引用本文： 林海平, 曹子昂, 楊異, 葉清. 可切除肺腺癌組織中甲狀腺轉錄因子1表達與表皮生長因子受體基因突變的關系. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(4): 518-521. doi: 10.7507/1007-4848.20140146 復制
在世界范圍內，肺癌的發病率及死亡率均在惡性腫瘤中位列前茅，近年來肺腺癌的發病率不斷增高，在部分地區已超過肺鱗癌的發病率[1]。針對肺腺癌患者的分子靶向藥物一直是臨床和基礎研究的熱點。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是這類藥物的代表。眾所周知，對于表皮生長因子受體(EGFR)基因呈突變型的患者應用EGFR-TKI的有效率更高。但EGFR基因檢測較為復雜、費用較高且未納入醫保，很多學者都在關注是否有其它生化指標與EGFR基因的突變存在關系。我們在臨床工作中發現，甲狀腺轉錄因子1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)在肺腺癌組織中廣泛表達，且與腫瘤組織中EGFR的基因表型存在著聯系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2009年6月至2012年12月在上海市第六人民醫院心胸外科及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院胸外科行肺癌手術后病理證實為肺腺癌的患者67例，其中男40例、女27例，年齡37~79 (57.6±1.8)歲；術后病理分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。
1.2 檢測方法
對肺癌切除后的石蠟包埋標本進行檢測，TTF-1檢測由病理科進行。將石蠟包埋組織塊進行4 μm連續切片，采用免疫組織化學法測定腫瘤組織中TTF-1表達。染色采用Envision兩步法，以正常肺組織做陽性對照，所用試劑均購自福州邁新生物技術開發公司。以細胞核染色顯示棕黃色或棕褐色為陽性細胞，每張切片隨即觀察5個高倍視野。按陽性細胞百分比以及染色的強弱綜合計分判讀結果：陽性細胞 < 5%為0分，6%~25%為1分，26%~50%為2分， > 50%為3分；染色程度無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項指標的評分相乘，≥4分者判定為TTF-1陽性表達。
EGFR基因突變檢測：針對外顯子18及外顯子20的點突變采用直接測序法。針對外顯子19缺失及外顯子21 L858R點突變，參照Asano等[2-3]的方法，應用突變富集體聚合酶鏈反應(PCR)檢測，由上海賽安生物技術有限公司進行。EGFR基因外顯子19突變檢測使用限制性內切酶MseⅠ酶切第一輪PCR擴增產物，然后以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；得到的終產物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色觀察結果；EGFR 19突變體呈現為82~91 bp(由缺失類型決定)條帶，酶切后殘存的野生型片段為100 bp的條帶。EGFR基因外顯子21 (L858R)突變檢測使用限制性內切酶MscⅠ酶切第一輪PCR擴增產物，然后以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；第二輪PCR擴增產物再使用限制性內切酶Sau96Ⅰ酶切擴增產物，得到的終產物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色觀察結果；EGFR 21突變體呈現為99 bp條帶，酶切后殘存的野生型片段則為130 bp的條帶。
1.3 統計學分析
采用SPSS 21.0統計軟件行校正卡方(χ2)檢驗和Pearson卡方相關性分析。
2 結果
67例肺腺癌患者的腫瘤組織中，TTF-1陽性57例，陰性10例，免疫組織化學染色結果見圖 1。共有44例肺癌組織中存在EGFR基因突變，電泳結果見圖 2，其中TTF-1陽性者42例，TTF-1陰性者2例。TTF-1陽性患者中EGFR基因突變率為73.7% (42/57)，TTF-1陰性患者中EGFR基因突變率為20.0% (2/10)，兩者差異有統計學意義(χ2=8.625，P=0.003)。根據上述結果列出四格表見表 1，在本組病例中以TTF-1表達預測EGFR基因突變的敏感度為95.5% (42/44)，特異度為34.8% (8/23)，陽性預測值為73.7%，陰性預測值為80.0%。
圖1
腫瘤組織中的TTF-1表達情況：細胞核染為棕黃色或棕褐色為陽性細胞(Envision二步法染色，DAB顯色，×100倍)
圖2
EGFR基因突變檢測結果：樣本出現與陽性對照一致的二根條帶為有突變
表1
TTF-1和EGFR基因突變檢測結果(例)
3 討論
EGFR-TKI作為肺腺癌分子靶向藥物的代表，在晚期肺腺癌及化療失敗的肺腺癌患者治療中的作用已得到肯定和認同[4]。正如IPASS研究所闡明的，亞洲人群有著更高的EGFR基因突變率，對經選擇的患者應用EGFR-TKI較之鉑類藥物化療有著更好的獲益[5]。因為并非對所有患者都適用，因此如何篩選能對EGFR-TKI治療獲益的目標人群一直是學者和臨床醫師所關心的，目前通常的做法是進行EGFR基因及K-ras基因突變的檢測[6]，從而篩選出EGFR突變的患者。通常來說這一檢測費時、費力，檢測費用昂貴且未納入醫保范圍，這是限制EGFR-TKI藥物廣泛應用的瓶頸。鑒于肺癌腫瘤靶向藥物治療并不能取代術后化療，臨床上患者多是在術后復發且化療失敗的情況下才寄希望于EGFR-TKI，此時患者的經濟條件和身心狀況已不堪重負。本項研究的目的是在病理科常規進行酶標檢測的分子靶標中尋找出一種同EGFR基因突變存在關聯的指標，以期據此對EGFR基因的表型進行預測，能夠在術后早期就為患者日后的輔助治療提供方向。
查閱近年的文獻，有學者報道相當一部分EGFR基因呈突變型的肺腺癌患者中，TTF-1呈陽性表達[7-8]。在很多三級甲等醫院的病理科，TTF-1是常規的免疫組化檢測項目，用以區分肺腺癌和肺鱗癌，以及原發性肺癌和肺轉移瘤。我們通過回顧分析近年來曾進行EGFR基因檢測的67例肺腺癌術后患者，同樣發現腫瘤組織中TTF-1的表達同EGFR基因的表型存在關聯。根據本組數據統計結果，TTF-1表達對EGFR基因突變進行預測的敏感度為95.5%，陰性預測值為80.0%。法國Vallee等[9]報道了1 038例肺腺癌病例中有148例存在EGFR突變，其中TTF-1陽性者145例，而TTF-1陰性病例中僅有3例存在EGFR突變。Somaiah等[10]報道224例TTF-1陰性表達的肺腺癌患者中僅有2例發生EGFR突變，TTF-1陽性表達對EGFR突變的敏感度和特異度分別為99.1%和36.4%，有著極高的陰性預測值。就亞洲人群來看，韓國Sun等[11]報道382例肺腺癌患者中，存在EGFR突變者196例，其中92.7%的患者腫瘤組織中TTF-1呈陽性表達，作者提出亞洲人群中肺腺癌伴EGFR突變者的比例較西方人群更高，且TTF-1陽性比例極大。因此，可以根據TTF-1的免疫組織化學檢測結果來預測EGFR基因的表型[12]。我國也有學者報道了肺腺癌組織中TTF-1表達同EGFR基因突變存在關聯[13-14]。
就本次研究的結果來看，盡管差異有顯著統計學意義，但我們的病例中TTF-1的陽性率以及預測EGFR突變的敏感度要低于文獻報道，可能與本組病例數相對較少有關。此外，2011年國際肺癌研究學會、美國胸科學會等將肺腺癌分成多個亞型[15-16]，不同亞型肺腺癌的生物學行為、分子靶標表型，甚至對化療的反應都不盡相同。有學者提出不同的腺癌亞型TTF-1的表達情況及EGFR突變率亦有不同[17-18]。本組病例數量有限，目前的報道數據僅為初步結果，隨著樣本量的增加，將進行下一步的分層細化研究。
肺腺癌在胸外科可切除肺癌中占據的比例不斷增高，針對腺癌的化療及靶向治療方面的研究也不斷增多，隨著更多的分子靶標與藥物療效的規律被不斷揭示，已有腫瘤科醫師提倡肺癌術后的個體化治療。胸外科醫師在肺癌中的作用絕不僅是切除腫瘤，還需研究術后病理中的免疫組織化學結果，尋找其中的規律，為后續治療提供有價值的指導作用。最近有報道TTF-1可作為肺腺癌術后的生存期預測因子，與腫瘤無進展生存時間及總生存期相關[19-20]。我們將進一步增加樣本量，探尋深層次的規律，例如不同肺腺癌亞型之間TTF-1表達的差異以及TTF-1狀態同靶向治療效果的關系等，以期利用簡便易行，可納入醫保支付范圍的免疫組織化學指標為肺癌患者的個體化治療提供指導。
在世界范圍內，肺癌的發病率及死亡率均在惡性腫瘤中位列前茅，近年來肺腺癌的發病率不斷增高，在部分地區已超過肺鱗癌的發病率[1]。針對肺腺癌患者的分子靶向藥物一直是臨床和基礎研究的熱點。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是這類藥物的代表。眾所周知，對于表皮生長因子受體(EGFR)基因呈突變型的患者應用EGFR-TKI的有效率更高。但EGFR基因檢測較為復雜、費用較高且未納入醫保，很多學者都在關注是否有其它生化指標與EGFR基因的突變存在關系。我們在臨床工作中發現，甲狀腺轉錄因子1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)在肺腺癌組織中廣泛表達，且與腫瘤組織中EGFR的基因表型存在著聯系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
納入2009年6月至2012年12月在上海市第六人民醫院心胸外科及上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院胸外科行肺癌手術后病理證實為肺腺癌的患者67例，其中男40例、女27例，年齡37~79 (57.6±1.8)歲；術后病理分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，Ⅳ期8例。
1.2 檢測方法
對肺癌切除后的石蠟包埋標本進行檢測，TTF-1檢測由病理科進行。將石蠟包埋組織塊進行4 μm連續切片，采用免疫組織化學法測定腫瘤組織中TTF-1表達。染色采用Envision兩步法，以正常肺組織做陽性對照，所用試劑均購自福州邁新生物技術開發公司。以細胞核染色顯示棕黃色或棕褐色為陽性細胞，每張切片隨即觀察5個高倍視野。按陽性細胞百分比以及染色的強弱綜合計分判讀結果：陽性細胞 < 5%為0分，6%~25%為1分，26%~50%為2分， > 50%為3分；染色程度無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項指標的評分相乘，≥4分者判定為TTF-1陽性表達。
EGFR基因突變檢測：針對外顯子18及外顯子20的點突變采用直接測序法。針對外顯子19缺失及外顯子21 L858R點突變，參照Asano等[2-3]的方法，應用突變富集體聚合酶鏈反應(PCR)檢測，由上海賽安生物技術有限公司進行。EGFR基因外顯子19突變檢測使用限制性內切酶MseⅠ酶切第一輪PCR擴增產物，然后以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；得到的終產物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色觀察結果；EGFR 19突變體呈現為82~91 bp(由缺失類型決定)條帶，酶切后殘存的野生型片段為100 bp的條帶。EGFR基因外顯子21 (L858R)突變檢測使用限制性內切酶MscⅠ酶切第一輪PCR擴增產物，然后以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；第二輪PCR擴增產物再使用限制性內切酶Sau96Ⅰ酶切擴增產物，得到的終產物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色觀察結果；EGFR 21突變體呈現為99 bp條帶，酶切后殘存的野生型片段則為130 bp的條帶。
1.3 統計學分析
采用SPSS 21.0統計軟件行校正卡方(χ2)檢驗和Pearson卡方相關性分析。
2 結果
67例肺腺癌患者的腫瘤組織中，TTF-1陽性57例，陰性10例，免疫組織化學染色結果見圖 1。共有44例肺癌組織中存在EGFR基因突變，電泳結果見圖 2，其中TTF-1陽性者42例，TTF-1陰性者2例。TTF-1陽性患者中EGFR基因突變率為73.7% (42/57)，TTF-1陰性患者中EGFR基因突變率為20.0% (2/10)，兩者差異有統計學意義(χ2=8.625，P=0.003)。根據上述結果列出四格表見表 1，在本組病例中以TTF-1表達預測EGFR基因突變的敏感度為95.5% (42/44)，特異度為34.8% (8/23)，陽性預測值為73.7%，陰性預測值為80.0%。
圖1
腫瘤組織中的TTF-1表達情況：細胞核染為棕黃色或棕褐色為陽性細胞(Envision二步法染色，DAB顯色，×100倍)
圖2
EGFR基因突變檢測結果：樣本出現與陽性對照一致的二根條帶為有突變
表1
TTF-1和EGFR基因突變檢測結果(例)
3 討論
EGFR-TKI作為肺腺癌分子靶向藥物的代表，在晚期肺腺癌及化療失敗的肺腺癌患者治療中的作用已得到肯定和認同[4]。正如IPASS研究所闡明的，亞洲人群有著更高的EGFR基因突變率，對經選擇的患者應用EGFR-TKI較之鉑類藥物化療有著更好的獲益[5]。因為并非對所有患者都適用，因此如何篩選能對EGFR-TKI治療獲益的目標人群一直是學者和臨床醫師所關心的，目前通常的做法是進行EGFR基因及K-ras基因突變的檢測[6]，從而篩選出EGFR突變的患者。通常來說這一檢測費時、費力，檢測費用昂貴且未納入醫保范圍，這是限制EGFR-TKI藥物廣泛應用的瓶頸。鑒于肺癌腫瘤靶向藥物治療并不能取代術后化療，臨床上患者多是在術后復發且化療失敗的情況下才寄希望于EGFR-TKI，此時患者的經濟條件和身心狀況已不堪重負。本項研究的目的是在病理科常規進行酶標檢測的分子靶標中尋找出一種同EGFR基因突變存在關聯的指標，以期據此對EGFR基因的表型進行預測，能夠在術后早期就為患者日后的輔助治療提供方向。
查閱近年的文獻，有學者報道相當一部分EGFR基因呈突變型的肺腺癌患者中，TTF-1呈陽性表達[7-8]。在很多三級甲等醫院的病理科，TTF-1是常規的免疫組化檢測項目，用以區分肺腺癌和肺鱗癌，以及原發性肺癌和肺轉移瘤。我們通過回顧分析近年來曾進行EGFR基因檢測的67例肺腺癌術后患者，同樣發現腫瘤組織中TTF-1的表達同EGFR基因的表型存在關聯。根據本組數據統計結果，TTF-1表達對EGFR基因突變進行預測的敏感度為95.5%，陰性預測值為80.0%。法國Vallee等[9]報道了1 038例肺腺癌病例中有148例存在EGFR突變，其中TTF-1陽性者145例，而TTF-1陰性病例中僅有3例存在EGFR突變。Somaiah等[10]報道224例TTF-1陰性表達的肺腺癌患者中僅有2例發生EGFR突變，TTF-1陽性表達對EGFR突變的敏感度和特異度分別為99.1%和36.4%，有著極高的陰性預測值。就亞洲人群來看，韓國Sun等[11]報道382例肺腺癌患者中，存在EGFR突變者196例，其中92.7%的患者腫瘤組織中TTF-1呈陽性表達，作者提出亞洲人群中肺腺癌伴EGFR突變者的比例較西方人群更高，且TTF-1陽性比例極大。因此，可以根據TTF-1的免疫組織化學檢測結果來預測EGFR基因的表型[12]。我國也有學者報道了肺腺癌組織中TTF-1表達同EGFR基因突變存在關聯[13-14]。
就本次研究的結果來看，盡管差異有顯著統計學意義，但我們的病例中TTF-1的陽性率以及預測EGFR突變的敏感度要低于文獻報道，可能與本組病例數相對較少有關。此外，2011年國際肺癌研究學會、美國胸科學會等將肺腺癌分成多個亞型[15-16]，不同亞型肺腺癌的生物學行為、分子靶標表型，甚至對化療的反應都不盡相同。有學者提出不同的腺癌亞型TTF-1的表達情況及EGFR突變率亦有不同[17-18]。本組病例數量有限，目前的報道數據僅為初步結果，隨著樣本量的增加，將進行下一步的分層細化研究。
肺腺癌在胸外科可切除肺癌中占據的比例不斷增高，針對腺癌的化療及靶向治療方面的研究也不斷增多，隨著更多的分子靶標與藥物療效的規律被不斷揭示，已有腫瘤科醫師提倡肺癌術后的個體化治療。胸外科醫師在肺癌中的作用絕不僅是切除腫瘤，還需研究術后病理中的免疫組織化學結果，尋找其中的規律，為后續治療提供有價值的指導作用。最近有報道TTF-1可作為肺腺癌術后的生存期預測因子，與腫瘤無進展生存時間及總生存期相關[19-20]。我們將進一步增加樣本量，探尋深層次的規律，例如不同肺腺癌亞型之間TTF-1表達的差異以及TTF-1狀態同靶向治療效果的關系等，以期利用簡便易行，可納入醫保支付范圍的免疫組織化學指標為肺癌患者的個體化治療提供指導。
