引用本文： 熊偉, 袁靈梅, 王梁霞, 錢國文, 梁超軼, 潘斌, 郭靈, 魏文強, 邱勛祥, 鄧文芳, 曾志奎. 黃連素-柚皮苷雙重載藥復合微球的制備及其抗菌-成骨性能評估研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(12): 1505-1513. doi: 10.7507/1002-1892.202308054 復制
骨感染導致的大段骨缺損是臨床治療難題，采用生物材料修復是極具發展前景的治療策略。然而，植入材料通常缺乏抗菌能力，植入人體后易發生細菌感染，而且大多缺乏生物活性，成骨效能欠佳，難以與宿主骨良好融合，最終導致骨修復失敗[1-4]。為避免材料植入后發生感染，臨床常聯合全身應用抗生素方法，但存在因損傷部位局部血運不佳，難以達到有效殺菌濃度[5-7]，以及高濃度藥物不但具有嚴重毒副作用，還可能導致細菌耐藥，增加感染控制難度[8-10]等問題。因此，研發一種在修復骨缺損同時能有效殺死細菌、抑制感染的骨植入材料具有重要臨床意義。
載藥納米微球在克服現有感染性骨缺損修復方式缺點方面表現出巨大潛力[11-14]。介孔生物玻璃微球（mesoporous bioactive glasses，MBG）是骨組織工程研究常用的可降解載藥微球，具有高比表面積、介孔結構和良好生物相容性優點[15-17]，將藥物吸附于微球表面與介孔結構中，可實現緩慢釋放。聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂層易于合成且具有優異生物相容性及降解性能，用其對MBG進行表面改性后，通過在PDA涂層與微球中吸附離子或藥物，可構建具有多重功能的復合微球[18-20]。
黃連素（berberine，BBR）是中藥黃連的一種天然單體化合物，具有廣譜、強效抗菌功能[21-23]。柚皮苷（naringin，NG）是補腎壯骨中藥骨碎補的主要活性單體，能有效調節骨代謝、促進骨損傷修復，以及能誘導BMSCs向成骨分化[24-27]。基于上述既往研究結果，本課題組設計了一種BBR-NG雙重載藥復合微球（NG-MBG@PDA-BBR），首先將促成骨藥物NG負載于MBG，然后將抗菌藥物BBR混合于PDA后對載藥的MBG進行表面改性，以期通過緩慢釋放上述兩種中藥活性成分，實現抗菌和促成骨雙重目的，為臨床治療感染性骨缺損提供一種新材料。本次研究旨在測試該復合微球中NG和BBR的負載與釋放行為，評估其體外抗菌性能、細胞相容性及成骨性能，為下一步體內研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
乙醇、氨水（廣州化學試劑廠）；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、正硅酸鹽四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、四水硝酸鈣（calcium nitrate tetrahydrate，CN）、PDA、BBR、NG（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠BMSCs、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（江西理工大學實驗室保存）；FBS、青霉素和鏈霉素（廣州賽業生物科技有限公司）；ALP染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、活/死細胞染色試劑盒（武漢亞科因生物技術有限公司）；DMEM培養基、茜素紅染色液、胰蛋白酶、PBS緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）。
X射線衍射儀（Bruker公司，德國）；傅里葉紅外光譜儀（Thermoelectrics公司，美國）；比表面積及孔容分析儀（Micromeritics公司，美國）；全自動定量繪圖酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；JEM-F200透射電鏡（JEOL公司，日本）；EVO18掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）；CHT210R高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。
1.2 NG-MBG@PDA-BBR的制備
1.2.1 MBG制備
首先取1.5 mL濃氨水、25 mL無水乙醇和50 mL去離子水制備混合溶液，然后加入0.5 g CTAB于35℃劇烈攪拌，待CTAB溶解后每間隔30 min依次加入2 mL TEOS與0.9 g CN，繼續攪拌24 h后，以離心半徑15 cm、10 000 r/min 離心10 min。 收集白色沉淀物，無水乙醇洗滌3次后超聲分散在200 mL去離子水中，轉移至高壓釜中，于120℃條件下保存12 h。取出樣品待自然冷卻至室溫后，同上法離心后收集白色沉淀物；去離子水洗滌3次，再次同上法離心后收集白色沉淀物，并轉移至冷凍干燥機中冷凍干燥48 h后，轉移至坩堝中在馬弗爐內煅燒，升溫速度設置為5℃/min，至550℃后維持溫度6 h，自然冷卻至常溫，將樣品研磨成細粉末即獲得MBG微球。
1.2.2 NG-MBG制備
稱取30 mg NG與100 mg MBG，依次加入100 mL去離子水中，超聲分散后將溶液在室溫下攪拌24 h。收集溶液轉移至離心管中，同上法離心后收集底層沉淀物，于50℃干燥箱內烘干12 h后，獲得NG-MBG微球。
1.2.3 MBG@PDA制備
稱取500 mg PDA與500 mg MBG，加入100 mL去離子水，室溫下磁力攪拌1 h后添加NaOH調節溶液pH值至10左右，繼續攪拌24 h，收集溶液轉移至離心管中，同上法離心后收集沉淀物，去離子水與乙醇各沖洗3次，干燥后獲得MBG@PDA微球。
1.2.4 NG-MBG@PDA制備
稱取500 mg PDA與500 mg NG-MBG，同1.2.3 MBG@PDA制備方法，獲得NG-MBG@PDA微球。
1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制備
稱取500 mg PDA、500 mg NG-MBG和200 mg BBR，同1.2.3 MBG@PDA制備方法，獲得復合微球NG-MBG@PDA-BBR。見圖1。
圖1
NG-MBG@PDA-BBR制備流程示意圖
Figure1.
Schematic of NG-MBG@PDA-BBR preparation
1.3 觀測指標
1.3.1 微球理化性能表征
① 采用掃描電鏡觀察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR樣品表面形貌和結構。② 比表面積及孔容分析儀測定MBG比表面積。③ X射線衍射儀測定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR化學組成；同時采用小角度X射線衍射觀察MBG和NG-MBG，分析NG是否成功負載于MBG介孔結構。④ 傅里葉紅外光譜儀測定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR分子化學鍵的吸收峰。
1.3.2 復合微球藥物載藥率及釋放量
① NG載藥率測定：稱取5、10、15、20、25、30 mg NG，分別置于100 mL燒杯，加入去離子水溶解并定容至100 mL，NG溶液理論濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/mL。用移液槍分別取上述不同濃度的NG溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶標儀測定283 nm吸收波長處各組溶液吸光度（A）值，計算并繪制NG標準濃度曲線。取1.2.2 NG-MBG制備步驟離心后上清液，同上法測定A值，根據NG標準濃度曲線計算NG剩余量（M1）；同時收集離心沉淀物，用去離子水與乙醇超聲各沖洗3次，干燥后稱取粉末質量（M2），根據以下公式計算NG載藥率： NG載藥率=（30?M1）/［100+（30?M2）］×100%。實驗重復測量3次。
② BBR載藥率測定：稱取2、4、6、8、10、12 mg BBR，分別置于100 mL燒杯中，加入去離子水溶解并定容至100 mL，BBR溶液理論濃度分別為20、40、60、80、100、120 μg/mL。用移液槍分別取上述不同濃度的BBR溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶標儀測定346 nm吸收波長處各組溶液A值，計算并繪制BBR標準濃度曲線。取1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制備步驟離心后的上清液，測量346 nm吸收波長處A值，根據BBR標準曲線計算BBR剩余量（M3）；同時收集離心沉淀物，用去離子水與乙醇超聲各沖洗3次，干燥后稱取粉末質量（M4），根據以下公式計算BBR負載率：BBR載藥率=（200?M3）/M4×100%。實驗重復測量3次。
③ NG與BBR釋放量測定：將10 mg NG-MBG@PDA-BBR浸入10 mL去離子水中，每天更換去離子水，持續14 d。將每天獲得的浸泡液以離心半徑15 cm、10 000 r/min 離心5 min后，收集上清液，采用酶標儀分別在283、346 nm吸收波長處測量A值，根據NG、BBR標準濃度曲線計算NG、BBR釋放量。實驗重復測量3次。
1.3.3 復合微球抗菌性能評價
實驗分為4組，分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組取對應微球樣品與去離子水按照一定比例（樣品∶去離子水=10 mg∶1 mL）混合后靜置24 h，吸取樣品溶液置于96孔板，每孔100 μL，每組3孔；空白對照組添加相同體積去離子水。各孔中分別添加10 μL金黃色葡萄球菌與大腸桿菌細菌懸液（濃度為1×106 CFU/mL），于37℃恒溫培養箱中孵育24 h后，各組取50 μL細菌懸液稀釋10 000倍配置為工作液后，接種于營養瓊脂板；于37℃恒溫培養箱中繼續孵育12 h后，用Image J軟件計數菌落，根據以下公式計算抑菌率：抑菌率=（菌落數空白對照組?菌落數其他實驗組）/菌落數空白對照組×100%。實驗重復測量3次。
1.3.4 復合微球生物相容性評價
實驗分組方法同1.3.3。采用CCK-8法與活/死細胞熒光染色法測定樣品對大鼠BMSCs增殖的影響。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組樣品紫外光照射24 h滅菌后，與細胞培養基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基）混合（樣品∶培養基=10 mg∶1 mL），置于 37 ℃、5%CO2培養箱中24 h，獲得各樣品浸提液。
將大鼠BMSCs接種于96孔板，每孔3×103個；空白對照組添加150 μL細胞培養基，其余各組添加等體積樣品浸提液。于37℃、5%CO2培養箱中培養24、72 h后，各組分別取5孔參照試劑盒說明書行CCK-8檢測與活/死細胞熒光染色觀察。其中，CCK-8檢測以450 nm吸收波長處A值表示細胞活性。活/死細胞熒光染色后于熒光倒置顯微鏡下觀察染色結果，以綠色熒光為活細胞、紅色熒光為死細胞。
1.3.5 復合微球促成骨性能評價
實驗分組方法同1.3.3。將大鼠BMSCs接種于6孔板，每孔3×104個；空白對照組加入3 mL細胞培養基，其余各組添加等體積1.3.4中制備的樣品浸提液。于37℃、5%CO2培養箱中培養7、14 d后，各組分別取3孔，吸棄培養基，多聚甲醛固定1 h，PBS溶液沖洗；室溫下ALP染色（培養7 d）與茜素紅染色（培養14 d）24 h后，光鏡下觀察染色結果，隨機取5個視野以Image J軟件對ALP陽性面積和鈣結節數量進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 微球理化性能表征
2.1.1 掃描電鏡觀察
MBG呈粒徑分布均勻的球形結構，表面光滑且各微球集聚成團；MBG@PDA為球狀黏附沉積物；NG-MBG@PDA與MBG@PDA形貌相似，呈現為聚合的球狀沉積物，PDA涂層均勻分布在微球表面，將各微球緊密聚合；NG-MBG@PDA-BBR微球表面粗糙，存在不規則粗糙片層結構。見圖2a～d。
圖2
微球理化性能表征
a～d. 掃描電鏡觀察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR（×10 k）；e. MBG的N2吸附-脫附曲線；f. X射線衍射圖譜；g. 小角度X射線衍射圖譜；h. 傅里葉紅外光譜
Figure2. Characterization of physical and chemical properties of the microspheresa-d. Scanning electron microscopy observations (×10 k) of MBG, MBG@PDA, NG-MBG@PDA, and NG-MBG@PDA-BBR, respectively; e. N2 adsorption-desorption curves of MBG microspheres; f. X-ray diffraction patterns; g. Low-angle X-ray diffraction patterns; h. Fourier transform infrared spectra
2.1.2 比表面積及孔容分析儀測定
MBG的N2吸附-脫附曲線為典型Ⅳ型等溫線，存在明顯滯后環，提示該微球具有介孔結構，是理想的藥物載體（圖2e）。
2.1.3 X射線衍射測定
X射線衍射圖譜示，MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA和NG-MBG@PDA-BBR均可見位于衍射角22° 附近寬帶，為非晶硅酸鹽材料X射線衍射圖譜典型特征（圖2f）。小角度X射線衍射圖譜顯示NG-MBG微球介孔結構相關的特殊衍射峰（衍射角 2°）與MBG相比明顯下降，提示MBG通過其介孔結構實現對NG的負載。見圖2g。
2.1.4 傅里葉紅外光譜儀測定
紅外光譜示MBG在800 cm?1處存在Si-O-Si特征吸收峰；MBG@PDA該特征峰峰強較MBG略下降，可能與PDA的包裹有關； NG-MBG@PDA在800 cm?1附近特征峰則較MBG略上升，分析與NG在821 cm?1處存在苯環特征吸收峰相關；NG-MBG@PDA-BBR在1 500 cm?1處出現了BBR芳香環骨架振動吸收峰，提示微球中存在BBR。見圖2h。
2.2 復合微球藥物載藥率及釋放量
NG-MBG的NG載藥率為22.4%±0.5%，NG-MBG@PDA-BBR的BBR載藥率為25.1%±0.7%。釋放量觀測示，負載于PDA涂層中的BBR在第1天時展現出快速釋放行為，釋放率達42.7%±1.2%；之后隨時間延長，釋放逐漸放緩并趨于穩定，14 d時累計釋放率達90.2%±1.2%；負載于MBG微球中的NG前3天釋放較穩定，均在10%～15%；第4天時出現1個釋放高峰，當日釋放率達22.9%±0.7%，之后釋放逐漸放緩并趨于穩定，14 d時累計釋放率達60.4%±0.8%。見圖3。
圖3
復合微球藥物釋放曲線
a. 藥物釋放率；b. 藥物累計釋放率
Figure3. Drug release curves of composite microspheresa. Drug release rate; b. Cumulative drug release rate
2.3 復合微球抗菌性能評價
與兩種細菌懸液共培養24 h后，與空白對照組相比，MBG@PDA組菌落數未見明顯變化（P>0.05）；NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組菌落數均下降，其中NG-MBG@PDA-BBR組下降最明顯，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組對金黃色葡萄球菌抑菌率分別為4.6%±0.7%、56.0%±1.7%、78.8%±1.5%，對大腸桿菌抑菌率分別為5.0%±0.6%、55.7%±2.1%、91.5%±2.2%。見圖4。
圖4
復合微球抗菌性能評價
a. 各組培養24 h后金黃色葡萄球菌（上）、大腸桿菌（下）菌落觀察 從左至右分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組；b. 各組金黃色葡萄球菌菌落計數比較；c. 各組大腸桿菌菌落計數比較
Figure4. Antibacterial capability evaluation of composite microspheresa. Colony observation of
2.4 復合微球生物相容性評價
培養24 h，各組活細胞數量相似，組間A值差異均無統計學意義（P>0.05）。72 h時，與空白對照組相比，MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組及NG-MBG@PDA-BBR組活細胞數量均增加，A值均上升且差異有統計學意義（P<0.05）；其中NG-MBG@PDA組A值最高（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR組較NG-MBG@PDA組略下降，但差異無統計學意義（P>0.05），MBG@PDA組A值最低（P<0.05）。見圖5。
圖5
復合微球生物相容性評價
a. 培養24（上）、72 h（下）活/死細胞熒光染色觀察（熒光倒置顯微鏡×20） 從左至右分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組；b. CCK-8檢測細胞
a. Fluorescence staining observation of living/dead cells at 24 (top) and 72 hours (bottom) (Fluorescence inverted microscope×20) From left to right for the blank control group, MBG@PDA group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b.
2.5 復合微球促成骨性能評價
與空白對照組相比，MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組與NG-MBG@PDA-BBR組的ALP陽性面積和鈣結節數量均提高（P<0.05）。各微球組中，NG-MBG@PDA組最多（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR組次之但與前者差異無統計學意義（P>0.05），NGMBG@PDA組最少（P<0.05）。見圖6。
圖6
復合微球促成骨性能評價
a. ALP（上）及茜素紅（下）染色觀察（×20） 從左至右分別為空白對照組、NG-MBG組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組； b. ALP陽性面積相對值； c. 鈣結節計數相對值
Figure6. Osteogenesis evaluation of composite microspheresa. ALP (top) and alizarin red (bottom) staining observation (×20) From left to right for the blank control group, NG-MBG group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b. Relative value of ALP activity-positive area; c. Relative value of calcium nodule counting
3 討論
感染性骨缺損修復是目前骨科棘手難題，通過發揮骨組織工程材料在功能多樣化方面的優勢，有望徹底解決該難題。多功能介孔載藥微球在該領域極具應用潛力，借助介孔微球釋放促成骨分化和強抗菌性藥物成為感染性骨缺損修復領域的研究熱門。
本研究制備的MBG微球展現出良好藥物負載能力，并可通過介孔結構的屏障作用，有效減緩NG釋放速率，實現藥物持續釋放。此外，通過摻雜BBR的PDA涂層對NG-MBG微球進行二次修飾，實現了復合微球對NG與BBR的雙重負載，NG-MBG@PDA-BBR對NG與BBR的載藥率分別達22.4%±0.5%和25.1%±0.7%。藥物釋放率結果表明NG與BBR均可實現14 d持續釋放，累計釋放率分別達60.4%±0.8%與90.2%±1.2%。
BBR是傳統中藥黃連的主要活性生物堿，具有抑菌能力優異、廣譜抗菌與不易產生耐藥性等優勢，對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌表現出較強的抑菌作用，其在低濃度時可抑制細菌生長，高濃度時則可殺滅細菌。本研究通過在復合載藥微球表面修飾BBR，賦予微球抑菌能力。在體外細菌實驗中，NG-MBG@PDA-BBR組對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抑菌率達78.8%±1.5%與91.5%±2.2%，明顯高于其余實驗組。而優異且持續的抗菌性能對復合微球在臨床中的應用推廣具有重要價值[28]。
良好的生物相容性是評估復合微球綜合性能的基礎[29]。NG-MBG/PDA-BBR的主要成分包括MBG、NG、PDA和BBR，均已被證實為低細胞毒性材料，同時MBG與PDA作為載體和表面修飾材料在組織工程修復領域應用廣泛，安全性和可靠性均得到證實。在體外細胞實驗中，與大鼠BMSCs共培養后，相較于空白對照組，MBG@PDA、NG-MBG@PDA與NG-MBG@PDA-BBR組24 h時細胞增殖速率無明顯變化，72 h時細胞數量展現出增加趨勢，說明各組微球均具備良好的生物相容性。
ALP與茜素紅染色常用于評估材料的成骨分化性能[30]。研究表明MBG與PDA不僅有良好的生物相容性，還具備生物可降解性；MBG的離子降解產物，如硅離子、鈣離子與磷離子，一定程度可促進大鼠BMSCs增殖，誘導其成骨分化以加速骨組織修復重建。NG作為骨碎補的主要活性單體，可通過調控多條信號通路參與骨代謝調控，促進BMSCs成骨分化，同時抑制破骨細胞活性，以促進骨再生。本研究結果表明，與空白對照組和MBG@PDA組相比，NG-MBG@PDA-BBR組BMSCs 的ALP陽性面積和鈣結節生成數量顯著提高。同時在MBG@PDA顆粒誘導成骨的基礎上，負載NG可進一步增強誘導成骨性能。
綜上述，本實驗成功制備具有抗菌與成骨性能的多功能復合載藥微球NG-MBG@PDA-BBR。通過體外實驗驗證了該復合微球優異的抗菌能力與誘導成骨分化性能，可實現藥物的持續釋放，后續將進一步采用動物體內實驗以評估復合微球的綜合抗菌與成骨性能。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 熊偉：文章構思與設計、資料收集及論文撰寫；曾志奎：文章構思與設計、審校；錢國文：文章構思與設計；袁靈梅、梁超軼：資料收集；王梁霞、潘斌、郭靈、魏文強、邱勛祥、鄧文芳：數據分析
骨感染導致的大段骨缺損是臨床治療難題，采用生物材料修復是極具發展前景的治療策略。然而，植入材料通常缺乏抗菌能力，植入人體后易發生細菌感染，而且大多缺乏生物活性，成骨效能欠佳，難以與宿主骨良好融合，最終導致骨修復失敗[1-4]。為避免材料植入后發生感染，臨床常聯合全身應用抗生素方法，但存在因損傷部位局部血運不佳，難以達到有效殺菌濃度[5-7]，以及高濃度藥物不但具有嚴重毒副作用，還可能導致細菌耐藥，增加感染控制難度[8-10]等問題。因此，研發一種在修復骨缺損同時能有效殺死細菌、抑制感染的骨植入材料具有重要臨床意義。
載藥納米微球在克服現有感染性骨缺損修復方式缺點方面表現出巨大潛力[11-14]。介孔生物玻璃微球（mesoporous bioactive glasses，MBG）是骨組織工程研究常用的可降解載藥微球，具有高比表面積、介孔結構和良好生物相容性優點[15-17]，將藥物吸附于微球表面與介孔結構中，可實現緩慢釋放。聚多巴胺（polydopamine，PDA）涂層易于合成且具有優異生物相容性及降解性能，用其對MBG進行表面改性后，通過在PDA涂層與微球中吸附離子或藥物，可構建具有多重功能的復合微球[18-20]。
黃連素（berberine，BBR）是中藥黃連的一種天然單體化合物，具有廣譜、強效抗菌功能[21-23]。柚皮苷（naringin，NG）是補腎壯骨中藥骨碎補的主要活性單體，能有效調節骨代謝、促進骨損傷修復，以及能誘導BMSCs向成骨分化[24-27]。基于上述既往研究結果，本課題組設計了一種BBR-NG雙重載藥復合微球（NG-MBG@PDA-BBR），首先將促成骨藥物NG負載于MBG，然后將抗菌藥物BBR混合于PDA后對載藥的MBG進行表面改性，以期通過緩慢釋放上述兩種中藥活性成分，實現抗菌和促成骨雙重目的，為臨床治療感染性骨缺損提供一種新材料。本次研究旨在測試該復合微球中NG和BBR的負載與釋放行為，評估其體外抗菌性能、細胞相容性及成骨性能，為下一步體內研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
乙醇、氨水（廣州化學試劑廠）；十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、正硅酸鹽四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、四水硝酸鈣（calcium nitrate tetrahydrate，CN）、PDA、BBR、NG（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；大鼠BMSCs、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（江西理工大學實驗室保存）；FBS、青霉素和鏈霉素（廣州賽業生物科技有限公司）；ALP染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、活/死細胞染色試劑盒（武漢亞科因生物技術有限公司）；DMEM培養基、茜素紅染色液、胰蛋白酶、PBS緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司）。
X射線衍射儀（Bruker公司，德國）；傅里葉紅外光譜儀（Thermoelectrics公司，美國）；比表面積及孔容分析儀（Micromeritics公司，美國）；全自動定量繪圖酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；JEM-F200透射電鏡（JEOL公司，日本）；EVO18掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；熒光倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）；CHT210R高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。
1.2 NG-MBG@PDA-BBR的制備
1.2.1 MBG制備
首先取1.5 mL濃氨水、25 mL無水乙醇和50 mL去離子水制備混合溶液，然后加入0.5 g CTAB于35℃劇烈攪拌，待CTAB溶解后每間隔30 min依次加入2 mL TEOS與0.9 g CN，繼續攪拌24 h后，以離心半徑15 cm、10 000 r/min 離心10 min。 收集白色沉淀物，無水乙醇洗滌3次后超聲分散在200 mL去離子水中，轉移至高壓釜中，于120℃條件下保存12 h。取出樣品待自然冷卻至室溫后，同上法離心后收集白色沉淀物；去離子水洗滌3次，再次同上法離心后收集白色沉淀物，并轉移至冷凍干燥機中冷凍干燥48 h后，轉移至坩堝中在馬弗爐內煅燒，升溫速度設置為5℃/min，至550℃后維持溫度6 h，自然冷卻至常溫，將樣品研磨成細粉末即獲得MBG微球。
1.2.2 NG-MBG制備
稱取30 mg NG與100 mg MBG，依次加入100 mL去離子水中，超聲分散后將溶液在室溫下攪拌24 h。收集溶液轉移至離心管中，同上法離心后收集底層沉淀物，于50℃干燥箱內烘干12 h后，獲得NG-MBG微球。
1.2.3 MBG@PDA制備
稱取500 mg PDA與500 mg MBG，加入100 mL去離子水，室溫下磁力攪拌1 h后添加NaOH調節溶液pH值至10左右，繼續攪拌24 h，收集溶液轉移至離心管中，同上法離心后收集沉淀物，去離子水與乙醇各沖洗3次，干燥后獲得MBG@PDA微球。
1.2.4 NG-MBG@PDA制備
稱取500 mg PDA與500 mg NG-MBG，同1.2.3 MBG@PDA制備方法，獲得NG-MBG@PDA微球。
1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制備
稱取500 mg PDA、500 mg NG-MBG和200 mg BBR，同1.2.3 MBG@PDA制備方法，獲得復合微球NG-MBG@PDA-BBR。見圖1。
圖1
NG-MBG@PDA-BBR制備流程示意圖
Figure1.
Schematic of NG-MBG@PDA-BBR preparation
1.3 觀測指標
1.3.1 微球理化性能表征
① 采用掃描電鏡觀察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR樣品表面形貌和結構。② 比表面積及孔容分析儀測定MBG比表面積。③ X射線衍射儀測定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR化學組成；同時采用小角度X射線衍射觀察MBG和NG-MBG，分析NG是否成功負載于MBG介孔結構。④ 傅里葉紅外光譜儀測定MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR分子化學鍵的吸收峰。
1.3.2 復合微球藥物載藥率及釋放量
① NG載藥率測定：稱取5、10、15、20、25、30 mg NG，分別置于100 mL燒杯，加入去離子水溶解并定容至100 mL，NG溶液理論濃度分別為50、100、150、200、250、300 μg/mL。用移液槍分別取上述不同濃度的NG溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶標儀測定283 nm吸收波長處各組溶液吸光度（A）值，計算并繪制NG標準濃度曲線。取1.2.2 NG-MBG制備步驟離心后上清液，同上法測定A值，根據NG標準濃度曲線計算NG剩余量（M1）；同時收集離心沉淀物，用去離子水與乙醇超聲各沖洗3次，干燥后稱取粉末質量（M2），根據以下公式計算NG載藥率： NG載藥率=（30?M1）/［100+（30?M2）］×100%。實驗重復測量3次。
② BBR載藥率測定：稱取2、4、6、8、10、12 mg BBR，分別置于100 mL燒杯中，加入去離子水溶解并定容至100 mL，BBR溶液理論濃度分別為20、40、60、80、100、120 μg/mL。用移液槍分別取上述不同濃度的BBR溶液于96孔板，每孔100 μL，使用酶標儀測定346 nm吸收波長處各組溶液A值，計算并繪制BBR標準濃度曲線。取1.2.5 NG-MBG@PDA-BBR制備步驟離心后的上清液，測量346 nm吸收波長處A值，根據BBR標準曲線計算BBR剩余量（M3）；同時收集離心沉淀物，用去離子水與乙醇超聲各沖洗3次，干燥后稱取粉末質量（M4），根據以下公式計算BBR負載率：BBR載藥率=（200?M3）/M4×100%。實驗重復測量3次。
③ NG與BBR釋放量測定：將10 mg NG-MBG@PDA-BBR浸入10 mL去離子水中，每天更換去離子水，持續14 d。將每天獲得的浸泡液以離心半徑15 cm、10 000 r/min 離心5 min后，收集上清液，采用酶標儀分別在283、346 nm吸收波長處測量A值，根據NG、BBR標準濃度曲線計算NG、BBR釋放量。實驗重復測量3次。
1.3.3 復合微球抗菌性能評價
實驗分為4組，分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組取對應微球樣品與去離子水按照一定比例（樣品∶去離子水=10 mg∶1 mL）混合后靜置24 h，吸取樣品溶液置于96孔板，每孔100 μL，每組3孔；空白對照組添加相同體積去離子水。各孔中分別添加10 μL金黃色葡萄球菌與大腸桿菌細菌懸液（濃度為1×106 CFU/mL），于37℃恒溫培養箱中孵育24 h后，各組取50 μL細菌懸液稀釋10 000倍配置為工作液后，接種于營養瓊脂板；于37℃恒溫培養箱中繼續孵育12 h后，用Image J軟件計數菌落，根據以下公式計算抑菌率：抑菌率=（菌落數空白對照組?菌落數其他實驗組）/菌落數空白對照組×100%。實驗重復測量3次。
1.3.4 復合微球生物相容性評價
實驗分組方法同1.3.3。采用CCK-8法與活/死細胞熒光染色法測定樣品對大鼠BMSCs增殖的影響。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組樣品紫外光照射24 h滅菌后，與細胞培養基（含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基）混合（樣品∶培養基=10 mg∶1 mL），置于 37 ℃、5%CO2培養箱中24 h，獲得各樣品浸提液。
將大鼠BMSCs接種于96孔板，每孔3×103個；空白對照組添加150 μL細胞培養基，其余各組添加等體積樣品浸提液。于37℃、5%CO2培養箱中培養24、72 h后，各組分別取5孔參照試劑盒說明書行CCK-8檢測與活/死細胞熒光染色觀察。其中，CCK-8檢測以450 nm吸收波長處A值表示細胞活性。活/死細胞熒光染色后于熒光倒置顯微鏡下觀察染色結果，以綠色熒光為活細胞、紅色熒光為死細胞。
1.3.5 復合微球促成骨性能評價
實驗分組方法同1.3.3。將大鼠BMSCs接種于6孔板，每孔3×104個；空白對照組加入3 mL細胞培養基，其余各組添加等體積1.3.4中制備的樣品浸提液。于37℃、5%CO2培養箱中培養7、14 d后，各組分別取3孔，吸棄培養基，多聚甲醛固定1 h，PBS溶液沖洗；室溫下ALP染色（培養7 d）與茜素紅染色（培養14 d）24 h后，光鏡下觀察染色結果，隨機取5個視野以Image J軟件對ALP陽性面積和鈣結節數量進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 微球理化性能表征
2.1.1 掃描電鏡觀察
MBG呈粒徑分布均勻的球形結構，表面光滑且各微球集聚成團；MBG@PDA為球狀黏附沉積物；NG-MBG@PDA與MBG@PDA形貌相似，呈現為聚合的球狀沉積物，PDA涂層均勻分布在微球表面，將各微球緊密聚合；NG-MBG@PDA-BBR微球表面粗糙，存在不規則粗糙片層結構。見圖2a～d。
圖2
微球理化性能表征
a～d. 掃描電鏡觀察MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA、NG-MBG@PDA-BBR（×10 k）；e. MBG的N2吸附-脫附曲線；f. X射線衍射圖譜；g. 小角度X射線衍射圖譜；h. 傅里葉紅外光譜
Figure2. Characterization of physical and chemical properties of the microspheresa-d. Scanning electron microscopy observations (×10 k) of MBG, MBG@PDA, NG-MBG@PDA, and NG-MBG@PDA-BBR, respectively; e. N2 adsorption-desorption curves of MBG microspheres; f. X-ray diffraction patterns; g. Low-angle X-ray diffraction patterns; h. Fourier transform infrared spectra
2.1.2 比表面積及孔容分析儀測定
MBG的N2吸附-脫附曲線為典型Ⅳ型等溫線，存在明顯滯后環，提示該微球具有介孔結構，是理想的藥物載體（圖2e）。
2.1.3 X射線衍射測定
X射線衍射圖譜示，MBG、MBG@PDA、NG-MBG@PDA和NG-MBG@PDA-BBR均可見位于衍射角22° 附近寬帶，為非晶硅酸鹽材料X射線衍射圖譜典型特征（圖2f）。小角度X射線衍射圖譜顯示NG-MBG微球介孔結構相關的特殊衍射峰（衍射角 2°）與MBG相比明顯下降，提示MBG通過其介孔結構實現對NG的負載。見圖2g。
2.1.4 傅里葉紅外光譜儀測定
紅外光譜示MBG在800 cm?1處存在Si-O-Si特征吸收峰；MBG@PDA該特征峰峰強較MBG略下降，可能與PDA的包裹有關； NG-MBG@PDA在800 cm?1附近特征峰則較MBG略上升，分析與NG在821 cm?1處存在苯環特征吸收峰相關；NG-MBG@PDA-BBR在1 500 cm?1處出現了BBR芳香環骨架振動吸收峰，提示微球中存在BBR。見圖2h。
2.2 復合微球藥物載藥率及釋放量
NG-MBG的NG載藥率為22.4%±0.5%，NG-MBG@PDA-BBR的BBR載藥率為25.1%±0.7%。釋放量觀測示，負載于PDA涂層中的BBR在第1天時展現出快速釋放行為，釋放率達42.7%±1.2%；之后隨時間延長，釋放逐漸放緩并趨于穩定，14 d時累計釋放率達90.2%±1.2%；負載于MBG微球中的NG前3天釋放較穩定，均在10%～15%；第4天時出現1個釋放高峰，當日釋放率達22.9%±0.7%，之后釋放逐漸放緩并趨于穩定，14 d時累計釋放率達60.4%±0.8%。見圖3。
圖3
復合微球藥物釋放曲線
a. 藥物釋放率；b. 藥物累計釋放率
Figure3. Drug release curves of composite microspheresa. Drug release rate; b. Cumulative drug release rate
2.3 復合微球抗菌性能評價
與兩種細菌懸液共培養24 h后，與空白對照組相比，MBG@PDA組菌落數未見明顯變化（P>0.05）；NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組菌落數均下降，其中NG-MBG@PDA-BBR組下降最明顯，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組對金黃色葡萄球菌抑菌率分別為4.6%±0.7%、56.0%±1.7%、78.8%±1.5%，對大腸桿菌抑菌率分別為5.0%±0.6%、55.7%±2.1%、91.5%±2.2%。見圖4。
圖4
復合微球抗菌性能評價
a. 各組培養24 h后金黃色葡萄球菌（上）、大腸桿菌（下）菌落觀察 從左至右分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組；b. 各組金黃色葡萄球菌菌落計數比較；c. 各組大腸桿菌菌落計數比較
Figure4. Antibacterial capability evaluation of composite microspheresa. Colony observation of
2.4 復合微球生物相容性評價
培養24 h，各組活細胞數量相似，組間A值差異均無統計學意義（P>0.05）。72 h時，與空白對照組相比，MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組及NG-MBG@PDA-BBR組活細胞數量均增加，A值均上升且差異有統計學意義（P<0.05）；其中NG-MBG@PDA組A值最高（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR組較NG-MBG@PDA組略下降，但差異無統計學意義（P>0.05），MBG@PDA組A值最低（P<0.05）。見圖5。
圖5
復合微球生物相容性評價
a. 培養24（上）、72 h（下）活/死細胞熒光染色觀察（熒光倒置顯微鏡×20） 從左至右分別為空白對照組、MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組；b. CCK-8檢測細胞
a. Fluorescence staining observation of living/dead cells at 24 (top) and 72 hours (bottom) (Fluorescence inverted microscope×20) From left to right for the blank control group, MBG@PDA group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b.
2.5 復合微球促成骨性能評價
與空白對照組相比，MBG@PDA組、NG-MBG@PDA組與NG-MBG@PDA-BBR組的ALP陽性面積和鈣結節數量均提高（P<0.05）。各微球組中，NG-MBG@PDA組最多（P<0.05），NG-MBG@PDA-BBR組次之但與前者差異無統計學意義（P>0.05），NGMBG@PDA組最少（P<0.05）。見圖6。
圖6
復合微球促成骨性能評價
a. ALP（上）及茜素紅（下）染色觀察（×20） 從左至右分別為空白對照組、NG-MBG組、NG-MBG@PDA組、NG-MBG@PDA-BBR組； b. ALP陽性面積相對值； c. 鈣結節計數相對值
Figure6. Osteogenesis evaluation of composite microspheresa. ALP (top) and alizarin red (bottom) staining observation (×20) From left to right for the blank control group, NG-MBG group, NG-MBG@PDA group, and NG-MBG@PDA-BBR group, respectively; b. Relative value of ALP activity-positive area; c. Relative value of calcium nodule counting
3 討論
感染性骨缺損修復是目前骨科棘手難題，通過發揮骨組織工程材料在功能多樣化方面的優勢，有望徹底解決該難題。多功能介孔載藥微球在該領域極具應用潛力，借助介孔微球釋放促成骨分化和強抗菌性藥物成為感染性骨缺損修復領域的研究熱門。
本研究制備的MBG微球展現出良好藥物負載能力，并可通過介孔結構的屏障作用，有效減緩NG釋放速率，實現藥物持續釋放。此外，通過摻雜BBR的PDA涂層對NG-MBG微球進行二次修飾，實現了復合微球對NG與BBR的雙重負載，NG-MBG@PDA-BBR對NG與BBR的載藥率分別達22.4%±0.5%和25.1%±0.7%。藥物釋放率結果表明NG與BBR均可實現14 d持續釋放，累計釋放率分別達60.4%±0.8%與90.2%±1.2%。
BBR是傳統中藥黃連的主要活性生物堿，具有抑菌能力優異、廣譜抗菌與不易產生耐藥性等優勢，對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌表現出較強的抑菌作用，其在低濃度時可抑制細菌生長，高濃度時則可殺滅細菌。本研究通過在復合載藥微球表面修飾BBR，賦予微球抑菌能力。在體外細菌實驗中，NG-MBG@PDA-BBR組對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抑菌率達78.8%±1.5%與91.5%±2.2%，明顯高于其余實驗組。而優異且持續的抗菌性能對復合微球在臨床中的應用推廣具有重要價值[28]。
良好的生物相容性是評估復合微球綜合性能的基礎[29]。NG-MBG/PDA-BBR的主要成分包括MBG、NG、PDA和BBR，均已被證實為低細胞毒性材料，同時MBG與PDA作為載體和表面修飾材料在組織工程修復領域應用廣泛，安全性和可靠性均得到證實。在體外細胞實驗中，與大鼠BMSCs共培養后，相較于空白對照組，MBG@PDA、NG-MBG@PDA與NG-MBG@PDA-BBR組24 h時細胞增殖速率無明顯變化，72 h時細胞數量展現出增加趨勢，說明各組微球均具備良好的生物相容性。
ALP與茜素紅染色常用于評估材料的成骨分化性能[30]。研究表明MBG與PDA不僅有良好的生物相容性，還具備生物可降解性；MBG的離子降解產物，如硅離子、鈣離子與磷離子，一定程度可促進大鼠BMSCs增殖，誘導其成骨分化以加速骨組織修復重建。NG作為骨碎補的主要活性單體，可通過調控多條信號通路參與骨代謝調控，促進BMSCs成骨分化，同時抑制破骨細胞活性，以促進骨再生。本研究結果表明，與空白對照組和MBG@PDA組相比，NG-MBG@PDA-BBR組BMSCs 的ALP陽性面積和鈣結節生成數量顯著提高。同時在MBG@PDA顆粒誘導成骨的基礎上，負載NG可進一步增強誘導成骨性能。
綜上述，本實驗成功制備具有抗菌與成骨性能的多功能復合載藥微球NG-MBG@PDA-BBR。通過體外實驗驗證了該復合微球優異的抗菌能力與誘導成骨分化性能，可實現藥物的持續釋放，后續將進一步采用動物體內實驗以評估復合微球的綜合抗菌與成骨性能。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 熊偉：文章構思與設計、資料收集及論文撰寫；曾志奎：文章構思與設計、審校；錢國文：文章構思與設計；袁靈梅、梁超軼：資料收集；王梁霞、潘斌、郭靈、魏文強、邱勛祥、鄧文芳：數據分析
