引用本文： 張冬坤, 蘇曉東, 張旭, 胡祎, 戎鐵華. Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表達及其與預后的關系. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(1): 47-51. doi: 10.7507/1007-4848.20140014 復制
食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，外科手術仍為治療食管癌的主要方法，近30年來食管癌外科治療5年生存率仍在30%左右，因此，目前有關食管癌的發生、發展以及預后的相關分子標記物研究成為熱點之一。細胞周期素Dl（Cyclin D1）是重要的細胞周期調節蛋白，其與細胞周期蛋白依賴性激酶結合，促使細胞從G期順利進入S期，使細胞發生分裂與增殖[1]。Cyclin D1蛋白的過度表達可促使細胞持續增殖，并可能導致細胞發生惡性轉化[2]。已發現Cyclin D1在多種腫瘤（如喉癌[3]、肝癌[4]、結直腸癌[5]、口腔癌[6]、卵巢癌[7]等）中的表達明顯增高，并與預后密切相關。目前Cyclin D1過表達與食管癌預后的關系結論不一，我們利用組織芯片技術和免疫組織化學染色方法檢測Cyclin Dl蛋白在T2～3N0M0期食管癌組織中的表達，旨在探討其表達與食管癌臨床病理特征和預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取1997年1月至2004年12月，在中山大學附屬腫瘤醫院接受手術治療的食管癌患者，入選標準：（1）切除后顯微鏡下無殘留（R0切除）的胸段食管鱗狀細胞癌；（2）術后病理分期T2～3N0M0；（3）手術入路經左胸或右胸；（4）術前未行化療和/或放射治療；（5）蠟塊保存完整并能完成組織芯片制作。排除術后死亡（術后住院期間或術后30 d內死亡）和多原發癌的患者。227例患者符合入選標準，其中男165例，女62例；年齡32～77歲，中位年齡58歲，<65歲168例，≥65歲59例；腫瘤部位：胸上段25例，胸中段152例，胸下段50例；≤5 cm155例，>5 cm72例；pT2 88例和pT3 139例；高分化57例，中分化114例，低分化56例。所有患者術后均未行輔助治療，術前常規接受胸部CT掃描，腹部B超或CT檢查排除肺、肝等遠處轉移。
1.2 方法
我院提供食管癌患者的原始蠟塊，在陜西超英生物科技有限公司實驗室制作完成組織芯片。用組織芯片儀（美國Beecher公司生產）在空白的受體蠟塊上鉆孔，孔徑1 mm，然后在原始蠟塊上穿刺取2～3條直徑為1 mm、有代表性的腫瘤組織芯放入受體蠟塊孔內，直至將所有組織標本全部種植于受體蠟塊中，4 μm厚連續切片。免疫組織化學實驗所用鼠抗人Cyclin D1單抗、SP染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。實驗方法參照免疫組織化學SP試劑盒說明書進行操作，每組實驗均設陽性和陰性對照，陽性對照片為試劑公司提供，陰性對照用PBS代替一抗。
在觀察免疫組織化學染色結果時，根據陽性細胞占全部細胞的比例分為：無陽性細胞記錄為“0”；陽性細胞數<10%記錄為“1”；陽性細胞數10%～25%記錄為“2”；陽性細胞數26%～50%記錄為“3”；陽性細胞數51%～75%記錄為“4”；陽性細胞數>75%記錄為“5”。染色強度分為3級：弱（淺黃色）記錄為“1”；中（棕黃色）記錄為“2”；強（棕褐色）記錄為“3”。免疫組織化學染色結果計算時取每一個指標的染色強度與陽性細胞占全部細胞比例的乘積和的平均值[8]，即（染色強度１×細胞比例1+染色強度2×細胞比例2+染色強度3×細胞比例3）/3。由兩位病理學專家獨立閱片，確定免疫組織化學結果。不一致之處協商討論決定免疫組織化學結果。本研究應用ROC曲線確定最佳免疫組織化學分界點[8-10]。
1.3 統計學分析
隨訪至2007年12月或死亡，生存時間按手術日期至死亡日期計算，至末次隨訪時間仍生存患者和死于非腫瘤原因患者的生存時間按刪失值處理。采用SPSS 16.0統計軟件包進行數據處理。ROC曲線的生成和分析采用MedCalc統計軟件包11.0.1（MedCalc軟件公司，比利時）。組間陽性率比較采用χ2檢驗，Kaplan-Meier生存曲線法計算患者生存率，Log-rank檢驗比較生存率間有無統計學差異，Cox比例風險回歸模型進行預后多因素生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Cyclin D1陽性表達的部位和免疫組織化學染色記分的ROC曲線圖和界點的選擇
Cyclin D1陽性表達主要位于細胞核內，見圖 1。根據ROC曲線分析判定3.0為Cyclin D1免疫組織化學高表達和低表達的分界點，見圖 2。
圖1
Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表達×400
圖2
Cyclin D1免疫組織化學染色記分的ROC曲線圖和界點的選擇
2.2 Cyclin D1表達與食管癌臨床病理特征的關系
將Cyclin D1的表達分為低表達組（≤3.0）90例和高表達組（>3.0）137例。Cyclin D1蛋白的表達與性別（P=0.298）、年齡（P=0.525）、腫瘤位置（P=0.570）、腫瘤長度（P=0.056）、分化程度（P=0.713）和浸潤深度（P=0.557）無明顯相關性，見表 1。
表1
227例T2～3N0M0期食管癌Cyclin D1蛋白表達與臨床病理特征的關系（例）
2.3 Cyclin D1表達與食管癌預后的關系
Kaplan-Meier單因素生存分析結果顯示，腫瘤浸潤深度和Cyclin D1的表達與食管癌預后有關。Cyclin D1低表達組與高表達組總的1年、3年、5年生存率分別為87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，Log-rank檢驗差異有統計學意義（P=0.047），生存曲線見圖 3。
圖3
Cyclin D1表達的T2～3N0M0期食管癌患者的生存曲線
2.4 Cox風險比例模型分析結果
將食管癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤長度、腫瘤分化、腫瘤浸潤深度和Cyclin D1蛋白表達7個因素引入Cox比例風險模型，多因素生存分析結果發現僅腫瘤浸潤深度是影響食管癌預后的獨立危險因素（P=0.027）；Cyclin D1不是食管癌的獨立預后因素（RR值=1.378，95% CI 0.990-1.919，P=0.057）；見表 2。
表2
227例T2～3N0M0期食管癌的Cox風險比例模型分析結果
3 討論
Cyclin Dl是細胞周期蛋白家族的重要成員，定位于染色體11q13，長約120 kb，基因跨距約15 kb，含有5個外顯子，編碼295個氨基酸構成的蛋白質，相對分子質量為34 000 [11]，含量隨細胞周期呈周期性變化，它是細胞周期G1期增殖信號的關鍵蛋白，為G1/S期檢查點的主要正向調控因子，Cyclin Dl擴增或過表達時G1/S期縮短，促使細胞過度增殖形成腫瘤[12]。近年來，不少研究表明Cyclin D1基因參與腫瘤的發生、發展，并被認為是一種促癌基因，其過度表達對腫瘤的診斷和預后具有重要的意義[13-14]。
Cyclin D1與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移、分期和預后的相關性尚不明確。Nagasawa等[15]報道，食管癌Cyclin D1的過表達與淋巴結轉移、淋巴血管侵犯和不良預后有關，是食管癌獨立預后的指標，同時Cyclin D1的表達增高也降低了食管癌對化療的敏感性。張旭等[16]應用組織芯片免疫組織化學法檢測Cyclin D1在食管癌組織中的表達狀態，結果Cyclin D1在晚期食管癌組織中的表達顯著增加，T3和T4期Cyclin D1的表達率為70%，T1和T2期的表達率為40%，兩組表達差異有統計學意義（P<0.05）。另外Cyclin D1表達與腫瘤分化、淋巴結轉移、性別和年齡臨床病理因素的差異均無統計學意義（P>0.05）。Itami等[17]對156例食管癌進行多因素生存分析，Cyclin D1是食管癌獨立的預后因素。另一方面，Shiozaki等[18]的研究指出，Cyclin D1的過表達與淋巴結轉移、淋巴血管侵犯及預后無明顯相關性。Zhao等[19]報道Meta分析20篇（n=2 041例），應用免疫組織化學染色方法研究Cyclin D1與食管鱗癌臨床病理特征和預后的文獻，Meta分析結果顯示，Cyclin D1過表達與食管鱗癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和分期均顯著相關（P<0.05），有10篇[15, 20-28]Cyclin D1的表達與預后關系的文獻，其中8篇文獻Cyclin D1是食管鱗癌獨立預后因素，2篇文獻Cyclin D1和預后無相關性，合并風險比為1.78（95% CI：1.49-2.12，P=0.000），結果Cyclin D1過表達與食管癌不良預后顯著相關。
導致Cyclin D1的過表達與食管癌預后報道不一致的主要原因可能是目前缺乏統一的、被廣泛接受的免疫組織化學評分方法，由于選用了不同的免疫組織化學評分方法，并且其界點選擇也存在一定的主觀性。我們的研究采用了聯合免疫組織化學染色百分比和染色強度的可重復記分方法，根據ROC曲線分析判定Cyclin D1高表達和低表達的界點，該方法可比較客觀地進行最大整體數量的正確分類。本組以3為判定Cyclin D1高表達和低表達的分界點，Cyclin D1表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤長度、腫瘤分化和腫瘤浸潤深度均無明顯相關性（P>0.05）。Cyclin D1低表達組與高表達組總的1、3、5年生存率分別為87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，差異有統計學意義（P=0.047）；經Cox回歸多因素生存分析Cyclin D1雖然不是T2～3N0M0期食管癌預后的獨立影響因素，但接近有統計學差異（P=0.057）。本組研究結果與多數文獻結果有相似之處，這種研究結果的差別可能與有無食管癌分期分層分析，免疫組織化學評分系統和分界點的選擇不同，樣本量的大小以及病例選擇偏倚等因素有關。因此，Cyclin D1蛋白在食管癌中的表達及與預后的關系還需進行深入地研究。
食管癌是我國常見的消化道惡性腫瘤之一，外科手術仍為治療食管癌的主要方法，近30年來食管癌外科治療5年生存率仍在30%左右，因此，目前有關食管癌的發生、發展以及預后的相關分子標記物研究成為熱點之一。細胞周期素Dl（Cyclin D1）是重要的細胞周期調節蛋白，其與細胞周期蛋白依賴性激酶結合，促使細胞從G期順利進入S期，使細胞發生分裂與增殖[1]。Cyclin D1蛋白的過度表達可促使細胞持續增殖，并可能導致細胞發生惡性轉化[2]。已發現Cyclin D1在多種腫瘤（如喉癌[3]、肝癌[4]、結直腸癌[5]、口腔癌[6]、卵巢癌[7]等）中的表達明顯增高，并與預后密切相關。目前Cyclin D1過表達與食管癌預后的關系結論不一，我們利用組織芯片技術和免疫組織化學染色方法檢測Cyclin Dl蛋白在T2～3N0M0期食管癌組織中的表達，旨在探討其表達與食管癌臨床病理特征和預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取1997年1月至2004年12月，在中山大學附屬腫瘤醫院接受手術治療的食管癌患者，入選標準：（1）切除后顯微鏡下無殘留（R0切除）的胸段食管鱗狀細胞癌；（2）術后病理分期T2～3N0M0；（3）手術入路經左胸或右胸；（4）術前未行化療和/或放射治療；（5）蠟塊保存完整并能完成組織芯片制作。排除術后死亡（術后住院期間或術后30 d內死亡）和多原發癌的患者。227例患者符合入選標準，其中男165例，女62例；年齡32～77歲，中位年齡58歲，<65歲168例，≥65歲59例；腫瘤部位：胸上段25例，胸中段152例，胸下段50例；≤5 cm155例，>5 cm72例；pT2 88例和pT3 139例；高分化57例，中分化114例，低分化56例。所有患者術后均未行輔助治療，術前常規接受胸部CT掃描，腹部B超或CT檢查排除肺、肝等遠處轉移。
1.2 方法
我院提供食管癌患者的原始蠟塊，在陜西超英生物科技有限公司實驗室制作完成組織芯片。用組織芯片儀（美國Beecher公司生產）在空白的受體蠟塊上鉆孔，孔徑1 mm，然后在原始蠟塊上穿刺取2～3條直徑為1 mm、有代表性的腫瘤組織芯放入受體蠟塊孔內，直至將所有組織標本全部種植于受體蠟塊中，4 μm厚連續切片。免疫組織化學實驗所用鼠抗人Cyclin D1單抗、SP染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。實驗方法參照免疫組織化學SP試劑盒說明書進行操作，每組實驗均設陽性和陰性對照，陽性對照片為試劑公司提供，陰性對照用PBS代替一抗。
在觀察免疫組織化學染色結果時，根據陽性細胞占全部細胞的比例分為：無陽性細胞記錄為“0”；陽性細胞數<10%記錄為“1”；陽性細胞數10%～25%記錄為“2”；陽性細胞數26%～50%記錄為“3”；陽性細胞數51%～75%記錄為“4”；陽性細胞數>75%記錄為“5”。染色強度分為3級：弱（淺黃色）記錄為“1”；中（棕黃色）記錄為“2”；強（棕褐色）記錄為“3”。免疫組織化學染色結果計算時取每一個指標的染色強度與陽性細胞占全部細胞比例的乘積和的平均值[8]，即（染色強度１×細胞比例1+染色強度2×細胞比例2+染色強度3×細胞比例3）/3。由兩位病理學專家獨立閱片，確定免疫組織化學結果。不一致之處協商討論決定免疫組織化學結果。本研究應用ROC曲線確定最佳免疫組織化學分界點[8-10]。
1.3 統計學分析
隨訪至2007年12月或死亡，生存時間按手術日期至死亡日期計算，至末次隨訪時間仍生存患者和死于非腫瘤原因患者的生存時間按刪失值處理。采用SPSS 16.0統計軟件包進行數據處理。ROC曲線的生成和分析采用MedCalc統計軟件包11.0.1（MedCalc軟件公司，比利時）。組間陽性率比較采用χ2檢驗，Kaplan-Meier生存曲線法計算患者生存率，Log-rank檢驗比較生存率間有無統計學差異，Cox比例風險回歸模型進行預后多因素生存分析，以P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Cyclin D1陽性表達的部位和免疫組織化學染色記分的ROC曲線圖和界點的選擇
Cyclin D1陽性表達主要位于細胞核內，見圖 1。根據ROC曲線分析判定3.0為Cyclin D1免疫組織化學高表達和低表達的分界點，見圖 2。
圖1
Cyclin D1蛋白在T2～3N0M0期食管癌中的表達×400
圖2
Cyclin D1免疫組織化學染色記分的ROC曲線圖和界點的選擇
2.2 Cyclin D1表達與食管癌臨床病理特征的關系
將Cyclin D1的表達分為低表達組（≤3.0）90例和高表達組（>3.0）137例。Cyclin D1蛋白的表達與性別（P=0.298）、年齡（P=0.525）、腫瘤位置（P=0.570）、腫瘤長度（P=0.056）、分化程度（P=0.713）和浸潤深度（P=0.557）無明顯相關性，見表 1。
表1
227例T2～3N0M0期食管癌Cyclin D1蛋白表達與臨床病理特征的關系（例）
2.3 Cyclin D1表達與食管癌預后的關系
Kaplan-Meier單因素生存分析結果顯示，腫瘤浸潤深度和Cyclin D1的表達與食管癌預后有關。Cyclin D1低表達組與高表達組總的1年、3年、5年生存率分別為87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，Log-rank檢驗差異有統計學意義（P=0.047），生存曲線見圖 3。
圖3
Cyclin D1表達的T2～3N0M0期食管癌患者的生存曲線
2.4 Cox風險比例模型分析結果
將食管癌患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤長度、腫瘤分化、腫瘤浸潤深度和Cyclin D1蛋白表達7個因素引入Cox比例風險模型，多因素生存分析結果發現僅腫瘤浸潤深度是影響食管癌預后的獨立危險因素（P=0.027）；Cyclin D1不是食管癌的獨立預后因素（RR值=1.378，95% CI 0.990-1.919，P=0.057）；見表 2。
表2
227例T2～3N0M0期食管癌的Cox風險比例模型分析結果
3 討論
Cyclin Dl是細胞周期蛋白家族的重要成員，定位于染色體11q13，長約120 kb，基因跨距約15 kb，含有5個外顯子，編碼295個氨基酸構成的蛋白質，相對分子質量為34 000 [11]，含量隨細胞周期呈周期性變化，它是細胞周期G1期增殖信號的關鍵蛋白，為G1/S期檢查點的主要正向調控因子，Cyclin Dl擴增或過表達時G1/S期縮短，促使細胞過度增殖形成腫瘤[12]。近年來，不少研究表明Cyclin D1基因參與腫瘤的發生、發展，并被認為是一種促癌基因，其過度表達對腫瘤的診斷和預后具有重要的意義[13-14]。
Cyclin D1與腫瘤分化、浸潤深度、淋巴結轉移、分期和預后的相關性尚不明確。Nagasawa等[15]報道，食管癌Cyclin D1的過表達與淋巴結轉移、淋巴血管侵犯和不良預后有關，是食管癌獨立預后的指標，同時Cyclin D1的表達增高也降低了食管癌對化療的敏感性。張旭等[16]應用組織芯片免疫組織化學法檢測Cyclin D1在食管癌組織中的表達狀態，結果Cyclin D1在晚期食管癌組織中的表達顯著增加，T3和T4期Cyclin D1的表達率為70%，T1和T2期的表達率為40%，兩組表達差異有統計學意義（P<0.05）。另外Cyclin D1表達與腫瘤分化、淋巴結轉移、性別和年齡臨床病理因素的差異均無統計學意義（P>0.05）。Itami等[17]對156例食管癌進行多因素生存分析，Cyclin D1是食管癌獨立的預后因素。另一方面，Shiozaki等[18]的研究指出，Cyclin D1的過表達與淋巴結轉移、淋巴血管侵犯及預后無明顯相關性。Zhao等[19]報道Meta分析20篇（n=2 041例），應用免疫組織化學染色方法研究Cyclin D1與食管鱗癌臨床病理特征和預后的文獻，Meta分析結果顯示，Cyclin D1過表達與食管鱗癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移和分期均顯著相關（P<0.05），有10篇[15, 20-28]Cyclin D1的表達與預后關系的文獻，其中8篇文獻Cyclin D1是食管鱗癌獨立預后因素，2篇文獻Cyclin D1和預后無相關性，合并風險比為1.78（95% CI：1.49-2.12，P=0.000），結果Cyclin D1過表達與食管癌不良預后顯著相關。
導致Cyclin D1的過表達與食管癌預后報道不一致的主要原因可能是目前缺乏統一的、被廣泛接受的免疫組織化學評分方法，由于選用了不同的免疫組織化學評分方法，并且其界點選擇也存在一定的主觀性。我們的研究采用了聯合免疫組織化學染色百分比和染色強度的可重復記分方法，根據ROC曲線分析判定Cyclin D1高表達和低表達的界點，該方法可比較客觀地進行最大整體數量的正確分類。本組以3為判定Cyclin D1高表達和低表達的分界點，Cyclin D1表達與患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤長度、腫瘤分化和腫瘤浸潤深度均無明顯相關性（P>0.05）。Cyclin D1低表達組與高表達組總的1、3、5年生存率分別為87.8%、51.1%、43.3%和79.6%、43.8%、30.7%，差異有統計學意義（P=0.047）；經Cox回歸多因素生存分析Cyclin D1雖然不是T2～3N0M0期食管癌預后的獨立影響因素，但接近有統計學差異（P=0.057）。本組研究結果與多數文獻結果有相似之處，這種研究結果的差別可能與有無食管癌分期分層分析，免疫組織化學評分系統和分界點的選擇不同，樣本量的大小以及病例選擇偏倚等因素有關。因此，Cyclin D1蛋白在食管癌中的表達及與預后的關系還需進行深入地研究。
