引用本文： 趙少華, 郝曉亮, 菅炎鵬, 王一公, 劉偉杰, 邵欣慰, 樊俊, 徐松山. 肌肉脫細胞基質制備雙重交聯可注射水凝膠用于促進肌母細胞增殖和成肌分化. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(12): 1514-1522. doi: 10.7507/1002-1892.202306054 復制
肌肉組織在人體中扮演重要角色，大面積的肌肉缺損可能導致其功能障礙且無法自愈[1]。研究表明，使用良好設計的生物材料（如水凝膠）進行肌肉再生的組織工程技術具有恢復受損肌肉的潛力[2]。迄今為止，尚未開發出一種理想的具有促進肌母細胞增殖和向肌肉分化能力的可注射水凝膠。由于肌母細胞生長在以天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為主的肌肉特異性微環境中，所以利用肌肉特異性ECM的特點可能有助于肌肉再生[3]。因此，賦予可注射水凝膠具有肌肉特異性ECM微環境，可能會提升肌肉再生效果。
近期研究表明肌肉脫細胞基質（acellular muscular matrix，AMM）具有良好的生物相容性和可忽略的免疫原性，并可為肌肉再生提供必要的再生和分化微環境[4]。因此，本研究擬開發一種基于甲基丙烯酰胺氧化透明質酸（methacrylamidated oxidized hyaluronic acid，MOHA）和氨基化AMM（aminated AMM，AAMM）的雙重交聯可注射水凝膠（MOHA/AAMM），驗證其促進肌母細胞增殖和向肌肉分化的能力，為將來基于AMM制備雙重交聯可注射水凝膠修復大塊肌肉缺損奠定技術和理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C2C12肌母細胞（中國科學院上海細胞庫）。透明質酸（hyaluronic acid，HA）、十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、DNA酶、碳酰二亞胺（carbodiimide，EDC）、乙二醇、甲基丙烯酸酐（Sigma-Aldrich公司，美國）；高碘酸鈉（北京市通廣精細化工公司）；乙醇（上海滬試實驗室器材股份有限公司）；EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1的ELISA試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo公司，日本）；FBS、PBS、0.25%胰蛋白酶、DMEM培養基、胰蛋白酶/EDTA（GIBCO公司，美國）。透析袋（截留相對分子質量為1 000；上海源葉生物科技有限公司）。
FV1200激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；傅立葉變換紅外吸收光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR；Thermo Fisher公司，美國）；Anton Paar MCR302流變儀 ［安東帕（上海）商貿有限公司］；納米壓痕儀（OPTICS Ⅱ公司，荷蘭）；SAFAS MP96微孔板閱讀器（SAFAS公司，法國）。
1.2 水凝膠的制備
1.2.1 MOHA水凝膠的制備
將1 g HA溶解于100 mL水中，攪拌至HA完全溶解；滴加5 mL 0.5 mol/L高碘酸鈉，室溫下暗處以250 r/min速度攪拌2 h；加入1 mL乙二醇，室溫靜置1 h以去除未反應的過碘酸鈉。經過3 d的透析處理后，得到氧化HA（oxidized HA，OHA），并進行凍干；然后通過與甲基丙烯酰酸反應對OHA進行雙鍵修飾，即將1 g OHA溶解于100 mL水中并攪拌至完全溶解，加入1 mL甲基丙烯酰酸于pH 8.0～8.5和4℃條件下反應12 h。使用透析袋將溶液透析2 d，凍干后得到MOHA水凝膠前體樣品。
1.2.2 AMM的制備
從當地屠宰場獲取新鮮豬前腹壁，通過1條剖腹線切開外斜肌，暴露其下覆蓋的前直腹肌筋膜，將腹直肌分離并切成6.0 cm×2.0 cm×0.3 cm的薄片。去除所有可見的脂肪和結締組織后，去離子水中清洗1 h，37℃用0.25%胰蛋白酶/EDTA處理2 h；PBS沖洗1 h，將組織于2%十二烷基硫酸鈉中孵育12 h；PBS清洗2次，每次30 min，將組織置入1%Triton X-100中，每日更換溶液，孵育4 d；然后于37℃用DNA酶處理3 h，PBS沖洗2次，每次30 min，得到AMM。將AMM經凍干和γ射線消毒（30 kGy 60Co；中國科學院上海應用物理研究所）后存放于–80℃備用。
1.2.3 AAMM和MOHA/AAMM水凝膠的制備
取上述制備的AMM于EDC溶液中浸泡過夜進行氨基酸活化，然后用純水洗滌并冷凍干燥，獲得AAMM。然后將MOHA水凝膠前體和AAMM分別溶解于水中形成5 wt%溶液，將該溶液通過席夫堿反應和365 nm紫外光光交聯，制備雙重交聯可注射的MOHA/AAMM水凝膠。見圖1。
圖1
MOHA/AAMM水凝膠制備示意圖
a. 制備MOHA水凝膠；b. 制備AAMM；c. 制備雙重交聯可注射MOHA/AAMM水凝膠
Figure1. Schematic representation of MOHA/AAMM hydrogel preparationa. Preparation of MOHA hydrogel; b. Preparation of AAMM; c. Preparation of dual-crosslinked injectable MOHA/AAMM hydrogel
1.3 觀測指標
1.3.1 FTIR檢測
準備MOHA、AAMM和MOHA/AAMM水凝膠樣品，使用FTIR進行表征，測定樣品中存在的化合物種類和它們之間的鍵合。
1.3.2 MOHA/AAMM水凝膠的可注射性和成膠性能檢測
使用22號針頭手動注射以評估MOHA/AAMM水凝膠的可注射性。然后使用10 mW/cm2紫外光對樣品照射2 min，觀察MOHA/AAMM水凝膠的成膠性能。
1.3.3 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠力學性能檢測
采用流變儀測量MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的黏度。將水凝膠涂覆于平板-平板結構（直徑25 mm）的流變儀底板上，將2塊平板間的間隙設定為1 mm，蓋好流變儀；然后于紫外光刺激情況下測量水凝膠在剪切速率0.1～120.0 s?1的黏度。將兩種水凝膠樣品經過365 nm波長、10 mW/cm2紫外光照射120 s進行動態流變實驗，以固定時間頻率為6 s和1%的應變測定水凝膠的儲存模量（G’）。使用納米壓痕儀以10 μm/s下降速度測定兩種水凝膠的楊氏模量。
1.3.4 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠降解性能檢測
使用重量法評估MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的降解率。首先，將水凝膠干燥并稱重為α；然后，將干燥樣品浸入20 mL PBS（pH=7.4）中，1、3、5、7、9、11、13、15 d后取出樣品，擦干，稱重為β。按以下公式計算降解率：（β?α）/α×100%。
1.3.5 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的活性成分分析
首先，采用免疫熒光染色法分別檢測MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量。然后，采用ELISA試劑盒測定MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中所含生物活性因子EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1的含量。實驗均重復3次，取均值。
1.3.6 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的增殖檢測
① 活/死細胞染色觀察：取濃度為5%（V/W）的MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液，將C2C12肌母細胞以1×106個/mL濃度分別懸浮于兩種水凝膠前體中，采用10 mW/cm2紫外光照射2 min后使其固化成膠，并在含10%FBS的DMEM培養基中進行體外培養。分別于1、5、9 d后，對C2C12肌母細胞進行活/死細胞染色，激光共聚焦顯微鏡觀察兩種水凝膠中肌母細胞的增殖情況（活細胞染成綠色，死細胞染成紅色），采用Image J軟件計數死細胞。
② CCK-8法定量檢測細胞增殖情況：將C2C12肌母細胞以1×106個/mL濃度接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液。每組設3孔，分別加入濃度為5%（V/W）的MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液，孵育4 h后使細胞與MOHA/AAMM和MOHA水凝膠前體充分接觸。每孔加入10 mL CCK-8試劑，孵育3 h后，使用微孔板閱讀器于450 nm波長下測定吸光度（A）值。
1.3.7 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的成肌分化檢測
同1.3.6方法將C2C12肌母細胞與MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液體外培養9 d后，采用免疫熒光染色法檢測肌肉再生相關因子IGF-1的表達。然后使用實時定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分別檢測兩種水凝膠中肌成纖維細胞特異標志物 ［肌原蛋白（Myogenin）、肌鈣蛋白T（Troponin T）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）］基因表達量。使用比較閾值循環方法分析結果，并將靶基因的表達水平歸一化，內源性參考基因β-actin。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences in RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FTIR檢測
FTIR圖譜示，MOHA水凝膠的C=C鍵拉伸帶在1 700 cm?1處，提示成功被甲基丙烯酸酯修飾；AAMM水凝膠的N-H鍵和C-H鍵伸縮振動在3 580 cm?1處，提示氨基化修飾。MOHA/AAMM水凝膠同時包含AAMM和MOHA的特征峰，提示MOHA/AAMM水凝膠制備成功。見圖2a。
圖2
MOHA/AAMM水凝膠的表征
a. FTIR圖譜；b. MOHA/AAMM水凝膠可注射性觀察；c. MOHA/AAMM水凝膠成膠性能觀察
Figure2. Characterization of MOHA/AAMM hydrogelsa. FTIR spectrum; b. Injectability observation of MOHA/AAMM hydrogel; c. Observation on the performance of MOHA/AAMM hydrogel
2.2 MOHA/AAMM水凝膠的可注射性和成膠性能檢測
MOHA/AAMM水凝膠可通過注射針輕松注入小瓶中，并且形成連貫的水凝膠線條（圖2b）。紫外光照射2 min后可見瓶中MOHA/AAMM水凝膠實現液態向固態的轉化（圖2c）。
2.3 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的力學性能和降解性能檢測
相較于MOHA水凝膠，MOHA/AAMM水凝膠在0.1～120.0 s?1剪切速率下表現出更高黏度，且在0～120 s時間范圍內具有更高儲存模量G’，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。MOHA/AAMM水凝膠的楊氏模量為（20.967±3.167）kPa，顯著高于MOHA水凝膠的（14.033±0.929）kPa，差異有統計學意義（t=2.971，P=0.041）。降解性能檢測示，MOHA水凝膠在15 d內幾乎100%降解，而MOHA/AAMM水凝膠僅降解約70%。見圖3。
圖3
MOHA/AAMM和MOHA水凝膠的力學特性和降解性能
a. 黏度；b. 儲存模量G’；c. 體外降解率
Figure3. Mechanical properties and degradation performance of MOHA/AAMM and MOHA hydrogelsa. Viscosity; b. Storage modulus G’; c.
2.4 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的活性成分分析
免疫熒光染色示，MOHA/AAMM水凝膠含有大量紅色陽性深染的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，而MOHA水凝膠幾乎未見陽性染色的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原（圖4）。ELISA檢測示，MOHA/AAMM水凝膠EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1含量分別為（0.598±0.125）、（0.172±0.032）、（1.098±0.112）、（0.158±0.017）ng/μg，MOHA水凝膠分別為（0.088±0.032）、（0.044±0.021）、（0.104±0.025）、（0.058±0.017）ng/μg，差異均有統計學意義（t=7.900，P<0.001；t=6.746，P<0.001；t=17.380，P<0.001；t=8.220，P<0.001）。
圖4
免疫熒光染色分析MOHA（左）和MOHA/AAMM（右）水凝膠的活性成分（激光共聚焦顯微鏡×40）
a. Ⅰ型膠原；b. Ⅲ型膠原
Figure4. Analysis of active components of MOHA (left) and MOHA/AAMM (right) hydrogels by immunofluorescence staining (Laser confocal microscope×40)a. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
2.5 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞增殖檢測
活/死細胞染色觀察示，培養1、5、9 d，與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠中可觀察到更多綠色活細胞和更少紅色死細胞，且C2C12細胞多呈長梭形，而MOHA水凝膠中C2C12細胞多呈圓形。各時間點MOHA/AAMM水凝膠死亡細胞數也明顯少于MOHA水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。圖5、6。CCK-8法檢測示，培養1、5、9 d，MOHA/AAMM水凝膠細胞A值均顯著高于MOHA水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖5
活/死細胞染色觀察水凝膠對肌母細胞增殖的影響（激光共聚焦顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞、二者重疊，從左至右依次為培養1、5、9 d a. MOHA/AAMM水凝膠；b. MOHA水凝膠
Figure5. Effect of hydrogel on myoblasts proliferation observed by living/dead cell staining (Laser scanning confocal microscope×40)From top to bottom for living cells, dead cells, and merge, and from left to right for 1, 5, and 9 days after cultured, respectively a. MOHA/AAMM hydrogel; b. MOHA hydrogel
圖6
MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中死亡細胞數比較
Figure6.
Comparison of the number of dead cells in MOHA and MOHA/AAMM hydrogels
圖7
CCK-8法檢測肌母細胞在MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中的增殖情況
Figure7.
Proliferation of myoblasts in MOHA and MOHA/AAMM hydrogels detected by CCK-8 assay
2.6 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的成肌分化檢測
免疫熒光染色示MOHA/AAMM水凝膠中出現大量紅色深染的IGF-1沉積，而MOHA水凝膠中幾乎未見陽性IGF-1染色。見圖8。
圖8
IGF-1免疫熒光染色觀察水凝膠對肌母細胞的成肌分化的影響（激光共聚焦顯微鏡×40）
a. MOHA/AAMM水凝膠；b. MOHA水凝膠
Figure8. Myogenic differentiation of myoblasts by hydrogel observed by IGF-1 immunofluorescence staining (Laser scanning confocal microscope×40)a. MOHA/AAMM hydrogel; b. MOHA hydrogel
RT-qPCR檢測示，MOHA/AAMM水凝膠中Myogenin、Troponin T和MHC基因表達量分別為4.493±0.723、2.647±0.770和3.753±0.387，MOHA水凝膠中分別為1.327±0.279、0.697±0.189和3.753±0.387，差異均有統計學意義（t=5.778，P=0.005；t=3.794，P=0.019；t=8.848，P<0.001）。
3 討論
目前用于治療肌肉缺損的傳統方法是使用自體肌瓣進行手術修復，但面臨著嚴重手術創傷、低存活率、供體部位發生病變以及缺乏供體來源等多種限制[5]。因此，迫切需要一種新的有效治療肌肉缺損策略。肌肉組織工程的關鍵步驟是制備理想的生物材料支架，使其能夠促進肌母細胞增殖和肌肉發育分化。在各種生物材料中，可注射水凝膠具有突出優點[6]，包括避免創傷和手術切口、減少皮膚愈合時間和切口感染、填補不規則肌肉缺損等。然而，大多數水凝膠是生物惰性的，無法有效促進肌母細胞增殖或表達肌源性標記物[7]。
肌肉特異性ECM由復雜的三維功能分子組成，因此很難在實驗室條件下制備出接近天然肌肉ECM的合成材料[8-9]。既往有研究表明，通過引導機械刺激（如牽拉、壓縮等）來模擬肌肉生物環境，可以有效促進肌肉細胞的生長和分化[10-11]。此外，電生理刺激也可促進肌肉細胞的收縮和增強[12-13]。然而，這些復合支架的制備極其復雜。有研究表明，添加生物活性因子可以顯著促進肌肉再生，如IGF-1在肌細胞分化、肌母細胞增殖和存活中發揮作用[14]。然而，裝載生物活性因子的成本高昂，并且開發緩慢且持續釋放生物活性因子的系統存在很大困難。
近來大量研究表明，AMM保留了多種有利于肌肉再生的活性因子，如EGF、FGF-2、VEGF和IGF-1，可能具有促進肌肉分化的性質[15]。因此，AMM被認為是裝載生物活性因子的理想載體。此外，AMM的可生物降解副產物可以促進內源性祖細胞在肌肉再生反應中遷移和增殖，從而填充缺損組織。因此AMM在肌肉組織工程中具有重要應用前景[16]。
為了克服同種異體肌肉ECM的免疫原性，有必要將肌肉ECM去細胞化。大量研究表明，采用洗滌酶法獲得的AMM可以保留大部分原始生物活性成分，從而保留肌肉特異性微環境[17-18]。因此，本研究采用洗滌酶法獲得AMM，進而用于制備MOHA/AAMM水凝膠。結果顯示制備的MOHA/AAMM水凝膠保留了大量天然膠原蛋白成分（Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原）以及生物活性因子（EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1），為后續促進肌母細胞增殖和分化奠定了基礎。
席夫堿反應常用于創建酰胺鍵，具有強的黏附強度和生物相容性[19]。天然ECM含有固有氨基團[20]，可以通過席夫堿反應與醛基發生反應，形成交聯。N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸是構成透明質酸的重復單元，是蛋白聚糖復合物的分子框架。它具有C=C鍵的順式二醇基團，易于氧化生成反應性醛基團，可以通過席夫堿反應結合形成酰胺鍵。由于HA具有較高的生物相容性和生物活性，已廣泛應用于組織工程，被認為可以增強多種細胞的增殖并減少炎癥[21]。本研究中，首先通過高碘酸鈉進行氧化處理，再通過甲基化改性來制備MOHA水凝膠；隨后將MOHA和AAMM通過席夫堿反應和紫外光交聯進行了雙重交聯，從而制備了雙重交聯可注射MOHA/AAMM水凝膠。結果顯示，紫外光照射前的MOHA/AAMM水凝膠可以通過注射針輕松注射至小瓶內并形成連續線，表明MOHA/AAMM水凝膠中的初始席夫堿反應相對弱交聯，使得該水凝膠具有良好可注射性。MOHA/AAMM水凝膠經紫外光照射后可以輕松凝膠化，這是由于HA被甲基丙烯酸酯成功修飾。力學實驗結果表明，席夫堿反應的存在可以顯著提升MOHA/AAMM水凝膠的力學性能并延緩其降解速率，為肌肉再生提供較長時間的力學支撐。
C2C12細胞系是從肌肉衛星細胞中分化出的多能細胞系，這些細胞的有效融合可以形成肌管。本研究中，我們將C2C12肌母細胞與MOHA/AAMM水凝膠體外共培養9 d，結果顯示與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠顯著促進了C2C12肌母細胞增殖。值得注意的是，活/死細胞染色示MOHA/AAMM水凝膠中的肌母細胞形態更接近于長梭形，而MOHA水凝膠中的肌母細胞則基本呈圓形，表明MOHA/AAMM水凝膠可能促進C2C12肌母細胞的成肌分化。此外，與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠分泌了更多IGF-1，且向肌肉分化相關基因的表達水平均更高，提示MOHA/AAMM水凝膠能夠增強細胞成肌分化。
MOHA/AAMM水凝膠增強細胞成肌分化的潛在機制主要包括以下2個因素：① MOHA/AAMM水凝膠保留了特異性肌肉ECM蛋白，包括膠原蛋白、彈性蛋白、黏附蛋白和蛋白多糖，這些蛋白成分有助于細胞復制、增殖和分化。細胞微環境決定著細胞表達的ECM受體或整合素類型[22]。表達這些受體的細胞結合到其相應的ECM上，從而促進細胞增殖或分化。② MOHA/AAMM水凝膠提供三維培養條件，這是一個強有力的促進肌肉分化信號，從而促進肌肉分化[23]。
綜上述，本研究基于MOHA和氨基化AMM成功制備了一種雙重交聯可注射的MOHA/AAMM水凝膠，體外實驗結果顯示其顯著促進了肌原細胞的增殖和成肌分化，為未來肌肉修復與再生提供了一種全新的治療選擇。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 趙少華、郝曉亮：研究設計；樊俊、徐松山：研究實施；菅炎鵬：數據收集整理及統計分析；劉偉杰、邵欣慰：文章撰寫（起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱）；王一公：行政支持；徐松山：經費支持
肌肉組織在人體中扮演重要角色，大面積的肌肉缺損可能導致其功能障礙且無法自愈[1]。研究表明，使用良好設計的生物材料（如水凝膠）進行肌肉再生的組織工程技術具有恢復受損肌肉的潛力[2]。迄今為止，尚未開發出一種理想的具有促進肌母細胞增殖和向肌肉分化能力的可注射水凝膠。由于肌母細胞生長在以天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）為主的肌肉特異性微環境中，所以利用肌肉特異性ECM的特點可能有助于肌肉再生[3]。因此，賦予可注射水凝膠具有肌肉特異性ECM微環境，可能會提升肌肉再生效果。
近期研究表明肌肉脫細胞基質（acellular muscular matrix，AMM）具有良好的生物相容性和可忽略的免疫原性，并可為肌肉再生提供必要的再生和分化微環境[4]。因此，本研究擬開發一種基于甲基丙烯酰胺氧化透明質酸（methacrylamidated oxidized hyaluronic acid，MOHA）和氨基化AMM（aminated AMM，AAMM）的雙重交聯可注射水凝膠（MOHA/AAMM），驗證其促進肌母細胞增殖和向肌肉分化的能力，為將來基于AMM制備雙重交聯可注射水凝膠修復大塊肌肉缺損奠定技術和理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C2C12肌母細胞（中國科學院上海細胞庫）。透明質酸（hyaluronic acid，HA）、十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、DNA酶、碳酰二亞胺（carbodiimide，EDC）、乙二醇、甲基丙烯酸酐（Sigma-Aldrich公司，美國）；高碘酸鈉（北京市通廣精細化工公司）；乙醇（上海滬試實驗室器材股份有限公司）；EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1的ELISA試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo公司，日本）；FBS、PBS、0.25%胰蛋白酶、DMEM培養基、胰蛋白酶/EDTA（GIBCO公司，美國）。透析袋（截留相對分子質量為1 000；上海源葉生物科技有限公司）。
FV1200激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；傅立葉變換紅外吸收光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR；Thermo Fisher公司，美國）；Anton Paar MCR302流變儀 ［安東帕（上海）商貿有限公司］；納米壓痕儀（OPTICS Ⅱ公司，荷蘭）；SAFAS MP96微孔板閱讀器（SAFAS公司，法國）。
1.2 水凝膠的制備
1.2.1 MOHA水凝膠的制備
將1 g HA溶解于100 mL水中，攪拌至HA完全溶解；滴加5 mL 0.5 mol/L高碘酸鈉，室溫下暗處以250 r/min速度攪拌2 h；加入1 mL乙二醇，室溫靜置1 h以去除未反應的過碘酸鈉。經過3 d的透析處理后，得到氧化HA（oxidized HA，OHA），并進行凍干；然后通過與甲基丙烯酰酸反應對OHA進行雙鍵修飾，即將1 g OHA溶解于100 mL水中并攪拌至完全溶解，加入1 mL甲基丙烯酰酸于pH 8.0～8.5和4℃條件下反應12 h。使用透析袋將溶液透析2 d，凍干后得到MOHA水凝膠前體樣品。
1.2.2 AMM的制備
從當地屠宰場獲取新鮮豬前腹壁，通過1條剖腹線切開外斜肌，暴露其下覆蓋的前直腹肌筋膜，將腹直肌分離并切成6.0 cm×2.0 cm×0.3 cm的薄片。去除所有可見的脂肪和結締組織后，去離子水中清洗1 h，37℃用0.25%胰蛋白酶/EDTA處理2 h；PBS沖洗1 h，將組織于2%十二烷基硫酸鈉中孵育12 h；PBS清洗2次，每次30 min，將組織置入1%Triton X-100中，每日更換溶液，孵育4 d；然后于37℃用DNA酶處理3 h，PBS沖洗2次，每次30 min，得到AMM。將AMM經凍干和γ射線消毒（30 kGy 60Co；中國科學院上海應用物理研究所）后存放于–80℃備用。
1.2.3 AAMM和MOHA/AAMM水凝膠的制備
取上述制備的AMM于EDC溶液中浸泡過夜進行氨基酸活化，然后用純水洗滌并冷凍干燥，獲得AAMM。然后將MOHA水凝膠前體和AAMM分別溶解于水中形成5 wt%溶液，將該溶液通過席夫堿反應和365 nm紫外光光交聯，制備雙重交聯可注射的MOHA/AAMM水凝膠。見圖1。
圖1
MOHA/AAMM水凝膠制備示意圖
a. 制備MOHA水凝膠；b. 制備AAMM；c. 制備雙重交聯可注射MOHA/AAMM水凝膠
Figure1. Schematic representation of MOHA/AAMM hydrogel preparationa. Preparation of MOHA hydrogel; b. Preparation of AAMM; c. Preparation of dual-crosslinked injectable MOHA/AAMM hydrogel
1.3 觀測指標
1.3.1 FTIR檢測
準備MOHA、AAMM和MOHA/AAMM水凝膠樣品，使用FTIR進行表征，測定樣品中存在的化合物種類和它們之間的鍵合。
1.3.2 MOHA/AAMM水凝膠的可注射性和成膠性能檢測
使用22號針頭手動注射以評估MOHA/AAMM水凝膠的可注射性。然后使用10 mW/cm2紫外光對樣品照射2 min，觀察MOHA/AAMM水凝膠的成膠性能。
1.3.3 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠力學性能檢測
采用流變儀測量MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的黏度。將水凝膠涂覆于平板-平板結構（直徑25 mm）的流變儀底板上，將2塊平板間的間隙設定為1 mm，蓋好流變儀；然后于紫外光刺激情況下測量水凝膠在剪切速率0.1～120.0 s?1的黏度。將兩種水凝膠樣品經過365 nm波長、10 mW/cm2紫外光照射120 s進行動態流變實驗，以固定時間頻率為6 s和1%的應變測定水凝膠的儲存模量（G’）。使用納米壓痕儀以10 μm/s下降速度測定兩種水凝膠的楊氏模量。
1.3.4 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠降解性能檢測
使用重量法評估MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的降解率。首先，將水凝膠干燥并稱重為α；然后，將干燥樣品浸入20 mL PBS（pH=7.4）中，1、3、5、7、9、11、13、15 d后取出樣品，擦干，稱重為β。按以下公式計算降解率：（β?α）/α×100%。
1.3.5 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的活性成分分析
首先，采用免疫熒光染色法分別檢測MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量。然后，采用ELISA試劑盒測定MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中所含生物活性因子EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1的含量。實驗均重復3次，取均值。
1.3.6 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的增殖檢測
① 活/死細胞染色觀察：取濃度為5%（V/W）的MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液，將C2C12肌母細胞以1×106個/mL濃度分別懸浮于兩種水凝膠前體中，采用10 mW/cm2紫外光照射2 min后使其固化成膠，并在含10%FBS的DMEM培養基中進行體外培養。分別于1、5、9 d后，對C2C12肌母細胞進行活/死細胞染色，激光共聚焦顯微鏡觀察兩種水凝膠中肌母細胞的增殖情況（活細胞染成綠色，死細胞染成紅色），采用Image J軟件計數死細胞。
② CCK-8法定量檢測細胞增殖情況：將C2C12肌母細胞以1×106個/mL濃度接種至96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液。每組設3孔，分別加入濃度為5%（V/W）的MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液，孵育4 h后使細胞與MOHA/AAMM和MOHA水凝膠前體充分接觸。每孔加入10 mL CCK-8試劑，孵育3 h后，使用微孔板閱讀器于450 nm波長下測定吸光度（A）值。
1.3.7 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的成肌分化檢測
同1.3.6方法將C2C12肌母細胞與MOHA和MOHA/AAMM水凝膠前體懸液體外培養9 d后，采用免疫熒光染色法檢測肌肉再生相關因子IGF-1的表達。然后使用實時定量聚合酶鏈反應（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分別檢測兩種水凝膠中肌成纖維細胞特異標志物 ［肌原蛋白（Myogenin）、肌鈣蛋白T（Troponin T）和肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）］基因表達量。使用比較閾值循環方法分析結果，并將靶基因的表達水平歸一化，內源性參考基因β-actin。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences in RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 FTIR檢測
FTIR圖譜示，MOHA水凝膠的C=C鍵拉伸帶在1 700 cm?1處，提示成功被甲基丙烯酸酯修飾；AAMM水凝膠的N-H鍵和C-H鍵伸縮振動在3 580 cm?1處，提示氨基化修飾。MOHA/AAMM水凝膠同時包含AAMM和MOHA的特征峰，提示MOHA/AAMM水凝膠制備成功。見圖2a。
圖2
MOHA/AAMM水凝膠的表征
a. FTIR圖譜；b. MOHA/AAMM水凝膠可注射性觀察；c. MOHA/AAMM水凝膠成膠性能觀察
Figure2. Characterization of MOHA/AAMM hydrogelsa. FTIR spectrum; b. Injectability observation of MOHA/AAMM hydrogel; c. Observation on the performance of MOHA/AAMM hydrogel
2.2 MOHA/AAMM水凝膠的可注射性和成膠性能檢測
MOHA/AAMM水凝膠可通過注射針輕松注入小瓶中，并且形成連貫的水凝膠線條（圖2b）。紫外光照射2 min后可見瓶中MOHA/AAMM水凝膠實現液態向固態的轉化（圖2c）。
2.3 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的力學性能和降解性能檢測
相較于MOHA水凝膠，MOHA/AAMM水凝膠在0.1～120.0 s?1剪切速率下表現出更高黏度，且在0～120 s時間范圍內具有更高儲存模量G’，兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。MOHA/AAMM水凝膠的楊氏模量為（20.967±3.167）kPa，顯著高于MOHA水凝膠的（14.033±0.929）kPa，差異有統計學意義（t=2.971，P=0.041）。降解性能檢測示，MOHA水凝膠在15 d內幾乎100%降解，而MOHA/AAMM水凝膠僅降解約70%。見圖3。
圖3
MOHA/AAMM和MOHA水凝膠的力學特性和降解性能
a. 黏度；b. 儲存模量G’；c. 體外降解率
Figure3. Mechanical properties and degradation performance of MOHA/AAMM and MOHA hydrogelsa. Viscosity; b. Storage modulus G’; c.
2.4 MOHA和MOHA/AAMM水凝膠的活性成分分析
免疫熒光染色示，MOHA/AAMM水凝膠含有大量紅色陽性深染的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，而MOHA水凝膠幾乎未見陽性染色的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原（圖4）。ELISA檢測示，MOHA/AAMM水凝膠EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1含量分別為（0.598±0.125）、（0.172±0.032）、（1.098±0.112）、（0.158±0.017）ng/μg，MOHA水凝膠分別為（0.088±0.032）、（0.044±0.021）、（0.104±0.025）、（0.058±0.017）ng/μg，差異均有統計學意義（t=7.900，P<0.001；t=6.746，P<0.001；t=17.380，P<0.001；t=8.220，P<0.001）。
圖4
免疫熒光染色分析MOHA（左）和MOHA/AAMM（右）水凝膠的活性成分（激光共聚焦顯微鏡×40）
a. Ⅰ型膠原；b. Ⅲ型膠原
Figure4. Analysis of active components of MOHA (left) and MOHA/AAMM (right) hydrogels by immunofluorescence staining (Laser confocal microscope×40)a. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
2.5 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞增殖檢測
活/死細胞染色觀察示，培養1、5、9 d，與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠中可觀察到更多綠色活細胞和更少紅色死細胞，且C2C12細胞多呈長梭形，而MOHA水凝膠中C2C12細胞多呈圓形。各時間點MOHA/AAMM水凝膠死亡細胞數也明顯少于MOHA水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。圖5、6。CCK-8法檢測示，培養1、5、9 d，MOHA/AAMM水凝膠細胞A值均顯著高于MOHA水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖5
活/死細胞染色觀察水凝膠對肌母細胞增殖的影響（激光共聚焦顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞、二者重疊，從左至右依次為培養1、5、9 d a. MOHA/AAMM水凝膠；b. MOHA水凝膠
Figure5. Effect of hydrogel on myoblasts proliferation observed by living/dead cell staining (Laser scanning confocal microscope×40)From top to bottom for living cells, dead cells, and merge, and from left to right for 1, 5, and 9 days after cultured, respectively a. MOHA/AAMM hydrogel; b. MOHA hydrogel
圖6
MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中死亡細胞數比較
Figure6.
Comparison of the number of dead cells in MOHA and MOHA/AAMM hydrogels
圖7
CCK-8法檢測肌母細胞在MOHA和MOHA/AAMM水凝膠中的增殖情況
Figure7.
Proliferation of myoblasts in MOHA and MOHA/AAMM hydrogels detected by CCK-8 assay
2.6 MOHA/AAMM水凝膠促進肌母細胞的成肌分化檢測
免疫熒光染色示MOHA/AAMM水凝膠中出現大量紅色深染的IGF-1沉積，而MOHA水凝膠中幾乎未見陽性IGF-1染色。見圖8。
圖8
IGF-1免疫熒光染色觀察水凝膠對肌母細胞的成肌分化的影響（激光共聚焦顯微鏡×40）
a. MOHA/AAMM水凝膠；b. MOHA水凝膠
Figure8. Myogenic differentiation of myoblasts by hydrogel observed by IGF-1 immunofluorescence staining (Laser scanning confocal microscope×40)a. MOHA/AAMM hydrogel; b. MOHA hydrogel
RT-qPCR檢測示，MOHA/AAMM水凝膠中Myogenin、Troponin T和MHC基因表達量分別為4.493±0.723、2.647±0.770和3.753±0.387，MOHA水凝膠中分別為1.327±0.279、0.697±0.189和3.753±0.387，差異均有統計學意義（t=5.778，P=0.005；t=3.794，P=0.019；t=8.848，P<0.001）。
3 討論
目前用于治療肌肉缺損的傳統方法是使用自體肌瓣進行手術修復，但面臨著嚴重手術創傷、低存活率、供體部位發生病變以及缺乏供體來源等多種限制[5]。因此，迫切需要一種新的有效治療肌肉缺損策略。肌肉組織工程的關鍵步驟是制備理想的生物材料支架，使其能夠促進肌母細胞增殖和肌肉發育分化。在各種生物材料中，可注射水凝膠具有突出優點[6]，包括避免創傷和手術切口、減少皮膚愈合時間和切口感染、填補不規則肌肉缺損等。然而，大多數水凝膠是生物惰性的，無法有效促進肌母細胞增殖或表達肌源性標記物[7]。
肌肉特異性ECM由復雜的三維功能分子組成，因此很難在實驗室條件下制備出接近天然肌肉ECM的合成材料[8-9]。既往有研究表明，通過引導機械刺激（如牽拉、壓縮等）來模擬肌肉生物環境，可以有效促進肌肉細胞的生長和分化[10-11]。此外，電生理刺激也可促進肌肉細胞的收縮和增強[12-13]。然而，這些復合支架的制備極其復雜。有研究表明，添加生物活性因子可以顯著促進肌肉再生，如IGF-1在肌細胞分化、肌母細胞增殖和存活中發揮作用[14]。然而，裝載生物活性因子的成本高昂，并且開發緩慢且持續釋放生物活性因子的系統存在很大困難。
近來大量研究表明，AMM保留了多種有利于肌肉再生的活性因子，如EGF、FGF-2、VEGF和IGF-1，可能具有促進肌肉分化的性質[15]。因此，AMM被認為是裝載生物活性因子的理想載體。此外，AMM的可生物降解副產物可以促進內源性祖細胞在肌肉再生反應中遷移和增殖，從而填充缺損組織。因此AMM在肌肉組織工程中具有重要應用前景[16]。
為了克服同種異體肌肉ECM的免疫原性，有必要將肌肉ECM去細胞化。大量研究表明，采用洗滌酶法獲得的AMM可以保留大部分原始生物活性成分，從而保留肌肉特異性微環境[17-18]。因此，本研究采用洗滌酶法獲得AMM，進而用于制備MOHA/AAMM水凝膠。結果顯示制備的MOHA/AAMM水凝膠保留了大量天然膠原蛋白成分（Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原）以及生物活性因子（EGF、FGF-2、VEGF、IGF-1），為后續促進肌母細胞增殖和分化奠定了基礎。
席夫堿反應常用于創建酰胺鍵，具有強的黏附強度和生物相容性[19]。天然ECM含有固有氨基團[20]，可以通過席夫堿反應與醛基發生反應，形成交聯。N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸是構成透明質酸的重復單元，是蛋白聚糖復合物的分子框架。它具有C=C鍵的順式二醇基團，易于氧化生成反應性醛基團，可以通過席夫堿反應結合形成酰胺鍵。由于HA具有較高的生物相容性和生物活性，已廣泛應用于組織工程，被認為可以增強多種細胞的增殖并減少炎癥[21]。本研究中，首先通過高碘酸鈉進行氧化處理，再通過甲基化改性來制備MOHA水凝膠；隨后將MOHA和AAMM通過席夫堿反應和紫外光交聯進行了雙重交聯，從而制備了雙重交聯可注射MOHA/AAMM水凝膠。結果顯示，紫外光照射前的MOHA/AAMM水凝膠可以通過注射針輕松注射至小瓶內并形成連續線，表明MOHA/AAMM水凝膠中的初始席夫堿反應相對弱交聯，使得該水凝膠具有良好可注射性。MOHA/AAMM水凝膠經紫外光照射后可以輕松凝膠化，這是由于HA被甲基丙烯酸酯成功修飾。力學實驗結果表明，席夫堿反應的存在可以顯著提升MOHA/AAMM水凝膠的力學性能并延緩其降解速率，為肌肉再生提供較長時間的力學支撐。
C2C12細胞系是從肌肉衛星細胞中分化出的多能細胞系，這些細胞的有效融合可以形成肌管。本研究中，我們將C2C12肌母細胞與MOHA/AAMM水凝膠體外共培養9 d，結果顯示與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠顯著促進了C2C12肌母細胞增殖。值得注意的是，活/死細胞染色示MOHA/AAMM水凝膠中的肌母細胞形態更接近于長梭形，而MOHA水凝膠中的肌母細胞則基本呈圓形，表明MOHA/AAMM水凝膠可能促進C2C12肌母細胞的成肌分化。此外，與MOHA水凝膠相比，MOHA/AAMM水凝膠分泌了更多IGF-1，且向肌肉分化相關基因的表達水平均更高，提示MOHA/AAMM水凝膠能夠增強細胞成肌分化。
MOHA/AAMM水凝膠增強細胞成肌分化的潛在機制主要包括以下2個因素：① MOHA/AAMM水凝膠保留了特異性肌肉ECM蛋白，包括膠原蛋白、彈性蛋白、黏附蛋白和蛋白多糖，這些蛋白成分有助于細胞復制、增殖和分化。細胞微環境決定著細胞表達的ECM受體或整合素類型[22]。表達這些受體的細胞結合到其相應的ECM上，從而促進細胞增殖或分化。② MOHA/AAMM水凝膠提供三維培養條件，這是一個強有力的促進肌肉分化信號，從而促進肌肉分化[23]。
綜上述，本研究基于MOHA和氨基化AMM成功制備了一種雙重交聯可注射的MOHA/AAMM水凝膠，體外實驗結果顯示其顯著促進了肌原細胞的增殖和成肌分化，為未來肌肉修復與再生提供了一種全新的治療選擇。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 趙少華、郝曉亮：研究設計；樊俊、徐松山：研究實施；菅炎鵬：數據收集整理及統計分析；劉偉杰、邵欣慰：文章撰寫（起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱）；王一公：行政支持；徐松山：經費支持
