引用本文： 蔣文凱, 周志, 劉合棟, 任茂賢, 楊民. 丙戊酸鈉對羰基氰化物間氯苯腙誘導的成骨細胞氧化應激損傷的保護作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(3): 316-323. doi: 10.7507/1002-1892.202210030 復制
骨質疏松及相關疾病已成為世界范圍內最常見的骨骼疾病，發病人數顯著增加，危害嚴重[1]。研究表明，氧化應激在骨質疏松發生、發展過程中占有重要地位[2-3]。生物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由線粒體產生，當機體降解ROS能力下降時，就會發生氧化應激反應。過量的ROS會破壞成骨細胞功能，導致成骨細胞皺縮凋亡[4]，同時還會激活更多破骨細胞，破壞骨重建平衡，從而引起骨密度降低。此外，ROS增加可導致線粒體膜電位降低，線粒體氧化磷酸化解偶聯功能受到影響，引起細胞凋亡[5]。因此，減少氧化應激損傷對于保護成骨細胞和預防骨質疏松的發生具有重要意義[6]。
丙戊酸鈉（sodium valproic acid，VPA）是一種中長鏈脂肪酸鹽，其有效成分丙戊酸可從纈草中提取，在常溫下是一種無色液體。臨床采用VPA治療癲癇和預防偏頭痛療效顯著，口服生物利用度達80%；同時其作為一種細胞色素酶P450的抑制劑，對肝臟影響極小[7]。研究表明，VPA作為組蛋白去乙酰酶抑制劑效應明顯，能通過與組蛋白去乙酰酶催化中心結合發揮特異的抑制作用，刺激細胞凋亡，抑制某些癌細胞增殖，具有抗氧化功能[8]。
已有研究表明，低濃度VPA通過調節組蛋白乙酰化影響下游相關功能蛋白表達，通過蛋白的相互作用促進成骨細胞分化和成熟[9-14]。另外有證據顯示創傷性腦損傷后發生氧化應激反應，應用VPA會使細胞內核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）蛋白表達明顯升高[14-15]。目前臨床對于VPA藥效的研究和應用主要集中于癲癇治療，其是否參與成骨細胞的抗氧化應激及其作用機制尚未明確。 結合既往研究報道，我們分析VPA可能通過組蛋白乙酰化激活Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/Nrf2/抗氧化反應元件（antioxidant response element，Are）信號通路來抑制氧化應激，進而減少成骨細胞凋亡。據此，本研究使用羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）體外誘導構建成骨細胞氧化應激模型，探討VPA對成骨細胞氧化應激損傷的作用及其機制，以期為抗骨質疏松藥物治療尋找一種新靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生SD大鼠10只，雌雄各半，體質量（8±1）g，由皖南醫學院SPF動物房提供，動物實驗全程在該動物房進行。
DMEM完全培養基、FBS、青-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒、茜素紅檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探針（上海碧云天生物技術有限公司）；VPA（上海麥克林生化科技股份有限公司）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、0.2%茜素紅、十六烷基吡啶（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；抗體Nrf2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Bcl2、Bax、BMP-2、RUNX2、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）、β-actin（Affinity公司，美國）；Nrf2抑制劑ML385（MCE公司，美國）。
Image J軟件（National Institutes of Health，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CO2培養箱、離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；?80℃冰箱（青島海爾集團）。
1.2 實驗方法
1.2.1 成骨細胞分離、培養及鑒定
取10只SD大鼠脫臼處死后，置于75%乙醇中浸泡30 min，移入無菌操作臺；分離顱骨并置于3 cm玻璃培養皿中，刮去骨塊表面纖維結締組織至無明顯殘留，用含青-鏈霉素雙抗的PBS沖洗，直至骨塊發白，沖洗液清澈。將骨塊剪成1 mm×1 mm大小，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶消化10 min，棄胰蛋白酶；加入5 mL 0.5%Ⅰ型膠原酶震蕩消化30 min，吸除消化液；再次加入5 mL 0.5%Ⅰ型膠原酶，置于37℃恒溫下消化90 min；等量含血清的DMEM培養基終止消化，沉淀物用無菌篩網過濾，將碎骨倒置培養，4 h后翻轉培養瓶繼續培養。細胞爬出骨片后采用差速貼壁法純化成骨細胞，取第1代細胞用流式細胞儀檢測細胞純度。鑒定細胞純度達實驗要求，待細胞鋪滿培養瓶底70%～80%后，以1∶2或1∶3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
取第1代細胞經成骨誘導培養基（含1×10?7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C的DMEM完全培養基）培養7、21 d后，按照試劑盒說明書分別進行ALP和茜素紅染色觀察，鑒定培養細胞是否為成骨細胞[16]。
1.2.2 CCCP及VPA最適作用濃度及時間篩選
取第3代成骨細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后更換成含2、6、10、14、18 μmol/L CCCP的培養基，分別繼續培養2、6、10、14、18 min，培養結束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在培養箱中繼續孵育2 h。使用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞成活率，細胞成活率= ［ (A–Ab) / (Ac–Ab)］×100%。其中，A：實驗孔A值（含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物）；Ac：對照孔A值（含細胞、培養基、CCK-8 溶液，不含藥物）；Ab：空白孔A值（含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物）。根據半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）原理，選擇CCCP最適作用濃度及時間建立成骨細胞氧化應激模型，進行下一步實驗。
取第3代成骨細胞消化離心重懸計數后，以5×104個/孔接種于96孔板，加入預混梯度濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/mL的VPA基礎培養基，分別培養12、24、48、72 h后，采用CCK-8法同上法檢測細胞活性，評價VPA對成骨細胞增殖的影響，選擇細胞成活率最高的對應濃度及培養時間進行下一步實驗。
1.2.3 實驗分組及觀測
① 實驗分組及方法：取第3代成骨細胞按1×106個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁分為4組：包括空白對照組（正常培養細胞）、CCCP組（參照選擇的濃度及培養時間行CCCP處理）、VPA+CCCP組（參照選擇的濃度以及培養時間行VPA預處理+CCCP處理）、VPA+CCCP+ML385組（VPA預處理前用10 μmol/L Nrf抑制劑ML385預處理2 h，其余處理方法同VPA+CCCP組）。
② 氧化應激指標檢測：各組處理結束后收集細胞，用裂解液裂解細胞，按照SOD、MDA檢測試劑盒說明書操作，測定細胞中SOD活性及MDA含量；按照ROS檢測試劑盒說明書將細胞在預混DCFH-DA探針的培養基中孵育，熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件測量熒光強度。實驗重復3次。
③ 細胞凋亡檢測：各組處理結束后收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。
④ ALP染色觀測：各組經不同方案處理后，更換為普通培養基在CO2培養箱中繼續培養7 d后行ALP染色，用酶標儀測定570 nm處A值，表示細胞ALP活性。實驗重復3次。
⑤ 茜素紅染色觀測：各組經不同方案處理后，加入成骨誘導培養基培養21 d后行茜素紅染色，用十六烷基吡啶溶解鈣結節，用酶標儀測定570 nm處A值，表示鈣離子含量。實驗重復3次。
⑥ Western blot檢測：各組處理結束后將細胞置于冰上，預冷PBS沖洗3遍后使用RIPA裂解液充分裂解15 min，然后將細胞收集于1.5 mL離心管中，4℃以離心半徑10 cm、15 000 r/min離心30 min。將上清液轉移至新的1.5 mL離心管中得到總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并計算30 μg蛋白所需上樣量。按照1∶4比例將5×蛋白上樣緩沖液加入蛋白樣本中，煮沸12 min使蛋白變性。配制適用濃度SDS-PAGE凝膠用于電泳，然后轉膜。轉膜結束后，將聚偏二氟乙烯膜用5%牛血清白蛋白封閉2 h，置于含有Nrf2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、BMP-2（1∶1 000）、RUNX2（1∶1 000）、β-actin（1∶500）的抗體盒中，4℃搖床孵育過夜；將膜用TBST清洗干凈后，放入對應二抗中孵育2 h。孵育完成后用TBST清洗干凈，然后使用ECL發光液進行顯影，使用Image J軟件測定灰度值。以β-actin作為內參，計算目標蛋白相對表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察與鑒定
骨塊貼壁3 d后，倒置相差顯微鏡下可見骨塊蓬松，細胞開始有序地以鋪路石樣從骨塊邊緣爬出，呈飽滿長梭形；7 d后細胞鋪滿整個培養瓶底；傳代后細胞呈長梭形。流式細胞儀檢測細胞純度達 95% 左右。第1代成骨細胞經成骨誘導培養7 d后，ALP染色示細胞呈藍紫色；培養21 d后，茜素紅染色見數量不一、大小不等的橘紅色鈣結節。經鑒定分離培養的細胞為成骨細胞。見圖1。
圖1
成骨細胞形態觀察及鑒定
a. 貼壁3 d倒置相差顯微鏡下見細胞從骨片周圍爬出（×100）； b. 流式細胞儀鑒定成骨細胞純度；c. 第1代成骨細胞成骨誘導培養7 d ALP染色（×40）；d. 第1代成骨細胞成骨誘導培養21 d 茜素紅染色（×100）
Figure1. Morphological observation and identification of osteoblastsa. The cells from the bone sheet under an inverted contrast microscopy after 3 days of adherence (×100); b. The purity of osteoblasts was determined by flow cytometry; c. ALP staining of the 1st generation osteoblasts after 7 days of osteoinduction culture (×40); d. Alizarin red staining of the 1st generation osteoblasts after 21 days of osteoinduction culture (×100)
2.2 CCCP及VPA最適作用濃度和時間篩選
CCK-8法檢測示，隨著CCCP濃度升高和作用時間延長，成骨細胞活性逐漸下降，其中10 μmol/L濃度下作用10 min細胞成活率為54%，根據IC50原理，采用此濃度與時間建立成骨細胞氧化應激模型。隨VPA濃度增加及培養時間延長，成骨細胞成活率逐漸提高，至0.8 mmol/mL濃度、培養24 h時達峰值，之后隨濃度增加細胞成活率逐漸降低，差異有統計學意義（P<0.05）。最終選擇0.8 mmol/mLVPA及培養24 h進行下一步實驗。見圖2。
圖2
CCK-8法檢測不同濃度VPA及CCCP處理后成骨細胞成活率
a. CCCP；b. VPA
Figure2. The survival rate of osteoblasts after treated with different concentrations of VPA and CCCP detected by CCK-8a. CCCP; b. VPA
2.3 氧化應激指標檢測
與空白對照組比較，CCCP組細胞綠色熒光顯著增強，ROS、MDA含量升高，SOD活性降低。與CCCP組相比，VPA+CCCP組成骨細胞氧化應激損傷減小，ROS、MDA含量降低，SOD活性升高。與VPA+CCCP組相比，VPA+CCCP+ML385組中ML385能逆轉VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用，上述檢測指標均呈相反變化趨勢。上述指標組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
各組細胞氧化應激指標檢測
a. ROS熒光強度觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組；b. ROS熒光強度半定量分析 *
a. ROS fluorescence intensity determination (Fluorescence microscopy×200) From left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively; b. Semi-quantitative analysis of ROS fluorescence intensity *
2.4 細胞凋亡檢測
流式細胞術檢測示，空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組細胞凋亡率分別為8%±1%、30%±2%、12%±2%、24%±2%，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
流式細胞術檢測各組細胞凋亡
從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組
Figure4. Cell apoptosis in each group detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively
2.5 ALP及茜素紅染色觀測
鏡下見ALP染色均為陽性，空白對照組染色最深，其次為VPA+CCCP組、 VPA+CCCP+ML385組，CCCP組最淺。空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組A值分別為0.725±0.025、0.235±0.015、0.647±0.025、0.315±0.015，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5a。
圖5
各組ALP及茜素紅染色觀察（×100）
從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組 a. ALP染色；b. 茜素紅染色
Figure5. ALP and alizarin red staining in each group (×100)From left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively a. ALP staining; b. Alizarin red staining
茜素紅染色示均為陽性，其中空白對照組鈣結節最多，其次為VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組，CCCP組最少。空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組A值分別為0.856±0.015、0.187±0.020、0.643±0.023、0.403±0.015，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5b。
2.6 Western blot檢測
與空白對照組比較，CCCP組成骨相關蛋白BMP-2、RUNX2及抗凋亡家族蛋白Bcl2相對表達量均降低，凋亡核心蛋白Cleaved-Caspase-3、Bax以及通道蛋白Nrf2相對表達量均上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與CCCP組相比，VPA+CCCP組細胞經VPA處理后，BMP-2、RUNX2、Bcl2及Nrf2相對表達量上調，Cleaved-Caspase-3及Bax相對表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與VPA+CCCP組相比，VPA+CCCP+ML385組細胞經Nrf2抑制劑ML385處理后，VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用被逆轉，上述檢測指標均呈相反變化趨勢，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
Western blot檢測
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：CCCP組 3：VPA+CCCP組 4：VPA+CCCP+ML385組；b～g. 目的蛋白相對表達量 *
a. Electrophoretic image Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: CCCP group 3: VPA+CCCP group 4: VPA+CCCP+ML385 group; b-g. The relative expressions of target proteins *
3 討論
健康的骨骼系統由成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收的平衡來維持，當成骨細胞骨形成作用不足以彌補破骨細胞骨吸收時，會導致骨質流失而發展為骨質疏松[17]。ROS的主要成分是H2O2、O2–和-OH，本研究采用的CCCP誘導制備模型方法，根據其作用機制能穩定產生O2–和-OH和少量H2O2[18]，更貼近絕經后女性體內內源性氧化應激發生機制[19]。過量產生ROS將激活氧化應激并破壞脂質、核酸、蛋白質等生物大分子，引起脂質過氧化[20-21]。脂質過氧化產物可以通過調節NF-κB通路、MAPKs通路、PKC通路來誘導細胞發生凋亡[20, 22]，也是鐵死亡的誘發機制；同時ROS的大量產生將消耗細胞內過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、SOD等抗氧化物質，引起抗氧化酶活性降低。本研究結果顯示，成骨細胞經CCCP處理后ROS、MDA含量增加，SOD活性降低，成骨細胞凋亡增加，表明CCCP處理成功誘導了成骨細胞的氧化應激損傷，模型制備成功。
VPA作為一種可能通過與組蛋白去乙酰酶催化中心結合發揮特異抑制作用的脂肪酸鹽，拮抗氧化應激是其重要作用[4]。Li等[23]的研究證實長期大劑量服用VPA會降低骨量，但小劑量服用可能通過調節組蛋白乙酰化作用影響下游功能蛋白的表達，從而促進成骨細胞的分化和成熟。另有研究顯示，在中樞神經系統疾病模型中應用VPA后細胞Nrf2蛋白含量明顯升高[24]。基于此，我們分析VPA可能是通過促進組蛋白乙酰化調節下游Keap1/Nrf2/Are通路來減少氧化應激導致的成骨細胞凋亡。
Keap1/Nrf2/Are通路是細胞內重要的內源性抗氧化防御機制之一，與氧化應激發生、發展密切相關。在氧化應激條件下，該信號通路被激活并且啟動下游相關細胞保護性基因的表達，同時Nrf2蛋白從細胞質解離轉移到細胞核，與核內Are轉錄因子結合后可誘導血紅素加氧酶1等保護性基因的轉錄，進而保護細胞和組織免受氧化應激帶來的損傷[24]。而且Nrf2在自噬[25]、細胞凋亡、炎癥相關疾病中也有重要作用。近年研究表明，Keap1/Nrf2/Are通路與骨相關疾病的發生、發展密切相關。本研究中VPA上調Nrf2的表達，同時SOD活性增強，ROS、MDA含量降低，Bcl2表達升高而Bax表達降低，成骨細胞ALP活性增強，礦化能力升高，BMP-2、RUNX2表達增多；而Nrf2抑制劑ML385能夠抑制VPA的上述作用。本研究結果提示，VPA能通過促進組蛋白乙酰化調節Keap1/NRF2/Are通路，降低CCCP誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨。結合上述文獻報道以及本次研究結果分析，組蛋白乙酰化可能在拮抗氧化應激降低氧自由基的過程中發揮重要作用，這為我們藥物研發開辟了新思路。
綜上述，VPA可能通過調節Keap1/Nrf2/Are通路來抑制CCCP誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨。但是本實驗未研究VPA的抗炎作用和自噬保護作用是否參與抗骨質疏松，Nrf2通路激活過程中對于鐵死亡是否產生重要作用，對于破骨細胞的影響也未能證實。同時，需進一步通過體內實驗來驗證VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用，并驗證其作用機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經皖南醫學院弋磯山醫院科研與新技術倫理委員會批準［（2021）倫審國研第（71）］；實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004
作者貢獻聲明 蔣文凱：實驗實施、數據收集、圖片處理及撰稿；周志、劉合棟、任茂賢：部分實驗數據收集；楊民：實驗經費、實驗思路、文章構架及校稿
骨質疏松及相關疾病已成為世界范圍內最常見的骨骼疾病，發病人數顯著增加，危害嚴重[1]。研究表明，氧化應激在骨質疏松發生、發展過程中占有重要地位[2-3]。生物體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要由線粒體產生，當機體降解ROS能力下降時，就會發生氧化應激反應。過量的ROS會破壞成骨細胞功能，導致成骨細胞皺縮凋亡[4]，同時還會激活更多破骨細胞，破壞骨重建平衡，從而引起骨密度降低。此外，ROS增加可導致線粒體膜電位降低，線粒體氧化磷酸化解偶聯功能受到影響，引起細胞凋亡[5]。因此，減少氧化應激損傷對于保護成骨細胞和預防骨質疏松的發生具有重要意義[6]。
丙戊酸鈉（sodium valproic acid，VPA）是一種中長鏈脂肪酸鹽，其有效成分丙戊酸可從纈草中提取，在常溫下是一種無色液體。臨床采用VPA治療癲癇和預防偏頭痛療效顯著，口服生物利用度達80%；同時其作為一種細胞色素酶P450的抑制劑，對肝臟影響極小[7]。研究表明，VPA作為組蛋白去乙酰酶抑制劑效應明顯，能通過與組蛋白去乙酰酶催化中心結合發揮特異的抑制作用，刺激細胞凋亡，抑制某些癌細胞增殖，具有抗氧化功能[8]。
已有研究表明，低濃度VPA通過調節組蛋白乙酰化影響下游相關功能蛋白表達，通過蛋白的相互作用促進成骨細胞分化和成熟[9-14]。另外有證據顯示創傷性腦損傷后發生氧化應激反應，應用VPA會使細胞內核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）蛋白表達明顯升高[14-15]。目前臨床對于VPA藥效的研究和應用主要集中于癲癇治療，其是否參與成骨細胞的抗氧化應激及其作用機制尚未明確。 結合既往研究報道，我們分析VPA可能通過組蛋白乙酰化激活Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/Nrf2/抗氧化反應元件（antioxidant response element，Are）信號通路來抑制氧化應激，進而減少成骨細胞凋亡。據此，本研究使用羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP）體外誘導構建成骨細胞氧化應激模型，探討VPA對成骨細胞氧化應激損傷的作用及其機制，以期為抗骨質疏松藥物治療尋找一種新靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生SD大鼠10只，雌雄各半，體質量（8±1）g，由皖南醫學院SPF動物房提供，動物實驗全程在該動物房進行。
DMEM完全培養基、FBS、青-鏈霉素雙抗（GIBCO公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、BCIP/NBT堿性磷酸脂酶顯色試劑盒、茜素紅檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探針（上海碧云天生物技術有限公司）；VPA（上海麥克林生化科技股份有限公司）；地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、0.2%茜素紅、十六烷基吡啶（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物科技有限公司）；抗體Nrf2、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Bcl2、Bax、BMP-2、RUNX2、活化半胱氨酸蛋白酶3（Cleaved-Caspase-3）、β-actin（Affinity公司，美國）；Nrf2抑制劑ML385（MCE公司，美國）。
Image J軟件（National Institutes of Health，美國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CO2培養箱、離心機（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；?80℃冰箱（青島海爾集團）。
1.2 實驗方法
1.2.1 成骨細胞分離、培養及鑒定
取10只SD大鼠脫臼處死后，置于75%乙醇中浸泡30 min，移入無菌操作臺；分離顱骨并置于3 cm玻璃培養皿中，刮去骨塊表面纖維結締組織至無明顯殘留，用含青-鏈霉素雙抗的PBS沖洗，直至骨塊發白，沖洗液清澈。將骨塊剪成1 mm×1 mm大小，加入5 mL 0.25%胰蛋白酶消化10 min，棄胰蛋白酶；加入5 mL 0.5%Ⅰ型膠原酶震蕩消化30 min，吸除消化液；再次加入5 mL 0.5%Ⅰ型膠原酶，置于37℃恒溫下消化90 min；等量含血清的DMEM培養基終止消化，沉淀物用無菌篩網過濾，將碎骨倒置培養，4 h后翻轉培養瓶繼續培養。細胞爬出骨片后采用差速貼壁法純化成骨細胞，取第1代細胞用流式細胞儀檢測細胞純度。鑒定細胞純度達實驗要求，待細胞鋪滿培養瓶底70%～80%后，以1∶2或1∶3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
取第1代細胞經成骨誘導培養基（含1×10?7mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C的DMEM完全培養基）培養7、21 d后，按照試劑盒說明書分別進行ALP和茜素紅染色觀察，鑒定培養細胞是否為成骨細胞[16]。
1.2.2 CCCP及VPA最適作用濃度及時間篩選
取第3代成骨細胞按5×103個/孔接種于96孔板中，待細胞完全貼壁后更換成含2、6、10、14、18 μmol/L CCCP的培養基，分別繼續培養2、6、10、14、18 min，培養結束后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，在培養箱中繼續孵育2 h。使用酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞成活率，細胞成活率= ［ (A–Ab) / (Ac–Ab)］×100%。其中，A：實驗孔A值（含細胞、培養基、CCK-8 溶液和藥物）；Ac：對照孔A值（含細胞、培養基、CCK-8 溶液，不含藥物）；Ab：空白孔A值（含培養基、CCK-8 溶液，不含細胞、藥物）。根據半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）原理，選擇CCCP最適作用濃度及時間建立成骨細胞氧化應激模型，進行下一步實驗。
取第3代成骨細胞消化離心重懸計數后，以5×104個/孔接種于96孔板，加入預混梯度濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol/mL的VPA基礎培養基，分別培養12、24、48、72 h后，采用CCK-8法同上法檢測細胞活性，評價VPA對成骨細胞增殖的影響，選擇細胞成活率最高的對應濃度及培養時間進行下一步實驗。
1.2.3 實驗分組及觀測
① 實驗分組及方法：取第3代成骨細胞按1×106個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁分為4組：包括空白對照組（正常培養細胞）、CCCP組（參照選擇的濃度及培養時間行CCCP處理）、VPA+CCCP組（參照選擇的濃度以及培養時間行VPA預處理+CCCP處理）、VPA+CCCP+ML385組（VPA預處理前用10 μmol/L Nrf抑制劑ML385預處理2 h，其余處理方法同VPA+CCCP組）。
② 氧化應激指標檢測：各組處理結束后收集細胞，用裂解液裂解細胞，按照SOD、MDA檢測試劑盒說明書操作，測定細胞中SOD活性及MDA含量；按照ROS檢測試劑盒說明書將細胞在預混DCFH-DA探針的培養基中孵育，熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件測量熒光強度。實驗重復3次。
③ 細胞凋亡檢測：各組處理結束后收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。
④ ALP染色觀測：各組經不同方案處理后，更換為普通培養基在CO2培養箱中繼續培養7 d后行ALP染色，用酶標儀測定570 nm處A值，表示細胞ALP活性。實驗重復3次。
⑤ 茜素紅染色觀測：各組經不同方案處理后，加入成骨誘導培養基培養21 d后行茜素紅染色，用十六烷基吡啶溶解鈣結節，用酶標儀測定570 nm處A值，表示鈣離子含量。實驗重復3次。
⑥ Western blot檢測：各組處理結束后將細胞置于冰上，預冷PBS沖洗3遍后使用RIPA裂解液充分裂解15 min，然后將細胞收集于1.5 mL離心管中，4℃以離心半徑10 cm、15 000 r/min離心30 min。將上清液轉移至新的1.5 mL離心管中得到總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并計算30 μg蛋白所需上樣量。按照1∶4比例將5×蛋白上樣緩沖液加入蛋白樣本中，煮沸12 min使蛋白變性。配制適用濃度SDS-PAGE凝膠用于電泳，然后轉膜。轉膜結束后，將聚偏二氟乙烯膜用5%牛血清白蛋白封閉2 h，置于含有Nrf2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl2（1∶1 000）、Cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、BMP-2（1∶1 000）、RUNX2（1∶1 000）、β-actin（1∶500）的抗體盒中，4℃搖床孵育過夜；將膜用TBST清洗干凈后，放入對應二抗中孵育2 h。孵育完成后用TBST清洗干凈，然后使用ECL發光液進行顯影，使用Image J軟件測定灰度值。以β-actin作為內參，計算目標蛋白相對表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察與鑒定
骨塊貼壁3 d后，倒置相差顯微鏡下可見骨塊蓬松，細胞開始有序地以鋪路石樣從骨塊邊緣爬出，呈飽滿長梭形；7 d后細胞鋪滿整個培養瓶底；傳代后細胞呈長梭形。流式細胞儀檢測細胞純度達 95% 左右。第1代成骨細胞經成骨誘導培養7 d后，ALP染色示細胞呈藍紫色；培養21 d后，茜素紅染色見數量不一、大小不等的橘紅色鈣結節。經鑒定分離培養的細胞為成骨細胞。見圖1。
圖1
成骨細胞形態觀察及鑒定
a. 貼壁3 d倒置相差顯微鏡下見細胞從骨片周圍爬出（×100）； b. 流式細胞儀鑒定成骨細胞純度；c. 第1代成骨細胞成骨誘導培養7 d ALP染色（×40）；d. 第1代成骨細胞成骨誘導培養21 d 茜素紅染色（×100）
Figure1. Morphological observation and identification of osteoblastsa. The cells from the bone sheet under an inverted contrast microscopy after 3 days of adherence (×100); b. The purity of osteoblasts was determined by flow cytometry; c. ALP staining of the 1st generation osteoblasts after 7 days of osteoinduction culture (×40); d. Alizarin red staining of the 1st generation osteoblasts after 21 days of osteoinduction culture (×100)
2.2 CCCP及VPA最適作用濃度和時間篩選
CCK-8法檢測示，隨著CCCP濃度升高和作用時間延長，成骨細胞活性逐漸下降，其中10 μmol/L濃度下作用10 min細胞成活率為54%，根據IC50原理，采用此濃度與時間建立成骨細胞氧化應激模型。隨VPA濃度增加及培養時間延長，成骨細胞成活率逐漸提高，至0.8 mmol/mL濃度、培養24 h時達峰值，之后隨濃度增加細胞成活率逐漸降低，差異有統計學意義（P<0.05）。最終選擇0.8 mmol/mLVPA及培養24 h進行下一步實驗。見圖2。
圖2
CCK-8法檢測不同濃度VPA及CCCP處理后成骨細胞成活率
a. CCCP；b. VPA
Figure2. The survival rate of osteoblasts after treated with different concentrations of VPA and CCCP detected by CCK-8a. CCCP; b. VPA
2.3 氧化應激指標檢測
與空白對照組比較，CCCP組細胞綠色熒光顯著增強，ROS、MDA含量升高，SOD活性降低。與CCCP組相比，VPA+CCCP組成骨細胞氧化應激損傷減小，ROS、MDA含量降低，SOD活性升高。與VPA+CCCP組相比，VPA+CCCP+ML385組中ML385能逆轉VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用，上述檢測指標均呈相反變化趨勢。上述指標組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
各組細胞氧化應激指標檢測
a. ROS熒光強度觀察（熒光顯微鏡×200） 從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組；b. ROS熒光強度半定量分析 *
a. ROS fluorescence intensity determination (Fluorescence microscopy×200) From left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively; b. Semi-quantitative analysis of ROS fluorescence intensity *
2.4 細胞凋亡檢測
流式細胞術檢測示，空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組細胞凋亡率分別為8%±1%、30%±2%、12%±2%、24%±2%，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
圖4
流式細胞術檢測各組細胞凋亡
從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組
Figure4. Cell apoptosis in each group detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively
2.5 ALP及茜素紅染色觀測
鏡下見ALP染色均為陽性，空白對照組染色最深，其次為VPA+CCCP組、 VPA+CCCP+ML385組，CCCP組最淺。空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組A值分別為0.725±0.025、0.235±0.015、0.647±0.025、0.315±0.015，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5a。
圖5
各組ALP及茜素紅染色觀察（×100）
從左至右分別為空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組 a. ALP染色；b. 茜素紅染色
Figure5. ALP and alizarin red staining in each group (×100)From left to right for blank control group, CCCP group, VPA+CCCP group, and VPA+CCCP+ML385 group, respectively a. ALP staining; b. Alizarin red staining
茜素紅染色示均為陽性，其中空白對照組鈣結節最多，其次為VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組，CCCP組最少。空白對照組、CCCP組、VPA+CCCP組、VPA+CCCP+ML385組A值分別為0.856±0.015、0.187±0.020、0.643±0.023、0.403±0.015，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5b。
2.6 Western blot檢測
與空白對照組比較，CCCP組成骨相關蛋白BMP-2、RUNX2及抗凋亡家族蛋白Bcl2相對表達量均降低，凋亡核心蛋白Cleaved-Caspase-3、Bax以及通道蛋白Nrf2相對表達量均上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與CCCP組相比，VPA+CCCP組細胞經VPA處理后，BMP-2、RUNX2、Bcl2及Nrf2相對表達量上調，Cleaved-Caspase-3及Bax相對表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與VPA+CCCP組相比，VPA+CCCP+ML385組細胞經Nrf2抑制劑ML385處理后，VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用被逆轉，上述檢測指標均呈相反變化趨勢，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
Western blot檢測
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：CCCP組 3：VPA+CCCP組 4：VPA+CCCP+ML385組；b～g. 目的蛋白相對表達量 *
a. Electrophoretic image Mr: Relative molecular mass 1: Blank control group 2: CCCP group 3: VPA+CCCP group 4: VPA+CCCP+ML385 group; b-g. The relative expressions of target proteins *
3 討論
健康的骨骼系統由成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收的平衡來維持，當成骨細胞骨形成作用不足以彌補破骨細胞骨吸收時，會導致骨質流失而發展為骨質疏松[17]。ROS的主要成分是H2O2、O2–和-OH，本研究采用的CCCP誘導制備模型方法，根據其作用機制能穩定產生O2–和-OH和少量H2O2[18]，更貼近絕經后女性體內內源性氧化應激發生機制[19]。過量產生ROS將激活氧化應激并破壞脂質、核酸、蛋白質等生物大分子，引起脂質過氧化[20-21]。脂質過氧化產物可以通過調節NF-κB通路、MAPKs通路、PKC通路來誘導細胞發生凋亡[20, 22]，也是鐵死亡的誘發機制；同時ROS的大量產生將消耗細胞內過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、SOD等抗氧化物質，引起抗氧化酶活性降低。本研究結果顯示，成骨細胞經CCCP處理后ROS、MDA含量增加，SOD活性降低，成骨細胞凋亡增加，表明CCCP處理成功誘導了成骨細胞的氧化應激損傷，模型制備成功。
VPA作為一種可能通過與組蛋白去乙酰酶催化中心結合發揮特異抑制作用的脂肪酸鹽，拮抗氧化應激是其重要作用[4]。Li等[23]的研究證實長期大劑量服用VPA會降低骨量，但小劑量服用可能通過調節組蛋白乙酰化作用影響下游功能蛋白的表達，從而促進成骨細胞的分化和成熟。另有研究顯示，在中樞神經系統疾病模型中應用VPA后細胞Nrf2蛋白含量明顯升高[24]。基于此，我們分析VPA可能是通過促進組蛋白乙酰化調節下游Keap1/Nrf2/Are通路來減少氧化應激導致的成骨細胞凋亡。
Keap1/Nrf2/Are通路是細胞內重要的內源性抗氧化防御機制之一，與氧化應激發生、發展密切相關。在氧化應激條件下，該信號通路被激活并且啟動下游相關細胞保護性基因的表達，同時Nrf2蛋白從細胞質解離轉移到細胞核，與核內Are轉錄因子結合后可誘導血紅素加氧酶1等保護性基因的轉錄，進而保護細胞和組織免受氧化應激帶來的損傷[24]。而且Nrf2在自噬[25]、細胞凋亡、炎癥相關疾病中也有重要作用。近年研究表明，Keap1/Nrf2/Are通路與骨相關疾病的發生、發展密切相關。本研究中VPA上調Nrf2的表達，同時SOD活性增強，ROS、MDA含量降低，Bcl2表達升高而Bax表達降低，成骨細胞ALP活性增強，礦化能力升高，BMP-2、RUNX2表達增多；而Nrf2抑制劑ML385能夠抑制VPA的上述作用。本研究結果提示，VPA能通過促進組蛋白乙酰化調節Keap1/NRF2/Are通路，降低CCCP誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨。結合上述文獻報道以及本次研究結果分析，組蛋白乙酰化可能在拮抗氧化應激降低氧自由基的過程中發揮重要作用，這為我們藥物研發開辟了新思路。
綜上述，VPA可能通過調節Keap1/Nrf2/Are通路來抑制CCCP誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨。但是本實驗未研究VPA的抗炎作用和自噬保護作用是否參與抗骨質疏松，Nrf2通路激活過程中對于鐵死亡是否產生重要作用，對于破骨細胞的影響也未能證實。同時，需進一步通過體內實驗來驗證VPA對成骨細胞氧化應激損傷的保護作用，并驗證其作用機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經皖南醫學院弋磯山醫院科研與新技術倫理委員會批準［（2021）倫審國研第（71）］；實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004
作者貢獻聲明 蔣文凱：實驗實施、數據收集、圖片處理及撰稿；周志、劉合棟、任茂賢：部分實驗數據收集；楊民：實驗經費、實驗思路、文章構架及校稿
