引用本文： 唐生平, 廖世杰, 劉建宏, 羅曉林, 韋幀翟, 丁曉飛. 非編碼RNA在骨H型血管生成中的調控作用. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 1042-1048. doi: 10.7507/1002-1892.202304032 復制
骨是高度血管化的組織，在發育、修復與重塑過程中，骨形成及礦化的前提是血管侵入。骨血管不僅為骨組織提供必要的營養與氧氣，還能調節各種骨細胞和血管細胞間的相互作用，為骨形成提供必要的刺激信號[1]。血管生成是從已存在的血管中發育出新血管的過程，與成骨過程相互交織，兩者密切的時空聯系被稱為“血管生成-成骨偶聯”，該理論對指導骨骼疾病治療具有重要意義[2]。近年來，一種特殊的骨微血管亞型——H型血管被發現與骨形成高度偶聯，并參與許多骨骼疾病的發生、發展。目前，調控H型血管生成的分子機制已被陸續發現。基于此，利用藥物進行靶點干預，通過調控H型血管生成治療骨骼疾病具有廣闊應用前景。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）深度參與了骨微環境調控，對于骨H型血管生成的調控同樣發揮著關鍵作用[3-4]。現對ncRNA在H型血管生成中的調控作用機制以及目前用于治療骨骼疾病的相關研究進展作一綜述，以期為后續研究提供參考。
1 H型血管與ncRNA概述
2014年，Kusumbe等[5]在小鼠骨骼中鑒定出兩種微血管亞型——H型血管和L型血管。H型血管以高表達CD31與內皮黏蛋白為特征，主要分布于干骺端和骨內膜下，呈柱形、拱形分布；L型血管則低表達CD31與內皮黏蛋白，主要分布于骨干區域，呈高度分支狀；兩種血管在骨髓腔中相接。H型血管內皮細胞雖然僅為骨內總內皮細胞的極少部分，卻能吸引大量骨祖細胞、成骨細胞聚集在其周圍。這些骨祖細胞為骨形成提供了成骨細胞來源，而H型血管的高含氧量又能滿足成骨細胞代謝需求。因此，H型血管在血管生成-成骨偶聯中發揮關鍵作用。此外，處于生長發育期的個體中H型血管豐富，但在成年、老年個體中則明顯減少，這種年齡依賴性減少的現象已在臨床骨組織標本中得到了驗證，提示H型血管可能是人體骨量標志物[6]。目前，研究已發現H型血管參與了骨質疏松癥[7]、骨關節炎[8]、骨折修復[9]等諸多骨骼疾病發生發展過程，并明確缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）[5]、PDGF-BB[10]、神經軸突導向因子3（slit guidance ligand 3，SLIT3）[11]、表皮生長因子樣結構域6[12]等均能作為H型血管促進因子。近年來，隨著ncRNA被發現參與多種疾病進程，其與H型血管的關系也逐漸被揭示。
ncRNA是指由基因組轉錄而成、不編碼蛋白質的 RNA 分子，它們在人類基因轉錄組中的含量超過98%，能參與基因表達調控及轉錄后調控過程并發揮重要作用[13]。ncRNA 可分為基礎結構型ncRNA和調控型ncRNA兩種主要類型，前者包括轉運RNA、核糖體RNA、小核RNA等；后者包括微小RNA（microRNA，miRNA）、PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環狀（circular RNA，circRNA）等。目前對于ncRNA在骨骼疾病中調控H型血管生成的研究主要集中于miRNA、lncRNA和siRNA，它們也有望作為骨骼疾病診療靶點以及解析相關骨骼疾病發生的新型分子。
2 miRNA對H型血管生成的調控作用
2.1 miRNA作用方式
miRNA是長度為18～24 nt的單鏈 RNA 分子，由內源性基因編碼。初始miRNA在被轉錄并切割為發夾狀的前體miRNA后，會被 Dicer 酶剪切成長度約為22 nt的雙鏈 miRNA，隨后經降解形成成熟的單鏈miRNA，最終與RNA誘導沉默復合體結合形成miRNA誘導沉默復合體（microRNA-induced silencing complex，miRISC），識別并結合靶mRNA的3’UTR以抑制其翻譯。miRNA通過這種調控機制廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝等生命活動的調節和控制[3, 14]。miRNA是目前H型血管相關研究中出現最多的ncRNA，根據其作用結果可分為抑制和促進H型血管生成兩方面。
2.2 miRNA抑制H型血管生成
骨質疏松癥是一種以骨密度降低為特征的疾病，會導致骨折風險增加。絕經后婦女由于雌激素缺乏導致骨量減少，更易患骨質疏松癥。動物實驗與臨床絕經后婦女的骨組織標本均證明，H型血管將隨骨密度降低呈現減少趨勢[6, 15]。miRNA可能參與了骨丟失過程，研究顯示miR-148b-5p 可通過靶向結合SLIT3的3’UTR 抑制該因子表達，這可能是骨質疏松癥發展的分子機制之一[16]。研究表明通過體育活動增加機械力刺激可以緩解骨丟失、增強骨骼強度，在卵巢切除小鼠的膝關節施加機械負荷可明顯增加H型血管的數量，增加機械負荷能通過下調miR-214-3p表達，提高原本被miR-214-3p抑制的VEGF表達水平，從而誘導H型血管生成[17]。目前，對于H型血管具有年齡依賴性減少特性的研究較少，骨質疏松癥患者中H型血管減少的原因也不清楚。有學者發現miR-188-3p可能是該過程的關鍵調節因子，其在衰老內皮細胞中表達增加，內皮細胞miR-188-3p過表達的小鼠表現出H型血管生成與骨形成受損，而miR-188-3p敲除小鼠的年齡依賴性H型血管減少現象得到明顯改善，miR-188-3p靶向抑制內皮細胞中的整合素β3（integrin β3，ITGβ3）可能是其減少H型血管生成的主要分子機制[18]。以上結果提示靶向相關miRNA以促進H型血管生成，可能是緩解骨質疏松癥骨丟失的潛在策略。
骨關節炎發生過程中軟骨下骨的一個標志性改變是血管生成異常，H型血管參與了早期軟骨侵襲[19]。研究發現miR-135b在TGF-β1刺激的BMSCs來源外泌體中表達增加，將該外泌體干預骨關節炎小鼠模型，小鼠軟骨下骨中PDGF-BB表達和H型血管生成均受到明顯抑制，提示miR-135b可能是阻止骨關節炎中異常H型血管生成的有效靶點，有助于軟骨下骨微結構的正常化[20]。
雙膦酸鹽相關頜骨壞死是服用雙磷酸鹽的嚴重副作用之一，嚴重影響患者的生活質量。雙磷酸鹽（如唑來膦酸）可通過誘導氧化應激來抑制內皮細胞的遷移和增殖，導致骨修復受損[21]。H型血管也存在于人牙槽骨中，并在牙槽骨重塑中發揮重要作用[22]。有學者發現經唑來膦酸處理的骨髓源性巨噬細胞分泌的細胞外囊泡中miR-149-5p表達增加，該囊泡被內皮細胞內吞后，miR-149-5p可經Ras相關蛋白1a（RAS-associated protein 1a，Rap1a）/Rap1b/VEGF受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）途徑抑制內皮細胞的生物功能，導致H型血管生成減少，這可能是雙膦酸鹽相關頜骨壞死發生的機制之一[23]。
咖啡因具有發育毒性，產前咖啡因暴露（prenatal caffeine exposure，PCE）會導致胎兒在宮內生長遲緩和骨骼生長不良。有學者通過動物實驗發現，PCE可導致孕鼠后代的股骨長度發育障礙，并伴有H型血管豐度降低，同時使生長板軟骨細胞中的結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達降低，并以濃度依賴的方式增加miR-375表達，而miR-375抑制劑能挽救PCE誘發的CTGF表達抑制，提示PCE是通過miR-375來抑制CTGF的表達，從而介導H型血管相關的長骨發育不良[24]。
2.3 miRNA促進H型血管生成
miR-497～195簇在H型血管內皮細胞中高表達，但在衰老過程中逐漸降低。內皮細胞miR-497～195敲除小鼠顯示出H型血管減少與低骨量；而內皮細胞miR-497～195過表達小鼠中，與年齡相關的H型血管減少和骨丟失現象得到減輕。從作用機制上講，miR-497～195是通過維持內皮細胞Notch活性和HIF-1α穩定性來促進H型血管生成，這可能是年齡相關性骨質疏松癥的潛在治療靶點[25]。
骨吸收增加是骨質疏松癥發生的原因之一，有研究表明 miR-7b可抑制樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic cells-specific transmembrane protein，DC-STAMP）表達，阻礙破骨細胞前體融合為成熟的多核破骨細胞，抑制骨吸收活動[26]。miR-7b使破骨細胞前體蓄積后， PDGF-BB表達水平增高，有效增加 H型血管生成并減輕卵巢切除小鼠的骨丟失[27]。
長期大量飲酒易導致骨質疏松。研究發現乙醇可激活第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）基因，使骨形成和H型血管生成減少；在正常情況下，miR-136-3p可以靶向抑制PTEN表達以調節骨形成和血管生成，但乙醇能明顯下調miR-136-3p表達，使 PTEN表達升高，從而損害H型血管和骨形成，建立基于靶向miR-136-3p/PTEN軸的治療手段以刺激血管生成和骨形成，可能有利于減輕乙醇對骨骼系統的損害[28]。
此外，有學者發現miR-143在成骨細胞和H型內皮細胞中的表達顯著增加，并與骨形成標記基因BGLAP和ALP成正相關[29]。從機制上講，miR-143可直接靶向并抑制組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）表達，促進H型血管生成與成骨細胞分化的偶聯；同時miR-143在老年人血清中的表達低于年輕人，增加miR-143可以預防年齡相關的骨丟失，提示miR-143可能是骨質疏松癥潛在治療靶點[29]。
3 lncRNA對H型血管生成的調控作用
3.1 lncRNA的作用方式
lncRNA是長度超過200 nt的RNA轉錄本，起初因不能編碼蛋白質而被看作基因組轉錄的“噪音”，但隨著研究深入，越來越多lncRNA及其調控功能被發現。lncRNA參與了染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾等重要調控過程，其調控方式包括：作用于基因啟動子，抑制基因表達；作用于基因反義鏈，干擾mRNA的剪切；結合特定蛋白，起調控作用；作為“miRNA海綿”，保護目標mRNA不被降解或翻譯抑制等[30]。目前lncRNA與H型血管的相關研究較少，但其在調控H型血管生成和參與骨骼疾病發生、發展中同樣具有關鍵作用。
3.2 lncRNA調控H型血管生成
高骨量是一種遺傳性骨硬化癥，與骨質疏松相對立，會導致骨形成增加、骨密度異常升高，骨代謝調節因子突變是高骨量遺傳決定因素，但具體機制尚不清楚[31]。有學者分析了高骨量相關的lncRNA，發現lncRNA Reg1cp產生了一種新突變，通過對1 465名中國受試者進行分析，顯示雜合型Reg1cp個體的骨密度比野生型Reg1cp個體更高。突變的Reg1cp直接與Krüppel樣因子3（krüppel-like factor 3，KLF3）結合以抑制其活性，而KLF3又是VEGF-A的上游抑制因子；進一步動物實驗顯示內皮細胞KLF3敲除小鼠顯示出更高豐度的H型血管和高骨量，提示Reg1cp突變是高骨量發病機制之一，以此為啟發進一步建立靶向Reg1cp/KLF3軸的藥物干預手段可能用于治療骨質疏松癥、骨缺損等骨骼疾病[32-33]。
破骨細胞是骨中唯一具有骨吸收功能的細胞，起源于單核髓系造血干細胞，在NF-κB配體受體激活劑和巨噬細胞集落刺激因子的刺激下，破骨細胞前體分化與融合為成熟破骨細胞。值得注意的是，破骨細胞前體是PDGF-BB的主要來源，并能顯著促進H型血管生成[10]。骨吸收結束時，大多數破骨細胞開始凋亡，產生大量凋亡小體。有研究發現破骨細胞前體來源的凋亡小體能繼承親代細胞的功能，即具有促血管生成活性；進一步對該凋亡小體進行高通量測序與體內外實驗驗證，發現其攜帶的lncRNA GM16222對H型血管生成具有促進作用，作用機制可能與GM16222可靶向促進CD31、TGF-β1等血管生成相關因子表達有關[34]。
骨不愈合通常表現為軟骨內骨化受損，軟骨內骨化是由肥大軟骨細胞介導的硬骨替代軟骨。有研究發現lncRNA HCAR與肥大軟骨細胞介導的血管生成相關，在骨修復動物模型中，將肥大軟骨細胞中的HCAR敲低會抑制軟骨基質重塑并降低H型血管數量， HCAR通過競爭性內源性RNA機制，充當miR-15b-5p的“分子海綿”，增加基質金屬蛋白酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP-13）和VEGF的表達，以促進骨修復與H型血管生成，提示HCAR是促進軟骨內修復、骨折愈合的潛在靶點[35]。
4 siRNA 對H型血管生成的調控作用
4.1 siRNA的作用方式
siRNA是長度為19～30 nt的雙鏈RNA，能以完全互補的方式與靶mRNA結合，并誘導其降解而導致基因沉默，被稱為“RNA干擾現象”[36]。siRNA與miRNA作用方式類似但有不同，如siRNA具有高度特異性，僅靶向互補的mRNA，而miRNA可與不同靶mRNA結合[37]。siRNA是骨組織工程中進行基因調控的有效工具，目前多采用不同轉染技術將外源性siRNA導入細胞內，對特定基因產生敲低效果。
4.2 siRNA調控H型血管生成
目前研究已明確了一些調控H型血管的分子與通路，如HIF-1α、PDGF-BB、SLIT3、Notch通路等，siRNA與H型血管的相關研究也是圍繞這些分子與通路來進行。Shn3已被證實可抑制SLIT3表達[11]，有學者構建了裝載有si-Shn3的外泌體，該外泌體可顯著沉默成骨細胞Shn3基因的表達，并能提高SLIT3水平，從而誘導H型血管生成[38]。患者長期臥床常見并發癥之一是骨質流失，是因為負荷和運動產生的機械刺激是維持骨量的關鍵因素。后肢免負重小鼠模型中骨形成和H型血管同時減少，而西洋參皂苷可增加該小鼠模型的骨量和H型血管數量，當人微血管內皮細胞中的VEGF和Noggin被siRNA敲低后，西洋參皂苷的上述作用基本被抵消，提示西洋參皂苷是通過內皮細胞衍生的VEGF和Noggin來促進H型血管生成，從而發揮預防骨丟失的作用[39]。在另一項有關機械刺激與骨代謝的相關研究中，使用siRNA將機械敏感性蛋白鞘氨醇-1-磷酸受體（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1Pr1）敲除，能抑制VEGF-A、HIF-1α等血管生成相關基因的表達，而過表達S1Pr1則能明顯增加H型血管與骨祖細胞數量[40]。駱駝蓬堿是一種廣泛分布于自然界的β-咔啉類生物堿，具有抗成熟破骨細胞生成的作用，能增加破骨細胞前體數量和PDGF-BB的產生來促進H型血管生成，防止卵巢切除小鼠的骨丟失，在使用siRNA敲低DNA結合抑制劑 2（inhibitor of DNA binding 2，Id2）后，駱駝蓬堿的這種作用效果明顯下降，提示該藥物是通過促進Id2表達來刺激PDGF-BB分泌和H型血管生成[41]。許多藥物設計都是基于對靶基因的抑制作用，目前調控H型血管生成的部分分子機制已被驗證，因此siRNA的干擾效應可廣泛應用于H型血管的靶向藥物設計。
5 其他ncRNA對H型血管生成的調控作用
近年研究表明，除上述miRNA、lncRNA和siRNA外，circRNA、piRNA等其他ncRNA也參與了骨微環境穩態的調控[13]。circRNA因具有閉環結構、不易受降解而表達更穩定，能通過競爭性內源性RNA機制更好地發揮調控miRNA的作用[42]。piRNA可與PIWI家族亞蛋白結合形成復合物， PIWI蛋白引導piRNA識別并沉默靶mRNA以調節基因翻譯過程[43]。但目前關于circRNA、piRNA在調控H型血管生成方面的研究鮮有報道，這可能是未來研究方向，例如circRNA在破骨細胞前體中也有所表達，尋找特定circRNA并調控其表達以抑制破骨細胞成熟分化，則可保留破骨細胞前體數量而增加PDGF-BB分泌，促進骨H型血管生成。
ncRNA對H型血管產生的促進或抑制效應，多基于其對已探明的H型血管生成因子的直接或間接調控來實現。各類ncRNA在H型血管生成中的調控作用詳見表1。
表1
ncRNA調控H型血管生成研究總結
Table1.
Summary of research on the regulation of type H vessels angiogenesis by ncRNA
6 ncRNA在相關骨骼疾病治療中的應用
ncRNA在調控多種H型血管生長因子方面的能力，使其在H型血管相關骨骼疾病的治療中具有巨大潛力。目前多采用化學合成的核酸聚合物作為藥物進行干預，目的是通過抑制劑或激活劑來調控下游基因表達，但存在穩定性和靶向性差、遞送困難等限制，對此已有研究通過化學修飾以增強其穩定性，并運用合成納米顆粒、外泌體、水凝膠等作為遞送載體[44]。外泌體是一類直徑為40～150 nm的細胞外囊泡，具有高度的生物相容性，通過工程化改造來實現組織靶向性，可以避免其在非靶向位點積累[13]。Cui等[38]構建了一種基于使用骨靶向肽修飾的工程化外泌體，可以特異性地將si-Shn3遞送到成骨細胞，使H型血管生成增加，減少骨質疏松癥的骨丟失。而Dou等[27]開發了一種基于石墨烯的miRNA轉染方法，能顯著提高miR-7b 轉染效率，并通過增加H型血管數量，顯著增強骨密度、骨體積，有望用于治療破骨細胞性骨吸收過度的骨質疏松癥。目前將基于ncRNA的治療策略轉化為臨床應用仍存在挑戰，有待不斷深入的ncRNA與H型血管相關研究，為骨骼疾病的治療奠定堅實理論基礎。
7 總結與展望
H型血管是骨內特有的微血管，具有顯著的解剖特異性與年齡依賴性減少現象，深度參與了骨骼的生長發育、修復、重塑和代謝等過程。目前對于影響H型血管生成的分子機制逐漸被揭示，其中ncRNA對于骨骼疾病發生、發展中H型血管生成的調控作用至關重要，如miRNA、lncRNA、siRNA 可通過自身特有的作用機制，調節下游各種因子的表達，進而影響骨血管生成與骨形成（圖1）。研究表明促進H型血管生成有利于骨量恢復，提示這可能是治療骨質疏松、骨缺損及骨壞死的新方法。
圖1
ncRNA調控骨H型血管生成機制
Figure1.
Mechanistic diagram of the regulation of type H vessels angiogenesis by ncRNA
但是目前研究仍存在不足，ncRNA與H型血管的相關研究較少，屬于起步階段，并且多為細胞與動物實驗，缺乏臨床驗證。后續應擴大對其他類型ncRNA的研究，并進一步探索ncRNA在股骨頭壞死、腫瘤骨轉移等其他骨骼疾病中的作用。與傳統藥理學方法相比，基于ncRNA的靶向治療手段可能是骨組織工程中具有前景的新策略，相信隨著ncRNA與H型血管研究的深入，對于“血管生成-成骨偶聯”分子機制的理解也將不斷加深，相關研究成果有望為骨骼疾病診治提供新思路。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 唐生平：綜述構思、文獻查閱及文章撰寫；羅曉林、韋幀翟：文獻檢索與整理；廖世杰：對文章修改提出建設性意見；劉建宏、丁曉飛：對文章進行審校并修改
骨是高度血管化的組織，在發育、修復與重塑過程中，骨形成及礦化的前提是血管侵入。骨血管不僅為骨組織提供必要的營養與氧氣，還能調節各種骨細胞和血管細胞間的相互作用，為骨形成提供必要的刺激信號[1]。血管生成是從已存在的血管中發育出新血管的過程，與成骨過程相互交織，兩者密切的時空聯系被稱為“血管生成-成骨偶聯”，該理論對指導骨骼疾病治療具有重要意義[2]。近年來，一種特殊的骨微血管亞型——H型血管被發現與骨形成高度偶聯，并參與許多骨骼疾病的發生、發展。目前，調控H型血管生成的分子機制已被陸續發現。基于此，利用藥物進行靶點干預，通過調控H型血管生成治療骨骼疾病具有廣闊應用前景。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）深度參與了骨微環境調控，對于骨H型血管生成的調控同樣發揮著關鍵作用[3-4]。現對ncRNA在H型血管生成中的調控作用機制以及目前用于治療骨骼疾病的相關研究進展作一綜述，以期為后續研究提供參考。
1 H型血管與ncRNA概述
2014年，Kusumbe等[5]在小鼠骨骼中鑒定出兩種微血管亞型——H型血管和L型血管。H型血管以高表達CD31與內皮黏蛋白為特征，主要分布于干骺端和骨內膜下，呈柱形、拱形分布；L型血管則低表達CD31與內皮黏蛋白，主要分布于骨干區域，呈高度分支狀；兩種血管在骨髓腔中相接。H型血管內皮細胞雖然僅為骨內總內皮細胞的極少部分，卻能吸引大量骨祖細胞、成骨細胞聚集在其周圍。這些骨祖細胞為骨形成提供了成骨細胞來源，而H型血管的高含氧量又能滿足成骨細胞代謝需求。因此，H型血管在血管生成-成骨偶聯中發揮關鍵作用。此外，處于生長發育期的個體中H型血管豐富，但在成年、老年個體中則明顯減少，這種年齡依賴性減少的現象已在臨床骨組織標本中得到了驗證，提示H型血管可能是人體骨量標志物[6]。目前，研究已發現H型血管參與了骨質疏松癥[7]、骨關節炎[8]、骨折修復[9]等諸多骨骼疾病發生發展過程，并明確缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）[5]、PDGF-BB[10]、神經軸突導向因子3（slit guidance ligand 3，SLIT3）[11]、表皮生長因子樣結構域6[12]等均能作為H型血管促進因子。近年來，隨著ncRNA被發現參與多種疾病進程，其與H型血管的關系也逐漸被揭示。
ncRNA是指由基因組轉錄而成、不編碼蛋白質的 RNA 分子，它們在人類基因轉錄組中的含量超過98%，能參與基因表達調控及轉錄后調控過程并發揮重要作用[13]。ncRNA 可分為基礎結構型ncRNA和調控型ncRNA兩種主要類型，前者包括轉運RNA、核糖體RNA、小核RNA等；后者包括微小RNA（microRNA，miRNA）、PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）、小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和環狀（circular RNA，circRNA）等。目前對于ncRNA在骨骼疾病中調控H型血管生成的研究主要集中于miRNA、lncRNA和siRNA，它們也有望作為骨骼疾病診療靶點以及解析相關骨骼疾病發生的新型分子。
2 miRNA對H型血管生成的調控作用
2.1 miRNA作用方式
miRNA是長度為18～24 nt的單鏈 RNA 分子，由內源性基因編碼。初始miRNA在被轉錄并切割為發夾狀的前體miRNA后，會被 Dicer 酶剪切成長度約為22 nt的雙鏈 miRNA，隨后經降解形成成熟的單鏈miRNA，最終與RNA誘導沉默復合體結合形成miRNA誘導沉默復合體（microRNA-induced silencing complex，miRISC），識別并結合靶mRNA的3’UTR以抑制其翻譯。miRNA通過這種調控機制廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、代謝等生命活動的調節和控制[3, 14]。miRNA是目前H型血管相關研究中出現最多的ncRNA，根據其作用結果可分為抑制和促進H型血管生成兩方面。
2.2 miRNA抑制H型血管生成
骨質疏松癥是一種以骨密度降低為特征的疾病，會導致骨折風險增加。絕經后婦女由于雌激素缺乏導致骨量減少，更易患骨質疏松癥。動物實驗與臨床絕經后婦女的骨組織標本均證明，H型血管將隨骨密度降低呈現減少趨勢[6, 15]。miRNA可能參與了骨丟失過程，研究顯示miR-148b-5p 可通過靶向結合SLIT3的3’UTR 抑制該因子表達，這可能是骨質疏松癥發展的分子機制之一[16]。研究表明通過體育活動增加機械力刺激可以緩解骨丟失、增強骨骼強度，在卵巢切除小鼠的膝關節施加機械負荷可明顯增加H型血管的數量，增加機械負荷能通過下調miR-214-3p表達，提高原本被miR-214-3p抑制的VEGF表達水平，從而誘導H型血管生成[17]。目前，對于H型血管具有年齡依賴性減少特性的研究較少，骨質疏松癥患者中H型血管減少的原因也不清楚。有學者發現miR-188-3p可能是該過程的關鍵調節因子，其在衰老內皮細胞中表達增加，內皮細胞miR-188-3p過表達的小鼠表現出H型血管生成與骨形成受損，而miR-188-3p敲除小鼠的年齡依賴性H型血管減少現象得到明顯改善，miR-188-3p靶向抑制內皮細胞中的整合素β3（integrin β3，ITGβ3）可能是其減少H型血管生成的主要分子機制[18]。以上結果提示靶向相關miRNA以促進H型血管生成，可能是緩解骨質疏松癥骨丟失的潛在策略。
骨關節炎發生過程中軟骨下骨的一個標志性改變是血管生成異常，H型血管參與了早期軟骨侵襲[19]。研究發現miR-135b在TGF-β1刺激的BMSCs來源外泌體中表達增加，將該外泌體干預骨關節炎小鼠模型，小鼠軟骨下骨中PDGF-BB表達和H型血管生成均受到明顯抑制，提示miR-135b可能是阻止骨關節炎中異常H型血管生成的有效靶點，有助于軟骨下骨微結構的正常化[20]。
雙膦酸鹽相關頜骨壞死是服用雙磷酸鹽的嚴重副作用之一，嚴重影響患者的生活質量。雙磷酸鹽（如唑來膦酸）可通過誘導氧化應激來抑制內皮細胞的遷移和增殖，導致骨修復受損[21]。H型血管也存在于人牙槽骨中，并在牙槽骨重塑中發揮重要作用[22]。有學者發現經唑來膦酸處理的骨髓源性巨噬細胞分泌的細胞外囊泡中miR-149-5p表達增加，該囊泡被內皮細胞內吞后，miR-149-5p可經Ras相關蛋白1a（RAS-associated protein 1a，Rap1a）/Rap1b/VEGF受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）途徑抑制內皮細胞的生物功能，導致H型血管生成減少，這可能是雙膦酸鹽相關頜骨壞死發生的機制之一[23]。
咖啡因具有發育毒性，產前咖啡因暴露（prenatal caffeine exposure，PCE）會導致胎兒在宮內生長遲緩和骨骼生長不良。有學者通過動物實驗發現，PCE可導致孕鼠后代的股骨長度發育障礙，并伴有H型血管豐度降低，同時使生長板軟骨細胞中的結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達降低，并以濃度依賴的方式增加miR-375表達，而miR-375抑制劑能挽救PCE誘發的CTGF表達抑制，提示PCE是通過miR-375來抑制CTGF的表達，從而介導H型血管相關的長骨發育不良[24]。
2.3 miRNA促進H型血管生成
miR-497～195簇在H型血管內皮細胞中高表達，但在衰老過程中逐漸降低。內皮細胞miR-497～195敲除小鼠顯示出H型血管減少與低骨量；而內皮細胞miR-497～195過表達小鼠中，與年齡相關的H型血管減少和骨丟失現象得到減輕。從作用機制上講，miR-497～195是通過維持內皮細胞Notch活性和HIF-1α穩定性來促進H型血管生成，這可能是年齡相關性骨質疏松癥的潛在治療靶點[25]。
骨吸收增加是骨質疏松癥發生的原因之一，有研究表明 miR-7b可抑制樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic cells-specific transmembrane protein，DC-STAMP）表達，阻礙破骨細胞前體融合為成熟的多核破骨細胞，抑制骨吸收活動[26]。miR-7b使破骨細胞前體蓄積后， PDGF-BB表達水平增高，有效增加 H型血管生成并減輕卵巢切除小鼠的骨丟失[27]。
長期大量飲酒易導致骨質疏松。研究發現乙醇可激活第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）基因，使骨形成和H型血管生成減少；在正常情況下，miR-136-3p可以靶向抑制PTEN表達以調節骨形成和血管生成，但乙醇能明顯下調miR-136-3p表達，使 PTEN表達升高，從而損害H型血管和骨形成，建立基于靶向miR-136-3p/PTEN軸的治療手段以刺激血管生成和骨形成，可能有利于減輕乙醇對骨骼系統的損害[28]。
此外，有學者發現miR-143在成骨細胞和H型內皮細胞中的表達顯著增加，并與骨形成標記基因BGLAP和ALP成正相關[29]。從機制上講，miR-143可直接靶向并抑制組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）表達，促進H型血管生成與成骨細胞分化的偶聯；同時miR-143在老年人血清中的表達低于年輕人，增加miR-143可以預防年齡相關的骨丟失，提示miR-143可能是骨質疏松癥潛在治療靶點[29]。
3 lncRNA對H型血管生成的調控作用
3.1 lncRNA的作用方式
lncRNA是長度超過200 nt的RNA轉錄本，起初因不能編碼蛋白質而被看作基因組轉錄的“噪音”，但隨著研究深入，越來越多lncRNA及其調控功能被發現。lncRNA參與了染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾等重要調控過程，其調控方式包括：作用于基因啟動子，抑制基因表達；作用于基因反義鏈，干擾mRNA的剪切；結合特定蛋白，起調控作用；作為“miRNA海綿”，保護目標mRNA不被降解或翻譯抑制等[30]。目前lncRNA與H型血管的相關研究較少，但其在調控H型血管生成和參與骨骼疾病發生、發展中同樣具有關鍵作用。
3.2 lncRNA調控H型血管生成
高骨量是一種遺傳性骨硬化癥，與骨質疏松相對立，會導致骨形成增加、骨密度異常升高，骨代謝調節因子突變是高骨量遺傳決定因素，但具體機制尚不清楚[31]。有學者分析了高骨量相關的lncRNA，發現lncRNA Reg1cp產生了一種新突變，通過對1 465名中國受試者進行分析，顯示雜合型Reg1cp個體的骨密度比野生型Reg1cp個體更高。突變的Reg1cp直接與Krüppel樣因子3（krüppel-like factor 3，KLF3）結合以抑制其活性，而KLF3又是VEGF-A的上游抑制因子；進一步動物實驗顯示內皮細胞KLF3敲除小鼠顯示出更高豐度的H型血管和高骨量，提示Reg1cp突變是高骨量發病機制之一，以此為啟發進一步建立靶向Reg1cp/KLF3軸的藥物干預手段可能用于治療骨質疏松癥、骨缺損等骨骼疾病[32-33]。
破骨細胞是骨中唯一具有骨吸收功能的細胞，起源于單核髓系造血干細胞，在NF-κB配體受體激活劑和巨噬細胞集落刺激因子的刺激下，破骨細胞前體分化與融合為成熟破骨細胞。值得注意的是，破骨細胞前體是PDGF-BB的主要來源，并能顯著促進H型血管生成[10]。骨吸收結束時，大多數破骨細胞開始凋亡，產生大量凋亡小體。有研究發現破骨細胞前體來源的凋亡小體能繼承親代細胞的功能，即具有促血管生成活性；進一步對該凋亡小體進行高通量測序與體內外實驗驗證，發現其攜帶的lncRNA GM16222對H型血管生成具有促進作用，作用機制可能與GM16222可靶向促進CD31、TGF-β1等血管生成相關因子表達有關[34]。
骨不愈合通常表現為軟骨內骨化受損，軟骨內骨化是由肥大軟骨細胞介導的硬骨替代軟骨。有研究發現lncRNA HCAR與肥大軟骨細胞介導的血管生成相關，在骨修復動物模型中，將肥大軟骨細胞中的HCAR敲低會抑制軟骨基質重塑并降低H型血管數量， HCAR通過競爭性內源性RNA機制，充當miR-15b-5p的“分子海綿”，增加基質金屬蛋白酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP-13）和VEGF的表達，以促進骨修復與H型血管生成，提示HCAR是促進軟骨內修復、骨折愈合的潛在靶點[35]。
4 siRNA 對H型血管生成的調控作用
4.1 siRNA的作用方式
siRNA是長度為19～30 nt的雙鏈RNA，能以完全互補的方式與靶mRNA結合，并誘導其降解而導致基因沉默，被稱為“RNA干擾現象”[36]。siRNA與miRNA作用方式類似但有不同，如siRNA具有高度特異性，僅靶向互補的mRNA，而miRNA可與不同靶mRNA結合[37]。siRNA是骨組織工程中進行基因調控的有效工具，目前多采用不同轉染技術將外源性siRNA導入細胞內，對特定基因產生敲低效果。
4.2 siRNA調控H型血管生成
目前研究已明確了一些調控H型血管的分子與通路，如HIF-1α、PDGF-BB、SLIT3、Notch通路等，siRNA與H型血管的相關研究也是圍繞這些分子與通路來進行。Shn3已被證實可抑制SLIT3表達[11]，有學者構建了裝載有si-Shn3的外泌體，該外泌體可顯著沉默成骨細胞Shn3基因的表達，并能提高SLIT3水平，從而誘導H型血管生成[38]。患者長期臥床常見并發癥之一是骨質流失，是因為負荷和運動產生的機械刺激是維持骨量的關鍵因素。后肢免負重小鼠模型中骨形成和H型血管同時減少，而西洋參皂苷可增加該小鼠模型的骨量和H型血管數量，當人微血管內皮細胞中的VEGF和Noggin被siRNA敲低后，西洋參皂苷的上述作用基本被抵消，提示西洋參皂苷是通過內皮細胞衍生的VEGF和Noggin來促進H型血管生成，從而發揮預防骨丟失的作用[39]。在另一項有關機械刺激與骨代謝的相關研究中，使用siRNA將機械敏感性蛋白鞘氨醇-1-磷酸受體（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1Pr1）敲除，能抑制VEGF-A、HIF-1α等血管生成相關基因的表達，而過表達S1Pr1則能明顯增加H型血管與骨祖細胞數量[40]。駱駝蓬堿是一種廣泛分布于自然界的β-咔啉類生物堿，具有抗成熟破骨細胞生成的作用，能增加破骨細胞前體數量和PDGF-BB的產生來促進H型血管生成，防止卵巢切除小鼠的骨丟失，在使用siRNA敲低DNA結合抑制劑 2（inhibitor of DNA binding 2，Id2）后，駱駝蓬堿的這種作用效果明顯下降，提示該藥物是通過促進Id2表達來刺激PDGF-BB分泌和H型血管生成[41]。許多藥物設計都是基于對靶基因的抑制作用，目前調控H型血管生成的部分分子機制已被驗證，因此siRNA的干擾效應可廣泛應用于H型血管的靶向藥物設計。
5 其他ncRNA對H型血管生成的調控作用
近年研究表明，除上述miRNA、lncRNA和siRNA外，circRNA、piRNA等其他ncRNA也參與了骨微環境穩態的調控[13]。circRNA因具有閉環結構、不易受降解而表達更穩定，能通過競爭性內源性RNA機制更好地發揮調控miRNA的作用[42]。piRNA可與PIWI家族亞蛋白結合形成復合物， PIWI蛋白引導piRNA識別并沉默靶mRNA以調節基因翻譯過程[43]。但目前關于circRNA、piRNA在調控H型血管生成方面的研究鮮有報道，這可能是未來研究方向，例如circRNA在破骨細胞前體中也有所表達，尋找特定circRNA并調控其表達以抑制破骨細胞成熟分化，則可保留破骨細胞前體數量而增加PDGF-BB分泌，促進骨H型血管生成。
ncRNA對H型血管產生的促進或抑制效應，多基于其對已探明的H型血管生成因子的直接或間接調控來實現。各類ncRNA在H型血管生成中的調控作用詳見表1。
表1
ncRNA調控H型血管生成研究總結
Table1.
Summary of research on the regulation of type H vessels angiogenesis by ncRNA
6 ncRNA在相關骨骼疾病治療中的應用
ncRNA在調控多種H型血管生長因子方面的能力，使其在H型血管相關骨骼疾病的治療中具有巨大潛力。目前多采用化學合成的核酸聚合物作為藥物進行干預，目的是通過抑制劑或激活劑來調控下游基因表達，但存在穩定性和靶向性差、遞送困難等限制，對此已有研究通過化學修飾以增強其穩定性，并運用合成納米顆粒、外泌體、水凝膠等作為遞送載體[44]。外泌體是一類直徑為40～150 nm的細胞外囊泡，具有高度的生物相容性，通過工程化改造來實現組織靶向性，可以避免其在非靶向位點積累[13]。Cui等[38]構建了一種基于使用骨靶向肽修飾的工程化外泌體，可以特異性地將si-Shn3遞送到成骨細胞，使H型血管生成增加，減少骨質疏松癥的骨丟失。而Dou等[27]開發了一種基于石墨烯的miRNA轉染方法，能顯著提高miR-7b 轉染效率，并通過增加H型血管數量，顯著增強骨密度、骨體積，有望用于治療破骨細胞性骨吸收過度的骨質疏松癥。目前將基于ncRNA的治療策略轉化為臨床應用仍存在挑戰，有待不斷深入的ncRNA與H型血管相關研究，為骨骼疾病的治療奠定堅實理論基礎。
7 總結與展望
H型血管是骨內特有的微血管，具有顯著的解剖特異性與年齡依賴性減少現象，深度參與了骨骼的生長發育、修復、重塑和代謝等過程。目前對于影響H型血管生成的分子機制逐漸被揭示，其中ncRNA對于骨骼疾病發生、發展中H型血管生成的調控作用至關重要，如miRNA、lncRNA、siRNA 可通過自身特有的作用機制，調節下游各種因子的表達，進而影響骨血管生成與骨形成（圖1）。研究表明促進H型血管生成有利于骨量恢復，提示這可能是治療骨質疏松、骨缺損及骨壞死的新方法。
圖1
ncRNA調控骨H型血管生成機制
Figure1.
Mechanistic diagram of the regulation of type H vessels angiogenesis by ncRNA
但是目前研究仍存在不足，ncRNA與H型血管的相關研究較少，屬于起步階段，并且多為細胞與動物實驗，缺乏臨床驗證。后續應擴大對其他類型ncRNA的研究，并進一步探索ncRNA在股骨頭壞死、腫瘤骨轉移等其他骨骼疾病中的作用。與傳統藥理學方法相比，基于ncRNA的靶向治療手段可能是骨組織工程中具有前景的新策略，相信隨著ncRNA與H型血管研究的深入，對于“血管生成-成骨偶聯”分子機制的理解也將不斷加深，相關研究成果有望為骨骼疾病診治提供新思路。
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作者貢獻聲明 唐生平：綜述構思、文獻查閱及文章撰寫；羅曉林、韋幀翟：文獻檢索與整理；廖世杰：對文章修改提出建設性意見；劉建宏、丁曉飛：對文章進行審校并修改
