引用本文： 喻磊, 谷天祥, 師恩祎, 張光偉, 毛乃惠, 程實. 深低溫停循環腎損傷及其早期檢測. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(1): 90-96. doi: 10.7507/1007-4848.20140024 復制
主動脈弓置換術是一類復雜的心臟外科手術，需要在深低溫停循環（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）下施行，即使圍術期采取了多種措施，手術也會造成重要器官，尤其是腎臟的缺血損傷，術后發生急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）[1]。DHCA術后急性腎損傷的發生率高達5%～50% [2-4]，同時DHCA術后腎功能不全已經是患者死亡的重要危險因素[5-6]。然而DHCA術后急性腎損傷的檢測仍是目前困擾臨床的棘手問題，血肌酐和尿量是目前急性腎損傷的診斷指標，但受到很多因素影響，敏感性和特異性都不高。因診斷滯后，常貽誤治療的最佳時期。尋求具有高敏感性、特異性、易檢測的新生物標志物已經成為當前研究熱點之一。
進行DHCA所致腎臟損傷的研究需要一個合適的動物模型，既往DHCA研究模型常用豬、犬等動物，實驗花費高昂并且操作比較復雜[7-8]。近年來有應用兔模型來研究DHCA，但術后均不能長期生存[9-10]。我們成功地建立了術后能夠長期生存的不開胸DHCA兔模型，并應用于DHCA對腎臟的損傷及早期檢測指標的研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物模型和分組
新西蘭大耳兔（雌雄不拘）42只，體重3.5～4.0 kg（1～2歲齡），由中國醫科大學實驗動物中心提供。分為兩組：A組（體外循環組）和B組（DHCA組），每組各21只。
1.1.2 體外循環及DHCA模型的建立
實驗前禁食禁水6 h，每只兔子麻醉前給予肌肉注射速眠新0.5 mg/kg，穿刺耳緣靜脈，建立靜脈通道，并固定確切。靜脈推注阿托品0.01 mg/kg，以減少麻醉過程中支氣管粘液分泌。用地西泮和芬太尼維持麻醉。切開氣管內插管，使用小動物呼吸機（江西省特力麻醉呼吸設備公司DW-3000型）輔助呼吸，潮氣量10～15 ml/kg，呼吸頻率30～45次/分，吸入氧濃度50%，監測動脈血氣使pH值及二氧化碳分壓（PCO2）在生理范圍內。左腹股溝皮膚放置血氧飽和度監測探頭。四肢皮下置入心電圖針形電極。放置鼻咽溫和肛溫探頭。再游離出左或右股動、靜脈。股動脈連接三通和壓力換能器，用于動脈血取樣和連續監測動脈血壓，股靜脈穿刺用于輸液。體外循環前體溫用變溫毯維持在37.5 °C～38.5 °C之間。
體外循環的構成包括：StockertⅢ型體外循環機、膜肺（Dideco901），變溫水箱（Stockert）和超濾裝置（MAQUET）。為減少預充量所有連接管道內徑為3 mm（西京醫療器材有限公司）。預充液包括：同種兔血100 ml、50 ml生理鹽水、林格液（210 ml）、地塞米松（1 mg/kg）、呋塞米（5 mg）、甘露醇（1.5 g）、碳酸氫鈉（0.25 g）、先鋒霉素Ⅴ（0.5 g）、硫酸鎂（2 mg）、肝素鈉（500 U）。游離出左、右頸總動、靜脈，右頸動靜脈用于插管建立體外循環，左頸總動脈插管進行選擇性腦灌注。采用18G套管針經右頸總動脈逆行插入作為動脈灌注管，經右頸總靜脈將帶有多個側孔的內徑4 mm的靜脈引流管插入右心房（圖 1、2），再分別用近心端縫線妥善固定，靜脈推注肝素3 mg/kg，當激活全血凝固時間（ACT）>480 s時轉流開始。體外循環開始時轉流量為80～90 ml /（kg?min）轉流過程中動脈壓保持在60 mm Hg以上，轉流量逐漸增加達到120 ml /（kg?min）（圖 3）。體外循環轉流開始后為防止肺不張機械通氣采用持續正壓通氣（5 cm H2O），吸入氧濃度21%，但在DHCA期間停止機械通氣。整個體外循環中直腸溫度和血液溫度始終保持在10℃以內，肛溫降至30 ℃時，靜脈內推注10%氯化鉀6 ml使心臟在10 s內停跳。A組肛溫維持在28 ℃持續體外循環，B組在30 min內肛溫降至16～18 ℃時停循環，順行性腦灌注8～10 ml /（kg?min），停循環60 min后開放循環復溫，在30 min內復溫至肛溫35 ℃，之后維持體外循環30 min。復溫期間不能自動復跳出現心室顫動時給予體外電除顫10 Ws/kg（鹽水侵濕的兩個電極分別放在備過皮的前胸壁和右側腹股溝區，必要時可以反復除顫）。復溫期間靜脈應用多巴胺及副腎維持動脈壓在50 mm Hg以上直到肛溫達到35 ℃以上或流量達到60 ml /（kg?min）以上。所有動物復溫達到肛溫36 ℃，混合靜脈血氧飽和度達到70%以上，自主循環穩定時魚精蛋白1︰1中和后脫離體外循環。一旦自主呼吸恢復停止機械通氣改為插管處吸氧。術中血氣監測當溫度高于28 ℃時采用alpha-stat策略，當溫度低于28 ℃時采用PH-stat策略。術中采用常規超濾加零平衡超濾，術中維持紅細胞壓積0.25±0.05，體外循環結束后采用改良超濾（經頸動脈灌注管抽血、頸靜脈引流管還血，流量保持在10～15 ml /（kg?min）超濾約10 min紅細胞壓積維持在0.30±0.05左右。如果2 h內不能脫離體外循環認為動物死亡。
圖1
經頸總動脈及頸內靜脈插管建立體外循環??圖 2??動脈灌注管及靜脈引流管?圖 3??DHCA術中
1.2 標本采集
在術前、術后6 h、24 h及48 h分別采集靜脈血及尿樣，血液標本和尿液標本收集后立即在3 000轉/分轉速下離心10 min，取等量上清液，存放于-80℃冰箱中。兩組分別在術前、術后6 h、24 h及48 h處死動物各4只，立即進腹，游離雙側腎臟及腎動靜脈，結扎腎動脈近端，然后以生理鹽水經腎動脈沖洗腎臟3次，取下腎臟。血液標本分別檢測血清肌酐（Cr）、β-痕跡蛋白（β-TP）、尿樣行尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）值。留取腎臟組織經過處理后分別檢測丙二醛（MDA）含量、HE染色和凋亡指標缺口末端標法（TUNEL）染色以及透射電子顯微鏡觀察腎小管上皮細胞形態。Β-TP及NGAL的酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒由Life Science Lab（Dade Behring，Marburg，Germany）提供，其余試劑盒均購自南京建成生物制品公司。
1.3 統計學分析
所有數據均以均數±標準差（
2 結果
兩組術前資料及術中體外循環指標差異無統計學意義。A組死亡4只（2只術后不能脫離體外循環，2只因插靜脈引流管時引起大出血），B組死亡5只（3只術后不能脫離體外循環，1只因術后心臟不復跳，1只因插靜脈引流管時引起心搏驟停）。（1）血清Cr值（表 1）：A組組內各時間點之間差異無統計學意義（P>0.05），B組在術后24 h與組內及A組間比較明顯升高（P<0.05）。（2）血β-TP（表 2）及尿NGAL值（表 3）：A組組內各時間點之間差異無統計學意義（P>0.05）。B組內術后6 h、24 h、48 h與術前比較明顯升高（P<0.05），B組在術后24 h與組內其它時間點比較明顯升高（P<0.05）。B組術后6 h、24 h、48 h與A組比較明顯升高（P<0.05）。（3）腎組織MDA含量（表 4）：B組在術后24 h與組內及組間比較明顯升高（P<0.05），其它時間點在組內及組間差異無統計學意義（P>0.05）。（4）HE染色可見B組在術后24 h局部腎小管上皮細胞腫脹，出現水樣變性和空泡變性、灶狀壞死，腎髓質及皮髓交界處腎小管排列稀疏、紊亂，腎小管擴張明顯。A組腎小管排列整齊，間質無充血、水腫及炎癥細胞浸潤（圖 4）。（5）TUNEL染色陽性率：凋亡的組織細胞體積較小，核呈棕褐色或深棕色，非凋亡細胞核呈藍色。B組在術后24 h與組內及組間比較明顯升高（P<0.05），其它時間點在組內及組間差異無統計學意義（P>0.05，表 5、圖 5）。（6）電子顯微鏡觀察可見B組在術后24 h腎小管上皮細胞基底膜增厚，薄厚不均、線粒體腫脹溶解、細胞核外膜不清、內質網腫脹脫顆粒。A組腎小管上皮細胞基底膜完整，厚度一致，線粒體呈梭形，膜完整，無腫脹溶解（圖 6）。
表1
兩組兔子血清Cr水平比較（μmol/L，
表2
兩組兔子血清β-TP值比較（mg/L，
表3
兩組兔子尿NGAL值比較（μg/L，
表4
兩組兔子腎組織MDA含量比較[nmol /（mg?port），
圖4
A組腎小管??HE×400
注：A，B為A組，C為B組
表5
兩組兔子腎小管上皮細胞凋亡率（%，
圖5
腎小管組織??TUNEL×400
注：A為A組；B為B組
圖6
電子顯微鏡觀察腎組織??EM×8000
注：A，B為A組；C為B組
3 討論
既往研究應用兔為動物模型需要開胸，術中血液丟失較多，術后容易出現氣胸，并且術后均不能長期生存。我們經過改進成功建立了兔不開胸DHCA模型，因不開胸術中丟失血液較少，術后沒有氣胸發生，并且建模的成功率達到79%。因此本實驗的模型對于研究DHCA造成的器官損傷是一種簡單、方便、經濟并且能夠長期生存的動物模型。成功建立DHCA模型術中需要注意以下幾點：（1）靜脈引流管需要帶有多個側孔，內徑能夠達到4 mm并且插入右心房才能滿足體外循環的流量（我們應用成人吸痰管前端剪開幾個小側孔）。（2）靜脈引流管經右頸靜脈插入時避免過分粗暴以免造成靜脈破裂大出血。（3）靜脈引流管插入深度大約3 cm左右，插管時需要監測動脈血壓及心電圖，如果血壓突然升高或心電圖有心律失常發生說明靜脈引流管已經插入右心房。（4）膜肺高度應低于右心房水平50 cm左右，盡量減少靜脈引流管及動脈灌注管的長度。
胸主動脈疾病包括胸主動脈瘤和主動脈夾層，病變常累及主動脈弓，手術需要在DHCA下施行，即使圍術期采取了多種措施，手術也會造成重要器官，尤其是腎臟的缺血損傷[11]。隨著現代體外循環技術的發展，近年來心臟術后急性腎功能衰竭的發病率已趨下降，但一旦發生，其死亡率高達45%～100%[12-13]。預防和治療DHCA腎損傷是大血管外科期待解決的難題之一。目前DHCA術后發生急性腎損傷（AKI）的確切機制尚不明確，雖然在停循環各個器官缺血時，深低溫已經被證明是一種很有效的保護技術，但它同樣會產生器官的缺血-再灌注損傷[5]。同時由于體外循環的血流特點對腎臟供血的特殊性[14]，因此它與常溫腎臟缺血-再灌注又不完全相同。我們的研究中DHCA組術后24 h血Cr、尿NGAL、血β-TP較體外循環組均明顯增高，腎組織MDA含量較體外循環組均明顯升高，這些結果說明DHCA會造成術后腎臟損傷，且以術后24 h表現最為明顯，而且光學顯微鏡、電子顯微鏡均證實腎臟損傷的病理改變。同時我們發現腎臟損傷是以腎小管上皮細胞凋亡為主，并未發現明顯細胞壞死的改變，這說明可能是因為深低溫對腎臟的缺血有一定的保護作用。
腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）是評價腎功能的金標準[15]。GFR的檢測可以由菊粉清除率或者其它檢測方法如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA的檢測，但沒有一種可有效地用于臨床[16-17]。24 h肌酐清除率經常被用來評價腎功能，但它也缺乏精準度。并且由于需要收集24 h的尿液樣本使其應用更加受限。而目前臨床檢測腎小球濾過功能的標志物常用肌酐值，但它對于早期GFR損傷的預測敏感度較低，在GFR下降50%以上才會升高。在臨床檢測中Cr在體外循環急性腎損傷后24～48 h才會升高。因此以Cr的變化來診斷急性腎損傷及給予干預治療，可能使治療延誤及治療效果不良，因此能夠早期檢測腎臟損傷對于術后治療非常重要。
NGAL是一種調控腎小管上皮細胞凋亡的分子，正常情況下腎組織很少表達，腎缺血后NGAL基因是上調最顯著的基因之一，NGAL也是過表達最顯著的蛋白之一[18]。Martensson等[19]研究發現，血NGAL水平在伴或不伴有AKI的全身炎性反應綜合征、嚴重膿毒癥及膿毒癥休克患者都有升高，可能因為它是由活化的中性粒細胞所釋放的，所以多種其它疾病及其并發癥也可能使重癥患者的NGAL測值升高，故特異性不高，而尿NGAL更有利于診斷，因為在膿毒癥患者中，未發生AKI的患者其尿NGAL水平并不高。研究表明在腎缺血-再灌注損傷時，血和尿NGAL水平顯著增加[20]，在腎缺血引起腎損害時其在腎組織中的表達明顯上調并在數小時內可以在尿液中檢測到[21]，證明尿NGAL比血清肌酐更早期、更敏感反映AKI。近年來隨著研究的不斷深入，發現血清β-TP可以用來評價早期的腎小球濾過功能的損害。β-TP是脂質運載蛋白型前列腺素D合酶（lipocalin-type prostaglandin Dynthase，L-PGDS），最初由此Leone等[22]于1961年首次發現并將其命名為β-TP。β-TP是人腦脊液中的主要蛋白質，同時可以在人的血和尿中檢測到[23]。其生理功能為作為一種酶催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）轉化為前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）；作為Lipocalin超家族的成員，具有結合和轉運疏水性分子的性能，協同PGD2調控睡眠的作用。近年來有研究顯示慢性腎臟疾病患者β-TP己明顯升高，在血清Cr正常時（所謂肌酐盲區）也升高，β-TP可能是提示腎小球濾過率下降的一個早期檢測指標，是比較理想的反映腎小球濾過率的標記物[24]。我們發現DHCA術后6 h尿NGAL及血β-TP與對照組比較就已經明顯升高，術后24 h達到最高值，而血Cr只在術后24 h與對照組比較才明顯升高，這說明尿NGAL及血β-TP是DHCA術后腎損傷的早期檢測指標，與血Cr相比更加敏感。
不開胸DHCA兔模型對于研究深低溫停循環造成的器官損傷是一種簡單、方便、經濟并且能夠長期生存的動物模型。在DHCA手術后24 h腎損傷最嚴重，血β-TP和尿NGAL是DHCA腎損傷的早期檢測指標。
主動脈弓置換術是一類復雜的心臟外科手術，需要在深低溫停循環（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）下施行，即使圍術期采取了多種措施，手術也會造成重要器官，尤其是腎臟的缺血損傷，術后發生急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）[1]。DHCA術后急性腎損傷的發生率高達5%～50% [2-4]，同時DHCA術后腎功能不全已經是患者死亡的重要危險因素[5-6]。然而DHCA術后急性腎損傷的檢測仍是目前困擾臨床的棘手問題，血肌酐和尿量是目前急性腎損傷的診斷指標，但受到很多因素影響，敏感性和特異性都不高。因診斷滯后，常貽誤治療的最佳時期。尋求具有高敏感性、特異性、易檢測的新生物標志物已經成為當前研究熱點之一。
進行DHCA所致腎臟損傷的研究需要一個合適的動物模型，既往DHCA研究模型常用豬、犬等動物，實驗花費高昂并且操作比較復雜[7-8]。近年來有應用兔模型來研究DHCA，但術后均不能長期生存[9-10]。我們成功地建立了術后能夠長期生存的不開胸DHCA兔模型，并應用于DHCA對腎臟的損傷及早期檢測指標的研究。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物模型和分組
新西蘭大耳兔（雌雄不拘）42只，體重3.5～4.0 kg（1～2歲齡），由中國醫科大學實驗動物中心提供。分為兩組：A組（體外循環組）和B組（DHCA組），每組各21只。
1.1.2 體外循環及DHCA模型的建立
實驗前禁食禁水6 h，每只兔子麻醉前給予肌肉注射速眠新0.5 mg/kg，穿刺耳緣靜脈，建立靜脈通道，并固定確切。靜脈推注阿托品0.01 mg/kg，以減少麻醉過程中支氣管粘液分泌。用地西泮和芬太尼維持麻醉。切開氣管內插管，使用小動物呼吸機（江西省特力麻醉呼吸設備公司DW-3000型）輔助呼吸，潮氣量10～15 ml/kg，呼吸頻率30～45次/分，吸入氧濃度50%，監測動脈血氣使pH值及二氧化碳分壓（PCO2）在生理范圍內。左腹股溝皮膚放置血氧飽和度監測探頭。四肢皮下置入心電圖針形電極。放置鼻咽溫和肛溫探頭。再游離出左或右股動、靜脈。股動脈連接三通和壓力換能器，用于動脈血取樣和連續監測動脈血壓，股靜脈穿刺用于輸液。體外循環前體溫用變溫毯維持在37.5 °C～38.5 °C之間。
體外循環的構成包括：StockertⅢ型體外循環機、膜肺（Dideco901），變溫水箱（Stockert）和超濾裝置（MAQUET）。為減少預充量所有連接管道內徑為3 mm（西京醫療器材有限公司）。預充液包括：同種兔血100 ml、50 ml生理鹽水、林格液（210 ml）、地塞米松（1 mg/kg）、呋塞米（5 mg）、甘露醇（1.5 g）、碳酸氫鈉（0.25 g）、先鋒霉素Ⅴ（0.5 g）、硫酸鎂（2 mg）、肝素鈉（500 U）。游離出左、右頸總動、靜脈，右頸動靜脈用于插管建立體外循環，左頸總動脈插管進行選擇性腦灌注。采用18G套管針經右頸總動脈逆行插入作為動脈灌注管，經右頸總靜脈將帶有多個側孔的內徑4 mm的靜脈引流管插入右心房（圖 1、2），再分別用近心端縫線妥善固定，靜脈推注肝素3 mg/kg，當激活全血凝固時間（ACT）>480 s時轉流開始。體外循環開始時轉流量為80～90 ml /（kg?min）轉流過程中動脈壓保持在60 mm Hg以上，轉流量逐漸增加達到120 ml /（kg?min）（圖 3）。體外循環轉流開始后為防止肺不張機械通氣采用持續正壓通氣（5 cm H2O），吸入氧濃度21%，但在DHCA期間停止機械通氣。整個體外循環中直腸溫度和血液溫度始終保持在10℃以內，肛溫降至30 ℃時，靜脈內推注10%氯化鉀6 ml使心臟在10 s內停跳。A組肛溫維持在28 ℃持續體外循環，B組在30 min內肛溫降至16～18 ℃時停循環，順行性腦灌注8～10 ml /（kg?min），停循環60 min后開放循環復溫，在30 min內復溫至肛溫35 ℃，之后維持體外循環30 min。復溫期間不能自動復跳出現心室顫動時給予體外電除顫10 Ws/kg（鹽水侵濕的兩個電極分別放在備過皮的前胸壁和右側腹股溝區，必要時可以反復除顫）。復溫期間靜脈應用多巴胺及副腎維持動脈壓在50 mm Hg以上直到肛溫達到35 ℃以上或流量達到60 ml /（kg?min）以上。所有動物復溫達到肛溫36 ℃，混合靜脈血氧飽和度達到70%以上，自主循環穩定時魚精蛋白1︰1中和后脫離體外循環。一旦自主呼吸恢復停止機械通氣改為插管處吸氧。術中血氣監測當溫度高于28 ℃時采用alpha-stat策略，當溫度低于28 ℃時采用PH-stat策略。術中采用常規超濾加零平衡超濾，術中維持紅細胞壓積0.25±0.05，體外循環結束后采用改良超濾（經頸動脈灌注管抽血、頸靜脈引流管還血，流量保持在10～15 ml /（kg?min）超濾約10 min紅細胞壓積維持在0.30±0.05左右。如果2 h內不能脫離體外循環認為動物死亡。
圖1
經頸總動脈及頸內靜脈插管建立體外循環??圖 2??動脈灌注管及靜脈引流管?圖 3??DHCA術中
1.2 標本采集
在術前、術后6 h、24 h及48 h分別采集靜脈血及尿樣，血液標本和尿液標本收集后立即在3 000轉/分轉速下離心10 min，取等量上清液，存放于-80℃冰箱中。兩組分別在術前、術后6 h、24 h及48 h處死動物各4只，立即進腹，游離雙側腎臟及腎動靜脈，結扎腎動脈近端，然后以生理鹽水經腎動脈沖洗腎臟3次，取下腎臟。血液標本分別檢測血清肌酐（Cr）、β-痕跡蛋白（β-TP）、尿樣行尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）值。留取腎臟組織經過處理后分別檢測丙二醛（MDA）含量、HE染色和凋亡指標缺口末端標法（TUNEL）染色以及透射電子顯微鏡觀察腎小管上皮細胞形態。Β-TP及NGAL的酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒由Life Science Lab（Dade Behring，Marburg，Germany）提供，其余試劑盒均購自南京建成生物制品公司。
1.3 統計學分析
所有數據均以均數±標準差（
2 結果
兩組術前資料及術中體外循環指標差異無統計學意義。A組死亡4只（2只術后不能脫離體外循環，2只因插靜脈引流管時引起大出血），B組死亡5只（3只術后不能脫離體外循環，1只因術后心臟不復跳，1只因插靜脈引流管時引起心搏驟停）。（1）血清Cr值（表 1）：A組組內各時間點之間差異無統計學意義（P>0.05），B組在術后24 h與組內及A組間比較明顯升高（P<0.05）。（2）血β-TP（表 2）及尿NGAL值（表 3）：A組組內各時間點之間差異無統計學意義（P>0.05）。B組內術后6 h、24 h、48 h與術前比較明顯升高（P<0.05），B組在術后24 h與組內其它時間點比較明顯升高（P<0.05）。B組術后6 h、24 h、48 h與A組比較明顯升高（P<0.05）。（3）腎組織MDA含量（表 4）：B組在術后24 h與組內及組間比較明顯升高（P<0.05），其它時間點在組內及組間差異無統計學意義（P>0.05）。（4）HE染色可見B組在術后24 h局部腎小管上皮細胞腫脹，出現水樣變性和空泡變性、灶狀壞死，腎髓質及皮髓交界處腎小管排列稀疏、紊亂，腎小管擴張明顯。A組腎小管排列整齊，間質無充血、水腫及炎癥細胞浸潤（圖 4）。（5）TUNEL染色陽性率：凋亡的組織細胞體積較小，核呈棕褐色或深棕色，非凋亡細胞核呈藍色。B組在術后24 h與組內及組間比較明顯升高（P<0.05），其它時間點在組內及組間差異無統計學意義（P>0.05，表 5、圖 5）。（6）電子顯微鏡觀察可見B組在術后24 h腎小管上皮細胞基底膜增厚，薄厚不均、線粒體腫脹溶解、細胞核外膜不清、內質網腫脹脫顆粒。A組腎小管上皮細胞基底膜完整，厚度一致，線粒體呈梭形，膜完整，無腫脹溶解（圖 6）。
表1
兩組兔子血清Cr水平比較（μmol/L，
表2
兩組兔子血清β-TP值比較（mg/L，
表3
兩組兔子尿NGAL值比較（μg/L，
表4
兩組兔子腎組織MDA含量比較[nmol /（mg?port），
圖4
A組腎小管??HE×400
注：A，B為A組，C為B組
表5
兩組兔子腎小管上皮細胞凋亡率（%，
圖5
腎小管組織??TUNEL×400
注：A為A組；B為B組
圖6
電子顯微鏡觀察腎組織??EM×8000
注：A，B為A組；C為B組
3 討論
既往研究應用兔為動物模型需要開胸，術中血液丟失較多，術后容易出現氣胸，并且術后均不能長期生存。我們經過改進成功建立了兔不開胸DHCA模型，因不開胸術中丟失血液較少，術后沒有氣胸發生，并且建模的成功率達到79%。因此本實驗的模型對于研究DHCA造成的器官損傷是一種簡單、方便、經濟并且能夠長期生存的動物模型。成功建立DHCA模型術中需要注意以下幾點：（1）靜脈引流管需要帶有多個側孔，內徑能夠達到4 mm并且插入右心房才能滿足體外循環的流量（我們應用成人吸痰管前端剪開幾個小側孔）。（2）靜脈引流管經右頸靜脈插入時避免過分粗暴以免造成靜脈破裂大出血。（3）靜脈引流管插入深度大約3 cm左右，插管時需要監測動脈血壓及心電圖，如果血壓突然升高或心電圖有心律失常發生說明靜脈引流管已經插入右心房。（4）膜肺高度應低于右心房水平50 cm左右，盡量減少靜脈引流管及動脈灌注管的長度。
胸主動脈疾病包括胸主動脈瘤和主動脈夾層，病變常累及主動脈弓，手術需要在DHCA下施行，即使圍術期采取了多種措施，手術也會造成重要器官，尤其是腎臟的缺血損傷[11]。隨著現代體外循環技術的發展，近年來心臟術后急性腎功能衰竭的發病率已趨下降，但一旦發生，其死亡率高達45%～100%[12-13]。預防和治療DHCA腎損傷是大血管外科期待解決的難題之一。目前DHCA術后發生急性腎損傷（AKI）的確切機制尚不明確，雖然在停循環各個器官缺血時，深低溫已經被證明是一種很有效的保護技術，但它同樣會產生器官的缺血-再灌注損傷[5]。同時由于體外循環的血流特點對腎臟供血的特殊性[14]，因此它與常溫腎臟缺血-再灌注又不完全相同。我們的研究中DHCA組術后24 h血Cr、尿NGAL、血β-TP較體外循環組均明顯增高，腎組織MDA含量較體外循環組均明顯升高，這些結果說明DHCA會造成術后腎臟損傷，且以術后24 h表現最為明顯，而且光學顯微鏡、電子顯微鏡均證實腎臟損傷的病理改變。同時我們發現腎臟損傷是以腎小管上皮細胞凋亡為主，并未發現明顯細胞壞死的改變，這說明可能是因為深低溫對腎臟的缺血有一定的保護作用。
腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）是評價腎功能的金標準[15]。GFR的檢測可以由菊粉清除率或者其它檢測方法如99mTc-DTPA和51Cr-EDTA的檢測，但沒有一種可有效地用于臨床[16-17]。24 h肌酐清除率經常被用來評價腎功能，但它也缺乏精準度。并且由于需要收集24 h的尿液樣本使其應用更加受限。而目前臨床檢測腎小球濾過功能的標志物常用肌酐值，但它對于早期GFR損傷的預測敏感度較低，在GFR下降50%以上才會升高。在臨床檢測中Cr在體外循環急性腎損傷后24～48 h才會升高。因此以Cr的變化來診斷急性腎損傷及給予干預治療，可能使治療延誤及治療效果不良，因此能夠早期檢測腎臟損傷對于術后治療非常重要。
NGAL是一種調控腎小管上皮細胞凋亡的分子，正常情況下腎組織很少表達，腎缺血后NGAL基因是上調最顯著的基因之一，NGAL也是過表達最顯著的蛋白之一[18]。Martensson等[19]研究發現，血NGAL水平在伴或不伴有AKI的全身炎性反應綜合征、嚴重膿毒癥及膿毒癥休克患者都有升高，可能因為它是由活化的中性粒細胞所釋放的，所以多種其它疾病及其并發癥也可能使重癥患者的NGAL測值升高，故特異性不高，而尿NGAL更有利于診斷，因為在膿毒癥患者中，未發生AKI的患者其尿NGAL水平并不高。研究表明在腎缺血-再灌注損傷時，血和尿NGAL水平顯著增加[20]，在腎缺血引起腎損害時其在腎組織中的表達明顯上調并在數小時內可以在尿液中檢測到[21]，證明尿NGAL比血清肌酐更早期、更敏感反映AKI。近年來隨著研究的不斷深入，發現血清β-TP可以用來評價早期的腎小球濾過功能的損害。β-TP是脂質運載蛋白型前列腺素D合酶（lipocalin-type prostaglandin Dynthase，L-PGDS），最初由此Leone等[22]于1961年首次發現并將其命名為β-TP。β-TP是人腦脊液中的主要蛋白質，同時可以在人的血和尿中檢測到[23]。其生理功能為作為一種酶催化前列腺素H2（prostaglandin H2，PGH2）轉化為前列腺素D2（prostaglandin D2，PGD2）；作為Lipocalin超家族的成員，具有結合和轉運疏水性分子的性能，協同PGD2調控睡眠的作用。近年來有研究顯示慢性腎臟疾病患者β-TP己明顯升高，在血清Cr正常時（所謂肌酐盲區）也升高，β-TP可能是提示腎小球濾過率下降的一個早期檢測指標，是比較理想的反映腎小球濾過率的標記物[24]。我們發現DHCA術后6 h尿NGAL及血β-TP與對照組比較就已經明顯升高，術后24 h達到最高值，而血Cr只在術后24 h與對照組比較才明顯升高，這說明尿NGAL及血β-TP是DHCA術后腎損傷的早期檢測指標，與血Cr相比更加敏感。
不開胸DHCA兔模型對于研究深低溫停循環造成的器官損傷是一種簡單、方便、經濟并且能夠長期生存的動物模型。在DHCA手術后24 h腎損傷最嚴重，血β-TP和尿NGAL是DHCA腎損傷的早期檢測指標。
