引用本文： 鄔建飛, 王丙龍, 劉宇, 魏岱旭. 功能化聚羥基脂肪酸酯微球的制備及其抗菌、促成骨分化功能評價. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 929-936. doi: 10.7507/1002-1892.202303136 復制
受傷或疾病導致的骨缺損是骨科領域巨大挑戰，傳統治療方式以自體骨移植為主，但存在來源有限、供區繼發性損傷、慢性疼痛和感染等問題。骨組織工程技術成為骨修復理想策略[1]，但研究發現骨組織工程支架植入可能導致細菌感染、炎癥、免疫排斥反應等問題，嚴重影響材料與骨組織融合，抑制新骨生長，因此設計同時具備促成骨分化和良好抗菌性的新型工程化材料顯得尤為重要[2-4]。BMP-2是強效骨誘導生長因子，能夠有效促進骨祖細胞募集、生長和礦化[5-6]。最近發現的人β防御素3（human β-defensin 3，HBD3）具有較強廣譜抗菌性和低毒性，已廣泛用于抗菌研究[7]。Liu等[8]研究表明BMP-2結合HBD3可以同時滿足骨組織工程支架促成骨分化和抗菌性要求。
另一方面，良好的生物相容性是骨組織工程支架必不可少的屬性。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一類基于合成生物學平臺，由細菌合成、可生物降解的天然聚酯材料，具有良好生物相容性。同時PHA為典型疏水性材料，制備的微球對疏水性藥物表現出較高的藥物運載能力和穩定釋放能力，有利于負載藥物發揮作用[5, 9-12]。西北大學生命科學與醫學部魏岱旭團隊前期自創的大豆磷脂（soybean lecithin，SL）介導的生長因子修飾技術（SL-mediated introduction of growth factors into polyesters，SMIGP）[4, 6]，進一步實現了PHA對生長因子等蛋白的高效負載。迄今已有6種商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PBVHx）用于骨組織工程研究，其中PBVHx（又稱PHBVHHx）的生物相容性最佳[9-10]。本研究擬將BMP-2和HBD3兩種蛋白負載于PBVHx，再利用微流控技術制備適用于微創手術的可注射微球，以解決骨組織工程材料植入后出現的骨組織感染和成骨分化慢等難題。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
PBVHx（北京藍晶微生物科技有限公司）；SL、BMP-2、HBD3及其ELISA試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM、FBS及青、鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；Alexa FluorTM 555-鬼筆環肽、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）一抗、二抗及DAPI（Thermo Fisher公司，美國）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為本實驗室保存；ALP活性試劑盒、蛋白質測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；LIVE/DEADTM BacLightTM試劑盒、LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Invitrogen公司，美國）；OriCell? 成人BMSCs完全培養基、人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）［賽業（廣州）生物科技有限公司］。
激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）；CO2細胞培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司）；掃描電鏡（FEI公司，捷克）；多功能酶標儀、紫外分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；Transwell（Corning公司，美國）。
1.2 微球制備
采用SMIGP技術制備SL-BMP-2（sBMP-2）和SL-HBD3（sHBD3）[4, 6]。將10 ng SL分別與50 ng BMP-2或30 ng HBD3溶解于含5%（V/V）醋酸的DMSO中，30℃慢磁攪拌24 h；凍干12 h除去溶劑，分別得到sBMP-2和sHBD3。將12 μg sBMP-2（約含10 μg BMP-2）、0.8 μg sHBD3（約含0.6 μg HBD3）和1 g PBVHx溶解于40 mL二氯甲烷中，形成油相（sBMP-2/sHBD3/PBVHx溶液）。將0.1 g 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）溶于100 mL超純水（0.1%，W/V）， 80℃慢磁攪拌2 h，形成水相（PVA溶液）。室溫下，將油相和水相連接于注射器，兩端連接8號不銹鋼針頭與微流推注泵，推進速度分別為油相0.05 mL/min、水相2 mL/min，獲得含BMP-2及HBD3的功能化PHA微球（functional microsphere，f-PMS）。同法制備未添加BMP-2及HBD3的單純PHA微球（pure microsphere，p-PMS）作為對照。f-PMS具體制備流程見圖1。
圖1
f-PMS制備流程和藥物釋放示意圖
Figure1.
Schematic of preparation and drug release of f-PHA
1.3 微球觀測
1.3.1 微球理化特性表征
① 微球微觀形貌觀測：采用掃描電鏡在15 kV條件下觀察兩種微球表面結構及直徑。
② 吸水率檢測：取兩種干燥微球稱重記為Wd，置于純水中24 h后取出，用濾紙吸干表面水分后稱重，記為Ww。每種微球設定4個平行樣品，按照以下公式計算微球吸水率：吸水率=（Ww–Wd）/Wd×100%。
③ 藥物體外釋放實驗：取1 g f-PMS置于含40 mL PBS的50 mL離心管中，37℃、150 r/min恒溫搖床處理30 d；期間分別于第0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30天收集PBS，采用ELISA檢測試劑盒檢測BMP-2及HBD3濃度。按照以下公式計算累積釋放率：累積釋放率=C1/C0×100%，其中C0表示樣品中HBD3或BMP-2理論總濃度，C1為上述各時間點濃度。
1.3.2 微球抗菌能力評估
采用LB培養基制備起始細菌濁度為0.2的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸液，各取10 mL置于15 mL無菌離心管，分別加入0.5 g f-PMS和p-PMS。37℃、200 r/min恒溫搖床培養12、24 h時，采用紫外分光光度計于600 nm處測量吸光度（A）值，表示細菌濁度。同時，經LIVE/DEADTM BacLightTM試劑盒染色處理后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細菌情況，綠色熒光為活細菌，紅色熒光為死細菌。
1.3.3 微球生物相容性評估
將1×105個hBMSCs接種于Transwell底部的24孔板，分別將10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中，同時以未添加微球為空白組；使用OriCell?成人BMSCs完全培養基于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液。培養24、48 h時，加入10%CCK-8后再培養2 h，使用紫外分光光度計測量405 nm處A值，按照以下公式計算細胞相對增殖率：細胞相對增殖率=實驗組A值/空白組A值×100%，實驗重復6次。使用LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit試劑盒對微球表面上的細胞進行染色，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞存活情況，活細胞呈綠色染色，死細胞呈紅色染色。
1.3.4 微球對hBMSCs成骨分化的影響
將hBMSCs接種于含細胞爬片的24孔板中，每孔1×104個細胞，分別將10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中（以未添加微球組為空白組），使用OriCell?成人BMSCs完全培養基于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液，并持續培養10 d。
① COL-1免疫熒光染色觀察：培養后10 d取細胞經4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100滲透、3% 牛血清白蛋白室溫封閉；每孔加入450 μL COL-1一抗（1∶250，1%牛血清白蛋白-PBS溶液稀釋），濕盒4℃過夜孵育，PBS 清洗3 次；與二抗室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次；最后使用DAPI、Alexa FluorTM 555-鬼筆環肽染色后，滴加適量抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察COL-1表達，并采用顯微鏡自帶軟件分析相對熒光強度。實驗重復3次。
②ALP活性檢測：于培養后5、10 d取hBMSCs，參照ALP活性試劑盒和蛋白質測定試劑盒操作說明書檢測細胞中ALP總活性和總蛋白含量，兩者比值即為單位蛋白中ALP含量。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 微球理化特性表征
2.1.1 微球微觀形貌
掃描電鏡觀察示p-PMS和f-PMS兩種微球直徑相近，分別為（108.95±8.12）μm和（106.70±9.39）μm。其中，p-PMS表面粗糙，分布著直徑為1～3 μm的孔隙；而f-PMS表面更光滑，且負載大量BMP-2和HBD3白色顆粒狀物質，提示sBMP-2和sHBD3可改變微球微觀形態。見圖2a。
圖2
微球理化特性表征
a. 掃描電鏡觀察 從左至右分別為f-PMS、p-PMS，從上至下放大倍數分別為500、1 200，紅色箭頭示BMP-2和HBD3；b. 藥物釋放曲線
Figure2. Characterizations of microspheresa. Scanning electron microscope observation From left to right for f-PMS and p-PMS, respectively; from top to bottom for the magnifications of 500 and 1 200, respectively; red arrows represented BMP-2 and HBD3; b. Drug release curve
2.1.2 吸水率檢測
f-PMS吸水率為8.880%±1.922%，高于p-PMS的8.307%±2.146%，但差異無統計學意義（t=0.488，P=0.636）。
2.1.3 藥物體外釋放實驗
f-PMS中的BMP-2和HBD3釋放總趨勢基本一致，均呈早期突釋、后期緩釋，具體表現為前2天內突釋約20%，第2～10天勻速釋放約30%，第10～30天緩釋約28%。前10天兩種藥物累積釋放率幾乎重合，第10天后 HBD3累積釋放率略高于BMP-2。見圖2b。
2.2 微球抗菌能力評估
2.2.1 抗金黃色葡萄球菌實驗
激光共聚焦顯微鏡下觀察，f-PMS組金黃色葡萄球菌生長被完全抑制，微球表面幾乎沒有綠色活細菌，只存在大量紅色死細菌；相反p-PMS組金黃色葡萄球菌生長正常，微球表面存在大量綠色活細菌。見圖3a。培養12、24 h 時，f-PMS組A值分別為0.267±0.090、0.258±0.064，低于p-PMS組的2.724±0.242、3.656±0.275，差異均有統計學意義（t=29.437，P<0.001；t=23.335， P<0.001）。
圖3
活/死細菌染色觀察微球抗菌能力（激光共聚焦顯微鏡×100）
從左至右分別為活細菌、死細菌及兩者重疊；從上至下分別為p-PMS、f-PMS a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure3. The antibacterial ability of microspheres by live/dead bacterial staining (Laser confocal microscope×100)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively; from top to bottom for p-PMS and f-PMS, respectively a.
2.2.2 抗大腸桿菌實驗
兩組微球與大腸桿菌共培養后激光共聚焦顯微鏡下觀察結果與金黃色葡萄球菌實驗類似（圖3b）。培養12、24 h時，f-PMS組A值分別為0.297±0.010、0.286±0.071，低于p-PMS組的3.200±0.450、4.320±0.804，差異均有統計學意義（t=15.426，P<0.001；t=12.244，P<0.001）。
2.3 微球生物相容性評估
培養24、48 h時，f-PMS組細胞相對增殖率分別為94.866%±11.469%、94.706%±8.195%，p-PMS組分別為100.028%±17.338%、98.615%±16.551%，組間差異均無統計學意義（t=0.608，P=0.557；t=0.619，P=0.615）。激光共聚焦顯微鏡下觀察兩組僅在48 h時發現極少量紅色死細胞。見圖4。
圖4
活/死細胞染色觀察微球生物相容性（激光共聚焦顯微鏡×20）
從左至右分別為活細菌、死細菌及兩者重疊 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure4. Biocompatibility of microspheres by live/dead cell staining (Laser confocal microscope×20)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4 微球對hBMSCs成骨分化的影響
2.4.1 COL-1免疫熒光染色檢測
激光共聚焦顯微鏡下見兩組hBMSCs成骨特異性蛋白COL-1表達均為陽性，但f-PMS組COL-1熒光強度（57.725±4.132）高于p-PMS組（2.081±1.375），差異有統計學意義（t=22.127，P<0.001）。見圖5。
圖5
COL-1免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40）
從左至右分別為COL-1、細胞核、肌動蛋白及三者重疊 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure5. COL-1 immunofluorescence staining observation（Laser confocal microscope×40）From left to right for COL-1，nucleus, actin protein, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4.2 ALP活性檢測
培養5、10 d時，f-PMS組ALP活性分別為（5 851.572±953.166）、（8 294.177±2 509.040）U/g蛋白，均高于p-PMS組（2 048.396±217.479）、（2 481.611±113.610） U/g蛋白，差異有統計學意義（t=6.738，P=0.003；t=3.866，P=0.018）。
3 討論
骨組織工程通常由支架、骨細胞（或干細胞）和生長因子組成。研究已證實以BMP-2為代表的生長因子能有效促進骨損傷部位快速修復，實現新骨組織形成[13-15]。優良的生物相容性、有效的促成骨分化作用和強抗菌性是骨組織工程支架最重要的3個條件，同時滿足這3個條件的支架材料成為骨科領域的研究熱點[5, 16]。
可注射微球在骨科治療中表現出巨大應用前景，本研究利用微流控技術成功制備了f-PMS，掃描電鏡結果顯示f-PMS直徑與p-PMS接近。p-PMS表面粗糙，均勻分布孔隙，與我們前期制備的PBVHx微球相似[9]，而加入SL介導的BMP-2和HBD3后，f-PHA微球表面變得光滑，這可能是蛋白質引入所致。體外釋放實驗顯示f-PMS中的BMP-2和HBD3釋放曲線基本吻合，均呈現早期突釋、后期緩釋規律，且在0～2 d約釋放20%，2～10 d約釋放30%。在骨科手術早期，BMP-2快速釋放并保持在高水平可以有效誘導Smad信號通路的發生，從而加速礦化結節形成、促進成骨分化和骨愈合，縮短患者康復時間[17]。同時在手術早期，切口易受細菌感染，而HBD3早期突釋有利于保護切口免于細菌感染，促進組織愈合。
細菌感染是骨組織工程支架植入失敗的主要原因，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌等是導致感染的主要病原體。臨床上大量使用抗生素來抑制骨科手術過程中的細菌感染，這使得細菌耐藥性增加，同時抗生素會抑制成骨細胞活力并減少其數量，因此研發具備強抗菌性和低毒性HBD3成為骨組織工程研究熱點[8, 18]。Wang等[19]發現HBD3能在BMSCs中高度穩定表達，并賦予BMSCs強大的抗菌能力。我們對PHA微球的抗菌性進行檢測，發現f-PMS能完全抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長，說明其具有優良的廣譜抗菌性，作為骨組織工程支架能發揮強抑菌作用。
我們前期研究已證實PBVHx具有良好的生物相容性，是PHA家族中理想的骨組織工程支架材料來源[9]。有研究顯示PHA能有效促3T3-L1前脂肪細胞成骨分化，誘導新骨形成，對治療小鼠顱骨缺損具有積極意義，表現出良好生物相容性[6, 20]。Dhania 等[21]研究也發現制備的PHA納米顆粒可以有效提高Vero細胞的增殖能力和黏附力，對細胞表現出良好生物相容性。為了避免微球因重力壓迫細胞，我們在生物相容性實驗中利用Transwell將微球和細胞隔開培養，CCK-8試劑盒檢測培養24、48 h后細胞相對增殖率均達95%～98%，且f-PMS和p-PMS組間差異無統計學意義，進一步說明兩種微球均有良好生物相容性，可以成為骨組織工程理想材料。
誘導BMSCs成骨分化是促進新骨形成和骨再生的潛在方案，也是評價骨組織工程支架性能的重要指標。BMSCs先分化為前成骨細胞，再經過成骨細胞、骨細胞、骨襯里細胞3個步驟完成成骨分化，分化過程受到BMP-2/4/6/7/9信號通路、Wnt信號通路和Shh信號通路等調控，其中BMP-2是在BMSCs成骨分化中研究最廣泛的BMP家族成員[22]。我們利用免疫熒光技術檢測了成骨分化特異性蛋白COL-1的熒光強度，結果發現f-PMS組細胞的COL-1熒光強度顯著高于p-PMS組，說明f-PMS負載的BMP-2可以有效促進COL-1蛋白表達。COL-1的表達通常作為骨損傷修復的重要標志物。Liu等[8]發現成骨/抗菌雙功能鈦合金材料可以有效促進hBMSCs成骨分化，COL-1表達顯著提高。Mao等[23]在驗證功能性生物陶瓷對骨質疏松骨再生影響時也發現，負載鍶離子和硅離子的生物陶瓷可以增強骨形成和礦化，COL-1表達顯著增加。我們制備的f-PMS促進了細胞COL-1的表達，表明其具有優良的促成骨分化作用。為了進一步驗證f-PMS的促成骨分化作用，我們在細胞培養5、10 d時分別測定了ALP活性，結果表明f-PMS組ALP活性均高于p-PMS組，這與上述研究結果類似，提示制備的f-PMS具有優良促成骨分化作用。
綜上述，f-PMS具有良好的緩釋性能、生物相容性以及抗菌性，同時能促進hBMSCs成骨分化，具備臨床應用潛能。這些都為骨組織工程支架的構建、負載藥物的選擇及最終實現骨損傷修復提供了新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 鄔建飛：實驗結果統計分析、繪圖及文章撰寫；王丙龍：文章撰寫及審校；劉宇：文章審校；魏岱旭：實驗設計及實施、數據統計、繪圖及文章修改
受傷或疾病導致的骨缺損是骨科領域巨大挑戰，傳統治療方式以自體骨移植為主，但存在來源有限、供區繼發性損傷、慢性疼痛和感染等問題。骨組織工程技術成為骨修復理想策略[1]，但研究發現骨組織工程支架植入可能導致細菌感染、炎癥、免疫排斥反應等問題，嚴重影響材料與骨組織融合，抑制新骨生長，因此設計同時具備促成骨分化和良好抗菌性的新型工程化材料顯得尤為重要[2-4]。BMP-2是強效骨誘導生長因子，能夠有效促進骨祖細胞募集、生長和礦化[5-6]。最近發現的人β防御素3（human β-defensin 3，HBD3）具有較強廣譜抗菌性和低毒性，已廣泛用于抗菌研究[7]。Liu等[8]研究表明BMP-2結合HBD3可以同時滿足骨組織工程支架促成骨分化和抗菌性要求。
另一方面，良好的生物相容性是骨組織工程支架必不可少的屬性。聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）是一類基于合成生物學平臺，由細菌合成、可生物降解的天然聚酯材料，具有良好生物相容性。同時PHA為典型疏水性材料，制備的微球對疏水性藥物表現出較高的藥物運載能力和穩定釋放能力，有利于負載藥物發揮作用[5, 9-12]。西北大學生命科學與醫學部魏岱旭團隊前期自創的大豆磷脂（soybean lecithin，SL）介導的生長因子修飾技術（SL-mediated introduction of growth factors into polyesters，SMIGP）[4, 6]，進一步實現了PHA對生長因子等蛋白的高效負載。迄今已有6種商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PBVHx）用于骨組織工程研究，其中PBVHx（又稱PHBVHHx）的生物相容性最佳[9-10]。本研究擬將BMP-2和HBD3兩種蛋白負載于PBVHx，再利用微流控技術制備適用于微創手術的可注射微球，以解決骨組織工程材料植入后出現的骨組織感染和成骨分化慢等難題。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
PBVHx（北京藍晶微生物科技有限公司）；SL、BMP-2、HBD3及其ELISA試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM、FBS及青、鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；Alexa FluorTM 555-鬼筆環肽、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）一抗、二抗及DAPI（Thermo Fisher公司，美國）；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為本實驗室保存；ALP活性試劑盒、蛋白質測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；LIVE/DEADTM BacLightTM試劑盒、LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Invitrogen公司，美國）；OriCell? 成人BMSCs完全培養基、人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）［賽業（廣州）生物科技有限公司］。
激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）；CO2細胞培養箱（力康生物醫療科技控股有限公司）；掃描電鏡（FEI公司，捷克）；多功能酶標儀、紫外分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；Transwell（Corning公司，美國）。
1.2 微球制備
采用SMIGP技術制備SL-BMP-2（sBMP-2）和SL-HBD3（sHBD3）[4, 6]。將10 ng SL分別與50 ng BMP-2或30 ng HBD3溶解于含5%（V/V）醋酸的DMSO中，30℃慢磁攪拌24 h；凍干12 h除去溶劑，分別得到sBMP-2和sHBD3。將12 μg sBMP-2（約含10 μg BMP-2）、0.8 μg sHBD3（約含0.6 μg HBD3）和1 g PBVHx溶解于40 mL二氯甲烷中，形成油相（sBMP-2/sHBD3/PBVHx溶液）。將0.1 g 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）溶于100 mL超純水（0.1%，W/V）， 80℃慢磁攪拌2 h，形成水相（PVA溶液）。室溫下，將油相和水相連接于注射器，兩端連接8號不銹鋼針頭與微流推注泵，推進速度分別為油相0.05 mL/min、水相2 mL/min，獲得含BMP-2及HBD3的功能化PHA微球（functional microsphere，f-PMS）。同法制備未添加BMP-2及HBD3的單純PHA微球（pure microsphere，p-PMS）作為對照。f-PMS具體制備流程見圖1。
圖1
f-PMS制備流程和藥物釋放示意圖
Figure1.
Schematic of preparation and drug release of f-PHA
1.3 微球觀測
1.3.1 微球理化特性表征
① 微球微觀形貌觀測：采用掃描電鏡在15 kV條件下觀察兩種微球表面結構及直徑。
② 吸水率檢測：取兩種干燥微球稱重記為Wd，置于純水中24 h后取出，用濾紙吸干表面水分后稱重，記為Ww。每種微球設定4個平行樣品，按照以下公式計算微球吸水率：吸水率=（Ww–Wd）/Wd×100%。
③ 藥物體外釋放實驗：取1 g f-PMS置于含40 mL PBS的50 mL離心管中，37℃、150 r/min恒溫搖床處理30 d；期間分別于第0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30天收集PBS，采用ELISA檢測試劑盒檢測BMP-2及HBD3濃度。按照以下公式計算累積釋放率：累積釋放率=C1/C0×100%，其中C0表示樣品中HBD3或BMP-2理論總濃度，C1為上述各時間點濃度。
1.3.2 微球抗菌能力評估
采用LB培養基制備起始細菌濁度為0.2的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸液，各取10 mL置于15 mL無菌離心管，分別加入0.5 g f-PMS和p-PMS。37℃、200 r/min恒溫搖床培養12、24 h時，采用紫外分光光度計于600 nm處測量吸光度（A）值，表示細菌濁度。同時，經LIVE/DEADTM BacLightTM試劑盒染色處理后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細菌情況，綠色熒光為活細菌，紅色熒光為死細菌。
1.3.3 微球生物相容性評估
將1×105個hBMSCs接種于Transwell底部的24孔板，分別將10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中，同時以未添加微球為空白組；使用OriCell?成人BMSCs完全培養基于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液。培養24、48 h時，加入10%CCK-8后再培養2 h，使用紫外分光光度計測量405 nm處A值，按照以下公式計算細胞相對增殖率：細胞相對增殖率=實驗組A值/空白組A值×100%，實驗重復6次。使用LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit試劑盒對微球表面上的細胞進行染色，并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞存活情況，活細胞呈綠色染色，死細胞呈紅色染色。
1.3.4 微球對hBMSCs成骨分化的影響
將hBMSCs接種于含細胞爬片的24孔板中，每孔1×104個細胞，分別將10 mg f-PMS和p-PMS放置于Transwell小室中（以未添加微球組為空白組），使用OriCell?成人BMSCs完全培養基于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液，并持續培養10 d。
① COL-1免疫熒光染色觀察：培養后10 d取細胞經4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100滲透、3% 牛血清白蛋白室溫封閉；每孔加入450 μL COL-1一抗（1∶250，1%牛血清白蛋白-PBS溶液稀釋），濕盒4℃過夜孵育，PBS 清洗3 次；與二抗室溫孵育1 h，PBS 洗滌3 次；最后使用DAPI、Alexa FluorTM 555-鬼筆環肽染色后，滴加適量抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察COL-1表達，并采用顯微鏡自帶軟件分析相對熒光強度。實驗重復3次。
②ALP活性檢測：于培養后5、10 d取hBMSCs，參照ALP活性試劑盒和蛋白質測定試劑盒操作說明書檢測細胞中ALP總活性和總蛋白含量，兩者比值即為單位蛋白中ALP含量。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism 6.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 微球理化特性表征
2.1.1 微球微觀形貌
掃描電鏡觀察示p-PMS和f-PMS兩種微球直徑相近，分別為（108.95±8.12）μm和（106.70±9.39）μm。其中，p-PMS表面粗糙，分布著直徑為1～3 μm的孔隙；而f-PMS表面更光滑，且負載大量BMP-2和HBD3白色顆粒狀物質，提示sBMP-2和sHBD3可改變微球微觀形態。見圖2a。
圖2
微球理化特性表征
a. 掃描電鏡觀察 從左至右分別為f-PMS、p-PMS，從上至下放大倍數分別為500、1 200，紅色箭頭示BMP-2和HBD3；b. 藥物釋放曲線
Figure2. Characterizations of microspheresa. Scanning electron microscope observation From left to right for f-PMS and p-PMS, respectively; from top to bottom for the magnifications of 500 and 1 200, respectively; red arrows represented BMP-2 and HBD3; b. Drug release curve
2.1.2 吸水率檢測
f-PMS吸水率為8.880%±1.922%，高于p-PMS的8.307%±2.146%，但差異無統計學意義（t=0.488，P=0.636）。
2.1.3 藥物體外釋放實驗
f-PMS中的BMP-2和HBD3釋放總趨勢基本一致，均呈早期突釋、后期緩釋，具體表現為前2天內突釋約20%，第2～10天勻速釋放約30%，第10～30天緩釋約28%。前10天兩種藥物累積釋放率幾乎重合，第10天后 HBD3累積釋放率略高于BMP-2。見圖2b。
2.2 微球抗菌能力評估
2.2.1 抗金黃色葡萄球菌實驗
激光共聚焦顯微鏡下觀察，f-PMS組金黃色葡萄球菌生長被完全抑制，微球表面幾乎沒有綠色活細菌，只存在大量紅色死細菌；相反p-PMS組金黃色葡萄球菌生長正常，微球表面存在大量綠色活細菌。見圖3a。培養12、24 h 時，f-PMS組A值分別為0.267±0.090、0.258±0.064，低于p-PMS組的2.724±0.242、3.656±0.275，差異均有統計學意義（t=29.437，P<0.001；t=23.335， P<0.001）。
圖3
活/死細菌染色觀察微球抗菌能力（激光共聚焦顯微鏡×100）
從左至右分別為活細菌、死細菌及兩者重疊；從上至下分別為p-PMS、f-PMS a. 金黃色葡萄球菌；b. 大腸桿菌
Figure3. The antibacterial ability of microspheres by live/dead bacterial staining (Laser confocal microscope×100)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively; from top to bottom for p-PMS and f-PMS, respectively a.
2.2.2 抗大腸桿菌實驗
兩組微球與大腸桿菌共培養后激光共聚焦顯微鏡下觀察結果與金黃色葡萄球菌實驗類似（圖3b）。培養12、24 h時，f-PMS組A值分別為0.297±0.010、0.286±0.071，低于p-PMS組的3.200±0.450、4.320±0.804，差異均有統計學意義（t=15.426，P<0.001；t=12.244，P<0.001）。
2.3 微球生物相容性評估
培養24、48 h時，f-PMS組細胞相對增殖率分別為94.866%±11.469%、94.706%±8.195%，p-PMS組分別為100.028%±17.338%、98.615%±16.551%，組間差異均無統計學意義（t=0.608，P=0.557；t=0.619，P=0.615）。激光共聚焦顯微鏡下觀察兩組僅在48 h時發現極少量紅色死細胞。見圖4。
圖4
活/死細胞染色觀察微球生物相容性（激光共聚焦顯微鏡×20）
從左至右分別為活細菌、死細菌及兩者重疊 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure4. Biocompatibility of microspheres by live/dead cell staining (Laser confocal microscope×20)From left to right for live bacteria, dead bacteria, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4 微球對hBMSCs成骨分化的影響
2.4.1 COL-1免疫熒光染色檢測
激光共聚焦顯微鏡下見兩組hBMSCs成骨特異性蛋白COL-1表達均為陽性，但f-PMS組COL-1熒光強度（57.725±4.132）高于p-PMS組（2.081±1.375），差異有統計學意義（t=22.127，P<0.001）。見圖5。
圖5
COL-1免疫熒光染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40）
從左至右分別為COL-1、細胞核、肌動蛋白及三者重疊 a. p-PMS；b. f-PMS
Figure5. COL-1 immunofluorescence staining observation（Laser confocal microscope×40）From left to right for COL-1，nucleus, actin protein, and merge, respectively a. p-PMS; b. f-PMS
2.4.2 ALP活性檢測
培養5、10 d時，f-PMS組ALP活性分別為（5 851.572±953.166）、（8 294.177±2 509.040）U/g蛋白，均高于p-PMS組（2 048.396±217.479）、（2 481.611±113.610） U/g蛋白，差異有統計學意義（t=6.738，P=0.003；t=3.866，P=0.018）。
3 討論
骨組織工程通常由支架、骨細胞（或干細胞）和生長因子組成。研究已證實以BMP-2為代表的生長因子能有效促進骨損傷部位快速修復，實現新骨組織形成[13-15]。優良的生物相容性、有效的促成骨分化作用和強抗菌性是骨組織工程支架最重要的3個條件，同時滿足這3個條件的支架材料成為骨科領域的研究熱點[5, 16]。
可注射微球在骨科治療中表現出巨大應用前景，本研究利用微流控技術成功制備了f-PMS，掃描電鏡結果顯示f-PMS直徑與p-PMS接近。p-PMS表面粗糙，均勻分布孔隙，與我們前期制備的PBVHx微球相似[9]，而加入SL介導的BMP-2和HBD3后，f-PHA微球表面變得光滑，這可能是蛋白質引入所致。體外釋放實驗顯示f-PMS中的BMP-2和HBD3釋放曲線基本吻合，均呈現早期突釋、后期緩釋規律，且在0～2 d約釋放20%，2～10 d約釋放30%。在骨科手術早期，BMP-2快速釋放并保持在高水平可以有效誘導Smad信號通路的發生，從而加速礦化結節形成、促進成骨分化和骨愈合，縮短患者康復時間[17]。同時在手術早期，切口易受細菌感染，而HBD3早期突釋有利于保護切口免于細菌感染，促進組織愈合。
細菌感染是骨組織工程支架植入失敗的主要原因，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌等是導致感染的主要病原體。臨床上大量使用抗生素來抑制骨科手術過程中的細菌感染，這使得細菌耐藥性增加，同時抗生素會抑制成骨細胞活力并減少其數量，因此研發具備強抗菌性和低毒性HBD3成為骨組織工程研究熱點[8, 18]。Wang等[19]發現HBD3能在BMSCs中高度穩定表達，并賦予BMSCs強大的抗菌能力。我們對PHA微球的抗菌性進行檢測，發現f-PMS能完全抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長，說明其具有優良的廣譜抗菌性，作為骨組織工程支架能發揮強抑菌作用。
我們前期研究已證實PBVHx具有良好的生物相容性，是PHA家族中理想的骨組織工程支架材料來源[9]。有研究顯示PHA能有效促3T3-L1前脂肪細胞成骨分化，誘導新骨形成，對治療小鼠顱骨缺損具有積極意義，表現出良好生物相容性[6, 20]。Dhania 等[21]研究也發現制備的PHA納米顆粒可以有效提高Vero細胞的增殖能力和黏附力，對細胞表現出良好生物相容性。為了避免微球因重力壓迫細胞，我們在生物相容性實驗中利用Transwell將微球和細胞隔開培養，CCK-8試劑盒檢測培養24、48 h后細胞相對增殖率均達95%～98%，且f-PMS和p-PMS組間差異無統計學意義，進一步說明兩種微球均有良好生物相容性，可以成為骨組織工程理想材料。
誘導BMSCs成骨分化是促進新骨形成和骨再生的潛在方案，也是評價骨組織工程支架性能的重要指標。BMSCs先分化為前成骨細胞，再經過成骨細胞、骨細胞、骨襯里細胞3個步驟完成成骨分化，分化過程受到BMP-2/4/6/7/9信號通路、Wnt信號通路和Shh信號通路等調控，其中BMP-2是在BMSCs成骨分化中研究最廣泛的BMP家族成員[22]。我們利用免疫熒光技術檢測了成骨分化特異性蛋白COL-1的熒光強度，結果發現f-PMS組細胞的COL-1熒光強度顯著高于p-PMS組，說明f-PMS負載的BMP-2可以有效促進COL-1蛋白表達。COL-1的表達通常作為骨損傷修復的重要標志物。Liu等[8]發現成骨/抗菌雙功能鈦合金材料可以有效促進hBMSCs成骨分化，COL-1表達顯著提高。Mao等[23]在驗證功能性生物陶瓷對骨質疏松骨再生影響時也發現，負載鍶離子和硅離子的生物陶瓷可以增強骨形成和礦化，COL-1表達顯著增加。我們制備的f-PMS促進了細胞COL-1的表達，表明其具有優良的促成骨分化作用。為了進一步驗證f-PMS的促成骨分化作用，我們在細胞培養5、10 d時分別測定了ALP活性，結果表明f-PMS組ALP活性均高于p-PMS組，這與上述研究結果類似，提示制備的f-PMS具有優良促成骨分化作用。
綜上述，f-PMS具有良好的緩釋性能、生物相容性以及抗菌性，同時能促進hBMSCs成骨分化，具備臨床應用潛能。這些都為骨組織工程支架的構建、負載藥物的選擇及最終實現骨損傷修復提供了新思路。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 鄔建飛：實驗結果統計分析、繪圖及文章撰寫；王丙龍：文章撰寫及審校；劉宇：文章審校；魏岱旭：實驗設計及實施、數據統計、繪圖及文章修改
