引用本文： 王軼凡, 許英德, 張雪楓, 劉菁宇, 韓金彤, 朱勝利, 梁硯琴, 吳水林, 崔振鐸, 呂維加, 李朝陽. 近紅外光激發氧化石墨烯/磷酸銀/殼聚糖涂層改善鈦表面抗菌性能的研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 937-944. doi: 10.7507/1002-1892.202303041 復制
開放性手術引起的切口感染嚴重降低了人工骨植入手術成功率，植入體內的骨植入物表面會因為蛋白凝聚等原因附著大量細菌[1]。據報道，骨科手術后引發的植入物感染發生率達5%[2]。目前針對體內細菌感染采取的主要治療方式依舊是口服和注射抗生素，而預防性使用抗生素無法靶向清除材料表面細菌，同時抗生素濫用導致了嚴重的抗生素耐藥性問題和超級細菌的出現[3]。2021年世界衛生組織（WHO）透露目前處于研發中的43種抗生素均無法解決細菌耐藥性問題。植入物表面涂層既可以保留材料基本特性，又可使抗菌材料直接作用于病灶部位[4]，提升了植入物表面抗細菌黏附和抗菌能力，有利于預防和治療植入物感染[5]。
近年來，光熱療法和光動力療法因其抑制細菌生長的作用獲得廣泛研究[6]，但仍未出現能夠完美解決植入物表面抗菌問題的涂層材料。光熱和光動力材料分別通過光激發產生的局部熱和活性氧（reactive oxygen species，ROS）來破壞細菌膜結構和蛋白質[7]。相對于可見光激發源，808 nm近紅外光具有優秀的穿透效果，更容易穿透人體組織和血液，且更容易聚焦到患處[8]。同時由于光療依賴光源提供能量進行抗菌，在無光條件下涂層不會對身體組織產生危害。因此，利用表面涂層增強材料表面抗菌能力可行且具有應用價值。
殼聚糖（chitosan，CS）具有優秀的成膜性及抗菌效果，其表面含有豐富的陽離子基團，覆蓋了CS的鈦片與負電性氧化石墨烯（graphene oxide，GO）可以產生靜電吸附作用，增強涂層結合力[9-10]。GO比表面積大，表面富含各種官能團，金屬納米顆粒更容易均勻分散在其表面，從而減少納米顆粒團聚，是納米復合材料的優良載體[11-13]；同時，GO還具有優秀的光熱性能，可以吸收光能產生局部熱，利用GO抗菌性能的研究已成為熱點[14-16]。磷酸銀（Ag3PO4）具有優秀的光催化能力，微溶于水的特點使其可在水中緩慢溶解釋放Ag+，實現長期抑菌作用[17-19]。然而Ag3PO4 2.52 eV的過大帶隙導致其無法被808 nm近紅外光激發產生ROS[20]。鑒于此，本研究擬利用GO作為載體裝載Ag3PO4并調整其帶隙，形成GO/Ag3PO4異質結構用于光熱-光動力協同抗菌，并利用CS增強材料與基體的結合力，以期為預防鈦植入物感染提供解決策略。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
GO粉末（南京先豐納米材料科技有限公司）；AgNO3（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CS（上海源葉生物科技有限公司；生物試劑，脫乙酰度90%）；生物鈦片（直徑6 mm、高2.5 mm；上海寶山鋼鐵股份有限公司）；化學品均為分析級，無需進一步純化即可使用。
細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；Cu Kα輻射X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；Bruker公司，德國）；S-4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）； JEM2100F透射電鏡（JEOL公司，日本）；FLIR熱照相機（FLIR公司，美國）；UV-2700型紫外-可見光分光光度計（島津公司，日本）；帶有標準三電極系統的電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；酶標儀（Biotek公司，美國）。
1.2 GO/Ag3PO4/CS涂層制備方法
首先，取10 mg GO粉末與12.17 mg AgNO3于試管中，加入4 mL去離子水，使用細胞粉碎機超聲破碎5 min使材料完全溶解；放置2 h使GO和Ag+ 通過靜電吸附相互結合；加入50 mg/mL Na2HPO4溶液100 μL，所得溶液即為GO/Ag3PO4溶液。
然后，取50 mg CS溶解于裝有10 mL去離子水的燒杯中，加入200 μL冰醋酸攪拌至完全溶解；將生物鈦片于CS溶液中浸泡30 min后，在60℃烘箱中烘干，得到材料Ti-CS。在Ti-CS上滴加20 μL GO/Ag3PO4溶液并于37℃烘箱中烘干，重復4次，得到材料Ti-GO/Ag3PO4/CS。以同樣方式滴加相同濃度GO溶液，得到材料Ti-GO/CS。
1.3 材料的形貌物相觀察
取材料Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS，采用Cu Kα輻射XRD進行物相表征，采用掃描電鏡和透射電鏡進行微觀結構和形貌分析。
1.4 材料的光熱性能檢測
用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm2）對材料Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS照射5 min，通過FLIR熱照相機記錄材料每分鐘的溫度和熱圖像，測量材料升溫曲線。Ag3PO4光腐蝕是影響Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層光穩定性的主要因素，因此對Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層進行3次光熱循環測試，即使用近紅外光照射材料5 min，然后冷卻5 min，連續測試3個循環，以10 s間隔記錄材料的加熱-冷卻曲線。
1.5 材料的光催化性能檢測
用UV-2700型紫外-可見分光光度計測量Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的光吸收能力；并使用Tauc Plot法計算材料帶隙，計算公式：αhv=A（hv?Eg）n/2。其中α表示吸收系數，h表示普朗克常量，v表示光頻率，A表示比例常數，Eg表示帶隙，n與半導體材料的類型有關（直接帶隙半導體n=1，間接帶隙半導體n=4）。
使用帶有標準三電極系統的電化學工作站進行暫態光電流響應、電化學阻抗譜的測試。其中工作電極為涂層材料，對電極為鉑片，參比電極為Ag/AgCl電極，電解液為0.5 mol/L Na2SO4溶液。
利用DCFH-DA測量材料ROS總釋放量。首先，將以乙醇為溶劑的0.5 mL 1 mmol/L DCFH-DA溶液與2 mL 10 mmol/L NaOH溶液在黑暗中混合并攪拌30 min；之后用PBS（pH=7.4）稀釋溶液，?20℃下避光保存備用。黑暗中在放入各測試材料的96孔板中加入0.1 mL稀釋的DCFH-DA溶液，然后用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm2）照射該孔；將0.1 mL溶液全部轉移至另一96孔板中，通過酶標儀測量溶液在525 nm波長處吸光度（A）值，以5 min為間隔測量20 min，ROS總釋放量由各材料的A值得出。
1.6 材料的體外抗菌能力檢測
通過涂布平板法研究各材料對金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）的抗菌活性。細菌于37℃下在普通培養基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/mL瓊脂）中培養，然后稀釋至1×107 CFU/mL用于后續實驗。取稀釋后的10 μL細菌懸液滴加在各材料上，模擬細菌在植入物表面附著。材料通過光照產生ROS和局部熱進行殺菌，因此分為光照組和黑暗組。黑暗組涂層在黑暗中放置20 min，光照組涂層采用808 nm近紅外光照射20 min。然后，將處理后的材料放入有1 mL普通培養基的離心管中稀釋并震蕩，將黏附于材料上的細菌剝離；然后將稀釋后的20 μL細菌溶液均勻涂抹在LB瓊脂平板上，于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察各材料黑暗和光照下的抑菌情況。以未接觸材料而直接稀釋至相同濃度的細菌作為對照。按以下公式計算抗菌效率：抗菌效率=（CFU對照?CFU材料）/ CFU對照×100%。
1.7 材料與基體結合力測試
將Ti-GO/Ag3PO4/CS置于含2 mL PBS溶液的離心管中，放在搖床中震蕩以模擬身體運動，搖床轉速120 r/min，12 h后取出材料在烘箱中烘干。浸泡前后分別行大體觀察和掃描電鏡觀察。
1.8 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 材料的形貌物相
GO/Ag3PO4透射電鏡觀察示，GO為層片狀結構，粒徑為5～50 nm的Ag3PO4顆粒緊密貼合在GO層片狀結構上；GO/Ag3PO4高分辨率透射電鏡觀察示，Ag3PO4的晶格條紋在圖中被放大并作出標記，其中0.303 nm和0.190 nm晶格間距分別對應Ag3PO4的（200）和（310）晶格平面。見圖1a～c。
圖1
各材料形貌物相觀察
a. GO/Ag3PO4透射電鏡觀察（×100 k）；b. 圖a局部放大（×400 k）；c. GO/Ag3PO4 高分辨率透射電鏡觀察（×4 000 k） 方框為局部放大的晶格條紋；d. Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000） 箭頭示Ag3PO4納米顆粒；e. Ti-GO/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；f. Ti-CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；g. Ag3PO4和GO的XRD圖譜；h. Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS、Ti-CS和純Ti的XRD圖譜
Figure1. Morphology and phase observation of each materiala. Transmission electron microscope observation of GO/Ag3PO4 (×100 k); b. Local magnification of figure a (×400 k); c. High resolution transmission electron microscope observation of GO/Ag3PO4 (×4 000 k) Box indicated locally amplified lattice stripes; d. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/Ag3PO4/CS coating (×5 000) Arrows indicated Ag3PO4 nanoparticles; e. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/CS coating (×5 000); f. Scanning electron microscope observation of Ti-CS coating (×5 000); g. XRD patterns of Ag3PO4 and GO; h. XRD patterns of Ti-GO/Ag3PO4/CS, Ti-GO/CS, Ti-CS, and pure Ti, respectively
Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS和Ti-CS涂層掃描電鏡觀察示，Ag3PO4納米顆粒分布均勻，同時可見GO的褶皺形貌和CS的紋理結構。見圖1d～f。
Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層的XRD圖譜中發現立方晶系Ag3PO4的主峰（210）晶面峰及（231）晶面峰[21]；由于Ag3PO4的緊密結合破壞了GO的晶面結構，導致Ti-GO/CS涂層中未出現GO（001）晶面峰。 見圖1g、h。
2.2 材料的光熱性能
各材料升溫曲線示，Ti-GO/Ag3PO4/CS光熱效果最好，5 min內升溫至60℃左右，提示Ag3PO4增強了GO的光熱效應。光熱循環測試示，Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層在3個周期的最高溫度變化可以忽略不計，最高溫度穩定在60℃左右，說明材料的光熱穩定性良好。見圖2。
圖2
各材料的光熱性能檢測
a. 各材料的升溫曲線圖；b. Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層的加熱-冷卻曲線
Figure2. Photothermal properties of each materiala. Temperature rise curve of each material; b. Heating-cooling curve of Ti-GO/Ag3PO4/CS coating
2.3 材料的光催化性能
紫外-可見光譜對不同材料的光學性質評價示，純Ti與Ti-CS在300～850 nm波長未展現出光吸收能力；Ti-GO/CS具有相對良好的光吸收能力，并在波長500 nm處達峰值；而引入Ag3PO4的復合涂層不僅提高了材料的光吸收能力，還引起了光吸收峰值紅移（移動至600 nm附近）。見圖3a。
圖3
各材料的光催化性能
a. 紫外-可見光譜對不同材料的光學性質評價；b. Tauc Plot法計算得到的涂層帶隙；c. 光電流響應測試；d. 光照和黑暗下電化學阻抗譜測試；e. ROS總釋放量檢測
Figure3. Photocatalytic properties of each materiala. Evaluation of optical properties of different materials by UV-Vis spectroscopy; b. The coating band gap calculated by Tauc Plot method; c. Photocurrent response test; d. Electrochemical impedance spectroscopy test under light and dark; e. The total amount of reactive oxygen species generated test
Tauc Plot法計算得到的Ti-GO/Ag3PO4/CS和Ti-GO/CS涂層帶隙顯示，Ag3PO4的引入使涂層帶隙由1.79 eV降低至1.39 eV，而帶隙與激發光波長的關系由公式λ=hc/Eg得出，其中λ為激發光波長，h為普朗克常量，c為光速，Eg為帶隙。計算可知能被808 nm近紅外光激發的帶隙需要<1.53 eV，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層可以被808 nm近紅外光所激發。見圖3b。
光電流響應測試示，Ti-GO/Ag3PO4/CS相對于其他材料展現出最高的光電流響應，說明Ti-GO/Ag3PO4/CS在受到808 nm近紅外光激發時電荷分離速度最快，躍遷電子數量最多。電化學阻抗譜測試中，較低阻抗可以證明材料的電子轉移效率相對更高，而更高的電子轉移效率使電子與水分子反應更快，ROS的產率更高。光照組Ti-GO/Ag3PO4/CS的阻抗較黑暗組更低，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS電子轉移效率最高，光催化效果最好。見圖3c、d。
純Ti和Ti-CS在808 nm近紅外光照射下不會產生ROS，Ti-GO/CS在光照后會產生少量ROS，而Ti-GO/Ag3PO4/CS的ROS總釋放量明顯高于其他材料，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3e。
2.4 材料的體外抗菌能力
純Ti在黑暗中未顯示出任何抗菌作用，而Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS在黑暗中均展現出微弱抑菌效果；在808 nm近紅外光照射20 min后，Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的抑菌效果均有所提高，純Ti和Ti-CS的抑菌效果無明顯改善。Ti-GO/Ag3PO4/CS組抗菌效果達99.81%，而Ti-GO/CS組僅為71.61%，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層具有優秀的抗菌效果。同時，黑暗和光照下，Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的抑菌效率均顯著高于純Ti，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
材料的體外抗菌能力
a. 各材料對金黃色葡萄球菌的抗菌能力大體觀察 從左至右依次為Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS、Ti-CS、Ti，上層為黑暗組，下層為光照組；b. 各材料抗菌效率比較
Figure4. Antibacterial activity of the material in vitroa. General observation of the antibacterial ability of each material against
2.5 材料與基體結合力測試
Ti-GO/Ag3PO4/CS經12 h浸泡、震搖前后無明顯差異，浸泡后材料顏色略有不均勻，可能是因浸泡后Ag3PO4團聚所致。浸泡12 h后掃描電鏡觀察示，材料中Ag3PO4團聚成直徑2～10 μm的顆粒，但未消失，說明GO抑制了Ag3PO4的溶解，提示Ti-GO/Ag3PO4/CS與基體結合穩定。見圖5。
圖5
Ti-GO/Ag3PO4/CS與基體結合力測試
a. 浸泡12 h前（左）、后（右）大體觀察；b. 浸泡12 h后掃描電鏡觀察（×20 k）
Figure5. Test of binding force between Ti-GO/Ag3PO4/CS and matrixa. General observation before (left) and after (right) soaking for 12 hours; b. Scanning electron microscope observation after soaking for 12 hours (×20 k)
3 討論
在既往幾十年中，醫學界一直在努力開發新的抗生素，以治療對傳統抗生素產生耐藥性的細菌，如青蒿素、萬古霉素和達拉菲等[22]。抗生素的研發周期和成本相當高，但是細菌產生耐藥性卻只需要1周甚至更短時間。使用抗生素預防和治療感染的缺點及副作用也是不容忽視的。例如，抗生素引發的過敏反應普遍且危險；單一的抗生素僅能消滅1種或幾種細菌，而抗生素聯用后產生的不良反應亦會顯著增多；抗生素對患者肝腎功能負擔很大，尤其是老人和兒童；抗生素抗菌極易產生耐藥菌；抗生素通過注射或口服方式攝入，無法靶向清除患處感染。因此，探索更多更優秀的抗菌手段，在未來人類與細菌的戰斗中尤為重要[23]。金黃色葡萄球菌是植入物細菌感染的常見病原體，通常用平板涂布法測試涂層對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。其中菌落數量代表了材料抗菌能力。
除了利用抗生素治療和預防細菌感染外，許多新興抗菌策略也備受關注并得到廣泛研究。改性抗菌肽是天然存在于人類和動物體內的一類抗菌物質，具有廣譜抗菌活性，可對抗許多細菌、真菌和病毒感染[24]。季銨鹽是一種具有良好抗菌性能的雙親物質，其長鏈烷基部分是一種疏水性（非極性）部分，可以穿透非極性細胞膜，改變細胞膜的通透性來殺滅細菌。但他們分別作為酶和有機鹽，具有嚴重的生物毒性，限制了其應用空間。因此，很難找到一種可殺滅細菌卻對自身細胞無影響的抗菌方式。光熱-光動力抗菌材料通過產生的局部熱和ROS破壞細菌的膜和蛋白質，可實現廣譜抗菌[25]；同時，由于光療材料的光響應和ROS快速產生，可以實現患處有針對性地快速殺菌[26]，并可在黑暗環境下利用涂層優秀的生物相容性對機體提供所需的成骨活性。
Ag3PO4的應用范圍非常廣泛，除了應用于醫療設備和醫用材料外，其還被用于口腔衛生、皮膚科、兒科等醫療領域。Ag3PO4具有優秀的光催化能力，可以利用光生電子將H2O和O2等轉化為ROS。但其過寬的帶隙限制了其在體內的應用。將Ag3PO4負載至其他半導體或二維材料上，可以顯著提高其光穩定性[27]。同時，選擇合適的半導體材料也有利于降低其復合材料的帶隙，使其能夠接收更長的波長光進行原位抑菌[28]。GO擁有良好的光熱性能和光催化效果，原因是缺陷位點可以提供更多的活性催化中心[29-30]。同時，GO的二維結構為納米粒子的附著和均勻分布提供了更多位點，也對細菌表面具有物理刺破的作用。但Ag3PO4和GO的帶隙太寬，均不能被808 nm近紅外光激發，而制備的GO/Ag3PO4是一種異質結構，可以有效降低材料的帶隙，降低了被近紅外光激發所需的能量，使得光生電子能夠從GO轉移到Ag3PO4，最終移動到表面[31]。同時，摻雜Ag3PO4阻礙了光生電子與空穴的結合，增加了光生電子濃度；Ag3PO4的引入也擴大了涂層的比表面積，提供了更多活性位點，光生電子更容易與Ag3PO4表面的O2和H2O反應生成ROS，這樣使Ti-GO/Ag3PO4/CS比Ti-GO/CS更容易產生ROS，快速殺菌。GO/Ag3PO4受808 nm近紅外光照射產生ROS的機制見圖6。
圖6
材料受808 nm近紅外光照射產生ROS的機制示意圖
Figure6.
Schematic diagram of ROS generation mechanism of the material exposed to 808 nm near-infrared light
綜上述，本研究中Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層具有優異的抗菌性能，適用于醫用植入物表面抗菌改性。Ag3PO4的引入調節了GO的帶隙，使涂層更容易被808 nm近紅外光激發實現光動力抗菌。同時Ag3PO4促進了光生電子和空穴的分離，產生更多ROS，并持續釋放Ag+。光照產生的局部熱和ROS改變了細菌膜通透性，從而使Ag+ 更容易進入細菌內部。Ag+、ROS和局部熱協同作用，破壞DNA、蛋白質和細菌膜，導致細菌死亡。與Ti-GO/CS相比，Ti-GO/Ag3PO4/CS光催化活性更好，ROS總釋放量更高。經修飾的骨種植體表面可在808 nm近紅外光照下活化，并在20 min內迅速清除植入物表面細菌，抗菌效率可達99.81%。因此，使用Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層作為抗菌膜包覆策略可為術后植入物表面預防細菌感染提供新的思路。未來將對此材料進行動物實驗以判斷其體內抗菌效果和生物安全性。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 王軼凡：實驗實施、撰寫文章；許英德：實驗數據收集整理及分析；張雪楓：準備實驗材料并收集數據；劉菁宇、韓金彤：使用設備進行測試及收集數據；朱勝利、梁硯琴、吳水林、崔振鐸、呂維加：對文章進行審閱和修改；李朝陽：提供實驗思路、對文章進行審閱和修改
開放性手術引起的切口感染嚴重降低了人工骨植入手術成功率，植入體內的骨植入物表面會因為蛋白凝聚等原因附著大量細菌[1]。據報道，骨科手術后引發的植入物感染發生率達5%[2]。目前針對體內細菌感染采取的主要治療方式依舊是口服和注射抗生素，而預防性使用抗生素無法靶向清除材料表面細菌，同時抗生素濫用導致了嚴重的抗生素耐藥性問題和超級細菌的出現[3]。2021年世界衛生組織（WHO）透露目前處于研發中的43種抗生素均無法解決細菌耐藥性問題。植入物表面涂層既可以保留材料基本特性，又可使抗菌材料直接作用于病灶部位[4]，提升了植入物表面抗細菌黏附和抗菌能力，有利于預防和治療植入物感染[5]。
近年來，光熱療法和光動力療法因其抑制細菌生長的作用獲得廣泛研究[6]，但仍未出現能夠完美解決植入物表面抗菌問題的涂層材料。光熱和光動力材料分別通過光激發產生的局部熱和活性氧（reactive oxygen species，ROS）來破壞細菌膜結構和蛋白質[7]。相對于可見光激發源，808 nm近紅外光具有優秀的穿透效果，更容易穿透人體組織和血液，且更容易聚焦到患處[8]。同時由于光療依賴光源提供能量進行抗菌，在無光條件下涂層不會對身體組織產生危害。因此，利用表面涂層增強材料表面抗菌能力可行且具有應用價值。
殼聚糖（chitosan，CS）具有優秀的成膜性及抗菌效果，其表面含有豐富的陽離子基團，覆蓋了CS的鈦片與負電性氧化石墨烯（graphene oxide，GO）可以產生靜電吸附作用，增強涂層結合力[9-10]。GO比表面積大，表面富含各種官能團，金屬納米顆粒更容易均勻分散在其表面，從而減少納米顆粒團聚，是納米復合材料的優良載體[11-13]；同時，GO還具有優秀的光熱性能，可以吸收光能產生局部熱，利用GO抗菌性能的研究已成為熱點[14-16]。磷酸銀（Ag3PO4）具有優秀的光催化能力，微溶于水的特點使其可在水中緩慢溶解釋放Ag+，實現長期抑菌作用[17-19]。然而Ag3PO4 2.52 eV的過大帶隙導致其無法被808 nm近紅外光激發產生ROS[20]。鑒于此，本研究擬利用GO作為載體裝載Ag3PO4并調整其帶隙，形成GO/Ag3PO4異質結構用于光熱-光動力協同抗菌，并利用CS增強材料與基體的結合力，以期為預防鈦植入物感染提供解決策略。
1 材料與方法
1.1 主要材料及儀器
GO粉末（南京先豐納米材料科技有限公司）；AgNO3（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CS（上海源葉生物科技有限公司；生物試劑，脫乙酰度90%）；生物鈦片（直徑6 mm、高2.5 mm；上海寶山鋼鐵股份有限公司）；化學品均為分析級，無需進一步純化即可使用。
細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；Cu Kα輻射X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD；Bruker公司，德國）；S-4800掃描電鏡（Hitachi公司，日本）； JEM2100F透射電鏡（JEOL公司，日本）；FLIR熱照相機（FLIR公司，美國）；UV-2700型紫外-可見光分光光度計（島津公司，日本）；帶有標準三電極系統的電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；酶標儀（Biotek公司，美國）。
1.2 GO/Ag3PO4/CS涂層制備方法
首先，取10 mg GO粉末與12.17 mg AgNO3于試管中，加入4 mL去離子水，使用細胞粉碎機超聲破碎5 min使材料完全溶解；放置2 h使GO和Ag+ 通過靜電吸附相互結合；加入50 mg/mL Na2HPO4溶液100 μL，所得溶液即為GO/Ag3PO4溶液。
然后，取50 mg CS溶解于裝有10 mL去離子水的燒杯中，加入200 μL冰醋酸攪拌至完全溶解；將生物鈦片于CS溶液中浸泡30 min后，在60℃烘箱中烘干，得到材料Ti-CS。在Ti-CS上滴加20 μL GO/Ag3PO4溶液并于37℃烘箱中烘干，重復4次，得到材料Ti-GO/Ag3PO4/CS。以同樣方式滴加相同濃度GO溶液，得到材料Ti-GO/CS。
1.3 材料的形貌物相觀察
取材料Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS，采用Cu Kα輻射XRD進行物相表征，采用掃描電鏡和透射電鏡進行微觀結構和形貌分析。
1.4 材料的光熱性能檢測
用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm2）對材料Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS照射5 min，通過FLIR熱照相機記錄材料每分鐘的溫度和熱圖像，測量材料升溫曲線。Ag3PO4光腐蝕是影響Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層光穩定性的主要因素，因此對Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層進行3次光熱循環測試，即使用近紅外光照射材料5 min，然后冷卻5 min，連續測試3個循環，以10 s間隔記錄材料的加熱-冷卻曲線。
1.5 材料的光催化性能檢測
用UV-2700型紫外-可見分光光度計測量Ti、Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的光吸收能力；并使用Tauc Plot法計算材料帶隙，計算公式：αhv=A（hv?Eg）n/2。其中α表示吸收系數，h表示普朗克常量，v表示光頻率，A表示比例常數，Eg表示帶隙，n與半導體材料的類型有關（直接帶隙半導體n=1，間接帶隙半導體n=4）。
使用帶有標準三電極系統的電化學工作站進行暫態光電流響應、電化學阻抗譜的測試。其中工作電極為涂層材料，對電極為鉑片，參比電極為Ag/AgCl電極，電解液為0.5 mol/L Na2SO4溶液。
利用DCFH-DA測量材料ROS總釋放量。首先，將以乙醇為溶劑的0.5 mL 1 mmol/L DCFH-DA溶液與2 mL 10 mmol/L NaOH溶液在黑暗中混合并攪拌30 min；之后用PBS（pH=7.4）稀釋溶液，?20℃下避光保存備用。黑暗中在放入各測試材料的96孔板中加入0.1 mL稀釋的DCFH-DA溶液，然后用近紅外光（808 nm，0.5 W/cm2）照射該孔；將0.1 mL溶液全部轉移至另一96孔板中，通過酶標儀測量溶液在525 nm波長處吸光度（A）值，以5 min為間隔測量20 min，ROS總釋放量由各材料的A值得出。
1.6 材料的體外抗菌能力檢測
通過涂布平板法研究各材料對金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）的抗菌活性。細菌于37℃下在普通培養基（含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、15 g/mL瓊脂）中培養，然后稀釋至1×107 CFU/mL用于后續實驗。取稀釋后的10 μL細菌懸液滴加在各材料上，模擬細菌在植入物表面附著。材料通過光照產生ROS和局部熱進行殺菌，因此分為光照組和黑暗組。黑暗組涂層在黑暗中放置20 min，光照組涂層采用808 nm近紅外光照射20 min。然后，將處理后的材料放入有1 mL普通培養基的離心管中稀釋并震蕩，將黏附于材料上的細菌剝離；然后將稀釋后的20 μL細菌溶液均勻涂抹在LB瓊脂平板上，于37℃恒溫培養箱中培養24 h，觀察各材料黑暗和光照下的抑菌情況。以未接觸材料而直接稀釋至相同濃度的細菌作為對照。按以下公式計算抗菌效率：抗菌效率=（CFU對照?CFU材料）/ CFU對照×100%。
1.7 材料與基體結合力測試
將Ti-GO/Ag3PO4/CS置于含2 mL PBS溶液的離心管中，放在搖床中震蕩以模擬身體運動，搖床轉速120 r/min，12 h后取出材料在烘箱中烘干。浸泡前后分別行大體觀察和掃描電鏡觀察。
1.8 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 材料的形貌物相
GO/Ag3PO4透射電鏡觀察示，GO為層片狀結構，粒徑為5～50 nm的Ag3PO4顆粒緊密貼合在GO層片狀結構上；GO/Ag3PO4高分辨率透射電鏡觀察示，Ag3PO4的晶格條紋在圖中被放大并作出標記，其中0.303 nm和0.190 nm晶格間距分別對應Ag3PO4的（200）和（310）晶格平面。見圖1a～c。
圖1
各材料形貌物相觀察
a. GO/Ag3PO4透射電鏡觀察（×100 k）；b. 圖a局部放大（×400 k）；c. GO/Ag3PO4 高分辨率透射電鏡觀察（×4 000 k） 方框為局部放大的晶格條紋；d. Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000） 箭頭示Ag3PO4納米顆粒；e. Ti-GO/CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；f. Ti-CS涂層掃描電鏡觀察（×5 000）；g. Ag3PO4和GO的XRD圖譜；h. Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS、Ti-CS和純Ti的XRD圖譜
Figure1. Morphology and phase observation of each materiala. Transmission electron microscope observation of GO/Ag3PO4 (×100 k); b. Local magnification of figure a (×400 k); c. High resolution transmission electron microscope observation of GO/Ag3PO4 (×4 000 k) Box indicated locally amplified lattice stripes; d. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/Ag3PO4/CS coating (×5 000) Arrows indicated Ag3PO4 nanoparticles; e. Scanning electron microscope observation of Ti-GO/CS coating (×5 000); f. Scanning electron microscope observation of Ti-CS coating (×5 000); g. XRD patterns of Ag3PO4 and GO; h. XRD patterns of Ti-GO/Ag3PO4/CS, Ti-GO/CS, Ti-CS, and pure Ti, respectively
Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS和Ti-CS涂層掃描電鏡觀察示，Ag3PO4納米顆粒分布均勻，同時可見GO的褶皺形貌和CS的紋理結構。見圖1d～f。
Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層的XRD圖譜中發現立方晶系Ag3PO4的主峰（210）晶面峰及（231）晶面峰[21]；由于Ag3PO4的緊密結合破壞了GO的晶面結構，導致Ti-GO/CS涂層中未出現GO（001）晶面峰。 見圖1g、h。
2.2 材料的光熱性能
各材料升溫曲線示，Ti-GO/Ag3PO4/CS光熱效果最好，5 min內升溫至60℃左右，提示Ag3PO4增強了GO的光熱效應。光熱循環測試示，Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層在3個周期的最高溫度變化可以忽略不計，最高溫度穩定在60℃左右，說明材料的光熱穩定性良好。見圖2。
圖2
各材料的光熱性能檢測
a. 各材料的升溫曲線圖；b. Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層的加熱-冷卻曲線
Figure2. Photothermal properties of each materiala. Temperature rise curve of each material; b. Heating-cooling curve of Ti-GO/Ag3PO4/CS coating
2.3 材料的光催化性能
紫外-可見光譜對不同材料的光學性質評價示，純Ti與Ti-CS在300～850 nm波長未展現出光吸收能力；Ti-GO/CS具有相對良好的光吸收能力，并在波長500 nm處達峰值；而引入Ag3PO4的復合涂層不僅提高了材料的光吸收能力，還引起了光吸收峰值紅移（移動至600 nm附近）。見圖3a。
圖3
各材料的光催化性能
a. 紫外-可見光譜對不同材料的光學性質評價；b. Tauc Plot法計算得到的涂層帶隙；c. 光電流響應測試；d. 光照和黑暗下電化學阻抗譜測試；e. ROS總釋放量檢測
Figure3. Photocatalytic properties of each materiala. Evaluation of optical properties of different materials by UV-Vis spectroscopy; b. The coating band gap calculated by Tauc Plot method; c. Photocurrent response test; d. Electrochemical impedance spectroscopy test under light and dark; e. The total amount of reactive oxygen species generated test
Tauc Plot法計算得到的Ti-GO/Ag3PO4/CS和Ti-GO/CS涂層帶隙顯示，Ag3PO4的引入使涂層帶隙由1.79 eV降低至1.39 eV，而帶隙與激發光波長的關系由公式λ=hc/Eg得出，其中λ為激發光波長，h為普朗克常量，c為光速，Eg為帶隙。計算可知能被808 nm近紅外光激發的帶隙需要<1.53 eV，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層可以被808 nm近紅外光所激發。見圖3b。
光電流響應測試示，Ti-GO/Ag3PO4/CS相對于其他材料展現出最高的光電流響應，說明Ti-GO/Ag3PO4/CS在受到808 nm近紅外光激發時電荷分離速度最快，躍遷電子數量最多。電化學阻抗譜測試中，較低阻抗可以證明材料的電子轉移效率相對更高，而更高的電子轉移效率使電子與水分子反應更快，ROS的產率更高。光照組Ti-GO/Ag3PO4/CS的阻抗較黑暗組更低，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS電子轉移效率最高，光催化效果最好。見圖3c、d。
純Ti和Ti-CS在808 nm近紅外光照射下不會產生ROS，Ti-GO/CS在光照后會產生少量ROS，而Ti-GO/Ag3PO4/CS的ROS總釋放量明顯高于其他材料，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3e。
2.4 材料的體外抗菌能力
純Ti在黑暗中未顯示出任何抗菌作用，而Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS在黑暗中均展現出微弱抑菌效果；在808 nm近紅外光照射20 min后，Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的抑菌效果均有所提高，純Ti和Ti-CS的抑菌效果無明顯改善。Ti-GO/Ag3PO4/CS組抗菌效果達99.81%，而Ti-GO/CS組僅為71.61%，因此Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層具有優秀的抗菌效果。同時，黑暗和光照下，Ti-CS、Ti-GO/CS、Ti-GO/Ag3PO4/CS的抑菌效率均顯著高于純Ti，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
材料的體外抗菌能力
a. 各材料對金黃色葡萄球菌的抗菌能力大體觀察 從左至右依次為Ti-GO/Ag3PO4/CS、Ti-GO/CS、Ti-CS、Ti，上層為黑暗組，下層為光照組；b. 各材料抗菌效率比較
Figure4. Antibacterial activity of the material in vitroa. General observation of the antibacterial ability of each material against
2.5 材料與基體結合力測試
Ti-GO/Ag3PO4/CS經12 h浸泡、震搖前后無明顯差異，浸泡后材料顏色略有不均勻，可能是因浸泡后Ag3PO4團聚所致。浸泡12 h后掃描電鏡觀察示，材料中Ag3PO4團聚成直徑2～10 μm的顆粒，但未消失，說明GO抑制了Ag3PO4的溶解，提示Ti-GO/Ag3PO4/CS與基體結合穩定。見圖5。
圖5
Ti-GO/Ag3PO4/CS與基體結合力測試
a. 浸泡12 h前（左）、后（右）大體觀察；b. 浸泡12 h后掃描電鏡觀察（×20 k）
Figure5. Test of binding force between Ti-GO/Ag3PO4/CS and matrixa. General observation before (left) and after (right) soaking for 12 hours; b. Scanning electron microscope observation after soaking for 12 hours (×20 k)
3 討論
在既往幾十年中，醫學界一直在努力開發新的抗生素，以治療對傳統抗生素產生耐藥性的細菌，如青蒿素、萬古霉素和達拉菲等[22]。抗生素的研發周期和成本相當高，但是細菌產生耐藥性卻只需要1周甚至更短時間。使用抗生素預防和治療感染的缺點及副作用也是不容忽視的。例如，抗生素引發的過敏反應普遍且危險；單一的抗生素僅能消滅1種或幾種細菌，而抗生素聯用后產生的不良反應亦會顯著增多；抗生素對患者肝腎功能負擔很大，尤其是老人和兒童；抗生素抗菌極易產生耐藥菌；抗生素通過注射或口服方式攝入，無法靶向清除患處感染。因此，探索更多更優秀的抗菌手段，在未來人類與細菌的戰斗中尤為重要[23]。金黃色葡萄球菌是植入物細菌感染的常見病原體，通常用平板涂布法測試涂層對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。其中菌落數量代表了材料抗菌能力。
除了利用抗生素治療和預防細菌感染外，許多新興抗菌策略也備受關注并得到廣泛研究。改性抗菌肽是天然存在于人類和動物體內的一類抗菌物質，具有廣譜抗菌活性，可對抗許多細菌、真菌和病毒感染[24]。季銨鹽是一種具有良好抗菌性能的雙親物質，其長鏈烷基部分是一種疏水性（非極性）部分，可以穿透非極性細胞膜，改變細胞膜的通透性來殺滅細菌。但他們分別作為酶和有機鹽，具有嚴重的生物毒性，限制了其應用空間。因此，很難找到一種可殺滅細菌卻對自身細胞無影響的抗菌方式。光熱-光動力抗菌材料通過產生的局部熱和ROS破壞細菌的膜和蛋白質，可實現廣譜抗菌[25]；同時，由于光療材料的光響應和ROS快速產生，可以實現患處有針對性地快速殺菌[26]，并可在黑暗環境下利用涂層優秀的生物相容性對機體提供所需的成骨活性。
Ag3PO4的應用范圍非常廣泛，除了應用于醫療設備和醫用材料外，其還被用于口腔衛生、皮膚科、兒科等醫療領域。Ag3PO4具有優秀的光催化能力，可以利用光生電子將H2O和O2等轉化為ROS。但其過寬的帶隙限制了其在體內的應用。將Ag3PO4負載至其他半導體或二維材料上，可以顯著提高其光穩定性[27]。同時，選擇合適的半導體材料也有利于降低其復合材料的帶隙，使其能夠接收更長的波長光進行原位抑菌[28]。GO擁有良好的光熱性能和光催化效果，原因是缺陷位點可以提供更多的活性催化中心[29-30]。同時，GO的二維結構為納米粒子的附著和均勻分布提供了更多位點，也對細菌表面具有物理刺破的作用。但Ag3PO4和GO的帶隙太寬，均不能被808 nm近紅外光激發，而制備的GO/Ag3PO4是一種異質結構，可以有效降低材料的帶隙，降低了被近紅外光激發所需的能量，使得光生電子能夠從GO轉移到Ag3PO4，最終移動到表面[31]。同時，摻雜Ag3PO4阻礙了光生電子與空穴的結合，增加了光生電子濃度；Ag3PO4的引入也擴大了涂層的比表面積，提供了更多活性位點，光生電子更容易與Ag3PO4表面的O2和H2O反應生成ROS，這樣使Ti-GO/Ag3PO4/CS比Ti-GO/CS更容易產生ROS，快速殺菌。GO/Ag3PO4受808 nm近紅外光照射產生ROS的機制見圖6。
圖6
材料受808 nm近紅外光照射產生ROS的機制示意圖
Figure6.
Schematic diagram of ROS generation mechanism of the material exposed to 808 nm near-infrared light
綜上述，本研究中Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層具有優異的抗菌性能，適用于醫用植入物表面抗菌改性。Ag3PO4的引入調節了GO的帶隙，使涂層更容易被808 nm近紅外光激發實現光動力抗菌。同時Ag3PO4促進了光生電子和空穴的分離，產生更多ROS，并持續釋放Ag+。光照產生的局部熱和ROS改變了細菌膜通透性，從而使Ag+ 更容易進入細菌內部。Ag+、ROS和局部熱協同作用，破壞DNA、蛋白質和細菌膜，導致細菌死亡。與Ti-GO/CS相比，Ti-GO/Ag3PO4/CS光催化活性更好，ROS總釋放量更高。經修飾的骨種植體表面可在808 nm近紅外光照下活化，并在20 min內迅速清除植入物表面細菌，抗菌效率可達99.81%。因此，使用Ti-GO/Ag3PO4/CS涂層作為抗菌膜包覆策略可為術后植入物表面預防細菌感染提供新的思路。未來將對此材料進行動物實驗以判斷其體內抗菌效果和生物安全性。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 王軼凡：實驗實施、撰寫文章；許英德：實驗數據收集整理及分析；張雪楓：準備實驗材料并收集數據；劉菁宇、韓金彤：使用設備進行測試及收集數據；朱勝利、梁硯琴、吳水林、崔振鐸、呂維加：對文章進行審閱和修改；李朝陽：提供實驗思路、對文章進行審閱和修改
