=0.361+0.017x，DBM中BMP-2濃度對細胞ALP含量的影響有統計學意義（t=3.552，P=0.005）；BMP-2濃度每增加1 ng/g，ALP含量將增加0.017 ［95%CI（0.006，0.027）］ U/100 mL。
引用本文： 趙永杰, 尹剛, 杜瑞, 王麗敏, 鄧明明, 關國鋒, 孫廣超, 劉穎. 不同長骨制備的脫礦骨基質中BMP-2含量測定及其成骨性能的體外研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 945-951. doi: 10.7507/1002-1892.202303132 復制
骨不連占所有骨折術后并發癥的1.9%～10%，長骨骨折后骨不連發生率更是高達20%[1]。骨移植是一種利用骨組織材料進行骨缺損重建的技術，常用于骨不連的治療。自體髂骨由于兼具骨傳導性、骨誘導性和細胞成骨活性，一直以來是骨移植不可替代的材料；但因取骨量有限、供區疼痛、手術時間延長等缺點，限制了其臨床應用[2]。脫礦骨基質（demineralized bone matrix，DBM）是由皮質骨經過脫礦制備而成，有利于骨基質中生長因子尤其是BMP的釋放，從而發揮優于皮質骨的骨誘導性能。自1965年Urist首次報道以來，DBM被廣泛應用于骨科和口腔頜面外科領域[3-4]。然而，不同的市售DBM產品其骨誘導性能在細胞實驗、動物實驗以及臨床應用中表現出了顯著差異，而這種差異主要與DBM中BMP含量有關。研究表明DBM中BMP含量受到供體、表面形貌、殘余鈣含量、載體、滅菌方法和儲存條件等諸多因素的影響[4-7]，由于不同研究之間DBM的異質性，對DBM中BMP的含量及其骨誘導能力無法做出直接比較。
為了消除制備工藝這一變量因素，Bae等[8]比較了來自同一骨庫的DBM中BMP濃度，發現同種DBM產品不同批次間BMP的濃度變異性顯著高于不同產品之間BMP的濃度變異性，即產品內變異性高于產品間變異性。為了進一步消除供體因素，他們進一步將來自特定供體的10個批次DBM植入40只大鼠體內，進行后外側腰椎融合術，8周后脊柱融合率在不同批次間有顯著差異[9]。此時供體來源及處理工藝不再是變量，導致DBM骨誘導能力差異的最大原因可能是具體取材的骨骼部位。由此，我們提出以下假設：取材部位是導致DBM中BMP含量差異的另一重要原因，即不同皮質骨中天然BMP的含量不等；由取材部位引起的DBM中BMP含量差異足以導致不同DBM之間成骨活性的變異。為了驗證以上假設，本研究選取來自單一供體不同骨骼部位制備的DBM作為實驗對象，依次消除供體因素和制備工藝兩個變量，實現樣本的同質化處理。通過ELISA法測定由同一供體不同長骨皮質骨制備的DBM中BMP-2含量，進一步通過細胞實驗評估不同DBM的骨誘導能力。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）（天津市骨科研究所提供）。成年男性尸體標本1具（生前無代謝性疾病）作為供體，由北京威達峰醫學生物材料有限責任公司提供。人BMP-2 ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翔圣生物科技有限公司）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）。酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 不同DBM制備
取尸體標本脛骨、肱骨、尺骨骨干的皮質骨部分，依次經清洗、脫脂、凍干后，粉碎成直徑315～710 μm的骨粉，然后浸入0.6 mol/L HCl中脫礦25 min，經PBS（pH=5.5～7.5）漂洗后再次凍干。通過原子吸收光譜法測定DBM中的殘余鈣濃度為2%（W/W）。最后對DBM骨粉進行病毒滅活、超聲清洗、冷凍干燥、包裝，輻照滅菌處理后備用。按照取材部位不同，將DBM樣本分為股骨組、脛骨組、肱骨組、尺骨組，分別記為fDBM、 tDBM、hDBM和uDBM；同時將煮沸后的DBM設為對照組，記為cDBM。
1.3 DBM蛋白組分提取
將300 mg DBM樣品浸泡于5 mL 4 mol/L鹽酸胍（GuHCl）/0.05 mol/L Tris-HCl（pH=7.4）中，4℃下持續提取24 h，隨后以20 000×g離心15 min，收集上清液。然后將沉淀物重懸于5 mL新鮮GuHCl/Tris-HCl溶液中5 h，再次同上法離心并收集上清液。將兩次上清液混合后，于4℃下用相對分子質量10×103截止膜在500 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液中透析15 h；然后更換等量新鮮Tris-HCl溶液繼續透析10 h。最終透析袋中的液體為可提取的蛋白質組分，將其轉移至新的離心管中，并測量體積。每組DBM樣本分別進行3次獨立提取。
1.4 DBM中BMP-2濃度測定
按照人BMP-2 ELISA試劑盒說明書操作，標準品和樣品均設復孔，采用酶標儀進行雙波長（450、570 nm）測定，其在450 nm波長的測定值減 570 nm波長的測定值作為校準后的吸光度（A）值。通過繪制標準曲線計算各組DBM中BMP-2濃度。每組DBM樣本獨立測定3次，取均值。該濃度值與各組蛋白提取液體積的乘積再除以DBM樣本量（300 mg），記為每組DBM中BMP-2濃度。
1.5 CCK-8法檢測細胞增殖
將5組DBM按0.5 mg/mL濃度[10]加入24孔培養板（含10%FBS的DMEM培養液）中，每組設3個平行孔。按1×104個/孔密度接種小鼠MC3T3-E1細胞，于細胞培養箱內孵育，每隔2 d更換培養液。共培養1、3、5 d后棄培養液和骨粉，依次加入400 μL新鮮DMEM培養液和40 mL CCK-8試劑（體積比為10∶1），使用酶標儀測量各組在波長450 nm處的A值。
1.6 細胞成骨分化檢測
1.6.1 茜素紅、ALP、膠原染色觀察
將小鼠MC3T3-E1細胞以1×104個/孔密度接種于含有分化培養基（10 mmol/L β-磷酸甘油酯、1×10-8 mol/L地塞米松和50 μmol/L L-抗壞血酸的DMEM培養基）的6孔培養板中，之后各組加入等量DBM（濃度為0.5 mg/mL）。共培養14 d后棄培養液和骨粉，分別加入BCIP/NBT ALP顯色液、0.1%茜素紅染色液（pH=8.3）和Van Gieson試劑，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成骨分化情況。
1.6.2 ALP含量測定
取上述共培養14 d棄培養液和骨粉的細胞懸液，加入0.2%Triton X-100溶液裂解細胞，將裂解液以離心半徑5.5 cm、1 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用ALP試劑盒（微量酶標法）測定各組細胞ALP活性。
1.7 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。采用線性回歸分析DBM中BMP-2濃度對細胞合成ALP的影響。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DBM中BMP-2濃度檢測
fDBM、tDBM、hDBM、uDBM組中BMP-2濃度分別為（21.763±0.344）、（3.293±0.268）、（0.848±0.051）、（0.613±0.053）ng/g，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。下肢長骨中BMP-2濃度高于上肢長骨，其中fDBM組BMP-2濃度約為uDBM組的35.5倍。
2.2 CCK-8法檢測細胞增殖
各組A值均隨培養時間延長而增加，3 d后增加速度明顯加快。共培養1 d，5組A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；3 d，4個實驗組A值均顯著高于對照組（P<0.05），各實驗組間差異無統計學意義（P>0.05）；5 d，A值從高到低分別為fDBM組>tDBM組>hDBM組>uDBM組>cDBM組，4個實驗組A值均顯著高于對照組，fDBM組顯著高于其余3個實驗組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1。
圖1
CCK-8法檢測各組細胞增殖增殖情況
Figure1.
The cell proliferation of 5 groups detected by CCK-8 assay
2.3 細胞成骨分化檢測
2.3.1 茜素紅、ALP、膠原染色觀察
共培養14 d，染色示cDBM組無紅色鈣結節生成，uDBM組和hDBM組可見散在鈣化結節，tDBM組和fDBM組可見片狀鈣化結節。見圖2。ALP染色示cDBM組細胞鋪滿整個視野，未被染成紫色；uDBM組和hDBM組可見少許局部區域被染成紫色；tDBM組和fDBM組紫色面積明顯增多。見圖3。Van Gieson染色示cDBM組和uDBM組細胞排列疏松，僅可見少量紅色膠原成分形成；hDBM組、tDBM組和fDBM組細胞呈梭形排列，數量較另外兩組增加，且紅色膠原成分明顯增多。見圖4。
圖2
共培養14 d各組細胞茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure2. Alizarin red staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×100)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
圖3
共培養14 d各組細胞ALP染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure3. ALP staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×100)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
圖4
共培養14 d各組細胞Van Gieson染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure4. Van Gieson staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×200)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
2.3.2 ALP含量測定
fDBM、tDBM、hDBM、uDBM、cDBM組ALP含量分別為（0.706±0.025）、（0.544±0.014）、（0.468±0.024）、（0.168±0.005）、（0.037±0.009）U/100 mL，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.4 DBM中BMP-2濃度對細胞合成ALP的影響
線性回歸分析示，
=0.361+0.017x。DBM中BMP-2濃度對細胞ALP含量的影響有統計學意義（t=3.552，P=0.005）；BMP-2濃度每增加1 ng/g，ALP含量將增加0.017 ［95%CI（0.006，0.027）］ U/100 mL。見圖5。
圖5
DBM中BMP-2濃度和細胞表達ALP含量的線性回歸分析
Figure5.
Relationship between BMP-2 concentration and ALP content expressed by cells in DBM
3 討論
3.1 BMP-2在不同長骨皮質層中的分布特征
存在于骨基質中的BMP小分子蛋白，是DBM能夠發揮骨誘導能力的關鍵生物因子。Murray團隊成功提出了一種采用BMP-2濃度預測DBM成骨能力的數據統計模型，結論指出BMP-2水平是預測DBM成骨能力的最佳單一因子，其他生長因子的值僅在很小程度上影響著BMP-2的預測能力[11]。決定DBM骨誘導能力的因素不是BMP在DBM中的天然含量，而是其可釋放量。胡偵明團隊對新鮮小牛皮質骨進行了連續4次BMP提取，并將每次提取物與C2C12細胞共培養，觀察14 d后細胞的ALP活性，結果顯示第1次提取物誘導細胞表達ALP的活性顯著高于第2～4次提取物，表明每次提取都能夠有效分離出BMP成分[12]。
我們的實驗結果表明，由不同長骨制備的DBM中BMP-2濃度差異顯著，BMP-2在下肢長骨的分布濃度遠遠高于上肢長骨，其中股骨DBM中BMP-2濃度約為尺骨DBM中的35.5倍。分析原因可能是與BMSCs類似，不同骨骼中BMP-2的分布在胚胎階段就是異質的。既往一項動物實驗表明，細胞的增殖能力和歸巢效率取決于BMSCs的微解剖位置[13]。Siclari等[14]試圖使用獨特的酶消化法單獨分離骨內膜骨髓并進行細胞集落形成單位測定，發現即使在相同長骨內，鄰近骨內膜骨髓也含有比中央骨髓更高濃度的MSCs，他們將這一現象歸因于不同的骨重塑率。由于BMP-2可作用于BMSCs并誘導其分化為成骨細胞，而且可趨化破骨細胞，因此我們推測不同長骨中BMP-2濃度也與其不同的骨重塑率有關。此外，即使在個體出生后，長骨中BMP-2的含量也可能發生變化。下肢的長骨是承重骨，而上肢的長骨主要是連接骨，前者具有特殊的生物力學環境。我們推測可能存在另外一種解釋，即出生后的生物力學改變了不同長骨的重塑微環境，導致BMP-2在下肢骨和上肢骨的分布不同，也許這種差異只發生在人類長骨中，而不發生在四足動物上。雖然導致BMP-2在不同長骨中差異分布的根本原因還需要進一步基礎實驗來闡明，但本研究結果至少可以為不同DBM產品中BMP-2的濃度及其骨誘導能力的變異性提供更深層次、更強有力的理論依據。
3.2 不同BMP-2濃度的DBM對促進細胞增殖的影響
本研究CCK-8法檢測示，與對照組比較，4個實驗組DBM均顯示出對MC3T3-E1細胞的促增殖作用，這種效應在共培養1 d后即顯著呈現，3 d后A值增幅明顯加快且持續至第5天；并且第5天A值從高到低分別為fDBM組>tDBM組>hDBM組>uDBM組>cDBM組，fDBM組A值顯著高于其余3個實驗組。這一趨勢與不同實驗組中BMP-2的濃度分布趨勢一致，考慮最可能原因是DBM中可釋放的BMP-2是促進細胞增殖的關鍵因子。
目前關于BMP對細胞增殖影響的研究呈現出截然不同的觀點。大部分學者認為BMP可以促進細胞增殖，Han等[15]的研究指出，DBM中膠原纖維作為生長因子的載體主要是BMP的控制釋放裝置，可以持續刺激周圍細胞增殖。Kim等[16]的一項將肝素化殼聚糖作為BMP-2和DBM載體并測定其成骨能力的研究中，發現加入DBM組的細胞在14 d時活力仍然維持90%以上，而不加DBM組的細胞活力下降至85%以下，并且隨著DBM加入，細胞增殖潛力以劑量依賴方式增加。然而另有學者通過對MC3T3-E1細胞連續給藥重組人BMP-2（0～150 ng/mL）和阿倫膦酸鹽（0～15 μmol/L）來比較兩種藥物的成骨誘導能力，在第1、3、7天采用CCK-8法測定細胞活力，結果顯示重組人BMP-2濃度和治療時間的增加不會影響MC3T3-E1細胞的生存能力[17]。Hughes-Fulford等[18]的研究結果也發現BMP-2可以顯著刺激MC3T3-E1細胞礦化相關基因表達，但對與生長相關的基因表達幾乎沒有影響。更有學者指出，BMP-2可抑制細胞增殖，Yin等[19]在研究miR-35-5p調節成骨細胞分化和鈣化中的作用及其特異性分子機制中發現，在BMP-2中培養14 d后，MC3T3-E1細胞的增殖能力反而低于在無BMP-2培養基中的細胞。以上研究結果不一致的一種可能解釋是，BMP-2促進細胞增殖的作用可能是一種劑量“微量”和“持續”效應，即只有BMP-2在合適劑量且持續釋放并保持這種劑量的前提下，才會促進細胞增殖。DBM作為BMP-2的天然載體可以實現BMP-2的控制性釋放，而重組人BMP-2則是典型的爆發式釋放，即初始濃度過高，隨后濃度急劇下降，這可能是導致不同研究中BMP-2對細胞增殖作用差異的根本因素。
3.3 不同BMP-2濃度的DBM對促進細胞成骨分化的影響
成骨分化是反映DBM成骨性能最被普遍接受的細胞實驗指標。成骨細胞表型分化有兩個階段，第一階段或早期階段是由細胞外基質的成熟和骨細胞表型基質蛋白（主要是ALP和膠原）的相對表達確定；第二階段或晚期階段，細胞外基質由于鈣和磷酸鹽的沉積而礦化，導致原始軟骨周圍形成海綿狀骨層，形成致密骨[20]。本研究分別對細胞爬片進行了ALP、茜素紅和Van Gieson染色來定性觀察不同DBM對細胞的成骨分化作用，同時定量測定了共培養14 d時ALP的含量。定性結果顯示與對照組相比，4個實驗組DBM對細胞分化均有不同促進作用，細胞表達ALP、鈣化結節和膠原纖維的程度與DBM中BMP-2的分布濃度趨勢一致。既往研究結論也支持本研究結果。Han等[21]發現將DBM與C2C12細胞共培養后誘導的ALP活性呈劑量反應性，與DBM中活性BMP的含量相對應。Sampath等[22]研究表明將BMP-7添加到不同分化階段富含成骨細胞的培養物中時，會刺激細胞膠原合成。Takuwa等[23]在MC3T3-E1細胞上分別研究了BMP-1、BMP-2和BMP-3對ALP、Ⅰ型膠原和DNA合成的影響，結果表明BMP-2既能刺激ALP生成，也能刺激膠原合成，BMP-3僅能刺激膠原合成，而BMP-1對成骨分化無促進作用。Cheng等[24]用表達BMP的重組腺病毒分別轉染C2C12 細胞和C3H10T1/2細胞，21 d后茜素紅染色示AdBMP-2、AdBMP-6和AdBMP-9轉染的細胞中很容易檢測到礦化結節，而在AdBMP-4和AdBMP-7轉染的細胞中只能檢測到稀疏的礦化結節。這些結果均表明BMP能夠促進細胞基質礦化，并且不同成員刺激細胞礦化的作用各不相同。
盡管DBM促細胞分化的能力被大多數學者認可，但是DBM的成骨能力并不是“全或無”的概念，實際上是一種劑量相關效應。在一項研究中，不同濃度DBM植入無胸腺大鼠肌肉內，28 d后顯示DBM與種植體礦化之間的線性關系，即100%活性的DBM表現為最大的骨誘導效應，隨著植入物中活性DBM的減少，其成骨誘導能力也隨之降低，作者將其描述為“比例骨誘導性”[21]。Han等[15]在研究溫度和濕度對DBM骨誘導性影響的研究中發現，膠原骨基質作為生長因子的控制釋放裝置，可以持續刺激細胞分化，DBM釋放的骨誘導因子量越大，細胞表達的ALP活性越高。本研究線性回歸分析顯示，DBM中BMP-2濃度對細胞ALP含量的影響有統計學意義，BMP-2濃度每增加1 ng/g，ALP含量將增加0.017 U/100 mL，表明DBM對細胞的促成骨分化能力與其可釋放的BMP-2含量成正相關關系。黃振明等[25]的研究也證實，miR-335-5p mimics可通過上調人BMSCs中BMP-2 mRNA及蛋白表達水平，促進成骨分化，進一步提示miR-335-5p治療骨質疏松癥的作用機制是調控BMP-2的表達。
本研究存在以下不足：為了消除供體因素和制備工藝兩個變量，實現樣本的同質化處理，研究中限制了DBM的取材量。后期我們會繼續選取更多合適供體，以驗證BMP在不同骨骼中的分布差異是否具有普遍性。前期研究表明BMP-2作為轉化生長因子家族的一員，在骨基質中濃度最大，產生骨誘導的作用最強[18]。因此，本實驗初步測定了DBM中BMP-2的濃度，并由此驗證了BMP-2濃度與細胞增殖、分化的劑量反應關系。實際上，細胞的增殖和分化是骨基質中多種生長因子共同作用的結果，其他生長因子在某種程度上會影響最終實驗結果。但是，本研究揭示的BMP-2在不同骨骼部位的分布特征，為不同骨骼尤其是皮質骨愈合過程和時間方面提供了新的理論基礎，具有較好的臨床指導意義。
綜上述，不同長骨中天然BMP-2的濃度差異較大，下肢長骨高于上肢長骨，BMP-2在不同長骨中的不均衡分布會進一步導致所制備DBM產品之間骨誘導能力的變異。制備DBM時，骨骼取材部位是影響DBM成骨性能的一個重要因素。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經濱州醫學院附屬醫院科研倫理委員會批準［【2021】倫審字（KT-026）號］
作者貢獻聲明 趙永杰：實驗設計與操作，數據收集整理及文章撰寫；尹剛、杜瑞：蛋白的提取和測定；王麗敏：材料制備；鄧明明、關國鋒：細胞實驗和數據分析；孫廣超：文章修改和復審；劉穎：提供實驗設計思路，把控實驗正確實施，文章審核修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱
骨不連占所有骨折術后并發癥的1.9%～10%，長骨骨折后骨不連發生率更是高達20%[1]。骨移植是一種利用骨組織材料進行骨缺損重建的技術，常用于骨不連的治療。自體髂骨由于兼具骨傳導性、骨誘導性和細胞成骨活性，一直以來是骨移植不可替代的材料；但因取骨量有限、供區疼痛、手術時間延長等缺點，限制了其臨床應用[2]。脫礦骨基質（demineralized bone matrix，DBM）是由皮質骨經過脫礦制備而成，有利于骨基質中生長因子尤其是BMP的釋放，從而發揮優于皮質骨的骨誘導性能。自1965年Urist首次報道以來，DBM被廣泛應用于骨科和口腔頜面外科領域[3-4]。然而，不同的市售DBM產品其骨誘導性能在細胞實驗、動物實驗以及臨床應用中表現出了顯著差異，而這種差異主要與DBM中BMP含量有關。研究表明DBM中BMP含量受到供體、表面形貌、殘余鈣含量、載體、滅菌方法和儲存條件等諸多因素的影響[4-7]，由于不同研究之間DBM的異質性，對DBM中BMP的含量及其骨誘導能力無法做出直接比較。
為了消除制備工藝這一變量因素，Bae等[8]比較了來自同一骨庫的DBM中BMP濃度，發現同種DBM產品不同批次間BMP的濃度變異性顯著高于不同產品之間BMP的濃度變異性，即產品內變異性高于產品間變異性。為了進一步消除供體因素，他們進一步將來自特定供體的10個批次DBM植入40只大鼠體內，進行后外側腰椎融合術，8周后脊柱融合率在不同批次間有顯著差異[9]。此時供體來源及處理工藝不再是變量，導致DBM骨誘導能力差異的最大原因可能是具體取材的骨骼部位。由此，我們提出以下假設：取材部位是導致DBM中BMP含量差異的另一重要原因，即不同皮質骨中天然BMP的含量不等；由取材部位引起的DBM中BMP含量差異足以導致不同DBM之間成骨活性的變異。為了驗證以上假設，本研究選取來自單一供體不同骨骼部位制備的DBM作為實驗對象，依次消除供體因素和制備工藝兩個變量，實現樣本的同質化處理。通過ELISA法測定由同一供體不同長骨皮質骨制備的DBM中BMP-2含量，進一步通過細胞實驗評估不同DBM的骨誘導能力。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
小鼠胚胎成骨細胞前體細胞（MC3T3-E1）（天津市骨科研究所提供）。成年男性尸體標本1具（生前無代謝性疾病）作為供體，由北京威達峰醫學生物材料有限責任公司提供。人BMP-2 ELISA試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海翔圣生物科技有限公司）；ALP試劑盒（南京建成生物工程研究所）。酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 不同DBM制備
取尸體標本脛骨、肱骨、尺骨骨干的皮質骨部分，依次經清洗、脫脂、凍干后，粉碎成直徑315～710 μm的骨粉，然后浸入0.6 mol/L HCl中脫礦25 min，經PBS（pH=5.5～7.5）漂洗后再次凍干。通過原子吸收光譜法測定DBM中的殘余鈣濃度為2%（W/W）。最后對DBM骨粉進行病毒滅活、超聲清洗、冷凍干燥、包裝，輻照滅菌處理后備用。按照取材部位不同，將DBM樣本分為股骨組、脛骨組、肱骨組、尺骨組，分別記為fDBM、 tDBM、hDBM和uDBM；同時將煮沸后的DBM設為對照組，記為cDBM。
1.3 DBM蛋白組分提取
將300 mg DBM樣品浸泡于5 mL 4 mol/L鹽酸胍（GuHCl）/0.05 mol/L Tris-HCl（pH=7.4）中，4℃下持續提取24 h，隨后以20 000×g離心15 min，收集上清液。然后將沉淀物重懸于5 mL新鮮GuHCl/Tris-HCl溶液中5 h，再次同上法離心并收集上清液。將兩次上清液混合后，于4℃下用相對分子質量10×103截止膜在500 mL 0.05 mol/L Tris-HCl溶液中透析15 h；然后更換等量新鮮Tris-HCl溶液繼續透析10 h。最終透析袋中的液體為可提取的蛋白質組分，將其轉移至新的離心管中，并測量體積。每組DBM樣本分別進行3次獨立提取。
1.4 DBM中BMP-2濃度測定
按照人BMP-2 ELISA試劑盒說明書操作，標準品和樣品均設復孔，采用酶標儀進行雙波長（450、570 nm）測定，其在450 nm波長的測定值減 570 nm波長的測定值作為校準后的吸光度（A）值。通過繪制標準曲線計算各組DBM中BMP-2濃度。每組DBM樣本獨立測定3次，取均值。該濃度值與各組蛋白提取液體積的乘積再除以DBM樣本量（300 mg），記為每組DBM中BMP-2濃度。
1.5 CCK-8法檢測細胞增殖
將5組DBM按0.5 mg/mL濃度[10]加入24孔培養板（含10%FBS的DMEM培養液）中，每組設3個平行孔。按1×104個/孔密度接種小鼠MC3T3-E1細胞，于細胞培養箱內孵育，每隔2 d更換培養液。共培養1、3、5 d后棄培養液和骨粉，依次加入400 μL新鮮DMEM培養液和40 mL CCK-8試劑（體積比為10∶1），使用酶標儀測量各組在波長450 nm處的A值。
1.6 細胞成骨分化檢測
1.6.1 茜素紅、ALP、膠原染色觀察
將小鼠MC3T3-E1細胞以1×104個/孔密度接種于含有分化培養基（10 mmol/L β-磷酸甘油酯、1×10-8 mol/L地塞米松和50 μmol/L L-抗壞血酸的DMEM培養基）的6孔培養板中，之后各組加入等量DBM（濃度為0.5 mg/mL）。共培養14 d后棄培養液和骨粉，分別加入BCIP/NBT ALP顯色液、0.1%茜素紅染色液（pH=8.3）和Van Gieson試劑，倒置相差顯微鏡下觀察細胞成骨分化情況。
1.6.2 ALP含量測定
取上述共培養14 d棄培養液和骨粉的細胞懸液，加入0.2%Triton X-100溶液裂解細胞，將裂解液以離心半徑5.5 cm、1 000 r/min離心10 min，收集上清液，使用ALP試劑盒（微量酶標法）測定各組細胞ALP活性。
1.7 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料經Shapiro-Wilk檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。采用線性回歸分析DBM中BMP-2濃度對細胞合成ALP的影響。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 DBM中BMP-2濃度檢測
fDBM、tDBM、hDBM、uDBM組中BMP-2濃度分別為（21.763±0.344）、（3.293±0.268）、（0.848±0.051）、（0.613±0.053）ng/g，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。下肢長骨中BMP-2濃度高于上肢長骨，其中fDBM組BMP-2濃度約為uDBM組的35.5倍。
2.2 CCK-8法檢測細胞增殖
各組A值均隨培養時間延長而增加，3 d后增加速度明顯加快。共培養1 d，5組A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）；3 d，4個實驗組A值均顯著高于對照組（P<0.05），各實驗組間差異無統計學意義（P>0.05）；5 d，A值從高到低分別為fDBM組>tDBM組>hDBM組>uDBM組>cDBM組，4個實驗組A值均顯著高于對照組，fDBM組顯著高于其余3個實驗組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖1。
圖1
CCK-8法檢測各組細胞增殖增殖情況
Figure1.
The cell proliferation of 5 groups detected by CCK-8 assay
2.3 細胞成骨分化檢測
2.3.1 茜素紅、ALP、膠原染色觀察
共培養14 d，染色示cDBM組無紅色鈣結節生成，uDBM組和hDBM組可見散在鈣化結節，tDBM組和fDBM組可見片狀鈣化結節。見圖2。ALP染色示cDBM組細胞鋪滿整個視野，未被染成紫色；uDBM組和hDBM組可見少許局部區域被染成紫色；tDBM組和fDBM組紫色面積明顯增多。見圖3。Van Gieson染色示cDBM組和uDBM組細胞排列疏松，僅可見少量紅色膠原成分形成；hDBM組、tDBM組和fDBM組細胞呈梭形排列，數量較另外兩組增加，且紅色膠原成分明顯增多。見圖4。
圖2
共培養14 d各組細胞茜素紅染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure2. Alizarin red staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×100)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
圖3
共培養14 d各組細胞ALP染色觀察（倒置相差顯微鏡×100）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure3. ALP staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×100)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
圖4
共培養14 d各組細胞Van Gieson染色觀察（倒置相差顯微鏡×200）
a. cDBM組；b. uDBM組；c. hDBM組；d. tDBM組；e. fDBM組
Figure4. Van Gieson staining observation of each group at 14 days of co-culture (Inverted phase contrast microscope×200)a. cDBM group; b. uDBM group; c. hDBM group; d. tDBM group; e. fDBM group
2.3.2 ALP含量測定
fDBM、tDBM、hDBM、uDBM、cDBM組ALP含量分別為（0.706±0.025）、（0.544±0.014）、（0.468±0.024）、（0.168±0.005）、（0.037±0.009）U/100 mL，各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.4 DBM中BMP-2濃度對細胞合成ALP的影響
線性回歸分析示，=0.361+0.017x。DBM中BMP-2濃度對細胞ALP含量的影響有統計學意義（t=3.552，P=0.005）；BMP-2濃度每增加1 ng/g，ALP含量將增加0.017 ［95%CI（0.006，0.027）］ U/100 mL。見圖5。
圖5
DBM中BMP-2濃度和細胞表達ALP含量的線性回歸分析
Figure5.
Relationship between BMP-2 concentration and ALP content expressed by cells in DBM
3 討論
3.1 BMP-2在不同長骨皮質層中的分布特征
存在于骨基質中的BMP小分子蛋白，是DBM能夠發揮骨誘導能力的關鍵生物因子。Murray團隊成功提出了一種采用BMP-2濃度預測DBM成骨能力的數據統計模型，結論指出BMP-2水平是預測DBM成骨能力的最佳單一因子，其他生長因子的值僅在很小程度上影響著BMP-2的預測能力[11]。決定DBM骨誘導能力的因素不是BMP在DBM中的天然含量，而是其可釋放量。胡偵明團隊對新鮮小牛皮質骨進行了連續4次BMP提取，并將每次提取物與C2C12細胞共培養，觀察14 d后細胞的ALP活性，結果顯示第1次提取物誘導細胞表達ALP的活性顯著高于第2～4次提取物，表明每次提取都能夠有效分離出BMP成分[12]。
我們的實驗結果表明，由不同長骨制備的DBM中BMP-2濃度差異顯著，BMP-2在下肢長骨的分布濃度遠遠高于上肢長骨，其中股骨DBM中BMP-2濃度約為尺骨DBM中的35.5倍。分析原因可能是與BMSCs類似，不同骨骼中BMP-2的分布在胚胎階段就是異質的。既往一項動物實驗表明，細胞的增殖能力和歸巢效率取決于BMSCs的微解剖位置[13]。Siclari等[14]試圖使用獨特的酶消化法單獨分離骨內膜骨髓并進行細胞集落形成單位測定，發現即使在相同長骨內，鄰近骨內膜骨髓也含有比中央骨髓更高濃度的MSCs，他們將這一現象歸因于不同的骨重塑率。由于BMP-2可作用于BMSCs并誘導其分化為成骨細胞，而且可趨化破骨細胞，因此我們推測不同長骨中BMP-2濃度也與其不同的骨重塑率有關。此外，即使在個體出生后，長骨中BMP-2的含量也可能發生變化。下肢的長骨是承重骨，而上肢的長骨主要是連接骨，前者具有特殊的生物力學環境。我們推測可能存在另外一種解釋，即出生后的生物力學改變了不同長骨的重塑微環境，導致BMP-2在下肢骨和上肢骨的分布不同，也許這種差異只發生在人類長骨中，而不發生在四足動物上。雖然導致BMP-2在不同長骨中差異分布的根本原因還需要進一步基礎實驗來闡明，但本研究結果至少可以為不同DBM產品中BMP-2的濃度及其骨誘導能力的變異性提供更深層次、更強有力的理論依據。
3.2 不同BMP-2濃度的DBM對促進細胞增殖的影響
本研究CCK-8法檢測示，與對照組比較，4個實驗組DBM均顯示出對MC3T3-E1細胞的促增殖作用，這種效應在共培養1 d后即顯著呈現，3 d后A值增幅明顯加快且持續至第5天；并且第5天A值從高到低分別為fDBM組>tDBM組>hDBM組>uDBM組>cDBM組，fDBM組A值顯著高于其余3個實驗組。這一趨勢與不同實驗組中BMP-2的濃度分布趨勢一致，考慮最可能原因是DBM中可釋放的BMP-2是促進細胞增殖的關鍵因子。
目前關于BMP對細胞增殖影響的研究呈現出截然不同的觀點。大部分學者認為BMP可以促進細胞增殖，Han等[15]的研究指出，DBM中膠原纖維作為生長因子的載體主要是BMP的控制釋放裝置，可以持續刺激周圍細胞增殖。Kim等[16]的一項將肝素化殼聚糖作為BMP-2和DBM載體并測定其成骨能力的研究中，發現加入DBM組的細胞在14 d時活力仍然維持90%以上，而不加DBM組的細胞活力下降至85%以下，并且隨著DBM加入，細胞增殖潛力以劑量依賴方式增加。然而另有學者通過對MC3T3-E1細胞連續給藥重組人BMP-2（0～150 ng/mL）和阿倫膦酸鹽（0～15 μmol/L）來比較兩種藥物的成骨誘導能力，在第1、3、7天采用CCK-8法測定細胞活力，結果顯示重組人BMP-2濃度和治療時間的增加不會影響MC3T3-E1細胞的生存能力[17]。Hughes-Fulford等[18]的研究結果也發現BMP-2可以顯著刺激MC3T3-E1細胞礦化相關基因表達，但對與生長相關的基因表達幾乎沒有影響。更有學者指出，BMP-2可抑制細胞增殖，Yin等[19]在研究miR-35-5p調節成骨細胞分化和鈣化中的作用及其特異性分子機制中發現，在BMP-2中培養14 d后，MC3T3-E1細胞的增殖能力反而低于在無BMP-2培養基中的細胞。以上研究結果不一致的一種可能解釋是，BMP-2促進細胞增殖的作用可能是一種劑量“微量”和“持續”效應，即只有BMP-2在合適劑量且持續釋放并保持這種劑量的前提下，才會促進細胞增殖。DBM作為BMP-2的天然載體可以實現BMP-2的控制性釋放，而重組人BMP-2則是典型的爆發式釋放，即初始濃度過高，隨后濃度急劇下降，這可能是導致不同研究中BMP-2對細胞增殖作用差異的根本因素。
3.3 不同BMP-2濃度的DBM對促進細胞成骨分化的影響
成骨分化是反映DBM成骨性能最被普遍接受的細胞實驗指標。成骨細胞表型分化有兩個階段，第一階段或早期階段是由細胞外基質的成熟和骨細胞表型基質蛋白（主要是ALP和膠原）的相對表達確定；第二階段或晚期階段，細胞外基質由于鈣和磷酸鹽的沉積而礦化，導致原始軟骨周圍形成海綿狀骨層，形成致密骨[20]。本研究分別對細胞爬片進行了ALP、茜素紅和Van Gieson染色來定性觀察不同DBM對細胞的成骨分化作用，同時定量測定了共培養14 d時ALP的含量。定性結果顯示與對照組相比，4個實驗組DBM對細胞分化均有不同促進作用，細胞表達ALP、鈣化結節和膠原纖維的程度與DBM中BMP-2的分布濃度趨勢一致。既往研究結論也支持本研究結果。Han等[21]發現將DBM與C2C12細胞共培養后誘導的ALP活性呈劑量反應性，與DBM中活性BMP的含量相對應。Sampath等[22]研究表明將BMP-7添加到不同分化階段富含成骨細胞的培養物中時，會刺激細胞膠原合成。Takuwa等[23]在MC3T3-E1細胞上分別研究了BMP-1、BMP-2和BMP-3對ALP、Ⅰ型膠原和DNA合成的影響，結果表明BMP-2既能刺激ALP生成，也能刺激膠原合成，BMP-3僅能刺激膠原合成，而BMP-1對成骨分化無促進作用。Cheng等[24]用表達BMP的重組腺病毒分別轉染C2C12 細胞和C3H10T1/2細胞，21 d后茜素紅染色示AdBMP-2、AdBMP-6和AdBMP-9轉染的細胞中很容易檢測到礦化結節，而在AdBMP-4和AdBMP-7轉染的細胞中只能檢測到稀疏的礦化結節。這些結果均表明BMP能夠促進細胞基質礦化，并且不同成員刺激細胞礦化的作用各不相同。
盡管DBM促細胞分化的能力被大多數學者認可，但是DBM的成骨能力并不是“全或無”的概念，實際上是一種劑量相關效應。在一項研究中，不同濃度DBM植入無胸腺大鼠肌肉內，28 d后顯示DBM與種植體礦化之間的線性關系，即100%活性的DBM表現為最大的骨誘導效應，隨著植入物中活性DBM的減少，其成骨誘導能力也隨之降低，作者將其描述為“比例骨誘導性”[21]。Han等[15]在研究溫度和濕度對DBM骨誘導性影響的研究中發現，膠原骨基質作為生長因子的控制釋放裝置，可以持續刺激細胞分化，DBM釋放的骨誘導因子量越大，細胞表達的ALP活性越高。本研究線性回歸分析顯示，DBM中BMP-2濃度對細胞ALP含量的影響有統計學意義，BMP-2濃度每增加1 ng/g，ALP含量將增加0.017 U/100 mL，表明DBM對細胞的促成骨分化能力與其可釋放的BMP-2含量成正相關關系。黃振明等[25]的研究也證實，miR-335-5p mimics可通過上調人BMSCs中BMP-2 mRNA及蛋白表達水平，促進成骨分化，進一步提示miR-335-5p治療骨質疏松癥的作用機制是調控BMP-2的表達。
本研究存在以下不足：為了消除供體因素和制備工藝兩個變量，實現樣本的同質化處理，研究中限制了DBM的取材量。后期我們會繼續選取更多合適供體，以驗證BMP在不同骨骼中的分布差異是否具有普遍性。前期研究表明BMP-2作為轉化生長因子家族的一員，在骨基質中濃度最大，產生骨誘導的作用最強[18]。因此，本實驗初步測定了DBM中BMP-2的濃度，并由此驗證了BMP-2濃度與細胞增殖、分化的劑量反應關系。實際上，細胞的增殖和分化是骨基質中多種生長因子共同作用的結果，其他生長因子在某種程度上會影響最終實驗結果。但是，本研究揭示的BMP-2在不同骨骼部位的分布特征，為不同骨骼尤其是皮質骨愈合過程和時間方面提供了新的理論基礎，具有較好的臨床指導意義。
綜上述，不同長骨中天然BMP-2的濃度差異較大，下肢長骨高于上肢長骨，BMP-2在不同長骨中的不均衡分布會進一步導致所制備DBM產品之間骨誘導能力的變異。制備DBM時，骨骼取材部位是影響DBM成骨性能的一個重要因素。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經濱州醫學院附屬醫院科研倫理委員會批準［【2021】倫審字（KT-026）號］
作者貢獻聲明 趙永杰：實驗設計與操作，數據收集整理及文章撰寫；尹剛、杜瑞：蛋白的提取和測定；王麗敏：材料制備；鄧明明、關國鋒：細胞實驗和數據分析；孫廣超：文章修改和復審；劉穎：提供實驗設計思路，把控實驗正確實施，文章審核修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱
