引用本文： 姚裕斌, 魏剛, 丁婕, 崔文國. 可注射水凝膠微球治療骨關節炎的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 918-928. doi: 10.7507/1002-1892.202302105 復制
骨關節炎是一種關節軟骨退行性病變，嚴重影響患者生活質量[1]。軟骨損傷后多以纖維軟骨替代，相比透明軟骨，其彈性較差，不利于維持關節功能[2-4]。研究發現雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DS）能通過抑制環氧合酶活性，減少前列腺素合成，改善局部炎癥微環境，為軟骨再生提供有利條件[5-6]。但口服制劑易引發肝、腎功能衰竭等不良反應[7-9]，注射制劑注射后滯留時間短、藥物利用率低[10-11]。
近年來，大量骨關節炎治療研究中采用水凝膠等新型生物活性材料作為藥物遞送載體，但大多局限于改善局部炎癥環境[12-17]。而再生醫學的關鍵是損傷組織的原位再生[18-20]，因此開發一款兼具藥物緩釋和抗炎、促軟骨修復的藥物遞送體系，是提高骨關節炎治療效果的突破口。低聚倍半硅氧烷（polyhedral oligomeric silsesquioxane，POSS）是一類有機/無機納米雜化材料[21-22]，具有促細胞增殖效果[23]，其中八巰基POSS （sulfhydryl POSS，POSS-SH）可通過巰基反應接枝各類功能性小分子。為此，本研究選擇POSS-SH作為納米構筑平臺，采用“點擊化學”法將聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、DS以化學鍵接枝，構建POSS雜化分子，命名為POSS-DS；進一步將POSS-DS與甲基丙烯酰透明質酸（hyaluronic acid methacrylate，HAMA）結合，制備多功能水凝膠微球，將其命名為HAMA@POSS-DS；并通過體內外實驗探討其用于骨關節炎治療的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12周齡雄性SD大鼠30只，體質量350～400 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。軟骨細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司。
POSS-SH、PEG、無水二氯甲烷、碳酸鉀、丙烯酰氯二氯甲烷、二羥甲基丙酸、四氫呋喃、透明質酸（hyaluronic acid，HA）、甲基丙烯酸酐（methacrylic acid anhydride，MA）、氫氧化鈉、石蠟油、司班80、異丙醇（上述試劑均為分析級；Sigma-Aldrich公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；活/死細胞染色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；兔抗Ⅱ型膠原一抗、FITC標記驢抗兔抗體（Affinity Biosciences公司，美國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；反轉錄系統試劑盒、SYBR Premix Ex Tag Kit（Takara公司，日本）； ABI 7500 型實時熒光定量PCR系統（Application Biosystems公司，美國）；Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，Adamts5）、速激肽1（recombinant tachykinin precursor 1，TAC1）以及GAPDH的特異性引物 ［上海生物工程（上海）股份有限公司］。
Bruker AMX-600核磁共振波譜儀（Bruker公司，瑞士）；Lambda35紫外吸收光譜儀（PerkinElmer公司，美國）；光鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Tecnai G2 Spirit Biotwin透射電鏡（Thermo Fisher公司，美國）；Sirion 200掃描電鏡（Frequency Electronics公司，美國）；Micro-CT成像系統（SkyScan公司，比利時）；透析袋（截留相對分子質量14×103；北京索萊寶科技有限公司）；微量注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；自制改進微液流動性聚焦裝置；小動物X線成像儀（Faxitron公司，美國）。
1.2 POSS-DS制備及表征
1.2.1 POSS-DS制備
① PEG丙烯酸單酯（PEG-acrylate，PEG-Ac）以及DS丙烯酸單酯（DS-acrylate，DS-Ac）制備：于200 mL三口燒瓶中依次加入1.6 g PEG（4 mmol）、60.0 mL無水二氯甲烷以及0.6 g碳酸鉀（4 mmol），氮氣保護下于冰水浴（0～5℃）條件下持續攪拌10 min。完全溶解后，緩慢滴加10 mL丙烯酰氯二氯甲烷溶液（4 mmol），室溫下繼續反應24 h。濾去過量碳酸鉀，并進行萃取；無水硫酸鈉吸收殘留水分，旋干，獲得PEG-Ac。DS-Ac制備過程與PEG-Ac一致，僅將PEG更換為DS（2 mmol）。
② POSS-DS合成：稱取0.726 mg POSS-SH（1.6 mmol）、0.120 g PEG-Ac（0.120 mmol）以及二羥甲基丙酸，加入10 mL四氫呋喃充分溶解。將上述溶液轉入50 mL三口燒瓶中，室溫下使用365 nm紫外燈照射反應2.5 h。稱取0.127 g DS-Ac（0.2 mmol）溶解在5 mL四氫呋喃中，加入至上述溶液中繼續紫外燈照射反應6 h。旋蒸去除四氫呋喃，獲得POSS-DS。
1.2.2 觀測指標
① 核磁共振波譜儀分析：將POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac以及POSS-DS分別溶解于氘代DMSO中，采用核磁共振波譜儀分析化學組成和結構特征。測試條件：掃描頻率600 MHz，以四甲基硅烷為內標。
② 透射電鏡觀察和能譜分析：將1 μL POSS-DS置于1 mL無水乙醇中，超聲使其分散均勻后，取少量平鋪于銅網上，待無水乙醇揮發后將樣品置于透射電鏡，觀察納米顆粒形態及粒徑，同時對樣品中化學元素進行能譜分析。
1.3 HAMA@POSS-DS制備
1.3.1 HAMA合成
參考本團隊既往研究方法[24]合成HAMA。取10 g HA加入500 mL PBS中加熱至60℃，機械攪拌至澄清透明、完全熔化；滴加MA 10 mL，于50℃不間斷機械攪拌下持續混合反應1 h；采用微量注射泵滴加濃度為5 mol/L氫氧化鈉溶液，冰水浴條件下避光反應24 h。反應結束后，在攪拌同時加入PBS溶液稀釋停止反應，將溶液轉移至透析袋中，室溫下透析1周過濾雜質。最后將HAMA水溶液冷凍過夜后進行凍干處理。
1.3.2 HAMA@POSS-DS制備
采用微流控技術，以自制改進微液流動性聚焦裝置制備HAMA@POSS-DS。在含4 wt% HAMA的PBS溶液中加入1wt% POSS-DS以及0.5wt%光引發劑，充分攪拌混合至澄清透明，即為水相。于石蠟油中加入5wt%司班80充分混勻，即為油相。通過連接注射器泵的注射器控制水相和油相流量，將得到的單分散乳液滴在紫外光下進行光學交聯化。用試管收集光交聯后的水凝膠微球，加入適量異丙醇進行振蕩洗滌2～3遍，最后以250×g離心10 min，獲得HAMA@POSS-DS。見圖1。
圖1
微流控技術制備HAMA@POSS-DS流程圖
Figure1.
Schematic diagram of the preparation of HAMA@POSS-DS through microfluidic technology
1.4 HAMA@POSS-DS體外觀測
1.4.1 光鏡及掃描電鏡觀察
將含HAMA@POSS-DS的PBS懸液滴至載玻片，使其均勻分散單層平鋪。將載玻片置于光鏡明場下觀察水凝膠微球形態并測量粒徑大小。HAMA@POSS-DS凍干處理后呈粉末狀，直接置于掃描電鏡下觀測表面形態及粒徑大小。實驗重復3次。
1.4.2 體外降解及藥物釋放實驗
按照文獻 ［25］ 方法，將10 mg HAMA@POSS-DS置于5 mL PBS（pH7.4，37℃）中，加入濃度為150 U/L的透明質酸酶進行消化，每隔2 d補充1次酶溶液以保持酶活性（模擬體內生理環境）。在每周固定時間點（每周一下午14:00）光鏡觀察水凝膠微球形態變化，直至完全降解。測定前以250×g離心10 min，吸取上清液用于測定藥物濃度，并將殘留的水凝膠微球經定性濾紙吸濾后，用電子天平測定殘余質量。按照以下公式計算降解率：降解率=（初始質量–殘余質量）/初始質量× 100%。繪制降解曲線，分析HAMA@POSS-DS降解情況。
同時，將濃度為20 mmol/L的POSS-DS原液分別稀釋至200、150、100、50、10、1 μmol/L以及100、50、10 nmol/L，然后使用紫外分光光度計測定不同濃度POSS-DS的吸光度（A）值，并以濃度為橫坐標、A值為縱坐標繪制標準曲線，用于檢測上清液中實際藥物濃度數值。基于上述離心所得上清液A值，獲得上清液中藥物濃度，最終得到藥物釋放曲線。每個時間點觀測3個樣本。
1.5 HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
1.5.1 POSS-DS最佳濃度選擇
取軟骨細胞制成濃度為0.5×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔0.5 mL。將細胞分為5組，每組6個復孔；除對照組采用DMEM培養基進行培養外，其余4組分別采用含100、10、1 μmol/L及100 nmol/L POSS-DS的DMEM培養基進行培養。于37℃、5%CO2條件下進行孵育，每2天更換1次培養基。培養12、24、48 h后，每孔加入100 μL 含CCK-8的培養基（90 μL DMEM培養基混合10 μL CCK-8溶液），繼續孵育2 h。最后，在450 nm波長下檢測A值，以此篩選出促進細胞增殖的POSS-DS最佳濃度進行后續實驗。
1.5.2 細胞培養及觀測
① CCK-8觀測：同1.5.1方法將軟骨細胞接種至96孔板后，隨機分為4組，每組6個復孔；除對照組采用DMEM培養基培養外，HAMA組、HAMA@POSS-DS組、POSS-DS組分別采用含HAMA（0.1 mg/mL）及最佳濃度HAMA@POSS-DS、POSS-DS的培養基進行培養。于37℃、5% CO2條件下進行孵育，每2天更換1次培養基。培養后12、24、48 h，同上法測量A值。
② 活/死細胞染色觀測：取濃度為5×104個/mL的軟骨細胞懸液接種于24孔板，每孔1 mL。同CCK-8觀測方法分組培養12、24、48 h后，吸棄培養液，PBS清洗細胞后參照活/死細胞染色試劑盒說明進行染色，室溫下孵育40 min后熒光顯微鏡下觀察，其中活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。每組取3個視野，應用Image J軟件進行細胞計數。
1.6 HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
1.6.1 軟骨細胞炎癥模型構建
取濃度為5×105個/mL的軟骨細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，同時加入濃度為20 ng/mL的IL-1β。采用DMEM培養基于37℃、5%CO2條件培養0、6、12、24、48 h后，采用實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA相對表達量。具體步驟：采用Trizol試劑提取細胞總RNA，分別在260 nm和280 nm處測定A值，測定RNA濃度和純度。反轉錄系統試劑盒合成cDNA，用SYBR Premix Ex Tag Kit和ABI 7500 Sequencing Detection System擴增cDNA。引物序列見表1。以GAPDH作為內參，采用2–ΔΔCt法計算Ⅱ型膠原mRNA相對表達量。以不同時間點Ⅱ型膠原mRNA相對表達量為標準驗證軟骨細胞炎癥模型構建成功后，進行后續實驗。
表1
實時熒光定量PCR基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR genes (5′→3′)
1.6.2 免疫熒光染色觀察
參照既往研究[25]，取HAMA、HAMA@POSS-DS按照1 mg/mL濃度置于DMEM培養基中自然降解2周，取浸出液用于細胞培養。
取濃度為5×104 個/mL的軟骨細胞懸液接種于24孔培養板的蓋玻片上，每孔1 mL，隨機分為5組。對照組采用單純DMEM培養基培養，空白組、DS組、HAMA組及HAMA@POSS-DS組的DMEM培養基中加入20 ng/mL IL-1β以模擬炎癥環境，后3組進一步對應加入DS、HAMA浸出液和HAMA@POSS-DS浸出液。培養48 h后，將細胞置于4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100處理10 min，2%牛血清白蛋白孵育45 min；4℃與兔抗Ⅱ型膠原一抗（1∶500）孵育過夜，PBS洗滌3次，與FITC標記的驢抗兔抗體（1∶800）室溫下孵育1 h；PBS洗滌3次后，分別用鬼筆環肽（1∶2 000） 和DAPI（1∶1 000）對細胞骨架和細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察Ⅱ型膠原表達強度。
1.6.3 實時熒光定量PCR檢測
將濃度為5×105個/mL的軟骨細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，同1.6.2方法隨機分5組進行培養，每組3個復孔。培養24 h后，取細胞同1.6.1行實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原、AGG、MMP-13、Adamts5、 TAC1 mRNA相對表達量。引物序列見表1。
1.7 HAMA@POSS-DS體內觀測
1.7.1 大鼠骨關節炎模型構建及分組
將30只SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組。經面罩異氟烷吸入麻醉、皮下注射美洛昔康（1 mg/kg）和丁丙諾啡緩釋劑（1 mg/kg）麻醉后，左后肢備皮、消毒。于左側股骨遠端至脛骨近端平臺作一長2～3 cm切口，切開髕腱內側關節囊并用剪刀張開；將髕腱撥至外側，鈍性分離脂肪墊，顯露內側半月板的半月板脛側韌帶。假手術組不作其他處理，其余4組用顯微外科剪切開半月板脛側韌帶并切除內側半月板前角，然后依次縫合內側關節囊及皮膚創面。手術完成后，用無菌生理鹽水徹底沖洗關節，并重新定位髕骨；可吸收縫線縫合關節囊和皮膚。各組術后皮下注射溫熱生理鹽水（20 mL/kg），單獨飼養，自由獲取食物和水，并允許自由活動；3 d內皮下注射美洛昔康（1 mg/kg，q24h）、丁丙諾啡緩釋劑（1 mg/kg，q48h）。此外，PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組分別于術后第1、4、7周關節腔內注射200 μL PBS、DS溶液（1 μmol/L）、含 10 mg/mL HAMA 的PBS懸液和含10 mg/mLHAMA@POSS-DS的PBS懸液；假手術組不作特殊處理。
5組大鼠從術后1周開始每隔1 d在水平跑步機上以15 m/min速度進行1 h跑步訓練，誘導膝關節骨關節炎，持續至術后8周實驗結束。
1.7.2 觀測指標
① X線片檢查：術后1、8周將各組大鼠同上法麻醉后，用小動物X線成像儀進行掃描成像（曝光時間6 mAs，電壓32 kV），于X線片測量左膝關節間隙寬度，測量結果以假手術組進行標準化處理。
② Micro-CT成像評估：各組大鼠術后8周X線片檢查后，采用CO2吸入窒息法實施安樂死。按照原切口入路取術側膝關節，盡量剔除表面多余肌肉組織后，浸泡于4%多聚甲醛溶液24 h，然后轉至70%乙醇溶液中常溫保存。將膝關節標本固定在Micro-CT成像系統插槽上，掃描角度0.03°，電流130 μA、電壓70 kV，整合時間100 ms。根據突出骨骼輪廓和降低的骨密度測量骨贅體積，于CT圖像上選擇脛骨近端和股骨遠端測量，其總和為每個樣本骨贅總體積（total osteophyte volume，TOV）。
1.8 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 POSS-DS表征
2.1.1 核磁共振波譜儀分析
① POSS-SH：化學位移在0.76 ppm左右為與Si-CH2- 相連的質子氫的振動吸收峰，1.37 ppm左右為-SH質子氫的振動吸收峰，1.71 ppm左右是Si-CH2-CH2- 質子氫的振動吸收峰，2.56 ppm左右為Si-CH2-CH2-CH2- 質子氫的振動吸收峰。② PEG-Ac：6.63 ppm和6.19 ppm為乙烯基=CH2上質子氫的振動吸收峰，6.07 ppm為=CH- 上質子氫的振動吸收峰，4.21 ppm為-CH2- 上質子氫的振動吸收峰，3.69～3.39 ppm為PEG重復單元中-CH2- 上質子氫的振動吸收峰。③ DS-Ac：丙烯酰氯接枝成功表現為在6～8 ppm區間有1個三重峰，6.77、6.96、7.09 ppm處為丙酰氯特征峰，說明接枝成功。④ POSS-DS：原6.77、6.96、7.09 ppm處丙烯酰氯特征峰消失，而在1.5 ppm處有SH質子伸縮振動峰。上述結果提示DS已被成功鏈接在POSS上。見圖2a～d。
圖2
POSS-DS制備及表征
a～d. POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac、POSS-DS核磁氫譜； e. POSS-DS能譜分析；f. POSS-DS透射電鏡觀察（×5 000）
Figure2. Preparation and characterization of POSS-DSa-d. Nuclear magnetic hydrogen spectrum of POSS-SH, PEG-Ac, DS-Ac, and POSS-DS; e. Energy spectrum analysis of POSS-DS; f. Transmission electron microscope image of POSS-DS (×5 000)
2.1.2 透射電鏡觀察
POSS-DS總體粒徑均勻，約為100 nm。能譜分析結果顯示，POSS-DS中硅、碳、氧等基本組成元素含量高且分布均勻，DS特有的氯元素和鈉元素含量相對較少，但總體仍呈均勻分布，進一步說明POSS-DS制備成功。見圖2e、f。
2.2 HAMA@POSS-DS體外觀測
2.2.1 光鏡及掃描電鏡觀察
HAMA@POSS-DS在PBS溶液中靜置后可發生沉降現象，輕輕搖晃后可形成半透明、均一分散懸液，在室溫下可在較長時間內（約30 min）保持結構穩定性。光鏡下水凝膠微球不透明，粒徑均勻，約為100 μm。掃描電鏡下觀察，凍干狀態下該水凝膠微球粒徑在40 μm左右，整體呈疏松多孔結構。見圖3a～c。
圖3
HAMA@POSS-DS表征
a. 大體觀察；b. 光鏡觀察（×200）；c. 掃描電鏡觀察（×3 000）；d. 降解曲線；e. 藥物釋放曲線
Figure3. The characterization of HAMA@POSS-DSa. General observation; b. Observation under light microscope (×200); c. Observation under scanning electron microscope (×3 000); d. Degradation curve; e. Drug release curve
2.2.2 體外降解及藥物釋放實驗
HAMA@POSS-DS降解過程相對緩慢，第1周降解緩慢，此后降解速率稍增加，并維持較平穩降解狀態，最終在第9周時基本完全降解。藥物釋放曲線顯示前4周藥物釋放速率逐步提升，4～6周稍有減緩，6周后趨于平緩。見圖3d、e。
2.3 HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
2.3.1 POSS-DS最佳濃度選擇
培養12、24、48 h，與對照組相比，不同濃度POSS-DS 組A值均增高，差異有統計學意義（P<0.05）；且1 μmol/L POSS-DS組高于其他濃度POSS-DS組（P<0.05），故后續實驗選擇1 μmol/L POSS-DS以及對應的0.1 mg/mL HAMA@POSS-DS。見圖4a。
圖4
HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
a. 不同POSS-DS濃度下細胞增殖情況； b. CCK-8檢測結果；c. 活/死細胞染色細胞計數結果；d. 活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為對照組、HAMA組、HAMA@POSS-DS組、POSS-DS組，從上至下分別為培養12、24、48 h
Figure4. HAMA@POSS-DS cytotoxicity detectiona. Cell proliferation at different concentrations of POSS-DS; b. Results of CCK-8 test; c. Cell count results after live/dead staining; d. Live/dead staining images (Fluorescence microscope×200) From left to right for control group, HAMA group, HAMA@POSS-DS group, and POSS-DS group, respectively; from top to bottom for the incubation time of 12, 24, and 48 hours, respectively
2.3.2 CCK-8及活/死細胞染色觀測
各組細胞A值及細胞計數均隨培養時間增加而增加，且均未見明顯死亡細胞。組間比較：HAMA組各時間點A值及細胞計數與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；HAMA@POSS-DS組僅48 h時高于對照組且差異有統計學意義（P<0.05）；而POSS-DS組各時間點均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4 b～d。
2.4 HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
2.4.1 軟骨細胞炎癥模型構建
軟骨細胞經IL-1β處理后，Ⅱ型膠原mRNA相對表達量隨時間延長而顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。培養48 h時降至起始水平的18%，表明軟骨細胞炎癥模型建立成功。
2.4.2 免疫熒光染色觀察
空白組Ⅱ型膠原熒光強度與對照組相比顯著減弱。相比于空白組和HAMA組，DS組熒光強度較強，但與對照組仍存在明顯差距。HAMA@POSS-DS組Ⅱ型膠原熒光強度顯著強于空白組、DS組、HAMA組，甚至超過對照組。
2.4.3 實時熒光定量PCR觀測
① Ⅱ型膠原：與對照組比較，空白組、DS組、HAMA組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量均降低，而HAMA@POSS-DS組有所升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組升高（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。
② AGG：與對照組比較，空白組、DS組、HAMA組AGG mRNA相對表達量均下降（P<0.05），而HAMA@POSS-DS組差異無統計學意義（P>0.05）；與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組升高（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。
③ MMP-13：與對照組比較，其余各組MMP-13 mRNA相對表達量均升高（P<0.05）；與空白組比較， DS組、HAMA組、HAMA@POSS-DS組的MMP-13 mRNA相對表達量均降低（P<0.05）。
④ Adamts 5：除HAMA@POSS-DS組與對照組差異無統計學意義（P>0.05）外，Adamts 5 mRNA相對表達量組間差異總體與MMP-13一致。
⑤ TAC1：與對照組比較，其余各組TAC1 mRNA相對表達量均升高（P<0.05）；與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組的TAC1 mRNA相對表達量下降（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。
圖5
HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
a. Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為對照組、空白組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組，從上至下分別為Ⅱ型膠原、細胞核、細胞骨架及重疊圖像；b. IL-1β處理后軟骨細胞Ⅱ型膠原 mRNA相對表達量；c～g. 實時熒光定量PCR檢測各目的基因相對表達量
Figure5. Chondrocyte anti-inflammatory experiment of HAMA@POSS-DSa. Collagen type Ⅱ immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×200) From left to right for control group, blank group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; from top to bottom for collagen type Ⅱ, nucleus, cell skeleton, and merge images, respectively; b. Relative expression of collagen type Ⅱ mRNA in chondrocytes treated with IL-1β; c-g. Relative expression of each target gene detected by real-time fluorescence quantitative PCR
2.5 HAMA@POSS-DS體內觀測
2.5.1 X線片檢查
術后1周，各組大鼠相對關節間隙寬度差異無統計學意義（P>0.05）。8周時，PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組相對關節間隙寬度均小于假手術組，HAMA@POSS-DS組大于PBS組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5.2 Micro-CT成像評估
與假手術組相比，PBS組、DS組和HAMA組膝關節軟骨下骨骨質明顯增厚，發生了不同程度軟骨下骨硬化；而HAMA@POSS-DS組未見明顯上述變化。
PBS組骨贅體積最大，其次是HAMA組、DS組，HAMA@POSS-DS組及假手術組最小。其中，PBS組、HAMA組、DS組TOV與假手術組比較，PBS組與DS組、HAMA@POSS-DS組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
HAMA@POSS-DS體內治療效果觀測
a. 術后1周（上）、8周（下）膝關節側位X線片 從左至右分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組；b. 術后8周Micro-CT斷層影像（上）及三維重建影像（下） 從左至右分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組，箭頭示骨贅；c. 術后1周各組相對關節間隙寬度；d. 術后8周各組相對關節間隙寬度；e. 術后8周各組膝關節TOV
Figure6. In vivo therapeutic effect of HAMA@POSS-DSa. Lateral X-ray films of rat knees at 1 (top) and 8 (bottom) weeks after operation From left to right for sham operation group, PBS group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; b. Micro-CT tomographic images (top) and three-dimensional reconstruction images (bottom) of rat knee joints at 8 weeks after operation From left to right for sham operation group, PBS group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; arrow indicated the osteophytes; c. Relative joint gap width of each group at 1 week after operation; d. Relative joint gap width of each group at 8 weeks after operation; e. Total osteophyte volume of knee in each group at 8 weeks after operation
3 討論
本研究通過“點擊化學”法以POSS-SH為納米構筑平臺，成功合成了集抗炎、促軟骨再生于一體的功能性納米顆粒POSS-DS，并利用微流控技術制備了粒徑均一、高度單分散的雜化水凝膠微球HAMA@POSS-DS。細胞實驗中，HAMA@POSS-DS表現出了良好的生物相容性；與軟骨細胞共培養48 h過程中，隨著其負載的POSS-DS少量被緩釋到培養基中，軟骨細胞數量明顯增多，提示POSS-DS在促進軟骨細胞增殖方面具有顯著優勢，這與POSS骨架有利于細胞黏附密不可分[23]。此外，HAMA@POSS-DS還表現出了優異的抗炎性能。在軟骨細胞抗炎實驗中，HAMA@POSS-DS組在炎癥環境下可有效促進軟骨細胞增殖以及Ⅱ型膠原和AGG的表達，防止軟骨基質流失，進而對軟骨細胞起到有效保護作用。HAMA水凝膠微球緩慢的降解過程有利于其原位注射后在關節腔內的長期滯留，并緩慢釋放負載的抗炎藥物，這不僅大幅提升了目標藥物利用率，更有助于維持穩定的藥物濃度。促進軟骨細胞增殖，協同緩釋DS改善局部組織炎癥微環境，將更有助于軟骨組織的修復和再生。
骨關節炎病程早期軟骨損傷仍存在逆轉可能，這一階段也是治療的黃金時期，本研究旨在抓住骨關節炎早期階段，探索對損傷軟骨進行搶救性修復的藥物緩釋材料。因此，在動物實驗中選取了較短的觀測周期（8周）[26]。從治療終點的影像數據可以看出，HAMA@POSS-DS復合水凝膠微球對比傳統藥物治療具有顯著優勢，不僅在相同治療周期內獲得顯著治療效果，而且還減少了給藥頻率，有望減少患者在治療過程中的痛苦，提高依從性。與以往研究中單純將生物活性材料作為抗炎藥物的遞送載體不同，本研究的POSS納米顆粒本身對細胞增殖具有顯著促進作用，利用這一獨特的材料優勢制備出兼具抗炎和促再生的多功能微納水凝膠微球，兩方面作用相輔相成，極大地提高了骨關節炎治療效果。未對骨關節炎晚期病程進行進一步動物實驗是該研究不足之處。有了現階段正向的實驗結果，后續研究將進一步延長動物實驗周期，以針對逆轉骨關節炎晚期病程進行更深入探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的分析及其報道
倫理聲明 研究方案經維通利華實驗動物技術有限公司機構實驗動物管理和使用委員會審批（P2022076）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（浙）2019-0001，使用許可證批準號：SYXK（滬）2022-0018
作者貢獻聲明 姚裕斌：材料合成制備、生物實驗和論文撰寫；崔文國：科研設計；魏剛：指導納米材料合成；丁婕：文獻查閱和總結、英文審校和論文修改
骨關節炎是一種關節軟骨退行性病變，嚴重影響患者生活質量[1]。軟骨損傷后多以纖維軟骨替代，相比透明軟骨，其彈性較差，不利于維持關節功能[2-4]。研究發現雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium，DS）能通過抑制環氧合酶活性，減少前列腺素合成，改善局部炎癥微環境，為軟骨再生提供有利條件[5-6]。但口服制劑易引發肝、腎功能衰竭等不良反應[7-9]，注射制劑注射后滯留時間短、藥物利用率低[10-11]。
近年來，大量骨關節炎治療研究中采用水凝膠等新型生物活性材料作為藥物遞送載體，但大多局限于改善局部炎癥環境[12-17]。而再生醫學的關鍵是損傷組織的原位再生[18-20]，因此開發一款兼具藥物緩釋和抗炎、促軟骨修復的藥物遞送體系，是提高骨關節炎治療效果的突破口。低聚倍半硅氧烷（polyhedral oligomeric silsesquioxane，POSS）是一類有機/無機納米雜化材料[21-22]，具有促細胞增殖效果[23]，其中八巰基POSS （sulfhydryl POSS，POSS-SH）可通過巰基反應接枝各類功能性小分子。為此，本研究選擇POSS-SH作為納米構筑平臺，采用“點擊化學”法將聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、DS以化學鍵接枝，構建POSS雜化分子，命名為POSS-DS；進一步將POSS-DS與甲基丙烯酰透明質酸（hyaluronic acid methacrylate，HAMA）結合，制備多功能水凝膠微球，將其命名為HAMA@POSS-DS；并通過體內外實驗探討其用于骨關節炎治療的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
12周齡雄性SD大鼠30只，體質量350～400 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。軟骨細胞購于上海中喬新舟生物科技有限公司。
POSS-SH、PEG、無水二氯甲烷、碳酸鉀、丙烯酰氯二氯甲烷、二羥甲基丙酸、四氫呋喃、透明質酸（hyaluronic acid，HA）、甲基丙烯酸酐（methacrylic acid anhydride，MA）、氫氧化鈉、石蠟油、司班80、異丙醇（上述試劑均為分析級；Sigma-Aldrich公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；活/死細胞染色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；兔抗Ⅱ型膠原一抗、FITC標記驢抗兔抗體（Affinity Biosciences公司，美國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；反轉錄系統試劑盒、SYBR Premix Ex Tag Kit（Takara公司，日本）； ABI 7500 型實時熒光定量PCR系統（Application Biosystems公司，美國）；Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖（aggrecan，AGG）、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶5（recombinant A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，Adamts5）、速激肽1（recombinant tachykinin precursor 1，TAC1）以及GAPDH的特異性引物 ［上海生物工程（上海）股份有限公司］。
Bruker AMX-600核磁共振波譜儀（Bruker公司，瑞士）；Lambda35紫外吸收光譜儀（PerkinElmer公司，美國）；光鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；Tecnai G2 Spirit Biotwin透射電鏡（Thermo Fisher公司，美國）；Sirion 200掃描電鏡（Frequency Electronics公司，美國）；Micro-CT成像系統（SkyScan公司，比利時）；透析袋（截留相對分子質量14×103；北京索萊寶科技有限公司）；微量注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；自制改進微液流動性聚焦裝置；小動物X線成像儀（Faxitron公司，美國）。
1.2 POSS-DS制備及表征
1.2.1 POSS-DS制備
① PEG丙烯酸單酯（PEG-acrylate，PEG-Ac）以及DS丙烯酸單酯（DS-acrylate，DS-Ac）制備：于200 mL三口燒瓶中依次加入1.6 g PEG（4 mmol）、60.0 mL無水二氯甲烷以及0.6 g碳酸鉀（4 mmol），氮氣保護下于冰水浴（0～5℃）條件下持續攪拌10 min。完全溶解后，緩慢滴加10 mL丙烯酰氯二氯甲烷溶液（4 mmol），室溫下繼續反應24 h。濾去過量碳酸鉀，并進行萃取；無水硫酸鈉吸收殘留水分，旋干，獲得PEG-Ac。DS-Ac制備過程與PEG-Ac一致，僅將PEG更換為DS（2 mmol）。
② POSS-DS合成：稱取0.726 mg POSS-SH（1.6 mmol）、0.120 g PEG-Ac（0.120 mmol）以及二羥甲基丙酸，加入10 mL四氫呋喃充分溶解。將上述溶液轉入50 mL三口燒瓶中，室溫下使用365 nm紫外燈照射反應2.5 h。稱取0.127 g DS-Ac（0.2 mmol）溶解在5 mL四氫呋喃中，加入至上述溶液中繼續紫外燈照射反應6 h。旋蒸去除四氫呋喃，獲得POSS-DS。
1.2.2 觀測指標
① 核磁共振波譜儀分析：將POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac以及POSS-DS分別溶解于氘代DMSO中，采用核磁共振波譜儀分析化學組成和結構特征。測試條件：掃描頻率600 MHz，以四甲基硅烷為內標。
② 透射電鏡觀察和能譜分析：將1 μL POSS-DS置于1 mL無水乙醇中，超聲使其分散均勻后，取少量平鋪于銅網上，待無水乙醇揮發后將樣品置于透射電鏡，觀察納米顆粒形態及粒徑，同時對樣品中化學元素進行能譜分析。
1.3 HAMA@POSS-DS制備
1.3.1 HAMA合成
參考本團隊既往研究方法[24]合成HAMA。取10 g HA加入500 mL PBS中加熱至60℃，機械攪拌至澄清透明、完全熔化；滴加MA 10 mL，于50℃不間斷機械攪拌下持續混合反應1 h；采用微量注射泵滴加濃度為5 mol/L氫氧化鈉溶液，冰水浴條件下避光反應24 h。反應結束后，在攪拌同時加入PBS溶液稀釋停止反應，將溶液轉移至透析袋中，室溫下透析1周過濾雜質。最后將HAMA水溶液冷凍過夜后進行凍干處理。
1.3.2 HAMA@POSS-DS制備
采用微流控技術，以自制改進微液流動性聚焦裝置制備HAMA@POSS-DS。在含4 wt% HAMA的PBS溶液中加入1wt% POSS-DS以及0.5wt%光引發劑，充分攪拌混合至澄清透明，即為水相。于石蠟油中加入5wt%司班80充分混勻，即為油相。通過連接注射器泵的注射器控制水相和油相流量，將得到的單分散乳液滴在紫外光下進行光學交聯化。用試管收集光交聯后的水凝膠微球，加入適量異丙醇進行振蕩洗滌2～3遍，最后以250×g離心10 min，獲得HAMA@POSS-DS。見圖1。
圖1
微流控技術制備HAMA@POSS-DS流程圖
Figure1.
Schematic diagram of the preparation of HAMA@POSS-DS through microfluidic technology
1.4 HAMA@POSS-DS體外觀測
1.4.1 光鏡及掃描電鏡觀察
將含HAMA@POSS-DS的PBS懸液滴至載玻片，使其均勻分散單層平鋪。將載玻片置于光鏡明場下觀察水凝膠微球形態并測量粒徑大小。HAMA@POSS-DS凍干處理后呈粉末狀，直接置于掃描電鏡下觀測表面形態及粒徑大小。實驗重復3次。
1.4.2 體外降解及藥物釋放實驗
按照文獻 ［25］ 方法，將10 mg HAMA@POSS-DS置于5 mL PBS（pH7.4，37℃）中，加入濃度為150 U/L的透明質酸酶進行消化，每隔2 d補充1次酶溶液以保持酶活性（模擬體內生理環境）。在每周固定時間點（每周一下午14:00）光鏡觀察水凝膠微球形態變化，直至完全降解。測定前以250×g離心10 min，吸取上清液用于測定藥物濃度，并將殘留的水凝膠微球經定性濾紙吸濾后，用電子天平測定殘余質量。按照以下公式計算降解率：降解率=（初始質量–殘余質量）/初始質量× 100%。繪制降解曲線，分析HAMA@POSS-DS降解情況。
同時，將濃度為20 mmol/L的POSS-DS原液分別稀釋至200、150、100、50、10、1 μmol/L以及100、50、10 nmol/L，然后使用紫外分光光度計測定不同濃度POSS-DS的吸光度（A）值，并以濃度為橫坐標、A值為縱坐標繪制標準曲線，用于檢測上清液中實際藥物濃度數值。基于上述離心所得上清液A值，獲得上清液中藥物濃度，最終得到藥物釋放曲線。每個時間點觀測3個樣本。
1.5 HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
1.5.1 POSS-DS最佳濃度選擇
取軟骨細胞制成濃度為0.5×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔0.5 mL。將細胞分為5組，每組6個復孔；除對照組采用DMEM培養基進行培養外，其余4組分別采用含100、10、1 μmol/L及100 nmol/L POSS-DS的DMEM培養基進行培養。于37℃、5%CO2條件下進行孵育，每2天更換1次培養基。培養12、24、48 h后，每孔加入100 μL 含CCK-8的培養基（90 μL DMEM培養基混合10 μL CCK-8溶液），繼續孵育2 h。最后，在450 nm波長下檢測A值，以此篩選出促進細胞增殖的POSS-DS最佳濃度進行后續實驗。
1.5.2 細胞培養及觀測
① CCK-8觀測：同1.5.1方法將軟骨細胞接種至96孔板后，隨機分為4組，每組6個復孔；除對照組采用DMEM培養基培養外，HAMA組、HAMA@POSS-DS組、POSS-DS組分別采用含HAMA（0.1 mg/mL）及最佳濃度HAMA@POSS-DS、POSS-DS的培養基進行培養。于37℃、5% CO2條件下進行孵育，每2天更換1次培養基。培養后12、24、48 h，同上法測量A值。
② 活/死細胞染色觀測：取濃度為5×104個/mL的軟骨細胞懸液接種于24孔板，每孔1 mL。同CCK-8觀測方法分組培養12、24、48 h后，吸棄培養液，PBS清洗細胞后參照活/死細胞染色試劑盒說明進行染色，室溫下孵育40 min后熒光顯微鏡下觀察，其中活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。每組取3個視野，應用Image J軟件進行細胞計數。
1.6 HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
1.6.1 軟骨細胞炎癥模型構建
取濃度為5×105個/mL的軟骨細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，同時加入濃度為20 ng/mL的IL-1β。采用DMEM培養基于37℃、5%CO2條件培養0、6、12、24、48 h后，采用實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA相對表達量。具體步驟：采用Trizol試劑提取細胞總RNA，分別在260 nm和280 nm處測定A值，測定RNA濃度和純度。反轉錄系統試劑盒合成cDNA，用SYBR Premix Ex Tag Kit和ABI 7500 Sequencing Detection System擴增cDNA。引物序列見表1。以GAPDH作為內參，采用2–ΔΔCt法計算Ⅱ型膠原mRNA相對表達量。以不同時間點Ⅱ型膠原mRNA相對表達量為標準驗證軟骨細胞炎癥模型構建成功后，進行后續實驗。
表1
實時熒光定量PCR基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of real-time fluorescence quantitative PCR genes (5′→3′)
1.6.2 免疫熒光染色觀察
參照既往研究[25]，取HAMA、HAMA@POSS-DS按照1 mg/mL濃度置于DMEM培養基中自然降解2周，取浸出液用于細胞培養。
取濃度為5×104 個/mL的軟骨細胞懸液接種于24孔培養板的蓋玻片上，每孔1 mL，隨機分為5組。對照組采用單純DMEM培養基培養，空白組、DS組、HAMA組及HAMA@POSS-DS組的DMEM培養基中加入20 ng/mL IL-1β以模擬炎癥環境，后3組進一步對應加入DS、HAMA浸出液和HAMA@POSS-DS浸出液。培養48 h后，將細胞置于4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100處理10 min，2%牛血清白蛋白孵育45 min；4℃與兔抗Ⅱ型膠原一抗（1∶500）孵育過夜，PBS洗滌3次，與FITC標記的驢抗兔抗體（1∶800）室溫下孵育1 h；PBS洗滌3次后，分別用鬼筆環肽（1∶2 000） 和DAPI（1∶1 000）對細胞骨架和細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察Ⅱ型膠原表達強度。
1.6.3 實時熒光定量PCR檢測
將濃度為5×105個/mL的軟骨細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL，同1.6.2方法隨機分5組進行培養，每組3個復孔。培養24 h后，取細胞同1.6.1行實時熒光定量PCR檢測Ⅱ型膠原、AGG、MMP-13、Adamts5、 TAC1 mRNA相對表達量。引物序列見表1。
1.7 HAMA@POSS-DS體內觀測
1.7.1 大鼠骨關節炎模型構建及分組
將30只SD大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組。經面罩異氟烷吸入麻醉、皮下注射美洛昔康（1 mg/kg）和丁丙諾啡緩釋劑（1 mg/kg）麻醉后，左后肢備皮、消毒。于左側股骨遠端至脛骨近端平臺作一長2～3 cm切口，切開髕腱內側關節囊并用剪刀張開；將髕腱撥至外側，鈍性分離脂肪墊，顯露內側半月板的半月板脛側韌帶。假手術組不作其他處理，其余4組用顯微外科剪切開半月板脛側韌帶并切除內側半月板前角，然后依次縫合內側關節囊及皮膚創面。手術完成后，用無菌生理鹽水徹底沖洗關節，并重新定位髕骨；可吸收縫線縫合關節囊和皮膚。各組術后皮下注射溫熱生理鹽水（20 mL/kg），單獨飼養，自由獲取食物和水，并允許自由活動；3 d內皮下注射美洛昔康（1 mg/kg，q24h）、丁丙諾啡緩釋劑（1 mg/kg，q48h）。此外，PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組分別于術后第1、4、7周關節腔內注射200 μL PBS、DS溶液（1 μmol/L）、含 10 mg/mL HAMA 的PBS懸液和含10 mg/mLHAMA@POSS-DS的PBS懸液；假手術組不作特殊處理。
5組大鼠從術后1周開始每隔1 d在水平跑步機上以15 m/min速度進行1 h跑步訓練，誘導膝關節骨關節炎，持續至術后8周實驗結束。
1.7.2 觀測指標
① X線片檢查：術后1、8周將各組大鼠同上法麻醉后，用小動物X線成像儀進行掃描成像（曝光時間6 mAs，電壓32 kV），于X線片測量左膝關節間隙寬度，測量結果以假手術組進行標準化處理。
② Micro-CT成像評估：各組大鼠術后8周X線片檢查后，采用CO2吸入窒息法實施安樂死。按照原切口入路取術側膝關節，盡量剔除表面多余肌肉組織后，浸泡于4%多聚甲醛溶液24 h，然后轉至70%乙醇溶液中常溫保存。將膝關節標本固定在Micro-CT成像系統插槽上，掃描角度0.03°，電流130 μA、電壓70 kV，整合時間100 ms。根據突出骨骼輪廓和降低的骨密度測量骨贅體積，于CT圖像上選擇脛骨近端和股骨遠端測量，其總和為每個樣本骨贅總體積（total osteophyte volume，TOV）。
1.8 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 POSS-DS表征
2.1.1 核磁共振波譜儀分析
① POSS-SH：化學位移在0.76 ppm左右為與Si-CH2- 相連的質子氫的振動吸收峰，1.37 ppm左右為-SH質子氫的振動吸收峰，1.71 ppm左右是Si-CH2-CH2- 質子氫的振動吸收峰，2.56 ppm左右為Si-CH2-CH2-CH2- 質子氫的振動吸收峰。② PEG-Ac：6.63 ppm和6.19 ppm為乙烯基=CH2上質子氫的振動吸收峰，6.07 ppm為=CH- 上質子氫的振動吸收峰，4.21 ppm為-CH2- 上質子氫的振動吸收峰，3.69～3.39 ppm為PEG重復單元中-CH2- 上質子氫的振動吸收峰。③ DS-Ac：丙烯酰氯接枝成功表現為在6～8 ppm區間有1個三重峰，6.77、6.96、7.09 ppm處為丙酰氯特征峰，說明接枝成功。④ POSS-DS：原6.77、6.96、7.09 ppm處丙烯酰氯特征峰消失，而在1.5 ppm處有SH質子伸縮振動峰。上述結果提示DS已被成功鏈接在POSS上。見圖2a～d。
圖2
POSS-DS制備及表征
a～d. POSS-SH、PEG-Ac、DS-Ac、POSS-DS核磁氫譜； e. POSS-DS能譜分析；f. POSS-DS透射電鏡觀察（×5 000）
Figure2. Preparation and characterization of POSS-DSa-d. Nuclear magnetic hydrogen spectrum of POSS-SH, PEG-Ac, DS-Ac, and POSS-DS; e. Energy spectrum analysis of POSS-DS; f. Transmission electron microscope image of POSS-DS (×5 000)
2.1.2 透射電鏡觀察
POSS-DS總體粒徑均勻，約為100 nm。能譜分析結果顯示，POSS-DS中硅、碳、氧等基本組成元素含量高且分布均勻，DS特有的氯元素和鈉元素含量相對較少，但總體仍呈均勻分布，進一步說明POSS-DS制備成功。見圖2e、f。
2.2 HAMA@POSS-DS體外觀測
2.2.1 光鏡及掃描電鏡觀察
HAMA@POSS-DS在PBS溶液中靜置后可發生沉降現象，輕輕搖晃后可形成半透明、均一分散懸液，在室溫下可在較長時間內（約30 min）保持結構穩定性。光鏡下水凝膠微球不透明，粒徑均勻，約為100 μm。掃描電鏡下觀察，凍干狀態下該水凝膠微球粒徑在40 μm左右，整體呈疏松多孔結構。見圖3a～c。
圖3
HAMA@POSS-DS表征
a. 大體觀察；b. 光鏡觀察（×200）；c. 掃描電鏡觀察（×3 000）；d. 降解曲線；e. 藥物釋放曲線
Figure3. The characterization of HAMA@POSS-DSa. General observation; b. Observation under light microscope (×200); c. Observation under scanning electron microscope (×3 000); d. Degradation curve; e. Drug release curve
2.2.2 體外降解及藥物釋放實驗
HAMA@POSS-DS降解過程相對緩慢，第1周降解緩慢，此后降解速率稍增加，并維持較平穩降解狀態，最終在第9周時基本完全降解。藥物釋放曲線顯示前4周藥物釋放速率逐步提升，4～6周稍有減緩，6周后趨于平緩。見圖3d、e。
2.3 HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
2.3.1 POSS-DS最佳濃度選擇
培養12、24、48 h，與對照組相比，不同濃度POSS-DS 組A值均增高，差異有統計學意義（P<0.05）；且1 μmol/L POSS-DS組高于其他濃度POSS-DS組（P<0.05），故后續實驗選擇1 μmol/L POSS-DS以及對應的0.1 mg/mL HAMA@POSS-DS。見圖4a。
圖4
HAMA@POSS-DS細胞毒性觀測
a. 不同POSS-DS濃度下細胞增殖情況； b. CCK-8檢測結果；c. 活/死細胞染色細胞計數結果；d. 活/死細胞染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為對照組、HAMA組、HAMA@POSS-DS組、POSS-DS組，從上至下分別為培養12、24、48 h
Figure4. HAMA@POSS-DS cytotoxicity detectiona. Cell proliferation at different concentrations of POSS-DS; b. Results of CCK-8 test; c. Cell count results after live/dead staining; d. Live/dead staining images (Fluorescence microscope×200) From left to right for control group, HAMA group, HAMA@POSS-DS group, and POSS-DS group, respectively; from top to bottom for the incubation time of 12, 24, and 48 hours, respectively
2.3.2 CCK-8及活/死細胞染色觀測
各組細胞A值及細胞計數均隨培養時間增加而增加，且均未見明顯死亡細胞。組間比較：HAMA組各時間點A值及細胞計數與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；HAMA@POSS-DS組僅48 h時高于對照組且差異有統計學意義（P<0.05）；而POSS-DS組各時間點均明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4 b～d。
2.4 HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
2.4.1 軟骨細胞炎癥模型構建
軟骨細胞經IL-1β處理后，Ⅱ型膠原mRNA相對表達量隨時間延長而顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。培養48 h時降至起始水平的18%，表明軟骨細胞炎癥模型建立成功。
2.4.2 免疫熒光染色觀察
空白組Ⅱ型膠原熒光強度與對照組相比顯著減弱。相比于空白組和HAMA組，DS組熒光強度較強，但與對照組仍存在明顯差距。HAMA@POSS-DS組Ⅱ型膠原熒光強度顯著強于空白組、DS組、HAMA組，甚至超過對照組。
2.4.3 實時熒光定量PCR觀測
① Ⅱ型膠原：與對照組比較，空白組、DS組、HAMA組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量均降低，而HAMA@POSS-DS組有所升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組升高（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。
② AGG：與對照組比較，空白組、DS組、HAMA組AGG mRNA相對表達量均下降（P<0.05），而HAMA@POSS-DS組差異無統計學意義（P>0.05）；與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組升高（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。
③ MMP-13：與對照組比較，其余各組MMP-13 mRNA相對表達量均升高（P<0.05）；與空白組比較， DS組、HAMA組、HAMA@POSS-DS組的MMP-13 mRNA相對表達量均降低（P<0.05）。
④ Adamts 5：除HAMA@POSS-DS組與對照組差異無統計學意義（P>0.05）外，Adamts 5 mRNA相對表達量組間差異總體與MMP-13一致。
⑤ TAC1：與對照組比較，其余各組TAC1 mRNA相對表達量均升高（P<0.05）；與空白組比較，DS組和HAMA@POSS-DS組的TAC1 mRNA相對表達量下降（P<0.05），HAMA組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖5。
圖5
HAMA@POSS-DS抗炎作用觀測
a. Ⅱ型膠原免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為對照組、空白組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組，從上至下分別為Ⅱ型膠原、細胞核、細胞骨架及重疊圖像；b. IL-1β處理后軟骨細胞Ⅱ型膠原 mRNA相對表達量；c～g. 實時熒光定量PCR檢測各目的基因相對表達量
Figure5. Chondrocyte anti-inflammatory experiment of HAMA@POSS-DSa. Collagen type Ⅱ immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×200) From left to right for control group, blank group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; from top to bottom for collagen type Ⅱ, nucleus, cell skeleton, and merge images, respectively; b. Relative expression of collagen type Ⅱ mRNA in chondrocytes treated with IL-1β; c-g. Relative expression of each target gene detected by real-time fluorescence quantitative PCR
2.5 HAMA@POSS-DS體內觀測
2.5.1 X線片檢查
術后1周，各組大鼠相對關節間隙寬度差異無統計學意義（P>0.05）。8周時，PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組相對關節間隙寬度均小于假手術組，HAMA@POSS-DS組大于PBS組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。
2.5.2 Micro-CT成像評估
與假手術組相比，PBS組、DS組和HAMA組膝關節軟骨下骨骨質明顯增厚，發生了不同程度軟骨下骨硬化；而HAMA@POSS-DS組未見明顯上述變化。
PBS組骨贅體積最大，其次是HAMA組、DS組，HAMA@POSS-DS組及假手術組最小。其中，PBS組、HAMA組、DS組TOV與假手術組比較，PBS組與DS組、HAMA@POSS-DS組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
HAMA@POSS-DS體內治療效果觀測
a. 術后1周（上）、8周（下）膝關節側位X線片 從左至右分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組；b. 術后8周Micro-CT斷層影像（上）及三維重建影像（下） 從左至右分別為假手術組、PBS組、DS組、HAMA組和HAMA@POSS-DS組，箭頭示骨贅；c. 術后1周各組相對關節間隙寬度；d. 術后8周各組相對關節間隙寬度；e. 術后8周各組膝關節TOV
Figure6. In vivo therapeutic effect of HAMA@POSS-DSa. Lateral X-ray films of rat knees at 1 (top) and 8 (bottom) weeks after operation From left to right for sham operation group, PBS group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; b. Micro-CT tomographic images (top) and three-dimensional reconstruction images (bottom) of rat knee joints at 8 weeks after operation From left to right for sham operation group, PBS group, DS group, HAMA group, and HAMA@POSS-DS group, respectively; arrow indicated the osteophytes; c. Relative joint gap width of each group at 1 week after operation; d. Relative joint gap width of each group at 8 weeks after operation; e. Total osteophyte volume of knee in each group at 8 weeks after operation
3 討論
本研究通過“點擊化學”法以POSS-SH為納米構筑平臺，成功合成了集抗炎、促軟骨再生于一體的功能性納米顆粒POSS-DS，并利用微流控技術制備了粒徑均一、高度單分散的雜化水凝膠微球HAMA@POSS-DS。細胞實驗中，HAMA@POSS-DS表現出了良好的生物相容性；與軟骨細胞共培養48 h過程中，隨著其負載的POSS-DS少量被緩釋到培養基中，軟骨細胞數量明顯增多，提示POSS-DS在促進軟骨細胞增殖方面具有顯著優勢，這與POSS骨架有利于細胞黏附密不可分[23]。此外，HAMA@POSS-DS還表現出了優異的抗炎性能。在軟骨細胞抗炎實驗中，HAMA@POSS-DS組在炎癥環境下可有效促進軟骨細胞增殖以及Ⅱ型膠原和AGG的表達，防止軟骨基質流失，進而對軟骨細胞起到有效保護作用。HAMA水凝膠微球緩慢的降解過程有利于其原位注射后在關節腔內的長期滯留，并緩慢釋放負載的抗炎藥物，這不僅大幅提升了目標藥物利用率，更有助于維持穩定的藥物濃度。促進軟骨細胞增殖，協同緩釋DS改善局部組織炎癥微環境，將更有助于軟骨組織的修復和再生。
骨關節炎病程早期軟骨損傷仍存在逆轉可能，這一階段也是治療的黃金時期，本研究旨在抓住骨關節炎早期階段，探索對損傷軟骨進行搶救性修復的藥物緩釋材料。因此，在動物實驗中選取了較短的觀測周期（8周）[26]。從治療終點的影像數據可以看出，HAMA@POSS-DS復合水凝膠微球對比傳統藥物治療具有顯著優勢，不僅在相同治療周期內獲得顯著治療效果，而且還減少了給藥頻率，有望減少患者在治療過程中的痛苦，提高依從性。與以往研究中單純將生物活性材料作為抗炎藥物的遞送載體不同，本研究的POSS納米顆粒本身對細胞增殖具有顯著促進作用，利用這一獨特的材料優勢制備出兼具抗炎和促再生的多功能微納水凝膠微球，兩方面作用相輔相成，極大地提高了骨關節炎治療效果。未對骨關節炎晚期病程進行進一步動物實驗是該研究不足之處。有了現階段正向的實驗結果，后續研究將進一步延長動物實驗周期，以針對逆轉骨關節炎晚期病程進行更深入探索。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的分析及其報道
倫理聲明 研究方案經維通利華實驗動物技術有限公司機構實驗動物管理和使用委員會審批（P2022076）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（浙）2019-0001，使用許可證批準號：SYXK（滬）2022-0018
作者貢獻聲明 姚裕斌：材料合成制備、生物實驗和論文撰寫；崔文國：科研設計；魏剛：指導納米材料合成；丁婕：文獻查閱和總結、英文審校和論文修改
