引用本文： 謝淘, 仲鶴鶴, 金瑛, 劉修齊, 陳方, 向寬, 吳術紅. Runx2基因誘導人羊膜MSCs體外向韌帶成纖維細胞定向分化及促進兔腱-骨愈合的研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(12): 1523-1532. doi: 10.7507/1002-1892.202306010 復制
前交叉韌帶斷裂是臨床常見的膝關節損傷類型，損傷后膝關節不穩定，導致患者生活質量差、活動減少以及膝關節繼發性骨關節炎風險增加[1]。目前，臨床常采用止點修復或重建等方式治療[2]，術后腱-骨愈合過程涉及血管再生、纖維軟骨及骨組織形成，同時有多種細胞及細胞因子參與[3]。正常腱-骨界面是膠原纖維與骨組織的過渡結構，由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組成[4]。該過渡結構可傳遞及緩沖應力、降低腱-骨結合處牽張負荷，并在調節韌帶或肌腱生長、促進膠原纖維重塑方面起重要作用[5]。前交叉韌帶重建后，如腱-骨整合無法再生正常組織或在腱-骨界面形成纖維瘢痕組織，腱-骨愈合不良，將導致手術失敗[6]。為此，學者們探討了多種促進腱-骨愈合方法，例如基于細胞的治療方法、使用生長因子以及各種仿生支架材料等，但相關動物模型研究結果顯示腱-骨愈合后強度仍與正常腱-骨界面有一定差距[7]。
組織工程技術的發展為韌帶損傷治療提供新思路。人羊膜MSCs（human amniotic MSCs，hAMSCs）來自于孕婦分娩后廢棄的胎盤組織，除具有取材方便、免疫原性低或無以及多向分化潛能的干細胞特性[8]外，與研究常用的BMSCs相比，還具有更好的向肌腱/韌帶細胞分化潛能[9]，成為治療多種疾病的潛在干細胞來源[10-11]。 Runx2屬于RUNT家族，是一種成骨特異轉錄因子[12]，具有促進成骨相關基因表達、改善骨微環境，并影響成軟骨細胞和破骨細胞的功能[13]。本課題組前期研究發現，hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化及促進腱-骨愈合過程中伴有Runx2基因的表達[14-15]。但Runx2基因是否具有誘導hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化以及促進腱-骨愈合的能力，目前未見相關文獻報道。為此，本研究擬采用Runx2基因轉染hAMSCs，探討Runx2誘導hAMSCs向韌帶成纖維細胞定向分化的效應，同時將過表達Runx2的hAMSCs復合基質膠（Matrigel）構建細胞-支架復合體，修復兔前交叉韌帶損傷模型，驗證其能否促進腱-骨愈合，為hAMSCs在前交叉韌帶重建臨床應用提供理論支撐。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭白兔12只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg，購自湖南太平生物科技有限公司。動物適應性飼養1周后進行實驗；飼養條件：常規飼料、溫度20～26℃、濕度40%～70%、12 h光照/12 h黑夜。
293A細胞（江西中洪博元生物技術有限公司）；LipofiterTM（上海漢恒生物科技有限公司）；DMEM培養基、DMEM/F12培養基（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；Matrigel（杭州沐昀科技有限公司）；PBS、即用型DAPI染液（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；伊紅染液、Scott藍化液（北京索萊寶科技有限公司）；天狼猩紅染色液（北京金克隆生物試劑有限公司）；Gsafe Red plus核酸染料（GLPBIO公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；超純RNA提取試劑盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）。
倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、偏振光顯微鏡（Olympus公司，日本）；全自動酶標儀、蛋白垂直電泳儀、電泳儀（北京市六一儀器有限公司）；全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；紫外分光光度儀（Implen公司，德國）；熒光PCR儀、 超高靈敏度化學發光成像系統儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。
1.2 hAMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs分離培養及傳代
參考本課題組前期研究方法分離培養hAMSCs[16]。取遵義醫科大學附屬醫院產科健康足月產產婦自愿捐贈胎盤，無菌條件下剝離羊膜，PBS反復沖洗后將羊膜剪成碎片；加入0.02%EDTA-0.125%胰蛋白酶消化2次后，以0.75 g/LⅡ型膠原酶消化并收集細胞濾液，以離心半徑14 cm、1 500 r/min離心8 min，棄上清；加入含10%FBS的L-DMEM/F12培養基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。待細胞融合達80%～90%時進行傳代，取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 hAMSCs鑒定
取融合率達85%以上的第3代細胞，棄培養液，PBS清洗3次，加入0.02%EDTA-0.125%胰蛋白酶于37℃消化3 min，加入等體積終止液終止消化；將消化細胞吹打混勻，以離心半徑14 cm、1 500 r/min離心6 min，棄上清；PBS 吹打重懸細胞，同上條件重復離心2次，調整細胞濃度至1×109個/L后，將細胞懸液裝入流式管中，每管100 μL。室溫下避光分別加入鼠抗人單克隆抗體 CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy、CD73-APC 和陰性對照混合液CD34-PE，避光孵育30 min；每個流式管加入2 mL PBS，充分震蕩，同上條件離心后棄上清，加入250 μL PBS重懸細胞后行流式細胞儀鑒定，計算細胞表面抗原陽性率。
1.3 Runx2腺病毒載體構建及滴度測定
將AdEasy-EF1-MCS載體及含有酶切位點、3×Flag標簽的Runx2多核苷酸序列，分別經KpnⅠ、XhoⅠ酶切后純化；純化后載體及目的片段用T4連接酶連接，使用大腸桿菌DH5-α感受態細胞轉化后進行克隆及質粒抽取，測序確定目的片段已轉入質粒載體。取293A細胞采用含10%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養過夜，待細胞融合率達70%～80%時參照LipofiterTM轉染說明書分別轉染空質粒和pAdEasy-EF1-MCS-3×Flag-Runx2質粒，構建空質粒載體（Ad-NC）和攜帶Runx2基因的腺病毒載體（Ad-Runx2）。轉染48 h后，將培養皿中所有細胞及培養液收集于15 mL離心管，于液氮及37℃水浴反復凍融3次后，以離心半徑14 cm、3 000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液保存于?80℃冰箱。采用半數組織培養感染劑量（TCID50）法檢測Ad-Runx2病毒滴度為1.99×1010 PFU/mL、Ad-NC為4.0×1010 PFU/mL。
1.4 Runx2基因轉染hAMSCs及觀測
實驗分為3組，分別為單純hAMSCs組（空白對照組）、Ad-Runx2轉染hAMSCs組（Ad-Runx2組）、Ad-NC轉染hAMSCs組（Ad-NC組）。
1.4.1 基因轉染
取hAMSCs以4×105個/孔接種于6孔板，培養24 h后細胞融合率達70%～80%時，Ad-Runx2組和Ad-NC組加入4.8 μL LipofiterTM以及對應的1.6 μg Ad-Runx2或Ad-NC，于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后換液，24 h后加入嘌呤霉素對轉染細胞進行篩選，篩選濃度為4 μg/mL；72 h后將存活細胞收集至15 mL離心管中，以離心半徑14 cm、800 r/min離心5 min；棄上清，加入3 mL DMEM培養基，轉移至6孔板中培養，培養同時加入相應濃度嘌呤霉素以保持其抗性。
1.4.2 轉染細胞觀測
首先，實時熒光定量PCR及Western blot檢測3組細胞中Runx2基因及蛋白表達，驗證Ad-Runx2轉染hAMSCs有效性；然后，在細胞轉染相應腺病毒載體后繼續培養3、7 d時，進一步采用實時熒光定量PCR檢測3組韌帶成纖維細胞相關基因 ［VEGF、Ⅰ型膠原、纖連蛋白（Fibronectin）和肌腱蛋白C（Tenascin-C）］ 表達。
① 實時熒光定量PCR檢測：采用Trizol法提取細胞總RNA，RNA 超純提取試劑盒提取mRNA，紫外分光光度計測定mRNA濃度和純度；采用逆轉錄試劑盒獲得的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測Runx2基因以及韌帶成纖維細胞相關基因表達，引物序列見表1。分別以GAPDH以及β-actin作為內參，采用2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量PCR基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Real-time fluorescence quantitative PCR gene primer sequences (5′→3′)
② Western blot檢測：取培養細胞提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣本凝膠電泳后，轉膜、封閉，與一抗（兔抗Runx2 1∶1 000、鼠抗β-actin 1∶2 000）4℃搖床孵育過夜后，再與二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 1∶2 000）4℃孵育2 h，于蛋白條帶滴加發光液，置于超高靈敏度化學發光成像系統中顯影。以β-actin作為內參蛋白，采用Image J軟件分析各目的蛋白相對表達量。
1.5 hAMSCs-Matrigel復合物構建及篩選
將單純hAMSCs以及1.4中轉染不同腺病毒（Ad-NC和Ad-Runx2）的hAMSCs制成單細胞懸液，密度為2×105個/mL；于4℃條件下，分別與Matrigel按照體積比1∶1或1∶2進行混合（空白對照組、Ad-NC組、Ad-Runx2組）后，接種于96孔板，每孔1×104個。置于 37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，于培養后1、3、5、7 d每組取5孔，加入10 μL CCK-8試劑，于培養箱中孵育2 h后，酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值，以細胞增殖情況較好的對應比例復合物進行后續實驗。
1.6 動物實驗
1.6.1 前交叉韌帶重建模型制備及分組
將12只新西蘭白兔隨機分為假手術組（Sham組）、前交叉韌帶重建組（ACLR組）、前交叉韌帶重建+Ad-NC組（Ad-NC組）、前交叉韌帶重建+Ad-Runx2組（Ad-Runx2組）4組，每組3只。各組經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，首先取右后肢2～3 cm長跟腱作為韌帶重建材料。然后，暴露右后肢膝關節，Sham組僅暴露前交叉韌帶，不作其他處理。其他3組切斷前交叉韌帶，自前交叉韌帶脛骨及股骨止點分別由內向外使用2 mm克氏針制作骨隧道，將預先制備的跟腱兩端分別引入股骨和脛骨隧道重建韌帶后，Ad-NC組、Ad-Runx2組用注射器往骨隧道內對應注射1 mL 1.5中制備的最佳hAMSCs-Matrigel復合物，注射后停留3～5 min以防滲漏。最后使用骨錘在骨隧道骨眼處嵌入門型釘，再將兩段線頭結扎固定，關閉切口（圖1）。
圖1
前交叉韌帶重建模型制備
a. 前交叉韌帶損傷模型；b. 取跟腱作為移植物；c. 制作骨隧道；d. 韌帶重建完成
Figure1. Preparation of anterior cruciate ligament reconstruction modela. Anterior cruciate ligament injury model; b. Taking Achilles tendon as a graft; c. Making bone tunnel; d. Ligament reconstruction
1.6.2 大體觀察
術后觀察動物存活情況、有無感染等發生以及右后肢活動恢復情況。術后1個月，采用空氣栓塞法處死全部動物，沿原切口入路暴露植入部位，觀察移植物顏色、質地以及完整性。
1.6.3 組織學觀察
大體觀察后取脛骨韌帶組織，置于4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，制作石蠟切片，片厚4 μm。取部分切片常規HE染色及天狼猩紅染色，分別于光鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況，在偏振光顯微鏡下觀察膠原組織，其中Ⅰ型膠原纖維呈橘黃色或紅色粗纖維狀、Ⅲ型膠原纖維呈綠色細長纖維。
1.6.4 免疫熒光染色觀察
取部分組織切片經烤片、脫蠟、水化后，用胃蛋白酶進行抗原修復。經PBS浸洗后于37℃用5%牛血清白蛋白封閉30 min。向玻片分別滴加一抗（Ⅰ型膠原1∶200、Ⅲ型膠原1∶200、Tenascin-C 1∶200），4℃孵育過夜；次日，玻片復溫至室溫后，PBS 浸洗3次，每次3 min，滴加熒光二抗Cy3（1∶200）。DAPI復染細胞核5 min，洗滌并吸棄玻片上液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.7 統計學方法
采用GraphPad Prism 9.0軟件進行分析。所有實驗均至少重復3次。計量資料采用Shapiro-Wilk方法行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，分離培養3 d后細胞呈長梭形、多觸角，7 d后細胞形態無改變且狀態良好。第3代細胞經流式細胞檢測CD44、CD90、CD105、 CD73表達陽性，CD34表達陰性，符合MSCs表型特征。見圖2。
圖2
hAMSCs細胞形態觀察及鑒定
a、b. 分離培養3、7 d細胞形態（倒置相差顯微鏡×10）；c～g. 流式細胞鑒定CD44、CD90、CD105、 CD73、CD34表達
Figure2. Morphological observation and identification of hAMSCsa, b. Morphology of cells after cultured for 3 and 7 days (Inverted phase contrast microscope×10); c-g. Flow cytometric characterization of CD44, CD90, CD105, CD73, and CD34
2.2 Runx2基因轉染hAMSCs檢測
2.2.1 轉染有效性驗證
Ad-Runx2組、Ad-NC組和空白對照組Runx2蛋白相對表達量分別為0.341±0.083、0.287±0.086、0.131±0.120，Runx2 基因相對表達量分別為12.041±1.504、1.045±0.079、1。Ad-Runx2組Runx2蛋白及基因相對表達量均高于其他兩組（P<0.05），提示Ad-Runx2轉染細胞有效。見圖3a。
圖3
Runx2基因轉染hAMSCs檢測
a. Western blot檢測Runx2蛋白表達電泳圖 1～3分別為空白對照組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；b、c. 實時熒光定量PCR檢測轉染后培養3、7 d hAMSCs 韌帶成纖維細胞相關基因表達
Figure3. hAMSCs detection after transfected with Runx2 genea. Electrophoretic graphs of Runx2 protein expression by Western blot 1-3 for blank control group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; b, c. Ligament fibroblast-related gene expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR at 3 and 7 days after transfection
2.2.2 轉染后hAMSCs 韌帶成纖維細胞相關基因的表達
轉染后培養3 d時，Ad-Runx2組 VEGF、Ⅰ型膠原、Fibronectin、Tenascin-C基因相對表達量均高于Ad-NC組和空白對照組，其中前3個基因差異有統計學意義（P<0.05），見圖3b。
培養7 d時，Ad-Runx2組VEGF、Ⅰ型膠原基因相對表達量亦高于Ad-NC組和空白對照組（P<0.05），Tenascin-C基因相對表達量高于空白對照組（P<0.05），而Fibronectin基因相對表達量低于Ad-NC組（P<0.05），見圖3c。
2.3 hAMSCs-Matrigel復合物構建比例篩選
兩種比例混合培養后，各時間點3 組組間A值差異均無統計學意義（P>0.05）；隨著培養時間延長，3組組內A值差異亦無統計學意義（P>0.05）。見圖4。上述結果表明Matrigel對hAMSCs增殖無影響，選擇1∶1比例構建的hAMSCs-Matrigel復合物進行后續實驗。
圖4
hAMSCs以及Matrigel復合培養后CCK-8檢測細胞增殖
a. 1∶1；b. 2∶1
Figure4. Cell proliferation detected by CCK-8 after hAMSCs cultured with Matrigela. 1∶1; b. 2∶1
2.4 動物實驗
2.4.1 大體觀察
術后各組動物均存活至實驗完成，未出現切口感染及膝關節積液等情況，右后肢關節功能恢復良好。術后1個月，大體觀察見各組移植肌腱連續性完整，組織彈性好，移植肌腱關節內無松弛、變性壞死，半月板及關節軟骨未見明顯磨損。見圖5。
圖5
術后1個月大體觀察
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組
Figure5. Gross observation at 1 month after operationFrom left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively
2.4.2 組織學檢查
HE染色：Sham組為正常腱-骨界面，組織形態規則，膠原纖維多且排列有序，無炎癥細胞；ACLR組見炎癥細胞浸潤，組織形態不規則，膠原少；Ad-NC組見復合物與組織并存以及較多炎癥細胞浸潤；Ad-Runx2組組織修復情況優于ACLR組和 Ad-NC組，炎癥細胞更少。見圖6a。
圖6
術后1個月組織學觀察
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組 a. HE染色（×40）；b. 天狼猩紅染色（偏振光顯微鏡×20）
Figure6. Histological observation at 1 month after operationFrom left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively a. HE staining (×40); b. Sirius red staining (Polarized light microscope×20)
天狼猩紅染色：Sham組中可見大量膠原纖維且呈波浪狀規則排列；Ad-NC組和Ad-Runx2組韌帶組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維均多于ACLR組，且Ad-Runx2組Ⅰ型膠原纖維較Ad-NC組更多。Ad-Runx2 組組內Ⅰ型膠原纖維多于Ⅲ型膠原纖維，膠原凝集成束，排列有序，趨于形成正常 ACL 結構。見圖6b。
2.4.3 免疫熒光染色觀察
Sham組韌帶組織可見大量Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，排列有序，其中Tenascin-C蛋白熒光強度較弱，Ⅲ型膠原蛋白熒光強度低于Ad-Runx2組；ACLR組和Ad-NC組韌帶組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度相似，無明顯差異，但ACLR組Tenascin-C蛋白熒光強度與其余3組相比最強；Ad-Runx2組韌帶組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度與Ad-NC組相比顯著增強，Tenascin-C蛋白熒光強度與ACLR組和Ad-NC組相比減弱。見圖7～9。
圖7
術后1個月Ⅰ型膠原免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Ⅰ型膠原染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure7. Immunofluorescence staining of collagen typeⅠat 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for collagen typeⅠstaining, DAPI staining, and merge, respectively
圖8
術后1個月Ⅲ型膠原免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Ⅲ型膠原染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure8. Immunofluorescence staining of collagen type Ⅲ at 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for collagen type Ⅲ staining, DAPI staining, and merge, respectively
圖9
術后1個月Tenascin-C免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Tenascin-C染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure9. Immunofluorescence staining of Tenascin-C at 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for Tenascin-C staining, DAPI staining, and merge, respectively
3 討論
前交叉韌帶損傷后常采用止點修復和重建的方式進行治療，但術后存在愈合緩慢、腱-骨不愈合、腱-骨愈合部位機械強度差等問題，導致遠期療效欠佳[17-18]。因此，深入了解腱-骨界面組織結構及其愈合機制對臨床肌腱-骨止點損傷的修復和重建具有重要意義。
相關研究已經證明hAMSCs具有向韌帶成纖維細胞分化的能力，并在誘導因子作用下具有促進腱-骨愈合作用[16, 19]。Runx2是骨骼發育的重要轉錄因子，對成骨細胞分化和軟骨細胞成熟至關重要[20]。Xu等[21]通過腺病毒載體將Runx2基因轉染至MSCs后，植入兔股骨頭壞死模型中，6周后發現Ad-Runx2組壞死的股骨頭基本修復并被豐富的軟骨和骨組織覆蓋，修復效果明顯優于Runx2-小干擾RNA組、MSCs組和壞死模型組。Byers等[22]利用三維聚合物支架和過表達 Runx2 的MSCs制作組織工程構建體，隨后植入大鼠腓腸肌缺損處，并使用micro-CT 和組織形態計量學方法分析骨愈合情況。結果顯示Runx2修飾的構建體所含骨量是無Runx2修飾構建體2倍，提示Runx2能促進骨愈合。
本研究顯示通過腺病毒能將Runx2 基因成功轉染至hAMSCs，且轉染后細胞韌帶成纖維細胞相關基因相對表達量呈總體增加趨勢，提示其能向韌帶方向分化，表明Runx2具有促進hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化的潛力。Matrigel具有良好成膠性，為了讓hAMSCs更好地附著在腱-骨界面，我們將hAMSCs與Matrigel混合構建復合物進行移植。CCK-8檢測示兩者無論以1∶1或2∶1比例混合培養，支架上的細胞活性無明顯差異，且隨著培養時間延長，細胞增殖也無明顯變化，表明Matrigel對細胞增殖無影響。然后將細胞-支架復合物植入兔前交叉韌帶損傷重建模型中，觀察其對腱-骨愈合的作用。HE染色顯示ACLR組中韌帶組織發生炎癥反應，提示模型構建成功；Ad-NC組中有較多炎癥細胞浸潤，表明直接應用空載病毒轉染hAMSCs時，Matrigel會引起組織炎癥反應；而Ad-Runx2組組織修復情況較前兩組更好、炎癥細胞更少。
韌帶組織主要由膠原蛋白組成，膠原蛋白的持續合成是維持健康細胞外基質的必需條件[23]。其中，Ⅰ型膠原蛋白是韌帶細胞外基質主要組成部分，對于維持肌腱細胞表型和功能具有重要作用[24]。本研究采用天狼猩紅染色檢測韌帶組織中膠原構成，結果顯示相比于ACLR組和Ad-NC組，Ad-Runx2組韌帶組織中Ⅰ型膠原纖維含量逐漸上升，表明過表達Runx2的細胞懸液復合Matrigel支架后有助于脛骨韌帶組織修復。López等[25]認為在韌帶損傷后的修復過程中，Ⅲ型/Ⅰ型膠原纖維比例增高可能是韌帶細胞外基質組織不良的原因，這不僅會影響韌帶結構，還可能導致韌帶修復效果不佳。而本研究中Ad-Runx2組的Ⅰ型膠原纖維含量明顯高于Ⅲ型膠原纖維，表明該組韌帶組織修復效果最好，新生組織中膠原成分接近于正常韌帶組織。免疫熒光染色顯示Ad-Runx2組中韌帶組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度顯著增強，同樣表明過表達干預后的hAMSCs-Matrigel復合物有助于脛骨部位腱-骨界面修復。而對于Tenascin-C蛋白，ACLR組熒光強度最強、Ad-Runx2組較弱。相關研究表明Tenascin-C的表達與軟骨發育有關，在軟骨細胞成熟過程中其表達減少[26]。hAMSCs具有多向分化潛能，不僅可以向韌帶成纖維細胞分化，還能向軟骨細胞分化，分析過表達Runx2后Tenascin-C下降原因可能與hAMSCs成軟骨細胞效應有關，從而抑制了Tenascin-C表達，但具體原因尚不清楚。
綜上述，Runx2基因轉染hAMSCs后可以促進hAMSCs向韌帶成纖維細胞的分化，并能加速兔前交叉韌帶重建后腱-骨界面愈合，為韌帶損傷修復及促進腱-骨愈合提供了新思路。但本研究僅選擇了術后1個月觀察腱-骨愈合情況，而愈合是一個逐漸變化的過程，有待后續研究進行多時間點動態觀察；此外，對于修復機制也需要進一步探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經遵義醫科大學附屬醫院生物醫學研究倫理委員會批準（KLL-2021-303）；動物使用許可證號：SYXK（贛）2020-0001
作者貢獻聲明 謝淘：實驗設計及撰寫文章；仲鶴鶴、吳術紅：實驗方案評估及審校；全部作者參與實驗操作
前交叉韌帶斷裂是臨床常見的膝關節損傷類型，損傷后膝關節不穩定，導致患者生活質量差、活動減少以及膝關節繼發性骨關節炎風險增加[1]。目前，臨床常采用止點修復或重建等方式治療[2]，術后腱-骨愈合過程涉及血管再生、纖維軟骨及骨組織形成，同時有多種細胞及細胞因子參與[3]。正常腱-骨界面是膠原纖維與骨組織的過渡結構，由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨組成[4]。該過渡結構可傳遞及緩沖應力、降低腱-骨結合處牽張負荷，并在調節韌帶或肌腱生長、促進膠原纖維重塑方面起重要作用[5]。前交叉韌帶重建后，如腱-骨整合無法再生正常組織或在腱-骨界面形成纖維瘢痕組織，腱-骨愈合不良，將導致手術失敗[6]。為此，學者們探討了多種促進腱-骨愈合方法，例如基于細胞的治療方法、使用生長因子以及各種仿生支架材料等，但相關動物模型研究結果顯示腱-骨愈合后強度仍與正常腱-骨界面有一定差距[7]。
組織工程技術的發展為韌帶損傷治療提供新思路。人羊膜MSCs（human amniotic MSCs，hAMSCs）來自于孕婦分娩后廢棄的胎盤組織，除具有取材方便、免疫原性低或無以及多向分化潛能的干細胞特性[8]外，與研究常用的BMSCs相比，還具有更好的向肌腱/韌帶細胞分化潛能[9]，成為治療多種疾病的潛在干細胞來源[10-11]。 Runx2屬于RUNT家族，是一種成骨特異轉錄因子[12]，具有促進成骨相關基因表達、改善骨微環境，并影響成軟骨細胞和破骨細胞的功能[13]。本課題組前期研究發現，hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化及促進腱-骨愈合過程中伴有Runx2基因的表達[14-15]。但Runx2基因是否具有誘導hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化以及促進腱-骨愈合的能力，目前未見相關文獻報道。為此，本研究擬采用Runx2基因轉染hAMSCs，探討Runx2誘導hAMSCs向韌帶成纖維細胞定向分化的效應，同時將過表達Runx2的hAMSCs復合基質膠（Matrigel）構建細胞-支架復合體，修復兔前交叉韌帶損傷模型，驗證其能否促進腱-骨愈合，為hAMSCs在前交叉韌帶重建臨床應用提供理論支撐。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭白兔12只，雌雄不限，體質量2.0～2.5 kg，購自湖南太平生物科技有限公司。動物適應性飼養1周后進行實驗；飼養條件：常規飼料、溫度20～26℃、濕度40%～70%、12 h光照/12 h黑夜。
293A細胞（江西中洪博元生物技術有限公司）；LipofiterTM（上海漢恒生物科技有限公司）；DMEM培養基、DMEM/F12培養基（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；Matrigel（杭州沐昀科技有限公司）；PBS、即用型DAPI染液（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術有限公司）；伊紅染液、Scott藍化液（北京索萊寶科技有限公司）；天狼猩紅染色液（北京金克隆生物試劑有限公司）；Gsafe Red plus核酸染料（GLPBIO公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；超純RNA提取試劑盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）。
倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、偏振光顯微鏡（Olympus公司，日本）；全自動酶標儀、蛋白垂直電泳儀、電泳儀（北京市六一儀器有限公司）；全自動化學發光圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；紫外分光光度儀（Implen公司，德國）；熒光PCR儀、 超高靈敏度化學發光成像系統儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司）。
1.2 hAMSCs分離培養及鑒定
1.2.1 hAMSCs分離培養及傳代
參考本課題組前期研究方法分離培養hAMSCs[16]。取遵義醫科大學附屬醫院產科健康足月產產婦自愿捐贈胎盤，無菌條件下剝離羊膜，PBS反復沖洗后將羊膜剪成碎片；加入0.02%EDTA-0.125%胰蛋白酶消化2次后，以0.75 g/LⅡ型膠原酶消化并收集細胞濾液，以離心半徑14 cm、1 500 r/min離心8 min，棄上清；加入含10%FBS的L-DMEM/F12培養基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。待細胞融合達80%～90%時進行傳代，取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 hAMSCs鑒定
取融合率達85%以上的第3代細胞，棄培養液，PBS清洗3次，加入0.02%EDTA-0.125%胰蛋白酶于37℃消化3 min，加入等體積終止液終止消化；將消化細胞吹打混勻，以離心半徑14 cm、1 500 r/min離心6 min，棄上清；PBS 吹打重懸細胞，同上條件重復離心2次，調整細胞濃度至1×109個/L后，將細胞懸液裝入流式管中，每管100 μL。室溫下避光分別加入鼠抗人單克隆抗體 CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy、CD73-APC 和陰性對照混合液CD34-PE，避光孵育30 min；每個流式管加入2 mL PBS，充分震蕩，同上條件離心后棄上清，加入250 μL PBS重懸細胞后行流式細胞儀鑒定，計算細胞表面抗原陽性率。
1.3 Runx2腺病毒載體構建及滴度測定
將AdEasy-EF1-MCS載體及含有酶切位點、3×Flag標簽的Runx2多核苷酸序列，分別經KpnⅠ、XhoⅠ酶切后純化；純化后載體及目的片段用T4連接酶連接，使用大腸桿菌DH5-α感受態細胞轉化后進行克隆及質粒抽取，測序確定目的片段已轉入質粒載體。取293A細胞采用含10%FBS的DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養過夜，待細胞融合率達70%～80%時參照LipofiterTM轉染說明書分別轉染空質粒和pAdEasy-EF1-MCS-3×Flag-Runx2質粒，構建空質粒載體（Ad-NC）和攜帶Runx2基因的腺病毒載體（Ad-Runx2）。轉染48 h后，將培養皿中所有細胞及培養液收集于15 mL離心管，于液氮及37℃水浴反復凍融3次后，以離心半徑14 cm、3 000 r/min離心5 min，收集含病毒的上清液保存于?80℃冰箱。采用半數組織培養感染劑量（TCID50）法檢測Ad-Runx2病毒滴度為1.99×1010 PFU/mL、Ad-NC為4.0×1010 PFU/mL。
1.4 Runx2基因轉染hAMSCs及觀測
實驗分為3組，分別為單純hAMSCs組（空白對照組）、Ad-Runx2轉染hAMSCs組（Ad-Runx2組）、Ad-NC轉染hAMSCs組（Ad-NC組）。
1.4.1 基因轉染
取hAMSCs以4×105個/孔接種于6孔板，培養24 h后細胞融合率達70%～80%時，Ad-Runx2組和Ad-NC組加入4.8 μL LipofiterTM以及對應的1.6 μg Ad-Runx2或Ad-NC，于37℃、5%CO2培養箱中培養6 h后換液，24 h后加入嘌呤霉素對轉染細胞進行篩選，篩選濃度為4 μg/mL；72 h后將存活細胞收集至15 mL離心管中，以離心半徑14 cm、800 r/min離心5 min；棄上清，加入3 mL DMEM培養基，轉移至6孔板中培養，培養同時加入相應濃度嘌呤霉素以保持其抗性。
1.4.2 轉染細胞觀測
首先，實時熒光定量PCR及Western blot檢測3組細胞中Runx2基因及蛋白表達，驗證Ad-Runx2轉染hAMSCs有效性；然后，在細胞轉染相應腺病毒載體后繼續培養3、7 d時，進一步采用實時熒光定量PCR檢測3組韌帶成纖維細胞相關基因 ［VEGF、Ⅰ型膠原、纖連蛋白（Fibronectin）和肌腱蛋白C（Tenascin-C）］ 表達。
① 實時熒光定量PCR檢測：采用Trizol法提取細胞總RNA，RNA 超純提取試劑盒提取mRNA，紫外分光光度計測定mRNA濃度和純度；采用逆轉錄試劑盒獲得的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測Runx2基因以及韌帶成纖維細胞相關基因表達，引物序列見表1。分別以GAPDH以及β-actin作為內參，采用2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。
表1
實時熒光定量PCR基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Real-time fluorescence quantitative PCR gene primer sequences (5′→3′)
② Western blot檢測：取培養細胞提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣本凝膠電泳后，轉膜、封閉，與一抗（兔抗Runx2 1∶1 000、鼠抗β-actin 1∶2 000）4℃搖床孵育過夜后，再與二抗（辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 1∶2 000）4℃孵育2 h，于蛋白條帶滴加發光液，置于超高靈敏度化學發光成像系統中顯影。以β-actin作為內參蛋白，采用Image J軟件分析各目的蛋白相對表達量。
1.5 hAMSCs-Matrigel復合物構建及篩選
將單純hAMSCs以及1.4中轉染不同腺病毒（Ad-NC和Ad-Runx2）的hAMSCs制成單細胞懸液，密度為2×105個/mL；于4℃條件下，分別與Matrigel按照體積比1∶1或1∶2進行混合（空白對照組、Ad-NC組、Ad-Runx2組）后，接種于96孔板，每孔1×104個。置于 37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，于培養后1、3、5、7 d每組取5孔，加入10 μL CCK-8試劑，于培養箱中孵育2 h后，酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值，以細胞增殖情況較好的對應比例復合物進行后續實驗。
1.6 動物實驗
1.6.1 前交叉韌帶重建模型制備及分組
將12只新西蘭白兔隨機分為假手術組（Sham組）、前交叉韌帶重建組（ACLR組）、前交叉韌帶重建+Ad-NC組（Ad-NC組）、前交叉韌帶重建+Ad-Runx2組（Ad-Runx2組）4組，每組3只。各組經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，首先取右后肢2～3 cm長跟腱作為韌帶重建材料。然后，暴露右后肢膝關節，Sham組僅暴露前交叉韌帶，不作其他處理。其他3組切斷前交叉韌帶，自前交叉韌帶脛骨及股骨止點分別由內向外使用2 mm克氏針制作骨隧道，將預先制備的跟腱兩端分別引入股骨和脛骨隧道重建韌帶后，Ad-NC組、Ad-Runx2組用注射器往骨隧道內對應注射1 mL 1.5中制備的最佳hAMSCs-Matrigel復合物，注射后停留3～5 min以防滲漏。最后使用骨錘在骨隧道骨眼處嵌入門型釘，再將兩段線頭結扎固定，關閉切口（圖1）。
圖1
前交叉韌帶重建模型制備
a. 前交叉韌帶損傷模型；b. 取跟腱作為移植物；c. 制作骨隧道；d. 韌帶重建完成
Figure1. Preparation of anterior cruciate ligament reconstruction modela. Anterior cruciate ligament injury model; b. Taking Achilles tendon as a graft; c. Making bone tunnel; d. Ligament reconstruction
1.6.2 大體觀察
術后觀察動物存活情況、有無感染等發生以及右后肢活動恢復情況。術后1個月，采用空氣栓塞法處死全部動物，沿原切口入路暴露植入部位，觀察移植物顏色、質地以及完整性。
1.6.3 組織學觀察
大體觀察后取脛骨韌帶組織，置于4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，制作石蠟切片，片厚4 μm。取部分切片常規HE染色及天狼猩紅染色，分別于光鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況，在偏振光顯微鏡下觀察膠原組織，其中Ⅰ型膠原纖維呈橘黃色或紅色粗纖維狀、Ⅲ型膠原纖維呈綠色細長纖維。
1.6.4 免疫熒光染色觀察
取部分組織切片經烤片、脫蠟、水化后，用胃蛋白酶進行抗原修復。經PBS浸洗后于37℃用5%牛血清白蛋白封閉30 min。向玻片分別滴加一抗（Ⅰ型膠原1∶200、Ⅲ型膠原1∶200、Tenascin-C 1∶200），4℃孵育過夜；次日，玻片復溫至室溫后，PBS 浸洗3次，每次3 min，滴加熒光二抗Cy3（1∶200）。DAPI復染細胞核5 min，洗滌并吸棄玻片上液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.7 統計學方法
采用GraphPad Prism 9.0軟件進行分析。所有實驗均至少重復3次。計量資料采用Shapiro-Wilk方法行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hAMSCs細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，分離培養3 d后細胞呈長梭形、多觸角，7 d后細胞形態無改變且狀態良好。第3代細胞經流式細胞檢測CD44、CD90、CD105、 CD73表達陽性，CD34表達陰性，符合MSCs表型特征。見圖2。
圖2
hAMSCs細胞形態觀察及鑒定
a、b. 分離培養3、7 d細胞形態（倒置相差顯微鏡×10）；c～g. 流式細胞鑒定CD44、CD90、CD105、 CD73、CD34表達
Figure2. Morphological observation and identification of hAMSCsa, b. Morphology of cells after cultured for 3 and 7 days (Inverted phase contrast microscope×10); c-g. Flow cytometric characterization of CD44, CD90, CD105, CD73, and CD34
2.2 Runx2基因轉染hAMSCs檢測
2.2.1 轉染有效性驗證
Ad-Runx2組、Ad-NC組和空白對照組Runx2蛋白相對表達量分別為0.341±0.083、0.287±0.086、0.131±0.120，Runx2 基因相對表達量分別為12.041±1.504、1.045±0.079、1。Ad-Runx2組Runx2蛋白及基因相對表達量均高于其他兩組（P<0.05），提示Ad-Runx2轉染細胞有效。見圖3a。
圖3
Runx2基因轉染hAMSCs檢測
a. Western blot檢測Runx2蛋白表達電泳圖 1～3分別為空白對照組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；b、c. 實時熒光定量PCR檢測轉染后培養3、7 d hAMSCs 韌帶成纖維細胞相關基因表達
Figure3. hAMSCs detection after transfected with Runx2 genea. Electrophoretic graphs of Runx2 protein expression by Western blot 1-3 for blank control group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; b, c. Ligament fibroblast-related gene expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR at 3 and 7 days after transfection
2.2.2 轉染后hAMSCs 韌帶成纖維細胞相關基因的表達
轉染后培養3 d時，Ad-Runx2組 VEGF、Ⅰ型膠原、Fibronectin、Tenascin-C基因相對表達量均高于Ad-NC組和空白對照組，其中前3個基因差異有統計學意義（P<0.05），見圖3b。
培養7 d時，Ad-Runx2組VEGF、Ⅰ型膠原基因相對表達量亦高于Ad-NC組和空白對照組（P<0.05），Tenascin-C基因相對表達量高于空白對照組（P<0.05），而Fibronectin基因相對表達量低于Ad-NC組（P<0.05），見圖3c。
2.3 hAMSCs-Matrigel復合物構建比例篩選
兩種比例混合培養后，各時間點3 組組間A值差異均無統計學意義（P>0.05）；隨著培養時間延長，3組組內A值差異亦無統計學意義（P>0.05）。見圖4。上述結果表明Matrigel對hAMSCs增殖無影響，選擇1∶1比例構建的hAMSCs-Matrigel復合物進行后續實驗。
圖4
hAMSCs以及Matrigel復合培養后CCK-8檢測細胞增殖
a. 1∶1；b. 2∶1
Figure4. Cell proliferation detected by CCK-8 after hAMSCs cultured with Matrigela. 1∶1; b. 2∶1
2.4 動物實驗
2.4.1 大體觀察
術后各組動物均存活至實驗完成，未出現切口感染及膝關節積液等情況，右后肢關節功能恢復良好。術后1個月，大體觀察見各組移植肌腱連續性完整，組織彈性好，移植肌腱關節內無松弛、變性壞死，半月板及關節軟骨未見明顯磨損。見圖5。
圖5
術后1個月大體觀察
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組
Figure5. Gross observation at 1 month after operationFrom left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively
2.4.2 組織學檢查
HE染色：Sham組為正常腱-骨界面，組織形態規則，膠原纖維多且排列有序，無炎癥細胞；ACLR組見炎癥細胞浸潤，組織形態不規則，膠原少；Ad-NC組見復合物與組織并存以及較多炎癥細胞浸潤；Ad-Runx2組組織修復情況優于ACLR組和 Ad-NC組，炎癥細胞更少。見圖6a。
圖6
術后1個月組織學觀察
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組 a. HE染色（×40）；b. 天狼猩紅染色（偏振光顯微鏡×20）
Figure6. Histological observation at 1 month after operationFrom left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively a. HE staining (×40); b. Sirius red staining (Polarized light microscope×20)
天狼猩紅染色：Sham組中可見大量膠原纖維且呈波浪狀規則排列；Ad-NC組和Ad-Runx2組韌帶組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維均多于ACLR組，且Ad-Runx2組Ⅰ型膠原纖維較Ad-NC組更多。Ad-Runx2 組組內Ⅰ型膠原纖維多于Ⅲ型膠原纖維，膠原凝集成束，排列有序，趨于形成正常 ACL 結構。見圖6b。
2.4.3 免疫熒光染色觀察
Sham組韌帶組織可見大量Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，排列有序，其中Tenascin-C蛋白熒光強度較弱，Ⅲ型膠原蛋白熒光強度低于Ad-Runx2組；ACLR組和Ad-NC組韌帶組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度相似，無明顯差異，但ACLR組Tenascin-C蛋白熒光強度與其余3組相比最強；Ad-Runx2組韌帶組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度與Ad-NC組相比顯著增強，Tenascin-C蛋白熒光強度與ACLR組和Ad-NC組相比減弱。見圖7～9。
圖7
術后1個月Ⅰ型膠原免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Ⅰ型膠原染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure7. Immunofluorescence staining of collagen typeⅠat 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for collagen typeⅠstaining, DAPI staining, and merge, respectively
圖8
術后1個月Ⅲ型膠原免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Ⅲ型膠原染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure8. Immunofluorescence staining of collagen type Ⅲ at 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for collagen type Ⅲ staining, DAPI staining, and merge, respectively
圖9
術后1個月Tenascin-C免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
從左至右分別為Sham組、ACLR組、Ad-NC組、Ad-Runx2組；從上至下分別為Tenascin-C染色、DAPI染色以及兩者重疊
Figure9. Immunofluorescence staining of Tenascin-C at 1 month after operation (Fluorescence microscope×400)From left to right for Sham group, ACLR group, Ad-NC group, and Ad-Runx2 group, respectively; from top to bottom for Tenascin-C staining, DAPI staining, and merge, respectively
3 討論
前交叉韌帶損傷后常采用止點修復和重建的方式進行治療，但術后存在愈合緩慢、腱-骨不愈合、腱-骨愈合部位機械強度差等問題，導致遠期療效欠佳[17-18]。因此，深入了解腱-骨界面組織結構及其愈合機制對臨床肌腱-骨止點損傷的修復和重建具有重要意義。
相關研究已經證明hAMSCs具有向韌帶成纖維細胞分化的能力，并在誘導因子作用下具有促進腱-骨愈合作用[16, 19]。Runx2是骨骼發育的重要轉錄因子，對成骨細胞分化和軟骨細胞成熟至關重要[20]。Xu等[21]通過腺病毒載體將Runx2基因轉染至MSCs后，植入兔股骨頭壞死模型中，6周后發現Ad-Runx2組壞死的股骨頭基本修復并被豐富的軟骨和骨組織覆蓋，修復效果明顯優于Runx2-小干擾RNA組、MSCs組和壞死模型組。Byers等[22]利用三維聚合物支架和過表達 Runx2 的MSCs制作組織工程構建體，隨后植入大鼠腓腸肌缺損處，并使用micro-CT 和組織形態計量學方法分析骨愈合情況。結果顯示Runx2修飾的構建體所含骨量是無Runx2修飾構建體2倍，提示Runx2能促進骨愈合。
本研究顯示通過腺病毒能將Runx2 基因成功轉染至hAMSCs，且轉染后細胞韌帶成纖維細胞相關基因相對表達量呈總體增加趨勢，提示其能向韌帶方向分化，表明Runx2具有促進hAMSCs向韌帶成纖維細胞分化的潛力。Matrigel具有良好成膠性，為了讓hAMSCs更好地附著在腱-骨界面，我們將hAMSCs與Matrigel混合構建復合物進行移植。CCK-8檢測示兩者無論以1∶1或2∶1比例混合培養，支架上的細胞活性無明顯差異，且隨著培養時間延長，細胞增殖也無明顯變化，表明Matrigel對細胞增殖無影響。然后將細胞-支架復合物植入兔前交叉韌帶損傷重建模型中，觀察其對腱-骨愈合的作用。HE染色顯示ACLR組中韌帶組織發生炎癥反應，提示模型構建成功；Ad-NC組中有較多炎癥細胞浸潤，表明直接應用空載病毒轉染hAMSCs時，Matrigel會引起組織炎癥反應；而Ad-Runx2組組織修復情況較前兩組更好、炎癥細胞更少。
韌帶組織主要由膠原蛋白組成，膠原蛋白的持續合成是維持健康細胞外基質的必需條件[23]。其中，Ⅰ型膠原蛋白是韌帶細胞外基質主要組成部分，對于維持肌腱細胞表型和功能具有重要作用[24]。本研究采用天狼猩紅染色檢測韌帶組織中膠原構成，結果顯示相比于ACLR組和Ad-NC組，Ad-Runx2組韌帶組織中Ⅰ型膠原纖維含量逐漸上升，表明過表達Runx2的細胞懸液復合Matrigel支架后有助于脛骨韌帶組織修復。López等[25]認為在韌帶損傷后的修復過程中，Ⅲ型/Ⅰ型膠原纖維比例增高可能是韌帶細胞外基質組織不良的原因，這不僅會影響韌帶結構，還可能導致韌帶修復效果不佳。而本研究中Ad-Runx2組的Ⅰ型膠原纖維含量明顯高于Ⅲ型膠原纖維，表明該組韌帶組織修復效果最好，新生組織中膠原成分接近于正常韌帶組織。免疫熒光染色顯示Ad-Runx2組中韌帶組織的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白熒光強度顯著增強，同樣表明過表達干預后的hAMSCs-Matrigel復合物有助于脛骨部位腱-骨界面修復。而對于Tenascin-C蛋白，ACLR組熒光強度最強、Ad-Runx2組較弱。相關研究表明Tenascin-C的表達與軟骨發育有關，在軟骨細胞成熟過程中其表達減少[26]。hAMSCs具有多向分化潛能，不僅可以向韌帶成纖維細胞分化，還能向軟骨細胞分化，分析過表達Runx2后Tenascin-C下降原因可能與hAMSCs成軟骨細胞效應有關，從而抑制了Tenascin-C表達，但具體原因尚不清楚。
綜上述，Runx2基因轉染hAMSCs后可以促進hAMSCs向韌帶成纖維細胞的分化，并能加速兔前交叉韌帶重建后腱-骨界面愈合，為韌帶損傷修復及促進腱-骨愈合提供了新思路。但本研究僅選擇了術后1個月觀察腱-骨愈合情況，而愈合是一個逐漸變化的過程，有待后續研究進行多時間點動態觀察；此外，對于修復機制也需要進一步探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經遵義醫科大學附屬醫院生物醫學研究倫理委員會批準（KLL-2021-303）；動物使用許可證號：SYXK（贛）2020-0001
作者貢獻聲明 謝淘：實驗設計及撰寫文章；仲鶴鶴、吳術紅：實驗方案評估及審校；全部作者參與實驗操作
