引用本文： 魏岱旭, 譚友果. 聚羥基脂肪酸酯醫用器件在骨科領域應用的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 909-917. doi: 10.7507/1002-1892.202211018 復制
疾病、損傷導致的骨組織不愈合或骨壞死是骨科臨床一大難題，常需要手術植入替代物以彌補骨組織功能。與自體或同種異體骨相比，基于生物材料制備的組織工程骨支架具有來源豐富、價格低、免疫排斥反應小等優勢。理想的骨修復材料應具備以下特征：① 能在受損部位完全修復前給予足夠的機械支持； ② 具有多孔結構，適合新生骨組織和血管生長；③ 具有骨傳導活性，能誘導周圍干細胞成骨分化；④ 降解速度與新骨生成相匹配；⑤ 降解產物無毒，不會引發急性炎癥反應等[1]。隨著合成生物學、組織工程和醫用材料的快速發展，聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）作為新型生物材料，在骨組織修復方面顯得尤為突出[2]。本文從PHA特性在骨修復中的優勢、PHA醫用器件制備技術及其在骨科領域的應用進展三方面，對PHA在骨科的應用現狀與發展進行綜述。
1 PHA概述及其材料學特性
PHA是細菌體內作為碳源和能源的一類聚酯類高分子的統稱[3]。自然界中已經發現的不同聚合度PHA，其分子質量可以從幾萬到幾百萬道爾頓不等。同時，由于R基團種類和位置的可變性，產生了多種PHA單體（主要是3-羥基脂肪酸），通常把骨架碳原子為3～5個的單體稱為“短鏈PHA單體”，6～16個的單體稱為“中長鏈PHA單體”[4]。不同單體可進行多種組合，使得這一聚酯家族有很多成員，目前已知的PHA單體超過150種，而且實驗室利用工程菌還在不斷制造新的PHA[5]。不同單體組合也造成了PHA家族成員的理化性能存在較大差異，涵蓋從堅硬脆性的塑料體到柔軟韌性的彈性體[6-8]。迄今，已有6種商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PHBVHHx）用于骨組織工程研究[2]和其他醫療領域[9-12]，其材料學特征見表1。
表1
商用PHA材料學特征對比
Table1.
Comparative overview of the physical properties of commercial PHAs
2 PHA的生物可降解性和生物安全性研究
由于PHA主鏈為酯鍵，其生物降解行為主要依賴于脂肪酶和水解酶，且主要與自身分子質量成正相關性，分子質量越大降解越慢；此外，也與單體成分、單體比例、力學性能和結晶度有關。如在含0.1 g/L脂肪酶的PBS緩沖液中，HHx含量為12%的PHBHHx膜降解速度比PHB、HHx 含量為5%和20%的PHBHHx快[31]。兔皮下植入實驗也證明，PHB、PHBHHx和聚乳酸（polylactic acid，PLA）的降解率依次增加[32]。在大多數報道中，PHA的降解速度要比與之分子質量相近的PLA緩慢[33]；而PHB由于結晶度較高，降解速度最慢[32]。因此，PHA固有的生物降解性使其成為有前景的醫學生物材料，特別是作為骨修復和藥物輸送系統材料。除了受PHA解聚酶活性等物理性質（如組成、立體規整性和結晶度）的影響外，PHA的生物降解行為還受表面積和形態、物理形狀和形態、pH值、溫度和水分等各種外部因素的影響[4, 34] 。
良好生物安全性是醫用材料作為骨組織工程材料應用于人體的先決條件[11, 35-37]。大量研究表明，大多數PHA具有良好生物相容性、血液相容性[38]，且不存在致畸性和致癌性[39-40]。對PHA及類似聚酯類生物材料而言，其酸性降解產物及釋放情況將影響材料的生物相容性。所釋放的酸性降解產物越多越快，材料的生物相容性越差；反之亦然。有研究顯示HaCaT細胞在聚合物膜上的生長活性順序為PHBVHHx > P34HB ≈ PHBHHx ≈ PHBV > PHB > PLA[41]。主要原因為PHA降解產生的3HB或4HB單體或低聚物酸性較弱，其酸度值（pKa）分別為4.70和4.72，比聚乙醇酸降解產生的羥基乙酸（pKa=3.83）和PLA降解產生的乳酸（pKa=3.08）更偏中性，對人體刺激更小，僅引起較小的酸性和炎癥反應[42]。同時，Wei等[33]發現在相同條件下，PLA微球釋放的乳酸約為PHA（PHBVHHx）微球釋放的3HB的2.7倍，證實了單位時間內PHA釋放的酸性分子更少。
3 PHA的骨誘導性研究
既往研究認為PHA不具備顯著的骨誘導性，只能提供骨相關細胞生長的空間場所。但隨著對PHA主要降解產物3HB的研究深入，發現其“促骨”效應并非不可能。
3HB是人體天然的酸性代謝物，在人體血液中濃度為0.03～0.1 mg/mL，可影響人體的代謝和線粒體[10]。Zhao等[43]的體外研究發現，3HB能夠刺激成骨細胞MC3T3-E1的增殖、分化（ALP活性）和礦化（在一定濃度范圍內，礦化結節的形成隨著3HB濃度提高而增多），抑制血清饑餓誘導的細胞凋亡。3HB可刺激細胞外鈣離子內流，并引起細胞內平均鈣離子濃度升高[43-44]。同時，Zhao等[43]的研究還證實3HB可緩解骨質疏松癥大鼠的癥狀，并提高大鼠血清鈣含量，減少骨鈣素含量，阻止了骨密度降低，加強了股骨最大負荷和形變，并且提高了骨小梁體積比。這些研究結果表明，3HB可能成為一種抗骨質疏松的藥物，PHA及3HB具有用于老年疾病治療的研究前景。
4 面向骨修復的PHA 醫用器件
早期的PHA醫用器件主要采用傳統熔融鑄造法制備。該方法雖然工藝成熟、加工時間短，可大規模工業化生產，但制備的PHA醫用器件不夠精細化和個性化，在高溫作用下PHA分子質量也會顯著下降，且易出現后結晶現象。近年，靜電紡絲、3D打印、微流控等先進的生物精密制造技術不斷用于設計制備PHA醫用器件，如各種支架、纖維、微球和納米顆粒，研究顯示部分器件在骨修復中發揮重要作用[9, 36-37, 45-47]，詳見表2。
表2
面向骨修復的PHA醫用器件制備方法與特征
Table2.
Preparation methods and characteristics of PHA medical devices for bone repair
4.1 PHA支架
支架為組織再生提供了物理支持，這對于后續細胞移植至關重要，直到再生組織能夠穩定其自然結構。支架也作為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）臨時替代品，不僅提供結構支撐，而且促進細胞附著、生長、增殖、遷移、分化和ECM沉積[9]。目前常見的支架制備技術包括相分離法、靜電紡絲法、鹽浸法、3D打印等。
相分離法（也稱溶劑鑄造法）是將PHA溶解在1，4-二氧六環等有機溶劑中，形成均勻的溶液，然后倒入合適模具，用液氮快速冷凍，冷凍干燥1～2 d，得到PHA支架[72]。相分離法得到的支架為多孔結構，其微孔大小和排序方式與溶劑種類、有機溶劑移除條件有關[73]。相分離法制備的PHB和PHBV支架均可用于骨組織工程；但在相分離基礎上添加了鹽析法的顆粒后，所制備的PHBV骨支架具有更好的細胞接種率和成骨效率[50-52]。
通過靜電紡絲法制備的納米纖維也能較好地模仿ECM，但橫截面直徑<1 μm的納米纖維在骨科中很少單獨使用，因此可利用靜電紡絲技術制備數以百萬計的PHA納米纖維，使用接收器得到不同形貌或微觀結構的纖維狀支架[9]。目前，PHB、PHBV、P4HB和PHBHHx等納米纖維已被廣泛用作骨組織工程支架材料[53-57]，同時也具有作為藥物運載載體的潛力[9]。
鹽浸法（又稱鹽析法）是將不同粒徑的鹽晶體與聚合物混合，置于不銹鋼模具中高溫高壓熔融，然后用多余水將鹽浸出，制備多孔聚合物支架[74]。采用鹽浸法可以制備具有多孔結構的材料。隨著比表面積的增加，P4HB[75]、PHBHHx[76]和PHO[77]支架的細胞相容性提高。另有研究表明，鹽浸可提高PHB[58]和PHBV[59-60]復合羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架的力學性能。
基于增材制造原理的3D打印技術已經廣泛用于制造具有內部多孔結構、形狀和尺寸均可控的醫用三維支架。近年來，PHA在骨組織工程的應用中，3D打印技術占據了重要地位。采用該技術可制備具有特定內部結構的支架，有利于接種細胞均勻分布，為細胞附著、增殖和分化提供良好微環境，也可以模擬ECM。在PHA家族中，已成功制備出PHBV[61-62]、P34HB[63]和PHBHHx[64-65]3D打印骨組織工程支架。
4.2 PHA微球
直徑為10～500 μm的生物聚酯類微球也是潛在的組織工程載體或支架，具有實心、封閉多孔、開放多孔和納米纖維狀等不同結構，同時也存在光滑、高爾夫狀、皺紋狀、凹凸狀、粗糙和雙面狀表面拓撲結構[2]。常見的微球制備方法主要有乳化法、噴霧干燥法、膜乳化法和微流控法，其中根據體系組分不同，乳化法又可分為單乳法和復乳法，復乳法又細分為W1/O/W2、G/O/W、S/O/W等[2]。
其中，復乳法中W1/O/W2最常見，俗稱“水包油包水”。在單乳法體系前先將內水相（W1）與油相混合，形成初乳；再將初乳滴加進含有乳化劑（或穩定劑）的外水相（W2），通過攪拌、勻漿或超聲處理將初乳相和油相進行混合乳化，形成復乳液；除去有機溶劑后，即可得到中空或多孔的聚酯微球。Wei等[33, 78]利用此方法，通過調控不同的內水相，制備出表面光滑、內部多孔的中空微球和開放式多孔微球。
近年來，膜乳化技術成為研究熱點，因制備成本低、通量高、重復性好，已廣泛用于制備微球制劑，但目前還沒有該技術制備的微球產品上市。2022年，魏岱旭等[79]利用膜乳化首次制備出多種PHA微球，且粒徑均一。
除了上述方法，微流控法也是制備均勻顆粒物的一種新方法，可采用簡單一步法實現對微球粒度和粒度分布的控制，但目前還沒有微流控技術制備的PHA微球。
4.3 PHA納米顆粒
PHA納米顆粒的合成方法有很多，乳化法是最常用方法[80-82]。采用該方法已成功制備出PHB[83]、PHBV[84]、PHBHHx[85]、P34HB[47]和PHBVHHx[41]納米顆粒。除了乳化時的機械強度，穩定劑類型及含量也在不同程度上影響納米顆粒的大小[86-87]。
但目前鮮有PHA納米顆粒用于骨修復的報道，主要原因是促進骨生長和分化的生長因子BMP為蛋白質，乳化法制備PHA納米顆粒時，因有機溶劑的使用極易導致蛋白質失活。為解決上述問題，Wei等[46]首次提出利用自創的大豆磷脂介導的生長因子修飾技術（soybean lecithin-mediated introduction of growth factors into polyesters， SMIGP）實現骨誘導因子BMP-2的親水-疏水逆轉，提升BMP在PHA納米顆粒中的負載量和穩定性，避免了生長因子失活和降解等問題。
5 PHA醫用器件的應用
5.1 傳統PHA填充支架
高機械性能是骨組織的顯著特征，因而早期研究人員較多使用PHB和PHBV來填充骨缺損區域[88]。PHB支架植入兔后肢骨后能夠促進新骨生成，支架與周圍組織相容性良好，且在長達12個月的體內修復過程中沒有出現炎癥反應[89]；高度有序排列的新生骨組織在植入材料表面快速形成[90]。用PHB支架修復小型豬前顱底缺損，也得到了類似效果，且沒有出現炎癥反應或腦粘連[91]。與小孔徑多孔支架相比，成骨細胞在大孔PHBV多孔支架上增殖和礦化水平更優，干細胞在PHBV發泡材料上ALP活性增加，骨鈣素分泌增多，表現出成骨分化特征[92]。
后續研究發現，與PHB和PHBV相比，含中長鏈單體的共聚PHA韌性更好，更有利于仿生醫用器件的加工。其中，PHBHHx的研究最為普遍，能支持成骨細胞黏附、增殖，且不干擾細胞成骨分化[93]。將PHBHHx用電紡絲方法加工成定向排列的纖維，或使用生物微機電系統（BioMEMS）在材料表面加工出微米級溝槽結構，也有助于誘導干細胞向成骨方向分化[94-95]。P34HBHHx具有更加粗糙疏水的表面，也能支持干細胞快速增殖，可應用于骨組織工程支架[96]。
5.2 復合型PHA骨誘導支架
為了提高PHA支架的骨誘導效果和機械強度，通常將天然骨基質的主要成分HA與PHA共混形成不同形式的復合PHA，采用靜電紡絲法、相分離法、3D打印等技術制備三維支架。與單純PHA支架相比，復合HA的PHA支架可提高成骨細胞活性，并能促進小鼠[53]、大鼠[97]、兔[89]的骨再生。
通過熱誘導相分離技術可獲得具有多孔結構的PHA/HA復合支架，加入適當的HA可增強支架骨誘導性和骨導電性；相反，無機填料含量過多則會限制其生物活性[98]。有研究表明，種植在PHB/HA支架表面上的骨相關細胞在14 d后遷移至支架中[99]。同樣，體內骨修復評價研究顯示，PHBV/HA支架植入兔脛骨后，在植入材料與組織界面區域出現成骨細胞，加載至新生骨后，使骨厚度在幾個月內從130 μm增加到770 μm，同時伴有支架降解[48]。然而，部分研究表明HA添加并未增強支架力學性能或增強成骨細胞的生物相容性[93]，這可能與過多的無機物過度改變PHA結構有關。除HA外，如硅酸鹽、石墨烯等其他材料也能改善骨組織工程中PHA材料的性能，但其鈣化結果參差不齊，骨誘導效果也存在爭議。
5.3 可注射型PHA骨支架
因為組織缺損空間位置和手術方式的不同，相比傳統植入性支架，可注射型支架更有利于脊柱、下頜等特殊部位的骨修復。實心PHA微球早已用于骨、肝和大腦神經的修復，但存在諸多問題。Wei等[33]基于溶劑蒸發法，制備了基于PHBVHHx開放式多孔微球（PHA-OPM）的細胞“微型方舟”系統（micro-Ark）。該PHA-OPM兼具PHA卓越的生物相容性、傳統多孔支架提供細胞生長空間以及微球可注射性、可運輸性的優點。粒徑300～360 μm、孔徑10～60 μm的PHA-OPM細胞黏附率高達93.4%，優于傳統的PHA中空微球（PHA-HM）和PLA開放式多孔微球 (PLA-OPM)。PHA-OPM有利于人源干細胞增殖和成骨誘導分化，且通過裸鼠皮下異位成骨實驗證實，PHA-OPM比PHA-HM和PLA-OPM更適合骨組織的形成與修復，在骨組織工程中具有巨大的研究與應用潛力。Yuan等[68]也利用類似方法制備了具有非開放的P4HB多孔微球，用于顱骨缺損的修復。
5.4 抗菌型PHA骨支架
臨床上，用于骨修復的植入物常伴隨嚴重感染性并發癥，需進行多次外科手術清創，甚至截肢。因此，能負載并釋放抗菌劑的生物材料逐漸成為研究熱點[37, 100-104]，常用的抗菌劑為傳統抗生素、金屬離子（銀離子）、抗菌的納米顆粒（如納米銀、納米氧化鋅）、抗菌肽和從動植物中提取的天然抗菌小分子等[35, 104-105]。
PHA自身不具備抗菌性，通過負載萬古霉素[71]、銀離子[67]和納米氧化鋅[62]，可降低組織炎癥的發生率。最近，介孔生物活性玻璃納米顆粒和肉桂醛摻雜的PHBV，能在培養3 h內對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現出明顯的抗菌活性，同時不干擾人骨肉瘤細胞的增殖和附著[69]。消炎藥物左氧氟沙星能以81.8%負載率加入PHB的靜電紡絲網片中，在體外藥物釋放檢測的最初24 h內，PHB靜電紡絲網只釋放了約14.20%左氧氟沙星，13 d后釋放率增加到32.4%，具有顯著抗菌能力。這些抗菌性能的附加更有利于PHA在骨組織修復和相關手術器件方面的進一步推廣。
5.5 三維骨腫瘤仿生模型
傳統癌細胞二維培養存在諸多缺陷，如細胞只與培養表面接觸的一側發生吸附；許多細胞從組織中分離出來并置于平面細胞培養表面時，會逐步變得更加扁平，分裂異常，并喪失部分功能表型。除此之外，二維模型進行臨床前研發時，會嚴重依賴動物模型來進行生物利用率和毒物學的研究，常常無法構建有效的腫瘤生物學模型。Wei 等[78]利用氣體致孔劑（氨氣和CO2）制備具有開放式多孔結構的PHBVHHx三維微球作為三維培養支架，并基于人骨肉瘤細胞MG-63成功構建體外人骨肉瘤三維模型。同時，還基于相同的PHBVHHx材料利用不同制備技術，成功制備了實心微球和中空微球，并與開放式多孔微球進行細胞行為對比。接種MG-63細胞6 d后，與實心微球和中空微球相比，開放式多孔微球的細胞附著和增殖效果更好，死亡或凋亡細胞較少。由于開放式多孔結構的PHBVHHx微球具有較大表面孔和相互連接的內孔，通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡可觀察到細胞從其表面向內部遷移的現象。因此，開放式多孔微球可以作為一種新的細胞體外培養球型支架或載體，用于支撐更多細胞生長。該開放式多孔微球也可用于輔助類器官和腫瘤組織的三維構建。
5.6 骨生長因子納米化遞送系統
基于組織工程的概念，骨生長因子通常是負載于材料表面或內部，通過接觸或釋放的形式被細胞捕獲，并完成成骨誘導。采用SMIGP技術，魏岱旭團隊開發了一種基于粒徑為100～200 nm的PHA納米顆粒的新型細胞內骨生長因子納米化遞送系統，也稱BMP-PHA納米化遞送系統[47]。利用該系統，P34HB納米顆粒可被干細胞吞噬于體內并釋放BMP-7，完成“自內而外”的人脂肪干細胞成骨誘變。由于其特殊設計，P34HB納米顆粒在藥物釋放的最初24 h內只表現出短暫的BMP-7釋放，隨后20 d內穩步增加到累積釋放率80%。和游離的BMP-7組對比，P34HB納米顆粒組顯示出更高的ALP活性和骨分化相關基因的表達。
該課題組還進一步將兩種降解率不同的生物聚酯PLA和PHA（具體為P34HB）組成的納米顆粒，分別裝載在骨生長早期和晚期起主要作用的兩種BMP（BMP-2和BMP-7），探索不同納米顆粒在微重力刺激下對干細胞成骨分化的刺激作用[70]。結果表明，只需一次性添加混合納米顆粒，干細胞即可在20 d內表現出較高的ALP活性和分子表達，其成骨效果與連續提供游離BMP蛋白的成骨效果相似。該系統大大降低了用藥成本，并簡化了操作，也是專門為航天員在微重力環境下進行干細胞定向分化研究而設計的。
6 小結與展望
在臨床實踐中，隨著創傷、事故、腫瘤等導致的骨科疾病增加， 基于PHA的填充支架、復合型骨誘導支架、可注射型骨修復支架、抗菌型骨支架、三維骨腫瘤仿生模型和生長因子納米化遞送系統PHA醫用器件，在不同骨科疾病中均具有潛在應用前景。前期研究已充分證明，PHA具有優良的生物降解性、生物相容性和熱塑性，且目前沒有研究表明植入PHA后具有致畸性和致癌性，這為PHA醫用器件應用于骨缺損處的組織重構和功能修復提供了基本的材料及生物學保障。此外，大多數商用PHA的生物相容性優于分子質量相近的PLA，這可以歸因于其生物降解性較慢，主要降解產物3HB無毒。近年來通過對3HB骨誘導性和抗破骨能力的研究，發現PHA是應對骨質疏松癥的潛在新材料；這也打開了PHA是否具有成骨誘導能力的討論，但目前仍有爭議，并未達成共識。
由于存在PHA來源、生產成本和純化等問題，PHA醫用器件在骨科及其他醫學的應用受限，目前只有P4HB縫合線和補片等少量產品獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準應用于臨床。但隨著合成生物學的進一步發展，上述問題在不久的將來可逐步解決。我們也期待有更多新技術（如微針、可注射水凝膠等）[106-107]，制備微觀結構更緊密、誤差更小、操作更智能的PHA骨修復器件，進一步明確PHA降解產物在抗骨質疏松等老年性疾病治療方面的作用。這些具有不同空間和物理性質的PHA醫療器件，如何實現精確生物降解，如何實現植入物與周圍組織同步融合，以及如何完成新生骨的誘導等問題，都是未來PHA在骨科應用所面臨的挑戰。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突，項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 魏岱旭：查閱文獻、整理數據、論文撰寫；譚友果：參與討論
疾病、損傷導致的骨組織不愈合或骨壞死是骨科臨床一大難題，常需要手術植入替代物以彌補骨組織功能。與自體或同種異體骨相比，基于生物材料制備的組織工程骨支架具有來源豐富、價格低、免疫排斥反應小等優勢。理想的骨修復材料應具備以下特征：① 能在受損部位完全修復前給予足夠的機械支持； ② 具有多孔結構，適合新生骨組織和血管生長；③ 具有骨傳導活性，能誘導周圍干細胞成骨分化；④ 降解速度與新骨生成相匹配；⑤ 降解產物無毒，不會引發急性炎癥反應等[1]。隨著合成生物學、組織工程和醫用材料的快速發展，聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）作為新型生物材料，在骨組織修復方面顯得尤為突出[2]。本文從PHA特性在骨修復中的優勢、PHA醫用器件制備技術及其在骨科領域的應用進展三方面，對PHA在骨科的應用現狀與發展進行綜述。
1 PHA概述及其材料學特性
PHA是細菌體內作為碳源和能源的一類聚酯類高分子的統稱[3]。自然界中已經發現的不同聚合度PHA，其分子質量可以從幾萬到幾百萬道爾頓不等。同時，由于R基團種類和位置的可變性，產生了多種PHA單體（主要是3-羥基脂肪酸），通常把骨架碳原子為3～5個的單體稱為“短鏈PHA單體”，6～16個的單體稱為“中長鏈PHA單體”[4]。不同單體可進行多種組合，使得這一聚酯家族有很多成員，目前已知的PHA單體超過150種，而且實驗室利用工程菌還在不斷制造新的PHA[5]。不同單體組合也造成了PHA家族成員的理化性能存在較大差異，涵蓋從堅硬脆性的塑料體到柔軟韌性的彈性體[6-8]。迄今，已有6種商用PHA（PHB、P4HB、PHBV、PHBHHx、P34HB和PHBVHHx）用于骨組織工程研究[2]和其他醫療領域[9-12]，其材料學特征見表1。
表1
商用PHA材料學特征對比
Table1.
Comparative overview of the physical properties of commercial PHAs
2 PHA的生物可降解性和生物安全性研究
由于PHA主鏈為酯鍵，其生物降解行為主要依賴于脂肪酶和水解酶，且主要與自身分子質量成正相關性，分子質量越大降解越慢；此外，也與單體成分、單體比例、力學性能和結晶度有關。如在含0.1 g/L脂肪酶的PBS緩沖液中，HHx含量為12%的PHBHHx膜降解速度比PHB、HHx 含量為5%和20%的PHBHHx快[31]。兔皮下植入實驗也證明，PHB、PHBHHx和聚乳酸（polylactic acid，PLA）的降解率依次增加[32]。在大多數報道中，PHA的降解速度要比與之分子質量相近的PLA緩慢[33]；而PHB由于結晶度較高，降解速度最慢[32]。因此，PHA固有的生物降解性使其成為有前景的醫學生物材料，特別是作為骨修復和藥物輸送系統材料。除了受PHA解聚酶活性等物理性質（如組成、立體規整性和結晶度）的影響外，PHA的生物降解行為還受表面積和形態、物理形狀和形態、pH值、溫度和水分等各種外部因素的影響[4, 34] 。
良好生物安全性是醫用材料作為骨組織工程材料應用于人體的先決條件[11, 35-37]。大量研究表明，大多數PHA具有良好生物相容性、血液相容性[38]，且不存在致畸性和致癌性[39-40]。對PHA及類似聚酯類生物材料而言，其酸性降解產物及釋放情況將影響材料的生物相容性。所釋放的酸性降解產物越多越快，材料的生物相容性越差；反之亦然。有研究顯示HaCaT細胞在聚合物膜上的生長活性順序為PHBVHHx > P34HB ≈ PHBHHx ≈ PHBV > PHB > PLA[41]。主要原因為PHA降解產生的3HB或4HB單體或低聚物酸性較弱，其酸度值（pKa）分別為4.70和4.72，比聚乙醇酸降解產生的羥基乙酸（pKa=3.83）和PLA降解產生的乳酸（pKa=3.08）更偏中性，對人體刺激更小，僅引起較小的酸性和炎癥反應[42]。同時，Wei等[33]發現在相同條件下，PLA微球釋放的乳酸約為PHA（PHBVHHx）微球釋放的3HB的2.7倍，證實了單位時間內PHA釋放的酸性分子更少。
3 PHA的骨誘導性研究
既往研究認為PHA不具備顯著的骨誘導性，只能提供骨相關細胞生長的空間場所。但隨著對PHA主要降解產物3HB的研究深入，發現其“促骨”效應并非不可能。
3HB是人體天然的酸性代謝物，在人體血液中濃度為0.03～0.1 mg/mL，可影響人體的代謝和線粒體[10]。Zhao等[43]的體外研究發現，3HB能夠刺激成骨細胞MC3T3-E1的增殖、分化（ALP活性）和礦化（在一定濃度范圍內，礦化結節的形成隨著3HB濃度提高而增多），抑制血清饑餓誘導的細胞凋亡。3HB可刺激細胞外鈣離子內流，并引起細胞內平均鈣離子濃度升高[43-44]。同時，Zhao等[43]的研究還證實3HB可緩解骨質疏松癥大鼠的癥狀，并提高大鼠血清鈣含量，減少骨鈣素含量，阻止了骨密度降低，加強了股骨最大負荷和形變，并且提高了骨小梁體積比。這些研究結果表明，3HB可能成為一種抗骨質疏松的藥物，PHA及3HB具有用于老年疾病治療的研究前景。
4 面向骨修復的PHA 醫用器件
早期的PHA醫用器件主要采用傳統熔融鑄造法制備。該方法雖然工藝成熟、加工時間短，可大規模工業化生產，但制備的PHA醫用器件不夠精細化和個性化，在高溫作用下PHA分子質量也會顯著下降，且易出現后結晶現象。近年，靜電紡絲、3D打印、微流控等先進的生物精密制造技術不斷用于設計制備PHA醫用器件，如各種支架、纖維、微球和納米顆粒，研究顯示部分器件在骨修復中發揮重要作用[9, 36-37, 45-47]，詳見表2。
表2
面向骨修復的PHA醫用器件制備方法與特征
Table2.
Preparation methods and characteristics of PHA medical devices for bone repair
4.1 PHA支架
支架為組織再生提供了物理支持，這對于后續細胞移植至關重要，直到再生組織能夠穩定其自然結構。支架也作為細胞外基質（extracellular matrix，ECM）臨時替代品，不僅提供結構支撐，而且促進細胞附著、生長、增殖、遷移、分化和ECM沉積[9]。目前常見的支架制備技術包括相分離法、靜電紡絲法、鹽浸法、3D打印等。
相分離法（也稱溶劑鑄造法）是將PHA溶解在1，4-二氧六環等有機溶劑中，形成均勻的溶液，然后倒入合適模具，用液氮快速冷凍，冷凍干燥1～2 d，得到PHA支架[72]。相分離法得到的支架為多孔結構，其微孔大小和排序方式與溶劑種類、有機溶劑移除條件有關[73]。相分離法制備的PHB和PHBV支架均可用于骨組織工程；但在相分離基礎上添加了鹽析法的顆粒后，所制備的PHBV骨支架具有更好的細胞接種率和成骨效率[50-52]。
通過靜電紡絲法制備的納米纖維也能較好地模仿ECM，但橫截面直徑<1 μm的納米纖維在骨科中很少單獨使用，因此可利用靜電紡絲技術制備數以百萬計的PHA納米纖維，使用接收器得到不同形貌或微觀結構的纖維狀支架[9]。目前，PHB、PHBV、P4HB和PHBHHx等納米纖維已被廣泛用作骨組織工程支架材料[53-57]，同時也具有作為藥物運載載體的潛力[9]。
鹽浸法（又稱鹽析法）是將不同粒徑的鹽晶體與聚合物混合，置于不銹鋼模具中高溫高壓熔融，然后用多余水將鹽浸出，制備多孔聚合物支架[74]。采用鹽浸法可以制備具有多孔結構的材料。隨著比表面積的增加，P4HB[75]、PHBHHx[76]和PHO[77]支架的細胞相容性提高。另有研究表明，鹽浸可提高PHB[58]和PHBV[59-60]復合羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）支架的力學性能。
基于增材制造原理的3D打印技術已經廣泛用于制造具有內部多孔結構、形狀和尺寸均可控的醫用三維支架。近年來，PHA在骨組織工程的應用中，3D打印技術占據了重要地位。采用該技術可制備具有特定內部結構的支架，有利于接種細胞均勻分布，為細胞附著、增殖和分化提供良好微環境，也可以模擬ECM。在PHA家族中，已成功制備出PHBV[61-62]、P34HB[63]和PHBHHx[64-65]3D打印骨組織工程支架。
4.2 PHA微球
直徑為10～500 μm的生物聚酯類微球也是潛在的組織工程載體或支架，具有實心、封閉多孔、開放多孔和納米纖維狀等不同結構，同時也存在光滑、高爾夫狀、皺紋狀、凹凸狀、粗糙和雙面狀表面拓撲結構[2]。常見的微球制備方法主要有乳化法、噴霧干燥法、膜乳化法和微流控法，其中根據體系組分不同，乳化法又可分為單乳法和復乳法，復乳法又細分為W1/O/W2、G/O/W、S/O/W等[2]。
其中，復乳法中W1/O/W2最常見，俗稱“水包油包水”。在單乳法體系前先將內水相（W1）與油相混合，形成初乳；再將初乳滴加進含有乳化劑（或穩定劑）的外水相（W2），通過攪拌、勻漿或超聲處理將初乳相和油相進行混合乳化，形成復乳液；除去有機溶劑后，即可得到中空或多孔的聚酯微球。Wei等[33, 78]利用此方法，通過調控不同的內水相，制備出表面光滑、內部多孔的中空微球和開放式多孔微球。
近年來，膜乳化技術成為研究熱點，因制備成本低、通量高、重復性好，已廣泛用于制備微球制劑，但目前還沒有該技術制備的微球產品上市。2022年，魏岱旭等[79]利用膜乳化首次制備出多種PHA微球，且粒徑均一。
除了上述方法，微流控法也是制備均勻顆粒物的一種新方法，可采用簡單一步法實現對微球粒度和粒度分布的控制，但目前還沒有微流控技術制備的PHA微球。
4.3 PHA納米顆粒
PHA納米顆粒的合成方法有很多，乳化法是最常用方法[80-82]。采用該方法已成功制備出PHB[83]、PHBV[84]、PHBHHx[85]、P34HB[47]和PHBVHHx[41]納米顆粒。除了乳化時的機械強度，穩定劑類型及含量也在不同程度上影響納米顆粒的大小[86-87]。
但目前鮮有PHA納米顆粒用于骨修復的報道，主要原因是促進骨生長和分化的生長因子BMP為蛋白質，乳化法制備PHA納米顆粒時，因有機溶劑的使用極易導致蛋白質失活。為解決上述問題，Wei等[46]首次提出利用自創的大豆磷脂介導的生長因子修飾技術（soybean lecithin-mediated introduction of growth factors into polyesters， SMIGP）實現骨誘導因子BMP-2的親水-疏水逆轉，提升BMP在PHA納米顆粒中的負載量和穩定性，避免了生長因子失活和降解等問題。
5 PHA醫用器件的應用
5.1 傳統PHA填充支架
高機械性能是骨組織的顯著特征，因而早期研究人員較多使用PHB和PHBV來填充骨缺損區域[88]。PHB支架植入兔后肢骨后能夠促進新骨生成，支架與周圍組織相容性良好，且在長達12個月的體內修復過程中沒有出現炎癥反應[89]；高度有序排列的新生骨組織在植入材料表面快速形成[90]。用PHB支架修復小型豬前顱底缺損，也得到了類似效果，且沒有出現炎癥反應或腦粘連[91]。與小孔徑多孔支架相比，成骨細胞在大孔PHBV多孔支架上增殖和礦化水平更優，干細胞在PHBV發泡材料上ALP活性增加，骨鈣素分泌增多，表現出成骨分化特征[92]。
后續研究發現，與PHB和PHBV相比，含中長鏈單體的共聚PHA韌性更好，更有利于仿生醫用器件的加工。其中，PHBHHx的研究最為普遍，能支持成骨細胞黏附、增殖，且不干擾細胞成骨分化[93]。將PHBHHx用電紡絲方法加工成定向排列的纖維，或使用生物微機電系統（BioMEMS）在材料表面加工出微米級溝槽結構，也有助于誘導干細胞向成骨方向分化[94-95]。P34HBHHx具有更加粗糙疏水的表面，也能支持干細胞快速增殖，可應用于骨組織工程支架[96]。
5.2 復合型PHA骨誘導支架
為了提高PHA支架的骨誘導效果和機械強度，通常將天然骨基質的主要成分HA與PHA共混形成不同形式的復合PHA，采用靜電紡絲法、相分離法、3D打印等技術制備三維支架。與單純PHA支架相比，復合HA的PHA支架可提高成骨細胞活性，并能促進小鼠[53]、大鼠[97]、兔[89]的骨再生。
通過熱誘導相分離技術可獲得具有多孔結構的PHA/HA復合支架，加入適當的HA可增強支架骨誘導性和骨導電性；相反，無機填料含量過多則會限制其生物活性[98]。有研究表明，種植在PHB/HA支架表面上的骨相關細胞在14 d后遷移至支架中[99]。同樣，體內骨修復評價研究顯示，PHBV/HA支架植入兔脛骨后，在植入材料與組織界面區域出現成骨細胞，加載至新生骨后，使骨厚度在幾個月內從130 μm增加到770 μm，同時伴有支架降解[48]。然而，部分研究表明HA添加并未增強支架力學性能或增強成骨細胞的生物相容性[93]，這可能與過多的無機物過度改變PHA結構有關。除HA外，如硅酸鹽、石墨烯等其他材料也能改善骨組織工程中PHA材料的性能，但其鈣化結果參差不齊，骨誘導效果也存在爭議。
5.3 可注射型PHA骨支架
因為組織缺損空間位置和手術方式的不同，相比傳統植入性支架，可注射型支架更有利于脊柱、下頜等特殊部位的骨修復。實心PHA微球早已用于骨、肝和大腦神經的修復，但存在諸多問題。Wei等[33]基于溶劑蒸發法，制備了基于PHBVHHx開放式多孔微球（PHA-OPM）的細胞“微型方舟”系統（micro-Ark）。該PHA-OPM兼具PHA卓越的生物相容性、傳統多孔支架提供細胞生長空間以及微球可注射性、可運輸性的優點。粒徑300～360 μm、孔徑10～60 μm的PHA-OPM細胞黏附率高達93.4%，優于傳統的PHA中空微球（PHA-HM）和PLA開放式多孔微球 (PLA-OPM)。PHA-OPM有利于人源干細胞增殖和成骨誘導分化，且通過裸鼠皮下異位成骨實驗證實，PHA-OPM比PHA-HM和PLA-OPM更適合骨組織的形成與修復，在骨組織工程中具有巨大的研究與應用潛力。Yuan等[68]也利用類似方法制備了具有非開放的P4HB多孔微球，用于顱骨缺損的修復。
5.4 抗菌型PHA骨支架
臨床上，用于骨修復的植入物常伴隨嚴重感染性并發癥，需進行多次外科手術清創，甚至截肢。因此，能負載并釋放抗菌劑的生物材料逐漸成為研究熱點[37, 100-104]，常用的抗菌劑為傳統抗生素、金屬離子（銀離子）、抗菌的納米顆粒（如納米銀、納米氧化鋅）、抗菌肽和從動植物中提取的天然抗菌小分子等[35, 104-105]。
PHA自身不具備抗菌性，通過負載萬古霉素[71]、銀離子[67]和納米氧化鋅[62]，可降低組織炎癥的發生率。最近，介孔生物活性玻璃納米顆粒和肉桂醛摻雜的PHBV，能在培養3 h內對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現出明顯的抗菌活性，同時不干擾人骨肉瘤細胞的增殖和附著[69]。消炎藥物左氧氟沙星能以81.8%負載率加入PHB的靜電紡絲網片中，在體外藥物釋放檢測的最初24 h內，PHB靜電紡絲網只釋放了約14.20%左氧氟沙星，13 d后釋放率增加到32.4%，具有顯著抗菌能力。這些抗菌性能的附加更有利于PHA在骨組織修復和相關手術器件方面的進一步推廣。
5.5 三維骨腫瘤仿生模型
傳統癌細胞二維培養存在諸多缺陷，如細胞只與培養表面接觸的一側發生吸附；許多細胞從組織中分離出來并置于平面細胞培養表面時，會逐步變得更加扁平，分裂異常，并喪失部分功能表型。除此之外，二維模型進行臨床前研發時，會嚴重依賴動物模型來進行生物利用率和毒物學的研究，常常無法構建有效的腫瘤生物學模型。Wei 等[78]利用氣體致孔劑（氨氣和CO2）制備具有開放式多孔結構的PHBVHHx三維微球作為三維培養支架，并基于人骨肉瘤細胞MG-63成功構建體外人骨肉瘤三維模型。同時，還基于相同的PHBVHHx材料利用不同制備技術，成功制備了實心微球和中空微球，并與開放式多孔微球進行細胞行為對比。接種MG-63細胞6 d后，與實心微球和中空微球相比，開放式多孔微球的細胞附著和增殖效果更好，死亡或凋亡細胞較少。由于開放式多孔結構的PHBVHHx微球具有較大表面孔和相互連接的內孔，通過掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡可觀察到細胞從其表面向內部遷移的現象。因此，開放式多孔微球可以作為一種新的細胞體外培養球型支架或載體，用于支撐更多細胞生長。該開放式多孔微球也可用于輔助類器官和腫瘤組織的三維構建。
5.6 骨生長因子納米化遞送系統
基于組織工程的概念，骨生長因子通常是負載于材料表面或內部，通過接觸或釋放的形式被細胞捕獲，并完成成骨誘導。采用SMIGP技術，魏岱旭團隊開發了一種基于粒徑為100～200 nm的PHA納米顆粒的新型細胞內骨生長因子納米化遞送系統，也稱BMP-PHA納米化遞送系統[47]。利用該系統，P34HB納米顆粒可被干細胞吞噬于體內并釋放BMP-7，完成“自內而外”的人脂肪干細胞成骨誘變。由于其特殊設計，P34HB納米顆粒在藥物釋放的最初24 h內只表現出短暫的BMP-7釋放，隨后20 d內穩步增加到累積釋放率80%。和游離的BMP-7組對比，P34HB納米顆粒組顯示出更高的ALP活性和骨分化相關基因的表達。
該課題組還進一步將兩種降解率不同的生物聚酯PLA和PHA（具體為P34HB）組成的納米顆粒，分別裝載在骨生長早期和晚期起主要作用的兩種BMP（BMP-2和BMP-7），探索不同納米顆粒在微重力刺激下對干細胞成骨分化的刺激作用[70]。結果表明，只需一次性添加混合納米顆粒，干細胞即可在20 d內表現出較高的ALP活性和分子表達，其成骨效果與連續提供游離BMP蛋白的成骨效果相似。該系統大大降低了用藥成本，并簡化了操作，也是專門為航天員在微重力環境下進行干細胞定向分化研究而設計的。
6 小結與展望
在臨床實踐中，隨著創傷、事故、腫瘤等導致的骨科疾病增加， 基于PHA的填充支架、復合型骨誘導支架、可注射型骨修復支架、抗菌型骨支架、三維骨腫瘤仿生模型和生長因子納米化遞送系統PHA醫用器件，在不同骨科疾病中均具有潛在應用前景。前期研究已充分證明，PHA具有優良的生物降解性、生物相容性和熱塑性，且目前沒有研究表明植入PHA后具有致畸性和致癌性，這為PHA醫用器件應用于骨缺損處的組織重構和功能修復提供了基本的材料及生物學保障。此外，大多數商用PHA的生物相容性優于分子質量相近的PLA，這可以歸因于其生物降解性較慢，主要降解產物3HB無毒。近年來通過對3HB骨誘導性和抗破骨能力的研究，發現PHA是應對骨質疏松癥的潛在新材料；這也打開了PHA是否具有成骨誘導能力的討論，但目前仍有爭議，并未達成共識。
由于存在PHA來源、生產成本和純化等問題，PHA醫用器件在骨科及其他醫學的應用受限，目前只有P4HB縫合線和補片等少量產品獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準應用于臨床。但隨著合成生物學的進一步發展，上述問題在不久的將來可逐步解決。我們也期待有更多新技術（如微針、可注射水凝膠等）[106-107]，制備微觀結構更緊密、誤差更小、操作更智能的PHA骨修復器件，進一步明確PHA降解產物在抗骨質疏松等老年性疾病治療方面的作用。這些具有不同空間和物理性質的PHA醫療器件，如何實現精確生物降解，如何實現植入物與周圍組織同步融合，以及如何完成新生骨的誘導等問題，都是未來PHA在骨科應用所面臨的挑戰。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突，項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 魏岱旭：查閱文獻、整理數據、論文撰寫；譚友果：參與討論
