引用本文： 趙金鵬, 矯文捷, 趙艷東, 王滋宗. CUG結合蛋白1在非小細胞肺癌中的表達及與預后的關系. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(3): 389-393. doi: 10.7507/1007-4848.20140106 復制
由于高轉移及復發率，肺癌的死亡率高居各惡性腫瘤的首位，每年大約有120萬患者死于肺癌，其中85%為非小細胞肺癌，5年生存率僅10%～15%[1-2]，因此早期診斷、治療以及預測對于非小細胞肺癌患者尤為重要[3]。CUG結合蛋白1（CUG binding protein 1，CUGBP1）是Timchenko等于1996年用特異性抗體mAb3BI克隆得到的與肌強直蛋白激酶（dystrophin myotonia protein kinase，DMPK）基因的3’-UTR（CUG）n重復序列結合的49 kDa的RNA結合蛋白[4-6]。CUGBP1是一種調節選擇性剪接、mRNA翻譯及穩定的RNA結合蛋白。CUGBP1屬于CELF/BRUNOL蛋白家族成員，不僅在胚胎及心臟發育、骨骼肌及脂肪組織分化、生殖細胞行為等方面具有重要作用，而且在腫瘤的惡化中也發揮重要的調控作用[7-9]。本研究應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及免疫組織化學技術初步檢測了57例早期非小細胞肺癌組織及相應的癌周正常組織中CUGBP1 mRNA及蛋白的表達情況，并將所有的病例隨訪3年以上，以探討CUGBP1 mRNA與非小細胞肺癌預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2009年7月至2011年4月在青島大學附屬醫院胸外科接受手術治療的57例肺癌患者，男32例，女25例；年齡43～74（60.6±8.9）歲；術后病理類型診斷明確，見表 1。所有患者術后每2個月電話隨訪1次，采用腫瘤進展時間（time to progression，TTP）作為觀察評估指標。組織學分型根據WHO標準（1981年）進行病理學檢查，并根據TNM國際分期法（UICC，1997）進行分期。臨床病理資料分析項目包括：性別、年齡、吸煙、組織學類型、T分期、N分期、TNM分期以及分化。所有患者術前均未進行放化療及激素治療。
表1
57例非小細胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表達與各臨床病理參數的關系（例）
1.2 方法
1.2.1 半定量RT-PCR
每個樣品包括癌組織及周圍正常組織，手術切除標本后立即放入液氮中保存，按照制造商說明書使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，并且使用分光光度計于260/280 nm測量光密度來確定RNA的濃度和純度。每個樣品10 ng RNA逆轉錄成cDNA，使用特定的正向及反向引物進行目的基因擴增（Master Cycler，Eppendorf，Germany），按照以下步驟進行40個循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s。CUGBP1 mRNA的相對表達量用甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）進行標準化。CUGBP1 mRNA的正向及反向引物分別為：5′-GTC-AGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-TGACTTCAAC-AGCGACACCCA-3′。GAPDH的正向及反向引物分別為：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-CA-CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。所有引物于我院中心實驗室通過反相高效液相色譜法合成及純化。所有樣品于2%瓊脂糖凝膠上分離電泳確保正確的目的基因擴增，并且每個樣品半定量值使用熒光成像掃描儀（FluoroImager scanner，Molecular Dynamics公司）測量，使用ImageQuant軟件（Molecular Dynamics公司）進行分析。
1.2.2 免疫組織化學染色
10%福爾馬林固定標本，常規石蠟包埋，3 μm厚連續切片，Abcam公司購買CUGBP1單克隆抗體，按照說明書進行測試。切片脫蠟至水，放入新配制的3% H2O2 10 min，滅活內源性酶，于10 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=6）于20 min內加熱至95 ℃，重復3次。滴加CUGBP1單克隆抗體（濃度1:200，PBS稀釋），37 ℃溫箱中孵育90 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體（PV-6000）（濃度1% 200，PBS稀釋），37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，DAB顯色3 min，蘇木精輕度復染。
1.2.3 結果判定
CUGBP1 mRNA PCR結果：取0.6作為臨界值，半定量CUGBP1 mRNA值≥0.6為陽性，否則為陰性。CUGBP1免疫組織化學染色結果：通過測量染色強度（0：不染色；1：黃色染色；2：棕黃色染色；3：褐色染色）以及染色面積（0：0%，1：0%～10%；2：10%～50%，3：50%～100%）。染色強度與染色面積的分數相乘，結果0～3為陰性，4～9為陽性。
1.3 統計學分析
采用χ2檢驗對CUGBP1 mRNA及蛋白的表達進行統計分析，COX單因素及多因素分析CUGBP1 mRNA、年齡、TNM分期對于肺癌預后的意義。所有的統計分析均采用SAS9.2軟件，P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CUGBP1 mRNA及蛋白在非小細胞肺癌的表達及與臨床病理資料的關系
57例非小細胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表達與各臨床病理參數的關系見表 1。通過半定量RT-PCR分析，肺癌組CUGBP1 mRNA的陽性表達率為63.2%，明顯高于對照組43.9%，差異具有統計學意義（χ2=4.266 6，P=0.038 9），見表 2。通過免疫組織化學分析，CUGBP1位于細胞核，肺癌組陽性表達率為66.7%，與對照組陽性率（36.8%）差異具有統計學意義（χ2=10.152 9，P=0.001 4）（表 2）。并且CUGBP1mRNA與CUGBP1同時與肺癌的TNM分期、分化密切相關。但是肺癌組織內，CUGBP1 mRNA與CUGBP1表達差異無統計學意義（Z=0.500 0，P=0.479 5）；見表 3。
表2
CUGBP1 mRNA及蛋白在非小細胞肺癌中的分布[n=57，例（%）]
表3
肺癌組CUGBP1 mRNA與蛋白表達的關系（n=57，例）
2.2 CUGBP1 mRNA及臨床病理指標與預后的關系
所有肺癌患者隨訪時間1～39個月，中位數為10個月。生存曲線（圖 1）顯示高表達CUGBP1 mRNA患者的平均術后腫瘤進展時間（TTP）為16.8個月，與低表達患者（12.4個月）相比差異具有統計學意義（χ2=7.166 5，P=0.007 4）。通過單因素及多因素生存分析得知，CUGBP1 mRNA、TNM分期、年齡可作為非小細胞肺癌獨立的預后因素，見表 4和表 5。
圖1
肺癌患者術后生存曲線
表4
各臨床病理參數COX單因素分析結果（n=57）
表5
非小細胞肺癌患者預后的多因素分析結果
3 討論
非小細胞肺癌是世界上首位癌癥死亡原因，找出與非小細胞肺癌的進展和預后相關的分子標記物對于臨床醫生和基礎研究者是一個巨大的挑戰[10-11]。作為RNA結合蛋白中的重要一員，CUGBP1廣泛表達于各類組織細胞中的細胞核和細胞質中，具有調節RNA剪切和mRNA翻譯兩個主要功能[6, 12-13]。CUGBP1在RNA的可變剪切、mRNA翻譯以及mRNA降解中發揮著舉足輕重的作用，該基因表達的增強、磷酸化水平以及活性的高低直接影響其功能，進而引發各種疾病[14-17]。CUGBP1不僅涉及到乳腺癌和白血病的發展，也可能在腫瘤的發生與某些腫瘤的惡化進展發揮了巨大的作用[18]。Rattenbacher等[19]發現CUGBP1與目的基因轉錄后結合形成的調控網絡調節細胞生長和平衡，而這個網絡中斷可能導致癌癥的發生。Zheng等[8]報道CUGBP1在組織分化、細胞應激或腫瘤發生過程中通過調節p27蛋白水平發揮重要作用。在我們的研究中，CUGBP1 mRNA及CUGBP1在肺癌組織中高度表達，另外通過COX單因素及多因素分析，CUGBP1可以作為一個獨立預后因素來評估非小細胞肺癌患者的術后生存及腫瘤進展時間，說明CUGBP1可能在非小細胞肺癌的發生和惡化進展中發揮了巨大的作用，為臨床及基礎工作者對于肺癌的診斷、研究及治療指明了一個新的研究方向[20]。
綜上所述，CUGBP1 mRNA可能在非小細胞肺癌的發生和進展中具有調控作用，并且作為獨立的預后因素，可以在臨床上用來判斷肺癌患者的預后。本試驗首次研究了非小細胞肺癌CUGBP1 mRNA及蛋白的表達情況，以及與臨床病理參數之間的關系，特別是與非小細胞肺癌患者預后的關系。研究表明CUGBP1 mRNA過度表達的肺癌患者預后較差，CUGBP1 mRNA在非小細胞肺癌患者的檢測、治療和判斷預后具有一定的作用，為臨床工作者提供了一個嶄新的視野。作為獨立預后因素，我們建議在未來的臨床實踐工作中，應定期檢測CUGBP1 mRNA用以評估非小細胞肺癌患者的預后。
由于高轉移及復發率，肺癌的死亡率高居各惡性腫瘤的首位，每年大約有120萬患者死于肺癌，其中85%為非小細胞肺癌，5年生存率僅10%～15%[1-2]，因此早期診斷、治療以及預測對于非小細胞肺癌患者尤為重要[3]。CUG結合蛋白1（CUG binding protein 1，CUGBP1）是Timchenko等于1996年用特異性抗體mAb3BI克隆得到的與肌強直蛋白激酶（dystrophin myotonia protein kinase，DMPK）基因的3’-UTR（CUG）n重復序列結合的49 kDa的RNA結合蛋白[4-6]。CUGBP1是一種調節選擇性剪接、mRNA翻譯及穩定的RNA結合蛋白。CUGBP1屬于CELF/BRUNOL蛋白家族成員，不僅在胚胎及心臟發育、骨骼肌及脂肪組織分化、生殖細胞行為等方面具有重要作用，而且在腫瘤的惡化中也發揮重要的調控作用[7-9]。本研究應用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）及免疫組織化學技術初步檢測了57例早期非小細胞肺癌組織及相應的癌周正常組織中CUGBP1 mRNA及蛋白的表達情況，并將所有的病例隨訪3年以上，以探討CUGBP1 mRNA與非小細胞肺癌預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2009年7月至2011年4月在青島大學附屬醫院胸外科接受手術治療的57例肺癌患者，男32例，女25例；年齡43～74（60.6±8.9）歲；術后病理類型診斷明確，見表 1。所有患者術后每2個月電話隨訪1次，采用腫瘤進展時間（time to progression，TTP）作為觀察評估指標。組織學分型根據WHO標準（1981年）進行病理學檢查，并根據TNM國際分期法（UICC，1997）進行分期。臨床病理資料分析項目包括：性別、年齡、吸煙、組織學類型、T分期、N分期、TNM分期以及分化。所有患者術前均未進行放化療及激素治療。
表1
57例非小細胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表達與各臨床病理參數的關系（例）
1.2 方法
1.2.1 半定量RT-PCR
每個樣品包括癌組織及周圍正常組織，手術切除標本后立即放入液氮中保存，按照制造商說明書使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）提取總RNA，并且使用分光光度計于260/280 nm測量光密度來確定RNA的濃度和純度。每個樣品10 ng RNA逆轉錄成cDNA，使用特定的正向及反向引物進行目的基因擴增（Master Cycler，Eppendorf，Germany），按照以下步驟進行40個循環：95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s。CUGBP1 mRNA的相對表達量用甘油醛3-磷酸脫氫酶（GAPDH）進行標準化。CUGBP1 mRNA的正向及反向引物分別為：5′-GTC-AGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-TGACTTCAAC-AGCGACACCCA-3′。GAPDH的正向及反向引物分別為：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′和5′-CA-CCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。所有引物于我院中心實驗室通過反相高效液相色譜法合成及純化。所有樣品于2%瓊脂糖凝膠上分離電泳確保正確的目的基因擴增，并且每個樣品半定量值使用熒光成像掃描儀（FluoroImager scanner，Molecular Dynamics公司）測量，使用ImageQuant軟件（Molecular Dynamics公司）進行分析。
1.2.2 免疫組織化學染色
10%福爾馬林固定標本，常規石蠟包埋，3 μm厚連續切片，Abcam公司購買CUGBP1單克隆抗體，按照說明書進行測試。切片脫蠟至水，放入新配制的3% H2O2 10 min，滅活內源性酶，于10 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=6）于20 min內加熱至95 ℃，重復3次。滴加CUGBP1單克隆抗體（濃度1:200，PBS稀釋），37 ℃溫箱中孵育90 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體（PV-6000）（濃度1% 200，PBS稀釋），37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次，DAB顯色3 min，蘇木精輕度復染。
1.2.3 結果判定
CUGBP1 mRNA PCR結果：取0.6作為臨界值，半定量CUGBP1 mRNA值≥0.6為陽性，否則為陰性。CUGBP1免疫組織化學染色結果：通過測量染色強度（0：不染色；1：黃色染色；2：棕黃色染色；3：褐色染色）以及染色面積（0：0%，1：0%～10%；2：10%～50%，3：50%～100%）。染色強度與染色面積的分數相乘，結果0～3為陰性，4～9為陽性。
1.3 統計學分析
采用χ2檢驗對CUGBP1 mRNA及蛋白的表達進行統計分析，COX單因素及多因素分析CUGBP1 mRNA、年齡、TNM分期對于肺癌預后的意義。所有的統計分析均采用SAS9.2軟件，P≤0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CUGBP1 mRNA及蛋白在非小細胞肺癌的表達及與臨床病理資料的關系
57例非小細胞肺癌患者CUGBP1 mRNA及蛋白表達與各臨床病理參數的關系見表 1。通過半定量RT-PCR分析，肺癌組CUGBP1 mRNA的陽性表達率為63.2%，明顯高于對照組43.9%，差異具有統計學意義（χ2=4.266 6，P=0.038 9），見表 2。通過免疫組織化學分析，CUGBP1位于細胞核，肺癌組陽性表達率為66.7%，與對照組陽性率（36.8%）差異具有統計學意義（χ2=10.152 9，P=0.001 4）（表 2）。并且CUGBP1mRNA與CUGBP1同時與肺癌的TNM分期、分化密切相關。但是肺癌組織內，CUGBP1 mRNA與CUGBP1表達差異無統計學意義（Z=0.500 0，P=0.479 5）；見表 3。
表2
CUGBP1 mRNA及蛋白在非小細胞肺癌中的分布[n=57，例（%）]
表3
肺癌組CUGBP1 mRNA與蛋白表達的關系（n=57，例）
2.2 CUGBP1 mRNA及臨床病理指標與預后的關系
所有肺癌患者隨訪時間1～39個月，中位數為10個月。生存曲線（圖 1）顯示高表達CUGBP1 mRNA患者的平均術后腫瘤進展時間（TTP）為16.8個月，與低表達患者（12.4個月）相比差異具有統計學意義（χ2=7.166 5，P=0.007 4）。通過單因素及多因素生存分析得知，CUGBP1 mRNA、TNM分期、年齡可作為非小細胞肺癌獨立的預后因素，見表 4和表 5。
圖1
肺癌患者術后生存曲線
表4
各臨床病理參數COX單因素分析結果（n=57）
表5
非小細胞肺癌患者預后的多因素分析結果
3 討論
非小細胞肺癌是世界上首位癌癥死亡原因，找出與非小細胞肺癌的進展和預后相關的分子標記物對于臨床醫生和基礎研究者是一個巨大的挑戰[10-11]。作為RNA結合蛋白中的重要一員，CUGBP1廣泛表達于各類組織細胞中的細胞核和細胞質中，具有調節RNA剪切和mRNA翻譯兩個主要功能[6, 12-13]。CUGBP1在RNA的可變剪切、mRNA翻譯以及mRNA降解中發揮著舉足輕重的作用，該基因表達的增強、磷酸化水平以及活性的高低直接影響其功能，進而引發各種疾病[14-17]。CUGBP1不僅涉及到乳腺癌和白血病的發展，也可能在腫瘤的發生與某些腫瘤的惡化進展發揮了巨大的作用[18]。Rattenbacher等[19]發現CUGBP1與目的基因轉錄后結合形成的調控網絡調節細胞生長和平衡，而這個網絡中斷可能導致癌癥的發生。Zheng等[8]報道CUGBP1在組織分化、細胞應激或腫瘤發生過程中通過調節p27蛋白水平發揮重要作用。在我們的研究中，CUGBP1 mRNA及CUGBP1在肺癌組織中高度表達，另外通過COX單因素及多因素分析，CUGBP1可以作為一個獨立預后因素來評估非小細胞肺癌患者的術后生存及腫瘤進展時間，說明CUGBP1可能在非小細胞肺癌的發生和惡化進展中發揮了巨大的作用，為臨床及基礎工作者對于肺癌的診斷、研究及治療指明了一個新的研究方向[20]。
綜上所述，CUGBP1 mRNA可能在非小細胞肺癌的發生和進展中具有調控作用，并且作為獨立的預后因素，可以在臨床上用來判斷肺癌患者的預后。本試驗首次研究了非小細胞肺癌CUGBP1 mRNA及蛋白的表達情況，以及與臨床病理參數之間的關系，特別是與非小細胞肺癌患者預后的關系。研究表明CUGBP1 mRNA過度表達的肺癌患者預后較差，CUGBP1 mRNA在非小細胞肺癌患者的檢測、治療和判斷預后具有一定的作用，為臨床工作者提供了一個嶄新的視野。作為獨立預后因素，我們建議在未來的臨床實踐工作中，應定期檢測CUGBP1 mRNA用以評估非小細胞肺癌患者的預后。
