引用本文： 羅超, 周衛軍, 張鵠瑩, 朱金威, 陳路, 顧玉榮. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯延緩軟骨細胞衰老的相關研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(3): 308-315. doi: 10.7507/1002-1892.202210101 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是老年人最常見的肌肉骨骼疾病，也是導致關節疼痛和殘疾的主要原因，目前尚無有效防治方式[1]。研究發現OA患者關節滑液中IL-1、IL-6等細胞因子水平明顯升高，這些細胞因子能上調基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）和MMP-13的表達[2]，而MMP可以降解軟骨中蛋白多糖、膠原蛋白和纖連蛋白，導致軟骨細胞外基質減少。軟骨細胞外基質丟失是OA早期一個關鍵的特征，提示軟骨細胞和滑膜關節其他細胞衰老是OA發病的驅動因素。
表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中主要生物活性物質，具有強大抗炎、抗氧化作用[3]，在抗衰老和癌癥治療等領域都具有重要作用[4]。體內實驗表明，EGCG可通過抑制TNF-α和MMP-13活性，降低人OA軟骨細胞的晚期糖基化終產物生成[5]。體外研究表明，EGCG能夠降低MMP-1和MMP-13表達水平[6]。另外，綠茶中的兒茶酚類物質能夠抑制人軟骨中蛋白多糖和Ⅱ型膠原退變[7]。這些研究均顯示EGCG具有軟骨保護作用，但目前國內外有關EGCG對OA的作用及其作用機制的報道較少。
哺乳動物細胞自噬是通過溶酶體降解和移除蛋白質、核糖體、脂滴及其他細胞器等衰老和無用的細胞分子，維持細胞穩態[8-12]。研究表明，姜黃素[13]和異黃酮[14]等生物活性多酚可以促進軟骨細胞自噬發生。適當濃度的EGCG能夠誘導細胞自噬，發揮抗炎[15]、降解內皮細胞脂滴[16-17]和促進內毒素降解[18]等作用。另有研究顯示，EGCG能夠促進人胚胎腎細胞自噬，從而延緩凋亡介導的細胞死亡，最終延緩細胞衰老[19]。然而，細胞自噬在衰老軟骨細胞損傷中扮演的角色尚不明確。本研究以SD大鼠軟骨細胞退變模型為研究對象，探究EGCG能否通過促進軟骨細胞自噬來抑制其衰老以及相關作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級SD大鼠12只，雌性6只、雄性6只，體質量180～220 g，平均211.0 g；購自江西中醫藥大學。
EGCG（上海源葉生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、細胞自噬染色檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM/F12細胞培養液、PBS緩沖液（HyClone公司，美國）；重組鼠IL-1β（Peprotech公司，美國）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；Eastep Super總RNA提取試劑盒、Go Script逆轉錄試劑盒、Go Taq qPCR Master Mix（Promega公司，美國）；兔抗Beclin-1抗體、兔抗LC3抗體、兔抗MMP-3抗體、小鼠抗MMP-13抗體（Novus公司，美國）；小鼠抗GAPDH抗體、兔抗Ⅱ型膠原抗體（Abcam公司，美國）； mTOR（南京巴傲得生物科技有限公司）；兔抗大鼠P16抗體，山羊抗兔、抗鼠二抗（Proteintech公司，美國）；兔抗鼠AKT抗體（Santa Cruz公司，美國）。
25 cm2塑料培養瓶、6孔板、96孔板（Corning公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；化學發光成像分析系統、CO2恒溫培養箱（Eppendorf公司，德國）；酶標儀Model680（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 軟骨細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 軟骨細胞分離及培養
將12只SD大鼠以頸椎脫臼法處死后，置于75%乙醇浸泡30 min，無菌條件下分離股骨頸、股骨髁和脛骨平臺，取關節軟骨并切碎；胰蛋白酶與Ⅱ型膠原酶分步依次消化后，收集細胞接種至含15%FBS的DMEM/F12培養基中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，之后每2～3天更換培養基，待細胞貼壁生長達80%以上，使用胰蛋白酶消化細胞，按1∶2比例傳代。取第2代細胞進行后續實驗。
1.2.2 軟骨細胞鑒定
取第2代細胞調整濃度為1×105個/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h，分別行甲苯胺藍染色、阿利新藍染色及Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。
1.3 EGCG最佳藥物濃度測定
實驗分為8組，分別為空白對照組、10 ng/mL IL-1β培養組以及6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組。取第2代細胞，以5×103個/孔密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，空白對照組加入10 μL 完全培養基，其余實驗組按照分組分別加入10 ng/mL IL-1β以及各濃度EGCG，每孔 10 μL。繼續培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，實驗重復3次。根據細胞生長曲線，結合文獻 ［17，19］ 選擇在較低濃度下能發揮較大促細胞生長作用濃度進行后續實驗。
1.4 實驗分組及方法
實驗分為4組，空白對照組（A組）、10 ng/mL IL-1β培養組（B組）、EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組（C組）、EGCG+10 ng/mL IL-1β+5 mmol/L 3-MA組（D組）。取第2代細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL后接種于6孔板，每孔1 mL，每組設3個復孔。按照分組給予對應培養液培養后進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞衰老檢測
取各組培養24 h細胞，按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下見細胞呈藍色為陽性染色，Image J軟件測算各組陽性細胞數并計算衰老率，以評價軟骨細胞的衰老情況。
1.5.2 細胞自噬檢測
取各組培養24 h細胞，參照細胞自噬染色檢測試劑盒采用單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）法染色，熒光顯微鏡下細胞質內出現點狀熒光分布視為陽性染色，計數并拍照，采用Image J軟件計算熒光強度，反映軟骨細胞自噬活躍度。
1.5.3 實時熒光定量PCR檢測
取各組培養24 h細胞，按Eastep Super總RNA提取試劑盒、Go Script 逆轉錄試劑盒說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，按Go Taq qPCR Master Mix說明書配置20 μL反應體系進行PCR擴增。以 GAPDH 為內參，使用2–ΔΔCt方法計算目的基因（Ⅱ型膠原、MMP-3、MMP-13）相對表達量。引物序列見表1。
表1
引物序列和產物長度（5′→3′）
Table1.
Primer sequences and product length (5′→3′)
1.5.4 Western blot檢測
取各組培養48 h細胞，按總蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，依次進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉，孵育一抗（各抗體稀釋比例為Beclin-1 1∶2 000，LC3 1∶2 000、MMP-3 1∶1 000、MMP-13 1∶4 000、GAPDH 1∶5 000、Ⅱ型膠原 1∶2 000、P16 1∶2 000、mTOR 1∶1 000、AKT 1∶2 000）和二抗（1∶5 000），采用化學發光成像分析系統觀察分析條帶。內參為GAPDH，計算目的蛋白相對表達量。其中，LC3蛋白相對表達量以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表示。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態觀察及鑒定
第2代細胞呈三角形或多角形貼壁生長，胞核清晰，胞質豐富。甲苯胺藍染色見細胞質呈藍色，細胞核呈深藍色；阿利新藍染色見細胞質呈淡藍色；Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色見細胞質呈棕黃色，細胞核呈深棕色。3種染色均呈陽性，鑒定分離培養細胞為軟骨細胞。見圖1。
圖1
第2代軟骨細胞形態觀察及鑒定（×100）
a. 倒置相差顯微鏡下細胞形態；b. 甲苯胺藍染色；c. 阿利新藍染色；d. Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色
Figure1. Morphological observation and identification of P2 chondrocytes (×100)a. Cell morphology under inverted contrast microscopy; b. Toluidine blue staining; c. Alcian blue staining; d. Immunocytochemical staining for type Ⅱ collagen
2.2 EGCG最佳藥物濃度測定
與空白對照組相比，10 ng/mL IL-1β培養組細胞活力降低，A值差異有統計學意義（P<0.05）。與10 ng/mL IL-1β培養組相比，各濃度EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組細胞活性均上升；其中50.0、100.0、200.0 μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組與10 ng/mL IL-1β培養組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結合本組細胞生長情況以及既往文獻報道，EGCG 達到100.0 μmol/L以后細胞活性無明顯變化，最終選擇該濃度EGCG進行后續實驗。見圖2。
圖2
各組細胞A值
*
*
2.3 細胞衰老檢測
β-半乳糖苷酶染色示A組未見明顯染色反應，細胞衰老率為15.76%±5.59%；B組可見大量細胞呈深藍色，細胞衰老率為83.84%±6.55%；C組可見少量染色細胞，細胞衰老率為36.41%±4.50%；D組可見較多細胞呈深藍色，細胞衰老率為69.69%±3.24%。B、C、D組細胞衰老率均高于A組，B、D組高于C組，B組高于D組，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。 見圖3。
圖3
各組β-半乳糖苷酶染色觀察（×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure3. β-galactosidase staining in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 細胞自噬檢測
細胞自噬染色顯示A組細胞自噬較活躍（34.35±4.08），B組細胞自噬（12.45±3.17）與A組相比明顯減少，C組細胞自噬（46.64±3.67）較B組增強，D組細胞自噬（22.13±3.16）較C組明顯減弱；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
各組MDC法染色觀察（熒光顯微鏡×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure4. MDC method staining in each group (Fluorescence microscopy×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.5 實時熒光定量PCR檢測
與A組相比，B組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量下調，MMP-3、MMP-13上調。與B組相比，C組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量上調，MMP-3和MMP-13下調；與C組相比，D組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量下調，MMP-3、MMP-13上調。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
各組軟骨細胞衰老相關基因表達
*
*
2.6 Western blot檢測
與A組相比，B組P16蛋白相對表達量增加；與B組相比，C組P16蛋白相對表達量降低；與C組相比，D組蛋白相對表達量增加。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
與A組相比，B組Ⅱ型膠原、LC3、Beclin-1蛋白相對表達量下降，MMP-3、MMP-13、mTOR及AKT蛋白相對表達量均上調；與B組相比，C組Ⅱ型膠原、LC3、Beclin-1蛋白相對表達量上調，MMP-3、MMP-13、mTOR及AKT蛋白相對表達量均下降；與C組相比，D組上述指標均呈相反變化趨勢。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
Western blot檢測各組軟骨細胞相關蛋白表達
a. 電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組； b. 目的蛋白相對表達量
Figure6. Expressions of the chondrocytes related proteins in each group detected by Western blota. Electrophoresis 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Relative expressions of target proteins
3 討論
衰老是生物體必然經歷的一種自然過程，與眾多疾病的發病機制相關，OA也被認為是一種衰老情況。一種較為公認的學說是關節軟骨遭受過多的機械負荷或氧化應激等因素導致退變，最終引發OA[20]。目前，通常采用在軟骨細胞中加入特殊誘導藥物（IL-1β等）共培養方法體外構建軟骨細胞衰老模型。既往研究使用10 ng/mL IL-1β培養基成功建立OA細胞模型[21-22]，本研究預實驗濃度篩選結果與上述文獻結果一致，故采用10 ng/mL IL-1β為實驗終濃度，并獲得有效建模結果。
早期抗炎干預可能是治療OA的關鍵。研究表明綠茶能抑制小鼠OA進展[23]，并能抑制人類軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的降解[7]。既往研究表明，100 μmol/L EGCG能夠有效抑制人胚胎腎細胞[19]、大鼠脂肪肝細胞[17]等細胞的衰老。結合本研究不同濃度培養后細胞活性檢測結果，最終選擇100 μmol/L EGCG作為后續實驗藥物溶度。
研究表明，程序性細胞死亡可分為Ⅰ型細胞凋亡、Ⅱ型細胞自噬死亡。OA的繼發性改變往往伴隨著凋亡和自噬等一系列生化反應過程。凋亡途徑主要有線粒體途徑和死亡受體途徑。研究表明，線粒體是細胞凋亡的調控中心[24]。在缺血、缺氧、氧化應激、機械損傷等凋亡信號刺激下，線粒體膜電位是第1個出現變化的細胞部位，主要是線粒體膜電位下降。之后Bcl-2和Bax在線粒體膜上聚集形成同源二聚體，誘導線粒體通透性轉換孔開放，釋放線粒體內細胞色素C、凋亡誘導因子和活性氧等固有凋亡細胞因子到細胞質中[25-26]。
自噬與凋亡不同，是另一種程序性細胞死亡，被認為是身體對外界刺激的一種自我保護機制。自噬不僅能隔離受損細胞器，使其免受更嚴重的損傷，還能隔離運送到溶酶體降解的物質，維持機體代謝[27]。既往研究表明，LC3是使用最廣泛的細胞自噬標記物，與自噬小體的形成有關[28]。Beclin-1則通過復合體形式積聚其他自噬相關蛋白，在自噬早期的形成過程中發揮著重要作用[28]。本研究采用IL-1β建立軟骨細胞衰老模型，分析EGCG對軟骨細胞的抗衰老作用，并采用Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin-1和LC3的變化。結果顯示EGCG與軟骨細胞共培養后LC3和Beclin-1水平上升，表明自噬水平逐漸升高。
自噬具有復雜的調控機制，涉及多種信號途徑，包括mTOR依賴和mTOR獨立途徑[29-30]。mTOR是雷帕霉素在哺乳類動物細胞中的分子靶點，是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR蛋白有mTORC1和mTORC2兩種存在形式。雷帕霉素通過激活mTORC2中Thr308磷酸化位點及下游PDK1和Ser473的活化，特異性抑制AKT及其下游活性。PI3K通過AKT活化參與細胞新陳代謝、增殖、分化和遷移等過程[31-32]。3-MA是自噬體形成抑制劑[33]，可通過抑制Ⅲ型PI3K，進而抑制自噬體形成。大量研究表明，5 mmol/L 3-MA能有效抑制自噬體形成，而對細胞活性不會產生影響[33-35]。故本研究采用5 mmol/L 3-MA抑制自噬體形成來研究自噬在EGCG抑制軟骨細胞衰老中的作用。既往研究通常采用MDC染色對自噬進行量化觀察[28, 36]，故本研究參照上述研究選擇該染色法進行自噬觀察。近年來，眾多研究表明PI3K/AKT/mTOR通路調控自噬[33, 37]，然而軟骨細胞衰老和自噬之間的關系仍不確定。本研究結果表明，EGCG與IL-1β共培養后抑制細胞PI3K/AKT/mTOR通路，提高細胞自噬水平。
綜上述，在EGCG與IL-1β共培養軟骨細胞后，PI3K可激活下游信號分子mTOR并誘導自噬，進一步抑制軟骨細胞衰老；而添加3-MA會降低細胞自噬水平，提高軟骨細胞衰老比例。這一發現提示，EGCG可以通過激活自噬抑制軟骨細胞衰老。但本研究尚有一定局限性，在驗證環節對PI3K/AKT/mTOR通路進行了蛋白表達的研究，并結合有關PI3K/AKT/mTOR通路調控自噬的文獻[33, 37]論證軟骨細胞衰老和自噬之間的關系，但尚未進行PI3K/AKT/mTOR通路的mRNA表達量的檢測，有待下一步研究完善。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學研究倫理委員會批準［研臨審（2021）第（021）號］；實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）-2021-0004
作者貢獻聲明 羅超：研究設計及文章修改；周衛軍：研究實施；張鵠瑩：數據收集整理及統計分析；朱金威：文章撰寫；陳路：指導實驗；顧玉榮：經費支持及研究構思
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是老年人最常見的肌肉骨骼疾病，也是導致關節疼痛和殘疾的主要原因，目前尚無有效防治方式[1]。研究發現OA患者關節滑液中IL-1、IL-6等細胞因子水平明顯升高，這些細胞因子能上調基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）和MMP-13的表達[2]，而MMP可以降解軟骨中蛋白多糖、膠原蛋白和纖連蛋白，導致軟骨細胞外基質減少。軟骨細胞外基質丟失是OA早期一個關鍵的特征，提示軟骨細胞和滑膜關節其他細胞衰老是OA發病的驅動因素。
表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中主要生物活性物質，具有強大抗炎、抗氧化作用[3]，在抗衰老和癌癥治療等領域都具有重要作用[4]。體內實驗表明，EGCG可通過抑制TNF-α和MMP-13活性，降低人OA軟骨細胞的晚期糖基化終產物生成[5]。體外研究表明，EGCG能夠降低MMP-1和MMP-13表達水平[6]。另外，綠茶中的兒茶酚類物質能夠抑制人軟骨中蛋白多糖和Ⅱ型膠原退變[7]。這些研究均顯示EGCG具有軟骨保護作用，但目前國內外有關EGCG對OA的作用及其作用機制的報道較少。
哺乳動物細胞自噬是通過溶酶體降解和移除蛋白質、核糖體、脂滴及其他細胞器等衰老和無用的細胞分子，維持細胞穩態[8-12]。研究表明，姜黃素[13]和異黃酮[14]等生物活性多酚可以促進軟骨細胞自噬發生。適當濃度的EGCG能夠誘導細胞自噬，發揮抗炎[15]、降解內皮細胞脂滴[16-17]和促進內毒素降解[18]等作用。另有研究顯示，EGCG能夠促進人胚胎腎細胞自噬，從而延緩凋亡介導的細胞死亡，最終延緩細胞衰老[19]。然而，細胞自噬在衰老軟骨細胞損傷中扮演的角色尚不明確。本研究以SD大鼠軟骨細胞退變模型為研究對象，探究EGCG能否通過促進軟骨細胞自噬來抑制其衰老以及相關作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡SPF級SD大鼠12只，雌性6只、雄性6只，體質量180～220 g，平均211.0 g；購自江西中醫藥大學。
EGCG（上海源葉生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、β-半乳糖苷酶染色試劑盒、細胞自噬染色檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma-Aldrich公司，美國）；DMEM/F12細胞培養液、PBS緩沖液（HyClone公司，美國）；重組鼠IL-1β（Peprotech公司，美國）；總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；Eastep Super總RNA提取試劑盒、Go Script逆轉錄試劑盒、Go Taq qPCR Master Mix（Promega公司，美國）；兔抗Beclin-1抗體、兔抗LC3抗體、兔抗MMP-3抗體、小鼠抗MMP-13抗體（Novus公司，美國）；小鼠抗GAPDH抗體、兔抗Ⅱ型膠原抗體（Abcam公司，美國）； mTOR（南京巴傲得生物科技有限公司）；兔抗大鼠P16抗體，山羊抗兔、抗鼠二抗（Proteintech公司，美國）；兔抗鼠AKT抗體（Santa Cruz公司，美國）。
25 cm2塑料培養瓶、6孔板、96孔板（Corning公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；化學發光成像分析系統、CO2恒溫培養箱（Eppendorf公司，德國）；酶標儀Model680（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 軟骨細胞分離、培養及鑒定
1.2.1 軟骨細胞分離及培養
將12只SD大鼠以頸椎脫臼法處死后，置于75%乙醇浸泡30 min，無菌條件下分離股骨頸、股骨髁和脛骨平臺，取關節軟骨并切碎；胰蛋白酶與Ⅱ型膠原酶分步依次消化后，收集細胞接種至含15%FBS的DMEM/F12培養基中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養，之后每2～3天更換培養基，待細胞貼壁生長達80%以上，使用胰蛋白酶消化細胞，按1∶2比例傳代。取第2代細胞進行后續實驗。
1.2.2 軟骨細胞鑒定
取第2代細胞調整濃度為1×105個/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h，分別行甲苯胺藍染色、阿利新藍染色及Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。
1.3 EGCG最佳藥物濃度測定
實驗分為8組，分別為空白對照組、10 ng/mL IL-1β培養組以及6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組。取第2代細胞，以5×103個/孔密度接種于96孔板，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，空白對照組加入10 μL 完全培養基，其余實驗組按照分組分別加入10 ng/mL IL-1β以及各濃度EGCG，每孔 10 μL。繼續培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值，實驗重復3次。根據細胞生長曲線，結合文獻 ［17，19］ 選擇在較低濃度下能發揮較大促細胞生長作用濃度進行后續實驗。
1.4 實驗分組及方法
實驗分為4組，空白對照組（A組）、10 ng/mL IL-1β培養組（B組）、EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組（C組）、EGCG+10 ng/mL IL-1β+5 mmol/L 3-MA組（D組）。取第2代細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL后接種于6孔板，每孔1 mL，每組設3個復孔。按照分組給予對應培養液培養后進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞衰老檢測
取各組培養24 h細胞，按照β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行染色，光鏡下見細胞呈藍色為陽性染色，Image J軟件測算各組陽性細胞數并計算衰老率，以評價軟骨細胞的衰老情況。
1.5.2 細胞自噬檢測
取各組培養24 h細胞，參照細胞自噬染色檢測試劑盒采用單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverine，MDC）法染色，熒光顯微鏡下細胞質內出現點狀熒光分布視為陽性染色，計數并拍照，采用Image J軟件計算熒光強度，反映軟骨細胞自噬活躍度。
1.5.3 實時熒光定量PCR檢測
取各組培養24 h細胞，按Eastep Super總RNA提取試劑盒、Go Script 逆轉錄試劑盒說明書提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，按Go Taq qPCR Master Mix說明書配置20 μL反應體系進行PCR擴增。以 GAPDH 為內參，使用2–ΔΔCt方法計算目的基因（Ⅱ型膠原、MMP-3、MMP-13）相對表達量。引物序列見表1。
表1
引物序列和產物長度（5′→3′）
Table1.
Primer sequences and product length (5′→3′)
1.5.4 Western blot檢測
取各組培養48 h細胞，按總蛋白提取試劑盒說明書提取細胞總蛋白，并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，依次進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉，孵育一抗（各抗體稀釋比例為Beclin-1 1∶2 000，LC3 1∶2 000、MMP-3 1∶1 000、MMP-13 1∶4 000、GAPDH 1∶5 000、Ⅱ型膠原 1∶2 000、P16 1∶2 000、mTOR 1∶1 000、AKT 1∶2 000）和二抗（1∶5 000），采用化學發光成像分析系統觀察分析條帶。內參為GAPDH，計算目的蛋白相對表達量。其中，LC3蛋白相對表達量以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表示。
1.6 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態觀察及鑒定
第2代細胞呈三角形或多角形貼壁生長，胞核清晰，胞質豐富。甲苯胺藍染色見細胞質呈藍色，細胞核呈深藍色；阿利新藍染色見細胞質呈淡藍色；Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色見細胞質呈棕黃色，細胞核呈深棕色。3種染色均呈陽性，鑒定分離培養細胞為軟骨細胞。見圖1。
圖1
第2代軟骨細胞形態觀察及鑒定（×100）
a. 倒置相差顯微鏡下細胞形態；b. 甲苯胺藍染色；c. 阿利新藍染色；d. Ⅱ型膠原蛋白免疫細胞化學染色
Figure1. Morphological observation and identification of P2 chondrocytes (×100)a. Cell morphology under inverted contrast microscopy; b. Toluidine blue staining; c. Alcian blue staining; d. Immunocytochemical staining for type Ⅱ collagen
2.2 EGCG最佳藥物濃度測定
與空白對照組相比，10 ng/mL IL-1β培養組細胞活力降低，A值差異有統計學意義（P<0.05）。與10 ng/mL IL-1β培養組相比，各濃度EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組細胞活性均上升；其中50.0、100.0、200.0 μmol/L EGCG+10 ng/mL IL-1β共培養組與10 ng/mL IL-1β培養組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結合本組細胞生長情況以及既往文獻報道，EGCG 達到100.0 μmol/L以后細胞活性無明顯變化，最終選擇該濃度EGCG進行后續實驗。見圖2。
圖2
各組細胞A值
*
*
2.3 細胞衰老檢測
β-半乳糖苷酶染色示A組未見明顯染色反應，細胞衰老率為15.76%±5.59%；B組可見大量細胞呈深藍色，細胞衰老率為83.84%±6.55%；C組可見少量染色細胞，細胞衰老率為36.41%±4.50%；D組可見較多細胞呈深藍色，細胞衰老率為69.69%±3.24%。B、C、D組細胞衰老率均高于A組，B、D組高于C組，B組高于D組，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。 見圖3。
圖3
各組β-半乳糖苷酶染色觀察（×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure3. β-galactosidase staining in each group (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.4 細胞自噬檢測
細胞自噬染色顯示A組細胞自噬較活躍（34.35±4.08），B組細胞自噬（12.45±3.17）與A組相比明顯減少，C組細胞自噬（46.64±3.67）較B組增強，D組細胞自噬（22.13±3.16）較C組明顯減弱；組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
各組MDC法染色觀察（熒光顯微鏡×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure4. MDC method staining in each group (Fluorescence microscopy×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.5 實時熒光定量PCR檢測
與A組相比，B組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量下調，MMP-3、MMP-13上調。與B組相比，C組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量上調，MMP-3和MMP-13下調；與C組相比，D組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量下調，MMP-3、MMP-13上調。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
各組軟骨細胞衰老相關基因表達
*
*
2.6 Western blot檢測
與A組相比，B組P16蛋白相對表達量增加；與B組相比，C組P16蛋白相對表達量降低；與C組相比，D組蛋白相對表達量增加。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
與A組相比，B組Ⅱ型膠原、LC3、Beclin-1蛋白相對表達量下降，MMP-3、MMP-13、mTOR及AKT蛋白相對表達量均上調；與B組相比，C組Ⅱ型膠原、LC3、Beclin-1蛋白相對表達量上調，MMP-3、MMP-13、mTOR及AKT蛋白相對表達量均下降；與C組相比，D組上述指標均呈相反變化趨勢。上述組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
Western blot檢測各組軟骨細胞相關蛋白表達
a. 電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組； b. 目的蛋白相對表達量
Figure6. Expressions of the chondrocytes related proteins in each group detected by Western blota. Electrophoresis 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D; b. Relative expressions of target proteins
3 討論
衰老是生物體必然經歷的一種自然過程，與眾多疾病的發病機制相關，OA也被認為是一種衰老情況。一種較為公認的學說是關節軟骨遭受過多的機械負荷或氧化應激等因素導致退變，最終引發OA[20]。目前，通常采用在軟骨細胞中加入特殊誘導藥物（IL-1β等）共培養方法體外構建軟骨細胞衰老模型。既往研究使用10 ng/mL IL-1β培養基成功建立OA細胞模型[21-22]，本研究預實驗濃度篩選結果與上述文獻結果一致，故采用10 ng/mL IL-1β為實驗終濃度，并獲得有效建模結果。
早期抗炎干預可能是治療OA的關鍵。研究表明綠茶能抑制小鼠OA進展[23]，并能抑制人類軟骨蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的降解[7]。既往研究表明，100 μmol/L EGCG能夠有效抑制人胚胎腎細胞[19]、大鼠脂肪肝細胞[17]等細胞的衰老。結合本研究不同濃度培養后細胞活性檢測結果，最終選擇100 μmol/L EGCG作為后續實驗藥物溶度。
研究表明，程序性細胞死亡可分為Ⅰ型細胞凋亡、Ⅱ型細胞自噬死亡。OA的繼發性改變往往伴隨著凋亡和自噬等一系列生化反應過程。凋亡途徑主要有線粒體途徑和死亡受體途徑。研究表明，線粒體是細胞凋亡的調控中心[24]。在缺血、缺氧、氧化應激、機械損傷等凋亡信號刺激下，線粒體膜電位是第1個出現變化的細胞部位，主要是線粒體膜電位下降。之后Bcl-2和Bax在線粒體膜上聚集形成同源二聚體，誘導線粒體通透性轉換孔開放，釋放線粒體內細胞色素C、凋亡誘導因子和活性氧等固有凋亡細胞因子到細胞質中[25-26]。
自噬與凋亡不同，是另一種程序性細胞死亡，被認為是身體對外界刺激的一種自我保護機制。自噬不僅能隔離受損細胞器，使其免受更嚴重的損傷，還能隔離運送到溶酶體降解的物質，維持機體代謝[27]。既往研究表明，LC3是使用最廣泛的細胞自噬標記物，與自噬小體的形成有關[28]。Beclin-1則通過復合體形式積聚其他自噬相關蛋白，在自噬早期的形成過程中發揮著重要作用[28]。本研究采用IL-1β建立軟骨細胞衰老模型，分析EGCG對軟骨細胞的抗衰老作用，并采用Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin-1和LC3的變化。結果顯示EGCG與軟骨細胞共培養后LC3和Beclin-1水平上升，表明自噬水平逐漸升高。
自噬具有復雜的調控機制，涉及多種信號途徑，包括mTOR依賴和mTOR獨立途徑[29-30]。mTOR是雷帕霉素在哺乳類動物細胞中的分子靶點，是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR蛋白有mTORC1和mTORC2兩種存在形式。雷帕霉素通過激活mTORC2中Thr308磷酸化位點及下游PDK1和Ser473的活化，特異性抑制AKT及其下游活性。PI3K通過AKT活化參與細胞新陳代謝、增殖、分化和遷移等過程[31-32]。3-MA是自噬體形成抑制劑[33]，可通過抑制Ⅲ型PI3K，進而抑制自噬體形成。大量研究表明，5 mmol/L 3-MA能有效抑制自噬體形成，而對細胞活性不會產生影響[33-35]。故本研究采用5 mmol/L 3-MA抑制自噬體形成來研究自噬在EGCG抑制軟骨細胞衰老中的作用。既往研究通常采用MDC染色對自噬進行量化觀察[28, 36]，故本研究參照上述研究選擇該染色法進行自噬觀察。近年來，眾多研究表明PI3K/AKT/mTOR通路調控自噬[33, 37]，然而軟骨細胞衰老和自噬之間的關系仍不確定。本研究結果表明，EGCG與IL-1β共培養后抑制細胞PI3K/AKT/mTOR通路，提高細胞自噬水平。
綜上述，在EGCG與IL-1β共培養軟骨細胞后，PI3K可激活下游信號分子mTOR并誘導自噬，進一步抑制軟骨細胞衰老；而添加3-MA會降低細胞自噬水平，提高軟骨細胞衰老比例。這一發現提示，EGCG可以通過激活自噬抑制軟骨細胞衰老。但本研究尚有一定局限性，在驗證環節對PI3K/AKT/mTOR通路進行了蛋白表達的研究，并結合有關PI3K/AKT/mTOR通路調控自噬的文獻[33, 37]論證軟骨細胞衰老和自噬之間的關系，但尚未進行PI3K/AKT/mTOR通路的mRNA表達量的檢測，有待下一步研究完善。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經南昌大學第二附屬醫院醫學研究倫理委員會批準［研臨審（2021）第（021）號］；實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）-2021-0004
作者貢獻聲明 羅超：研究設計及文章修改；周衛軍：研究實施；張鵠瑩：數據收集整理及統計分析；朱金威：文章撰寫；陳路：指導實驗；顧玉榮：經費支持及研究構思
