引用本文： 鄭敏, 葉清, 楊成廣, 徐燁, 郭明, 徐志飛. 食管癌細胞MUC1過表達對5-氟尿嘧啶及順鉑化療效果的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(3): 394-398. doi: 10.7507/1007-4848.20140107 復制
MUCl黏蛋白（簡稱MUCl）是由MUCl基因編碼的一種高糖基化、高分子量蛋白。其對正常上皮起潤滑和保護作用，還能介導信號轉導和細胞黏附等功能。在腫瘤組織中，MUCl常出現異常表達[1]，成為腫瘤生物學治療的靶點。研究表明，MUCl在食管癌、胃腸癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達，與患者預后相關[2-4]。
食管癌是威脅人類健康的一大病癥，目前對食管癌侵襲性相關的研究較多，內容涉及MMP-9、E-Cadherin、膜聯蛋白（AnnexinA2）、COX-2蛋白等[5-8]，但對MUCl在食管癌中的作用研究較少，尤其對選擇性MUC1高表達食管癌細胞對常規化療藥物的影響報道甚少，本研究擬從體內研究MUCl過表達與穩定沉默對常規化療藥物的影響，為臨床上伴有MUCl過表達的食管癌患者的選擇性化療用藥或個體化化療用藥提供實驗參考。
1 材料與方法
1.1 材料
食管癌MUC1過表達細胞株（c-7細胞）及MUC1穩定沉默細胞株（4-9細胞）由上海交通大學醫學院細胞分化與凋亡實驗室提供；4周齡BALB/c雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；順鉑注射液購于江蘇豪森制藥有限公司，5-氟尿嘧啶注射液購于上海旭東海普藥業有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將凍存的MUC1過表達及MUC1穩定沉默食管癌細胞株進行快速復蘇，放入37℃ 5％的二氧化碳培養箱中培養。將細胞進行多次培養、消化、傳代之后，收集足夠量細胞，調整細胞濃度1×107/ml，活細胞比率>90％。
1.2.2 裸鼠移植瘤實驗
將購買的裸鼠于SPF級動物房喂養1周以上，以適應環境。將收集的細胞懸液輕輕吹打使懸液中的細胞均勻分布，室溫下取0.2 ml細胞懸液（約2×106個細胞）接種于裸鼠的左腋皮下，形成單一皮丘，避免滲漏。接種1周后，腫瘤生長至黃豆大小。
1.2.3 藥物實驗
挑選成瘤大小較均一的動物，分為對照組（MUC1穩定沉默）和試驗組（MUC1過表達），對照組和實驗組分別給予空白對照（空載，無菌生理鹽水）、順鉑、5-氟尿嘧啶處理，每個處理組各8只，第10 d開始每只裸鼠經腹腔注射給藥。給藥：順鉑按8 mg/kg的劑量于開始藥物實驗的第1 d及第7 d腹腔注射（d1，d7）；5-氟尿嘧啶按20 mg/kg的劑量于開始藥物實驗的第1至第6 d腹腔注射（d1～d6）。
1.2.4 觀察指標
（1）腫瘤體積抑瘤率及體積曲線于給藥后的第1 d開始，每3 d用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，腫瘤的體積（V）按以下公式計算：V=A×B2/2（A為腫瘤長徑；B為腫瘤短徑）。給藥后的第26 d將裸鼠處死。計算腫瘤體積抑瘤率[8]，抑瘤率=（對照組-實驗組）/對照組×100％；繪制腫瘤體積曲線，以反映腫瘤生長情況。
（2）化療藥物對體重的影響及體重曲線于給藥后的第1 d開始，每3 d用電子天平測量裸鼠體重，繪制體重曲線，以反映裸鼠化療后體重的變化情況。
（3）腫瘤壞死率及程度以往相關文獻對此項觀察報道很少，目前沒有明確的界定和規范，本實驗中通過觀察裸鼠瘤體及其浸潤皮膚的壞死深度和范圍來研究腫瘤的生長速度和對化療藥物的反應。本文中暫界定為：Ⅰ度壞死，壞死面積≤2 mm2，皮膚部分壞死，未達全程；Ⅱ度壞死，壞死面積2～5 mm2，皮膚全程壞死，未達瘤體內部；Ⅲ度壞死，壞死面積<5 mm2，皮膚全程壞死，深達瘤體內部。計算腫瘤壞死率。腫瘤壞死率=（對照組/實驗組壞死例數）/（對照組/實驗組例數）×100％。
（4）遠處轉移情況??將動物處死后迅速解剖，留取肺臟和肝臟，進行肉眼初篩，后進行組織固定，切片染色，鏡下觀察有無可疑轉移灶，統計遠處器官轉移情況。
1.3 統計學分析
所有計量資料應用Origin 8.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 化療藥物對瘤體體積影響及體積曲線
給藥后的第26 d將裸鼠處死。根據時間點（瘤細胞種植后時間）繪制MUC1過表達及穩定沉默裸鼠瘤體體積曲線（圖 1A、1B）。在MUC1穩定沉默裸鼠，與空載組相比，5-氟尿嘧啶（5-Fu）及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應。在MUC1過表達裸鼠，觀察時間結束時5-Fu腫瘤體積抑瘤率為11.7%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
圖1
不同化療藥物對MUC1過表達/穩定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響
MUC1過表達組，當不同化療藥物作用后瘤體體積兩兩比較時，在空載與順鉑組，于瘤細胞種植后的第20 d及35 d瘤體體積差異有統計學意義（P<0.05），在順鉑與5-Fu組以及空載與5-Fu組未出現差別。而在MUC1穩定沉默組，不同藥物組間兩兩比較其差異無統計學意義（P>0.05）。
考慮到不同組別之間或之內體重因素對瘤體體積的影響，同時將測得的瘤體體積用對應的裸鼠體重進行校正后再進行瘤體體積曲線分析，得出的瘤體體積/裸鼠體重曲線圖形（圖 1C、1D），其組間及組內走勢及分析結果與未校正前基本一致，但在空載與順鉑組，僅于瘤細胞種植后的第35 d瘤體體積差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 化療藥物對體重的影響及體重曲線
給藥后的第26 d將裸鼠處死。根據時間點（瘤細胞種植后時間）繪制MUC1過表達及穩定沉默裸鼠體重曲線（圖 2A、2B）。在MUC1穩定沉默組，5-Fu可以使裸鼠體重增加，順鉑組于觀察時間中期體重較空載組減少，后期增加明顯（P<0.05）。在MUC1過表達組，5-Fu可以使裸鼠體重稍有增加，而順鉑使裸鼠體重明顯減少（P<0.05），5-Fu對裸鼠體重影響小于順鉑。
圖2
不同化療藥物對MUC1過表達/穩定沉默種植瘤裸鼠體重的影響
MUC1過表達裸鼠，在空載與順鉑組，第20～29 d之間裸鼠體重差異有統計學意義（P<0.05），在5-Fu與順鉑組，第20～35 d之間裸鼠體重差異有統計學意義（P<0.05）。而在MUC1穩定沉默裸鼠，于觀察期間內各組之間體重差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3 腫瘤壞死情況
MUC1組從腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，而MUC1穩定沉默組在實驗觀察期間未見壞死。順鉑處理MUC1過表達組，未出現皮膚或腫瘤壞死，在MUC1穩定沉默組，于腫瘤種植后的第29 d出現皮膚或腫瘤壞死，但壞死程度低于同期觀察的MUC1過表達空載組。5-Fu處理MUC1過表達組后，于腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，于MUC1過表達空載組相比較，壞死出現時間及壞死程度差別不大，而在MUC1穩定沉默組，同樣于腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，壞死程度高于同期觀察的MUC1穩定沉默空載組，但于同期觀察的MUC1過表達空載組差別不大。
5-Fu組腫瘤壞死率在MUC1穩定沉默組為42.9%（腫瘤自然壞死率為0%），在MUC1過表達組為42.9%（腫瘤自然壞死率為57.2%）；順鉑組腫瘤壞死率在MUC1穩定沉默組為28.6%，在MUC1過表達組為0%。
2.4 遠處轉移情況
癌細胞接種后38 d處死動物，發現MUC1過表達空載組于肺內找到2處轉移灶，其余各組于觀察時間段內未找到轉移灶。
3 討論
MUC1粘蛋白（簡稱MUC1）是一種大分子量的糖蛋白，發現其在食管癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達，其mRNA或蛋白表達升高或異常，常常提示腫瘤侵襲轉移，且與患者的預后相關[9-13]。MUCl及其同種型表達于細胞表面，與多種細胞表面受體具有相似的結構，它們通過胞內段的酪氨酸磷酸化位點，與多種蛋白激酶相互作用，并被后者磷酸化，進而參與多種信號轉導通路[14]。
順鉑為治療多種實體瘤的一線用藥，是廣譜抗癌藥物，通過形成DDP～DNA復合物，干擾DNA復制，細胞阻滯于S期，不能進人G2/M期，增殖受抑，啟動細胞凋亡。Yim等者發現，順鉑（DDP）可以誘導子宮頸癌細胞的凋亡，其機制與下調Bc-l2、上調Fas有關[15]。研究還發現DDP可以引起食管癌細胞的凋亡，其機制與促細胞凋亡基因的Bax表達上調明顯相關[16]。本研究發現順鉑對MUCl過表達食管癌腫瘤細胞的生長呈現一定程度的抑制效應，并可促使腫瘤壞死，說明順鉑可能通過上述機制發揮作用，可作為MUCl過表達食管癌腫瘤的治療藥物，但順鉑對裸鼠體重影響較大。
5-Fu是一種廣譜抗腫瘤藥物，屬于細胞周期特異性藥物，它使DNA的合成受阻，最終抑制腫瘤細胞的增殖，使其終止于S期而死亡，廣泛應用于多種癌癥的治療，效果顯著。但是由于其對腫瘤組織的選擇性低，副作用多，具有毒性大等缺點，使其在應用上有一定的限制[17-18]。本實驗結果顯示，5-Fu對MUCl過表達食管癌種植瘤的生長有一定的抑制效果，但療效遠較順鉑低（瘤體抑瘤率11.7%；32.8%），5-Fu對化療期間裸鼠體重影響較小。
研究顯示，低濃度化療藥物比高濃度更早誘發凋亡，濃度越高，阻斷越完全，卻延長了細胞發生凋亡的時間，而未被完全阻斷的細胞很容易越過阻斷期，卻更易發生凋亡[19-20]。本實驗中發現順鉑及5-Fu在MUCl穩定沉默食管癌細胞未看到明顯的腫瘤體積抑制效應，以及MUCl過表達食管癌細胞順鉑組未出現腫瘤壞死，可能與上述機制有關，亦可能有其他機制參與，需進一步驗證。
在MUCl過表達空載組裸鼠體內可見遠處轉移，說明作為目前比較認可的一種腫瘤侵襲行為和轉移能力的一種分子標記物再次在食管癌得到證實，提示伴有MUCl過表達的食管癌細胞其侵襲和轉移能力增加；而在MUCl過表達其它組因為化療藥物的干預在實驗觀察例數范圍內未見遠處轉移，說明本研究選用的化療藥物對MUCl過表達食管癌治療有效；同時因實驗樣本量有限，對遠處轉移得出的結果有待大樣本實驗證實。
總之，通過MUCl過表達及穩定沉默食管癌細胞平臺，運用順鉑及5-Fu化療藥物進行干預，發現順鉑及5-Fu對MUCl過表達及穩定沉默食管癌細胞在腫瘤生長抑制、壞死及裸鼠體重等方面都有不同程度的影響，具體影響機制需進一步研究，兩者都可作為治療食管癌藥物，順鉑的抗癌效應可能較5-Fu更強，為臨床上食管癌腫瘤的個體化治療及化療藥物的選擇提供了實驗參考。
MUCl黏蛋白（簡稱MUCl）是由MUCl基因編碼的一種高糖基化、高分子量蛋白。其對正常上皮起潤滑和保護作用，還能介導信號轉導和細胞黏附等功能。在腫瘤組織中，MUCl常出現異常表達[1]，成為腫瘤生物學治療的靶點。研究表明，MUCl在食管癌、胃腸癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達，與患者預后相關[2-4]。
食管癌是威脅人類健康的一大病癥，目前對食管癌侵襲性相關的研究較多，內容涉及MMP-9、E-Cadherin、膜聯蛋白（AnnexinA2）、COX-2蛋白等[5-8]，但對MUCl在食管癌中的作用研究較少，尤其對選擇性MUC1高表達食管癌細胞對常規化療藥物的影響報道甚少，本研究擬從體內研究MUCl過表達與穩定沉默對常規化療藥物的影響，為臨床上伴有MUCl過表達的食管癌患者的選擇性化療用藥或個體化化療用藥提供實驗參考。
1 材料與方法
1.1 材料
食管癌MUC1過表達細胞株（c-7細胞）及MUC1穩定沉默細胞株（4-9細胞）由上海交通大學醫學院細胞分化與凋亡實驗室提供；4周齡BALB/c雌性裸鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；順鉑注射液購于江蘇豪森制藥有限公司，5-氟尿嘧啶注射液購于上海旭東海普藥業有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
將凍存的MUC1過表達及MUC1穩定沉默食管癌細胞株進行快速復蘇，放入37℃ 5％的二氧化碳培養箱中培養。將細胞進行多次培養、消化、傳代之后，收集足夠量細胞，調整細胞濃度1×107/ml，活細胞比率>90％。
1.2.2 裸鼠移植瘤實驗
將購買的裸鼠于SPF級動物房喂養1周以上，以適應環境。將收集的細胞懸液輕輕吹打使懸液中的細胞均勻分布，室溫下取0.2 ml細胞懸液（約2×106個細胞）接種于裸鼠的左腋皮下，形成單一皮丘，避免滲漏。接種1周后，腫瘤生長至黃豆大小。
1.2.3 藥物實驗
挑選成瘤大小較均一的動物，分為對照組（MUC1穩定沉默）和試驗組（MUC1過表達），對照組和實驗組分別給予空白對照（空載，無菌生理鹽水）、順鉑、5-氟尿嘧啶處理，每個處理組各8只，第10 d開始每只裸鼠經腹腔注射給藥。給藥：順鉑按8 mg/kg的劑量于開始藥物實驗的第1 d及第7 d腹腔注射（d1，d7）；5-氟尿嘧啶按20 mg/kg的劑量于開始藥物實驗的第1至第6 d腹腔注射（d1～d6）。
1.2.4 觀察指標
（1）腫瘤體積抑瘤率及體積曲線于給藥后的第1 d開始，每3 d用游標卡尺測量腫瘤長、短徑，腫瘤的體積（V）按以下公式計算：V=A×B2/2（A為腫瘤長徑；B為腫瘤短徑）。給藥后的第26 d將裸鼠處死。計算腫瘤體積抑瘤率[8]，抑瘤率=（對照組-實驗組）/對照組×100％；繪制腫瘤體積曲線，以反映腫瘤生長情況。
（2）化療藥物對體重的影響及體重曲線于給藥后的第1 d開始，每3 d用電子天平測量裸鼠體重，繪制體重曲線，以反映裸鼠化療后體重的變化情況。
（3）腫瘤壞死率及程度以往相關文獻對此項觀察報道很少，目前沒有明確的界定和規范，本實驗中通過觀察裸鼠瘤體及其浸潤皮膚的壞死深度和范圍來研究腫瘤的生長速度和對化療藥物的反應。本文中暫界定為：Ⅰ度壞死，壞死面積≤2 mm2，皮膚部分壞死，未達全程；Ⅱ度壞死，壞死面積2～5 mm2，皮膚全程壞死，未達瘤體內部；Ⅲ度壞死，壞死面積<5 mm2，皮膚全程壞死，深達瘤體內部。計算腫瘤壞死率。腫瘤壞死率=（對照組/實驗組壞死例數）/（對照組/實驗組例數）×100％。
（4）遠處轉移情況??將動物處死后迅速解剖，留取肺臟和肝臟，進行肉眼初篩，后進行組織固定，切片染色，鏡下觀察有無可疑轉移灶，統計遠處器官轉移情況。
1.3 統計學分析
所有計量資料應用Origin 8.0統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差（
2 結果
2.1 化療藥物對瘤體體積影響及體積曲線
給藥后的第26 d將裸鼠處死。根據時間點（瘤細胞種植后時間）繪制MUC1過表達及穩定沉默裸鼠瘤體體積曲線（圖 1A、1B）。在MUC1穩定沉默裸鼠，與空載組相比，5-氟尿嘧啶（5-Fu）及順鉑組均未看到明顯的腫瘤體積抑制效應。在MUC1過表達裸鼠，觀察時間結束時5-Fu腫瘤體積抑瘤率為11.7%，順鉑腫瘤體積抑瘤率為32.8%。
圖1
不同化療藥物對MUC1過表達/穩定沉默種植瘤體積及體積/體重比率的影響
MUC1過表達組，當不同化療藥物作用后瘤體體積兩兩比較時，在空載與順鉑組，于瘤細胞種植后的第20 d及35 d瘤體體積差異有統計學意義（P<0.05），在順鉑與5-Fu組以及空載與5-Fu組未出現差別。而在MUC1穩定沉默組，不同藥物組間兩兩比較其差異無統計學意義（P>0.05）。
考慮到不同組別之間或之內體重因素對瘤體體積的影響，同時將測得的瘤體體積用對應的裸鼠體重進行校正后再進行瘤體體積曲線分析，得出的瘤體體積/裸鼠體重曲線圖形（圖 1C、1D），其組間及組內走勢及分析結果與未校正前基本一致，但在空載與順鉑組，僅于瘤細胞種植后的第35 d瘤體體積差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2 化療藥物對體重的影響及體重曲線
給藥后的第26 d將裸鼠處死。根據時間點（瘤細胞種植后時間）繪制MUC1過表達及穩定沉默裸鼠體重曲線（圖 2A、2B）。在MUC1穩定沉默組，5-Fu可以使裸鼠體重增加，順鉑組于觀察時間中期體重較空載組減少，后期增加明顯（P<0.05）。在MUC1過表達組，5-Fu可以使裸鼠體重稍有增加，而順鉑使裸鼠體重明顯減少（P<0.05），5-Fu對裸鼠體重影響小于順鉑。
圖2
不同化療藥物對MUC1過表達/穩定沉默種植瘤裸鼠體重的影響
MUC1過表達裸鼠，在空載與順鉑組，第20～29 d之間裸鼠體重差異有統計學意義（P<0.05），在5-Fu與順鉑組，第20～35 d之間裸鼠體重差異有統計學意義（P<0.05）。而在MUC1穩定沉默裸鼠，于觀察期間內各組之間體重差異無統計學意義（P>0.05）。
2.3 腫瘤壞死情況
MUC1組從腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，而MUC1穩定沉默組在實驗觀察期間未見壞死。順鉑處理MUC1過表達組，未出現皮膚或腫瘤壞死，在MUC1穩定沉默組，于腫瘤種植后的第29 d出現皮膚或腫瘤壞死，但壞死程度低于同期觀察的MUC1過表達空載組。5-Fu處理MUC1過表達組后，于腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，于MUC1過表達空載組相比較，壞死出現時間及壞死程度差別不大，而在MUC1穩定沉默組，同樣于腫瘤種植后的第26 d開始出現皮膚或腫瘤壞死，壞死程度高于同期觀察的MUC1穩定沉默空載組，但于同期觀察的MUC1過表達空載組差別不大。
5-Fu組腫瘤壞死率在MUC1穩定沉默組為42.9%（腫瘤自然壞死率為0%），在MUC1過表達組為42.9%（腫瘤自然壞死率為57.2%）；順鉑組腫瘤壞死率在MUC1穩定沉默組為28.6%，在MUC1過表達組為0%。
2.4 遠處轉移情況
癌細胞接種后38 d處死動物，發現MUC1過表達空載組于肺內找到2處轉移灶，其余各組于觀察時間段內未找到轉移灶。
3 討論
MUC1粘蛋白（簡稱MUC1）是一種大分子量的糖蛋白，發現其在食管癌、胃腸癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中均有不同程度的異常表達，其mRNA或蛋白表達升高或異常，常常提示腫瘤侵襲轉移，且與患者的預后相關[9-13]。MUCl及其同種型表達于細胞表面，與多種細胞表面受體具有相似的結構，它們通過胞內段的酪氨酸磷酸化位點，與多種蛋白激酶相互作用，并被后者磷酸化，進而參與多種信號轉導通路[14]。
順鉑為治療多種實體瘤的一線用藥，是廣譜抗癌藥物，通過形成DDP～DNA復合物，干擾DNA復制，細胞阻滯于S期，不能進人G2/M期，增殖受抑，啟動細胞凋亡。Yim等者發現，順鉑（DDP）可以誘導子宮頸癌細胞的凋亡，其機制與下調Bc-l2、上調Fas有關[15]。研究還發現DDP可以引起食管癌細胞的凋亡，其機制與促細胞凋亡基因的Bax表達上調明顯相關[16]。本研究發現順鉑對MUCl過表達食管癌腫瘤細胞的生長呈現一定程度的抑制效應，并可促使腫瘤壞死，說明順鉑可能通過上述機制發揮作用，可作為MUCl過表達食管癌腫瘤的治療藥物，但順鉑對裸鼠體重影響較大。
5-Fu是一種廣譜抗腫瘤藥物，屬于細胞周期特異性藥物，它使DNA的合成受阻，最終抑制腫瘤細胞的增殖，使其終止于S期而死亡，廣泛應用于多種癌癥的治療，效果顯著。但是由于其對腫瘤組織的選擇性低，副作用多，具有毒性大等缺點，使其在應用上有一定的限制[17-18]。本實驗結果顯示，5-Fu對MUCl過表達食管癌種植瘤的生長有一定的抑制效果，但療效遠較順鉑低（瘤體抑瘤率11.7%；32.8%），5-Fu對化療期間裸鼠體重影響較小。
研究顯示，低濃度化療藥物比高濃度更早誘發凋亡，濃度越高，阻斷越完全，卻延長了細胞發生凋亡的時間，而未被完全阻斷的細胞很容易越過阻斷期，卻更易發生凋亡[19-20]。本實驗中發現順鉑及5-Fu在MUCl穩定沉默食管癌細胞未看到明顯的腫瘤體積抑制效應，以及MUCl過表達食管癌細胞順鉑組未出現腫瘤壞死，可能與上述機制有關，亦可能有其他機制參與，需進一步驗證。
在MUCl過表達空載組裸鼠體內可見遠處轉移，說明作為目前比較認可的一種腫瘤侵襲行為和轉移能力的一種分子標記物再次在食管癌得到證實，提示伴有MUCl過表達的食管癌細胞其侵襲和轉移能力增加；而在MUCl過表達其它組因為化療藥物的干預在實驗觀察例數范圍內未見遠處轉移，說明本研究選用的化療藥物對MUCl過表達食管癌治療有效；同時因實驗樣本量有限，對遠處轉移得出的結果有待大樣本實驗證實。
總之，通過MUCl過表達及穩定沉默食管癌細胞平臺，運用順鉑及5-Fu化療藥物進行干預，發現順鉑及5-Fu對MUCl過表達及穩定沉默食管癌細胞在腫瘤生長抑制、壞死及裸鼠體重等方面都有不同程度的影響，具體影響機制需進一步研究，兩者都可作為治療食管癌藥物，順鉑的抗癌效應可能較5-Fu更強，為臨床上食管癌腫瘤的個體化治療及化療藥物的選擇提供了實驗參考。
