可能是一個異時性的原發性肺癌。而對于同一肺葉內同時出現的多個病灶，影像學及傳統的組織病理學診斷方法不能準確地區分腫塊是肺癌的轉移灶還是同時性肺重復癌[9]。
肺癌的發生、發展過程中有多種復雜遺傳學和表觀遺傳學改變逐步發生，常常涉及等位基因缺失、染色體不穩定和不平衡、抑癌基因和原癌基因的突變[10]。在蛋白質層面上，Ono等[11]通過檢測癌相關蛋白表達的改變來區分肺重復癌及轉移癌；在DNA層面上，Garnis[12]通過基因芯片技術對肺鱗癌和腺癌細胞系進行高分辨率全基因組分析，發現其常出現5p、7號染色體、8q、11q13、19q和20q的區域性擴增，也常出現3p、4q、9p、10p、10q及18和21號染色體某些區域的缺失。基于此，相關研究提示可以從分子層面尋找對肺重復癌與轉移癌起到真正鑒別作用的方法。與此同時，和肺癌的發生、發展、診斷有密切關系的微衛星DNA引起了大家的高度關注[13]。
3.1 微衛星異常與肺重復癌的早期診斷
3.1.1 以基因點突變
為檢測靶點Reichel等[14]發現，位于17p染色體上的p53在腫瘤發生時出現了典型突變。在他們所研究的78%的樣本中，每一對樣本，即肺癌原發灶與轉移灶，都在p53上表現為相同的點突變，這說明p53的突變可以作為肺癌發生及轉移過程的一個早期診斷的指標；Chung [15]和Gasparotto等[16]都提出，當同一患者的兩個腫塊上都檢測到p53出現相同點突變時，可說明第二個腫塊與原發灶是轉移的關系；相反，若兩個腫塊的p53檢測表現出不同的點突變，則說明兩個腫塊之間沒有關系，是相互獨立的[17-19]。除了p53基因，K-ras基因也可作為檢測靶點輔助肺重復癌的鑒別診斷[20-21]。Wu等 [22]結合檢測腫瘤的EGFR基因和p53基因突變情況使其對肺重復癌的檢出率達到了77.3% （75/97）。然而使用點突變鑒別原發癌和轉移癌存在局限性，隨著腫瘤細胞的進展、演進，其基因也可呈現出新突變。例如，臨床上常見的易瑞沙獲得性耐藥現象，約52%是因為T790M出現新突變[23]。
3.1.2 以微衛星變化
為檢測靶點Geurts等[24]提出，通過檢測微衛星的雜合性缺失來說明肺部腫瘤之間的關系。他們應用12個微衛星標記檢測了44例患者的LOH，同時評價患者臨床評分，并比較二者鑒別頭頸部癌灶與肺部癌灶是轉移癌還是肺重復癌的情況。結果在用臨床評分鑒別時轉移癌為38例，肺重復癌為6例；而應用LOH分析時轉移癌為19例，肺重復癌為24例（另有1例LOH分析未得出結論）。近50%的患者通過LOH檢測方法都診斷為肺重復癌，這些患者因此可以進行手術治療。這表明微衛星的雜合性缺失可以作為肺重復癌早期診斷的一個方法。
然而，Mercer等[25]提出，雖然這個方法可以有效地區別腫瘤之間的關系，但是它的不足之處在于試驗時必須以正常組織作為對照。這種方法在通過細針穿刺活組織檢查獲得腫瘤組織時不太適用。因此，通過比較兩個癌灶之間的等位基因變化，他們發現轉移癌和肺重復癌的微衛星改變有著各自特異的變化趨勢，而這些不同的變化趨勢可以幫助鑒別診斷肺重復癌。Mercer等[25]選擇了20個微衛星標記，10例患者臨床病理診斷為肺重復癌，1例患者臨床病理診斷為肺轉移癌。10例肺重復癌患者中等位基因變化陽性率為10%～80%。在肺轉移癌中，所有的微衛星標記都與原發灶中的等位基因變化一致，均為原發灶中等位基因的變化多于轉移灶。而在肺重復癌中，原發癌灶與第二個癌灶之間有獨立的等位基因變化趨勢，即同時出現原發灶的某些等位基因變化多于第二個癌灶以及第二個癌灶的某些等位基因變化多于原發灶。這種判定方法既不用依賴于收集正常組織，又能在肺重復癌的早期診斷中發揮重要作用。Mercer的研究方法雖然對鑒別肺重復癌提供了良好的方案，但其涉及的患者均為肺鱗癌，且病例數較少，其方法是否適用于所有非小細胞肺癌仍待驗證。
Shen等 [26]在此基礎上增加病例數，結合位點的敏感性，篩選了其中6組位點（D2S1363，D6S1056，D7S1824，D10S1239，D15S822，D22S689），將肺腺癌及肺鱗癌患者同時納入研究，進一步驗證肺內多癌灶間的微衛星關系，此外通過比較不同病理類型與同病理類型的肺內多癌灶的微衛星變化，有效地鑒別了同時性肺內多癌灶是轉移所致還是多原發性肺癌。
3.2 微衛星異常與肺重復癌的預后診斷
微衛星DNA不僅可以很好地用于肺癌的早期基因診斷，而且由于分化低、進展快、分期晚的肺癌病理組織的LOH和MSI的陽性率更高，提示微衛星異常有判斷預后的意義。
Huang等[27]應用12個微衛星標記檢測6例肺轉移癌患者和9例肺重復癌患者中LOH情況。結果6例轉移癌患者原發灶和轉移灶有相同的LOH，同時隨著癌灶分化越低，分期越晚，LOH陽性率越高。這種趨勢提示區分轉移癌和肺重復癌以及肺重復癌的同時性與異時性對患者的治療和預后有重要意義，這個結果與Deschamps等[28]的研究相似。Deschamps等[28]選擇了80例肺重復癌患者進行預后研究，其中同時性肺重復癌36例，異時性肺重復癌44例。44例異時性肺重復癌患者第一次癌灶切除術后5年生存率與10年生存率分別為55.2%和27.0%，第二次癌灶切除術后5年生存率與10年生存率分別為41.0%和31.5%。而36例同時性肺重復癌患者癌灶切除術后5年生存率和10年生存率較異時性肺重復癌患者明顯降低，分別為15.7%和13.8%。由此可見，微衛星異常及其鑒別原發性肺癌與第二個癌灶關系所產生的對治療選擇和預后的影響有重要意義[29]。
3.3 外周血游離DNA的微衛星異常與肺重復癌
通過獲取肺癌組織行微衛星檢測不能完全滿足臨床需要，是否能通過血液學檢測了解微衛星的改變從而判斷肺重復癌、評估預后、監測病情變化？早在1977年，就有研究發現腫瘤患者的游離DNA濃度高于健康對照人群[30]。盡管血液中腫瘤相關游離DNA產生的具體機制仍未詳細闡明，但是很多研究提示通過抽血檢測腫瘤相關DNA可以實現早期診斷、評估預后、發現腫瘤亞臨床復發、甚至檢測到表皮生長因子受體（EGFR）基因的突變情況[31-34]。Beau-Faller等[35]選擇了12個位點進行檢測，34例肺癌患者（包括小細胞和非小細胞肺癌）中有30例可以通過血漿DNA檢測到微衛星不穩定性，其發生微衛星不穩定的位點常常不固定，分析數據發現檢測到D9S171和D9S179微衛星不穩定性的患者總體生存期明顯少于未檢測到的患者。對于小細胞肺癌，位于3p、17p13的微衛星位點敏感性較高；對于非小細胞肺癌，位于染色體5q、9p、9q和20q的位點則更加敏感。血漿與腫瘤組織中的微衛星改變通常較為一致，尤其隨著定量PCR的普遍使用，血漿中微量的DNA也可被敏感地測定[35-36]。眾所周知，腫瘤細胞存在異質性，一些研究發現了這樣的現象，同一患者的血漿DNA可以檢測到微衛星改變，而在腫瘤樣本中卻沒有，這種概率常常小于10% [31, 35-38]，目前認為這個現象是取材誤差所致，主要見于細針穿刺、刷片取得的少量腫瘤細胞，不能代表腫瘤整體，這個誤差可以通過增加取材樣本數量、多點取材來避免。
結合Mercer與Shen的研究，提示我們或許可以使用血漿游離DNA檢測微衛星來幫助鑒別肺重復癌與轉移癌。其可行性基于，一方面血液和腫瘤組織的變化較為一致，對于既往癌癥術后患者隨訪見肺內新生物，可抽血檢查微衛星情況，同時與手術標本進行微衛星比較，若血漿微衛星PCR見新的微衛星改變則考慮肺內新生物為第二原發癌；另一方面，對于同時性肺內多結節患者，可通過穿刺、纖維支氣管鏡獲得至少一個結節的標本，并抽取血液樣本，同時行微衛星PCR進行比較以幫助診斷。由于腫瘤內部異質性的存在，對抽血檢查的特異性存在一定影響，其臨床意義有待更多研究驗證。
4 現存問題與展望
雖然Mercer與Shen的微衛星DNA序列分析應用于臨床仍存在一些問題，比如分析位點的選擇與腫瘤生物學特性密切相關，因此位點的選擇對檢測的敏感性、特異性有重要影響，但隨著微衛星DNA檢測技術的漸趨完備，如能通過基因芯片篩查驗證更好的位點，微衛星異常分析在基因診斷領域有可能成為腫瘤早期診斷及預后判斷的有效手段。
配合特異性的微衛星檢測，血漿中的游離DNA將成為有相當應用前景的檢測途徑，然而血漿游離DNA因其產生機制機理仍未完全闡明，較大片段DNA（>200～300 bp）常常無法成功進行PCR[35, 37]，更適合于血液標本的微衛星位點還需更多研究探索驗證，但其具有無創、早期、快速等優點，可達到早期診斷、早期治療、最終提高肺重復癌患者存活率的目的；此外，按目前診療方案不適合手術的肺重復癌患者或許可通過檢測血漿游離DNA這種無創檢測方法，得到更可靠的診斷，減少肺重復癌的誤診誤治。