引用本文： 李晶, 任曉琦, 喬瑋, 石浩, 楊婷, 馬紹英, 李寶興, 趙亞平. 一種新型可塑形骨填充材料的制備及骨修復能力研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(3): 302-307. doi: 10.7507/1002-1892.202210022 復制
骨缺損是臨床常見骨損傷類型，常導致骨愈合較慢甚至不愈合，在缺損處植入骨填充材料是臨床治療骨缺損的常見手段。但臨床中需要治療的骨缺損通常形態不規則，目前常用顆粒材料或預成型材料填充植骨，難免會出現顆粒脫落或填充不完全，導致骨缺損治療失敗。可塑形骨填充材料可根據骨缺損形狀任意塑形，不僅可以完全填充不規則骨缺損，更好地促進骨缺損修復愈合[1]，而且可以通過很小切口植入患處，有效減少手術過程對患者的創傷[2-3]。
可塑形骨填充材料一般由成骨基質顆粒和黏性載體組成，二者的特性決定著材料的成骨能力及理化性質[4]。常見的成骨基質顆粒有羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）、生物活性玻璃等，其中DBM來源于天然骨組織，可被宿主新生成骨細胞逐漸爬行替代，還含有天然BMP等成骨活性因子，具有良好的骨傳導及一定骨誘導能力，已廣泛應用于臨床修復骨缺損[5-8]。慈政等[9]的研究表明HA、DBM及明膠制成的仿生支架具有良好的細胞相容性及骨誘導活性。常見的黏性載體有殼聚糖、透明質酸鈉、甘油、骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）等[10-13]，天然骨基質有機成分中90%以上為Ⅰ型膠原蛋白，可作為提取BMG的原料[14-15]。王松等[16-17]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物、BMG及磷酸鈣混合制成復合骨水泥，證明其具有良好的細胞相容性及骨誘導活性，且能夠有效促進兔腰椎骨缺損修復重建。
本研究將同種異體骨顆粒經脫礦、溫浴加熱法處理制得的BMG作為黏性載體，混合同種DBM顆粒制成可塑形骨填充材料。通過裸小鼠體內植入實驗評價該可塑形骨填充材料的骨誘導活性，兔股骨髁缺損修復實驗評價骨修復能力，為其進一步臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～9周齡SPF級健康雄性無胸腺裸小鼠（BALB/C品系）15只，體質量21～24 g，購自北京市海淀興旺動物養殖場；實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2017-0005。9月齡健康日本大耳兔8只，雌雄不限，體質量2.0～3.0 kg，購自北京市昌揚西山養殖場；實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0007。上述實驗動物均由中國輻射防護研究院 GLP 實驗中心負責飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2013-0002。實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求，術前每只動物在實驗動物中心適應性喂養7 d以上。
HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。生物組織自動脫水機、包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；RM2015型石蠟切片機（Leica公司，德國）；CX41-32L02三目顯微鏡（Olympus公司，日本）；SkyScan1176小動物Micro-CT掃描影像系統（Bruker公司，德國）；動物骨鉆（上海玉研科學儀器有限公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。
1.2 植入材料的制備及實驗分組
DBM顆粒制備：于無菌環境下取捐獻的人體股骨、脛骨段（山西紅十字醫用組織庫），粉碎后篩取粒徑為0.2～0.8 mm的皮質骨顆粒，純凈水清洗；加入2倍體積的氯仿/甲醇混合液（體積比1∶1）攪拌1 h脫脂；加入等體積0.6 mol/L鹽酸溶液，攪拌24 h脫礦；純凈水清洗去除鹽酸殘留，冷凍干燥后備用，其鈣含量約為2.0%。
BMG制備：取上述部分DBM顆粒，依次用2倍于材料體積的2 mol/L CaCl2溶液、0.5 mol/L EDTA溶液及8 mol/L LiCl溶液分別浸泡4 h；純凈水清洗后，用55℃純凈水攪拌溶解，以離心半徑10 cm、5 000 r/min離心10 min；棄上清，得到BMG。
實驗分為兩組，實驗組將制備的同種DBM與BMG按體積比1∶1混合，獲得可塑形骨填充材料；對照組僅為同種DBM。兩組材料均采用 60Co輻照滅菌。
1.3 裸鼠肌袋內植入實驗
1.3.1 動物模型制備
參照行標《YY/T1680-2020同種異體修復材料 脫礦骨材料的體內成骨誘導性能評價》進行實驗[18]。取15只雄性無胸腺裸小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，俯臥位固定于操作臺上；于動物左右側臀部皮膚作長約10 mm縱切口，用止血鉗沿肌肉纖維方向于臀中肌及臀大肌間鈍性剝離制造肌間空隙，于兩側肌間隙均植入50 mg實驗組樣品。充分止血后縫合肌肉、皮膚。術后連續3 d注射慶大霉素300 U/只。
1.3.2 觀測指標
分別于術后1、4、6周采用頸椎脫臼法隨機處死5只裸小鼠，大體觀察切口愈合情況。切取含植入材料的肌肉組織，10%甲醛溶液固定72 h，50%甲酸脫鈣30 d，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，制備厚4 μm組織切片，行HE染色，光鏡下觀察組織反應及成骨情況。
1.4 兔股骨髁骨缺損修復實驗
1.4.1 動物模型制備
取8只日本大耳兔，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）全身麻醉后，側臥于潔凈操作臺上，雙后肢股骨內側剃毛，聚維酮碘溶液消毒術區。逐層切開并分離皮膚、皮下組織、骨膜，暴露股骨內側髁。用帶刻度的直徑6 mm環形鉆頭在雙側股骨髁中心距遠端關節面4 mm處鉆出直徑6 mm、深10 mm的骨缺損，同時用生理鹽水冷卻。左、右側骨缺損處分別植入實驗組和對照組材料并壓實；逐層縫合骨膜、皮下組織和皮膚，紗布包扎。術后單籠飼養，允許患肢負重，術后連續3 d肌肉注射慶大霉素4萬U/只。實驗期內每天觀察1次動物健康狀況，并記錄切口周圍組織反應、活動、飲食情況以及其他異常行為。
1.4.2 觀測指標
術后12、26周分別過量麻醉處死4只動物取材，使用SkyScan1176小動物Micro-CT掃描影像系統進行分析，掃描參數：掃描范圍從植入材料一端至另一端，掃描角度360°，電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間800 ms，層距19 μm。將Micro-CT分析的感興趣區域（range of interests，ROI）確定為植入材料直徑7.0 mm（包括材料周圍0.5 mm）、長10.0 mm的圓柱形區域，觀察ROI內新骨形成情況，測量指標包括骨密度、骨體積分數、骨小梁厚度。
然后將樣品置于8～10倍體積10%甲醛溶液中固定至少72 h，同1.3.2方法行HE染色觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間及組內比較均采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 裸鼠肌袋內植入實驗
實驗動物術后活動正常、飲食良好，手術切口均愈合良好，未見感染等現象。
HE染色示，術后1周，植入物周圍組織未見異常反應，材料未見明顯吸收，BMG均勻分布于植入部位，形態松散，著色較淺；DBM顆粒結構致密，著色鮮艷；材料間隙有疏松結締組織填充、新生血管長入，可見大量間充質細胞及大量軟骨細胞，未見明顯炎癥細胞。術后4周，大部分BMG被吸收，仍可見大量DBM顆粒，偶見破骨細胞，材料間隙內可見類軟骨及軟骨組織。術后6周，BMG幾乎被完全吸收，部分DBM顆粒被吸收，DBM顆粒周圍可見新生軟骨組織。見圖1。
圖1
兩組裸鼠肌袋內植入術后各時間點HE染色觀察
*示BMG，▲示DBM，黃箭頭示軟骨細胞，藍箭頭示新生軟骨 a. 1周（×40）；b. 4周（×40）；c. 4周（×100）；d. 6周（×100）
Figure1. HE staining observation of the two groups at each time point after implantation in muscle pouches of nude mice* indicated BMG, ▲ indicated DBM, yellow arrow indicated the chondrocytes, blue arrow indicated the new cartilage a. At 1 week (×40); b. At 4 weeks (×40); c. At 4 weeks (×100); d. At 6 weeks (×100)
2.2 兔股骨髁骨缺損修復實驗
2.2.1 大體觀察
實驗動物術后活動正常、飲食良好，術后2周手術切口均愈合良好，未見感染等現象。
2.2.2 組織學觀察
HE染色示，術后12周，實驗組材料BMG完全降解，少量DBM殘留，偶見破骨細胞，有明顯骨小梁及編織骨結構；對照組少量DBM殘留，偶見破骨細胞，可見新生骨組織，骨小梁結構少于實驗組。術后26周，實驗組材料幾乎完全被吸收，偶見DBM，可見大量規則排列的新生骨組織及初級骨單元結構；對照組可見極少量DBM殘留，可見大量新生軟骨組織及骨組織，未出現明顯骨單元結構。見圖2。
圖2
兩組兔髁骨缺損修復術后各時間點HE染色觀察
▲示DBM，藍箭頭示新生軟骨，紅箭頭示骨單元結構 a. 實驗組術后12周（×100）；b. 實驗組術后26周（×100）；c. 實驗組術后26周（×200）；d. 對照組術后12周（×200）；e. 對照組術后26周（×200）；f. 對照組術后26周（×400）
Figure2. HE staining observation of the two groups at each time point after repair of rabbit condylar defects▲ indicated DBM, blue arrow indicated the new cartilage, red arrow indicated the bone unit structure a. Experimental group at 12 weeks after operation (×100); b. Experimental group at 26 weeks after operation (×100); c. Experimental group at 26 weeks after operation (×200); d. Control group at 12 weeks after operation (×200); e. Control group at 26 weeks after operation (×200); f. Control group at 26 weeks after operation (×400)
2.2.3 Micro-CT觀測
術后12周，實驗組骨缺損區域邊緣模糊，有大量骨小梁形成；對照組骨缺損邊緣相對明顯，有骨小梁形成。術后26周，實驗組有大量新骨形成，幾乎填滿骨缺損區域；對照組骨缺損區域仍有較明顯空洞。見圖3。
圖3
兩組兔髁骨缺損修復術后各時間點Micro-CT觀察
a. 實驗組術后12周；b. 實驗組術后26周；c. 對照組術后12周；d. 對照組術后26周
Figure3. Micro-CT observation of the two groups at each time point after repair of rabbit condylar defectsa. Experimental group at 12 weeks after operation; b. Experimental group at 26 weeks after operation; c. Control group at 12 weeks after operation; d. Control group at 26 weeks after operation
骨形態計量學參數檢測示，兩組術后26周各參數均較術后12周顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后12周，實驗組骨密度、骨體積分數顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組骨小梁厚度差異無統計學意義（P>0.05）。術后26周，實驗組骨密度顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組骨體積分數、骨小梁厚度差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
術后各時間點兩組骨形態計量學參數比較（n=4，
）
Table1.
Comparison of bone morphometric parameters between the two groups at different time points after operation (n=4, 
)
3 討論
為滿足骨缺損部位的快速成骨要求，理想骨填充材料應同時具有優秀的骨誘導和骨傳導性能，這就要求骨填充材料需要含有骨誘導活性物質，同時應具有多孔三維結構。新型可塑形骨填充材料是由人骨制備，其中的BMG及DBM均含有BMP等骨誘導活性物質，因此具有良好的骨誘導活性。DBM顆粒具有天然三維結構，有良好的骨傳導性能；顆粒之間的縫隙形成了孔隙結構，能夠促進細胞增殖、分化以及組織再生[19-20]。同種DBM鈣含量約為2%時最有利于其吸收，能展現出更高的骨誘導性能[6，21-23]。
裸小鼠（BALB/C品系）是一種免疫系統遺傳缺陷的小鼠模型，由于天生缺少胸腺，其T細胞免疫缺陷，B淋巴細胞正常但是功能缺陷，所以裸小鼠無接觸敏感性和移植排斥反應，適合進行同種異體骨異位誘導成骨實驗[24-25]。Dozza等[26]和Sutha等[27]將DBM植入裸小鼠體內，證明其具有良好的骨誘導活性。因此，本研究選擇裸小鼠肌袋異位成骨實驗，評價新型可塑形骨填充材料的骨誘導活性。新型可塑形骨填充材料以人骨為原料，且制備過程使得材料中的BMP等誘導成骨的活性物質得以暴露，展現出良好的骨誘導性能。將新型可塑形骨填充材料植入裸鼠肌袋中，結果顯示1周后植入物即可在其周圍招募大量MSCs并且誘導其轉化為軟骨細胞，可能是因為BMG中BMP的骨誘導效果；植入6周后，BMG幾乎被完全吸收，隨著DBM顆粒的逐步暴露和吸收，其中的BMP等成骨活性物質得以緩慢釋放，持續促進成骨。BMG中的成骨因子在成骨前期起到了主要骨誘導作用；DBM降解相對緩慢，其中的成骨活性物質釋放較慢，而在成骨后期發揮骨傳導及骨誘導作用；二者相輔相成，在成骨過程中最大化發揮成骨效果。
新型可塑形骨填充材料在制備過程中去除了細胞碎片、核酸等具有免疫原性的成分，生物相容性良好。將材料植入兔髁骨后未觀察到明顯免疫排斥反應，說明了材料的安全性。材料填充入缺損部位后，BMG中的BMP快速誘導MSCs轉化為成骨細胞；隨著BMG逐漸被吸收，DBM顆粒的三維孔隙結構及BMP得以暴露，其骨誘導及骨傳導能力共同促進機體快速成骨。兔髁骨成骨實驗結果表明，與僅填充DBM顆粒的對照組相比，混合有BMG的可塑形材料組在術后12周形成了更成熟的骨小梁、編織骨結構，術后26周已經生成初級骨單元結構，展現出更好的成骨效果及更快的成骨速度，這與Micro-CT評價骨形態計量學參數結果一致。說明新型可塑形骨填充材料中的BMG除了發揮其黏性載體作用外，還能夠誘導機體更快地成骨，縮短成骨周期。
本研究中，觀察期末仍可見部分材料未被吸收，由于植入物的量與其被新骨替代的時間成正相關，隨著時間延長，該新型可塑形骨填充材料應該最終會被新骨替代。
綜上述，本研究表明以DBM為基質顆粒、以BMG為黏性載體制備的新型可塑形骨填充材料具有良好的生物安全性及骨誘導活性，可用于不規則骨缺損的填充，為其下一步臨床試驗提供了一定依據。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經中國輻射防護研究院實驗動物管理和使用倫理委員會批準［CIRP-IACU-（R）2020006、CIRP-IACU-（R）2020007］
作者貢獻聲明 李晶：提出科研設計方案、參加實驗操作、數據收集分析及文章撰寫；任曉琦、喬瑋：參與科研設計、動物實驗實施，圖片處理及數據收集整理；石浩：參與數據整理及統計分析；楊婷：參與文章科研設計及討論部分分析；馬紹英、李寶興、趙亞平：對研究設計及實施提出建議，修改文章
骨缺損是臨床常見骨損傷類型，常導致骨愈合較慢甚至不愈合，在缺損處植入骨填充材料是臨床治療骨缺損的常見手段。但臨床中需要治療的骨缺損通常形態不規則，目前常用顆粒材料或預成型材料填充植骨，難免會出現顆粒脫落或填充不完全，導致骨缺損治療失敗。可塑形骨填充材料可根據骨缺損形狀任意塑形，不僅可以完全填充不規則骨缺損，更好地促進骨缺損修復愈合[1]，而且可以通過很小切口植入患處，有效減少手術過程對患者的創傷[2-3]。
可塑形骨填充材料一般由成骨基質顆粒和黏性載體組成，二者的特性決定著材料的成骨能力及理化性質[4]。常見的成骨基質顆粒有羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM）、生物活性玻璃等，其中DBM來源于天然骨組織，可被宿主新生成骨細胞逐漸爬行替代，還含有天然BMP等成骨活性因子，具有良好的骨傳導及一定骨誘導能力，已廣泛應用于臨床修復骨缺損[5-8]。慈政等[9]的研究表明HA、DBM及明膠制成的仿生支架具有良好的細胞相容性及骨誘導活性。常見的黏性載體有殼聚糖、透明質酸鈉、甘油、骨基質明膠（bone matrix gelatin，BMG）等[10-13]，天然骨基質有機成分中90%以上為Ⅰ型膠原蛋白，可作為提取BMG的原料[14-15]。王松等[16-17]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物、BMG及磷酸鈣混合制成復合骨水泥，證明其具有良好的細胞相容性及骨誘導活性，且能夠有效促進兔腰椎骨缺損修復重建。
本研究將同種異體骨顆粒經脫礦、溫浴加熱法處理制得的BMG作為黏性載體，混合同種DBM顆粒制成可塑形骨填充材料。通過裸小鼠體內植入實驗評價該可塑形骨填充材料的骨誘導活性，兔股骨髁缺損修復實驗評價骨修復能力，為其進一步臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～9周齡SPF級健康雄性無胸腺裸小鼠（BALB/C品系）15只，體質量21～24 g，購自北京市海淀興旺動物養殖場；實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2017-0005。9月齡健康日本大耳兔8只，雌雄不限，體質量2.0～3.0 kg，購自北京市昌揚西山養殖場；實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0007。上述實驗動物均由中國輻射防護研究院 GLP 實驗中心負責飼養，實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2013-0002。實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求，術前每只動物在實驗動物中心適應性喂養7 d以上。
HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。生物組織自動脫水機、包埋機（浙江金華科迪儀器設備有限公司）；RM2015型石蠟切片機（Leica公司，德國）；CX41-32L02三目顯微鏡（Olympus公司，日本）；SkyScan1176小動物Micro-CT掃描影像系統（Bruker公司，德國）；動物骨鉆（上海玉研科學儀器有限公司）；BS124S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。
1.2 植入材料的制備及實驗分組
DBM顆粒制備：于無菌環境下取捐獻的人體股骨、脛骨段（山西紅十字醫用組織庫），粉碎后篩取粒徑為0.2～0.8 mm的皮質骨顆粒，純凈水清洗；加入2倍體積的氯仿/甲醇混合液（體積比1∶1）攪拌1 h脫脂；加入等體積0.6 mol/L鹽酸溶液，攪拌24 h脫礦；純凈水清洗去除鹽酸殘留，冷凍干燥后備用，其鈣含量約為2.0%。
BMG制備：取上述部分DBM顆粒，依次用2倍于材料體積的2 mol/L CaCl2溶液、0.5 mol/L EDTA溶液及8 mol/L LiCl溶液分別浸泡4 h；純凈水清洗后，用55℃純凈水攪拌溶解，以離心半徑10 cm、5 000 r/min離心10 min；棄上清，得到BMG。
實驗分為兩組，實驗組將制備的同種DBM與BMG按體積比1∶1混合，獲得可塑形骨填充材料；對照組僅為同種DBM。兩組材料均采用 60Co輻照滅菌。
1.3 裸鼠肌袋內植入實驗
1.3.1 動物模型制備
參照行標《YY/T1680-2020同種異體修復材料 脫礦骨材料的體內成骨誘導性能評價》進行實驗[18]。取15只雄性無胸腺裸小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，俯臥位固定于操作臺上；于動物左右側臀部皮膚作長約10 mm縱切口，用止血鉗沿肌肉纖維方向于臀中肌及臀大肌間鈍性剝離制造肌間空隙，于兩側肌間隙均植入50 mg實驗組樣品。充分止血后縫合肌肉、皮膚。術后連續3 d注射慶大霉素300 U/只。
1.3.2 觀測指標
分別于術后1、4、6周采用頸椎脫臼法隨機處死5只裸小鼠，大體觀察切口愈合情況。切取含植入材料的肌肉組織，10%甲醛溶液固定72 h，50%甲酸脫鈣30 d，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，制備厚4 μm組織切片，行HE染色，光鏡下觀察組織反應及成骨情況。
1.4 兔股骨髁骨缺損修復實驗
1.4.1 動物模型制備
取8只日本大耳兔，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）全身麻醉后，側臥于潔凈操作臺上，雙后肢股骨內側剃毛，聚維酮碘溶液消毒術區。逐層切開并分離皮膚、皮下組織、骨膜，暴露股骨內側髁。用帶刻度的直徑6 mm環形鉆頭在雙側股骨髁中心距遠端關節面4 mm處鉆出直徑6 mm、深10 mm的骨缺損，同時用生理鹽水冷卻。左、右側骨缺損處分別植入實驗組和對照組材料并壓實；逐層縫合骨膜、皮下組織和皮膚，紗布包扎。術后單籠飼養，允許患肢負重，術后連續3 d肌肉注射慶大霉素4萬U/只。實驗期內每天觀察1次動物健康狀況，并記錄切口周圍組織反應、活動、飲食情況以及其他異常行為。
1.4.2 觀測指標
術后12、26周分別過量麻醉處死4只動物取材，使用SkyScan1176小動物Micro-CT掃描影像系統進行分析，掃描參數：掃描范圍從植入材料一端至另一端，掃描角度360°，電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間800 ms，層距19 μm。將Micro-CT分析的感興趣區域（range of interests，ROI）確定為植入材料直徑7.0 mm（包括材料周圍0.5 mm）、長10.0 mm的圓柱形區域，觀察ROI內新骨形成情況，測量指標包括骨密度、骨體積分數、骨小梁厚度。
然后將樣品置于8～10倍體積10%甲醛溶液中固定至少72 h，同1.3.2方法行HE染色觀察。
1.5 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間及組內比較均采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 裸鼠肌袋內植入實驗
實驗動物術后活動正常、飲食良好，手術切口均愈合良好，未見感染等現象。
HE染色示，術后1周，植入物周圍組織未見異常反應，材料未見明顯吸收，BMG均勻分布于植入部位，形態松散，著色較淺；DBM顆粒結構致密，著色鮮艷；材料間隙有疏松結締組織填充、新生血管長入，可見大量間充質細胞及大量軟骨細胞，未見明顯炎癥細胞。術后4周，大部分BMG被吸收，仍可見大量DBM顆粒，偶見破骨細胞，材料間隙內可見類軟骨及軟骨組織。術后6周，BMG幾乎被完全吸收，部分DBM顆粒被吸收，DBM顆粒周圍可見新生軟骨組織。見圖1。
圖1
兩組裸鼠肌袋內植入術后各時間點HE染色觀察
*示BMG，▲示DBM，黃箭頭示軟骨細胞，藍箭頭示新生軟骨 a. 1周（×40）；b. 4周（×40）；c. 4周（×100）；d. 6周（×100）
Figure1. HE staining observation of the two groups at each time point after implantation in muscle pouches of nude mice* indicated BMG, ▲ indicated DBM, yellow arrow indicated the chondrocytes, blue arrow indicated the new cartilage a. At 1 week (×40); b. At 4 weeks (×40); c. At 4 weeks (×100); d. At 6 weeks (×100)
2.2 兔股骨髁骨缺損修復實驗
2.2.1 大體觀察
實驗動物術后活動正常、飲食良好，術后2周手術切口均愈合良好，未見感染等現象。
2.2.2 組織學觀察
HE染色示，術后12周，實驗組材料BMG完全降解，少量DBM殘留，偶見破骨細胞，有明顯骨小梁及編織骨結構；對照組少量DBM殘留，偶見破骨細胞，可見新生骨組織，骨小梁結構少于實驗組。術后26周，實驗組材料幾乎完全被吸收，偶見DBM，可見大量規則排列的新生骨組織及初級骨單元結構；對照組可見極少量DBM殘留，可見大量新生軟骨組織及骨組織，未出現明顯骨單元結構。見圖2。
圖2
兩組兔髁骨缺損修復術后各時間點HE染色觀察
▲示DBM，藍箭頭示新生軟骨，紅箭頭示骨單元結構 a. 實驗組術后12周（×100）；b. 實驗組術后26周（×100）；c. 實驗組術后26周（×200）；d. 對照組術后12周（×200）；e. 對照組術后26周（×200）；f. 對照組術后26周（×400）
Figure2. HE staining observation of the two groups at each time point after repair of rabbit condylar defects▲ indicated DBM, blue arrow indicated the new cartilage, red arrow indicated the bone unit structure a. Experimental group at 12 weeks after operation (×100); b. Experimental group at 26 weeks after operation (×100); c. Experimental group at 26 weeks after operation (×200); d. Control group at 12 weeks after operation (×200); e. Control group at 26 weeks after operation (×200); f. Control group at 26 weeks after operation (×400)
2.2.3 Micro-CT觀測
術后12周，實驗組骨缺損區域邊緣模糊，有大量骨小梁形成；對照組骨缺損邊緣相對明顯，有骨小梁形成。術后26周，實驗組有大量新骨形成，幾乎填滿骨缺損區域；對照組骨缺損區域仍有較明顯空洞。見圖3。
圖3
兩組兔髁骨缺損修復術后各時間點Micro-CT觀察
a. 實驗組術后12周；b. 實驗組術后26周；c. 對照組術后12周；d. 對照組術后26周
Figure3. Micro-CT observation of the two groups at each time point after repair of rabbit condylar defectsa. Experimental group at 12 weeks after operation; b. Experimental group at 26 weeks after operation; c. Control group at 12 weeks after operation; d. Control group at 26 weeks after operation
骨形態計量學參數檢測示，兩組術后26周各參數均較術后12周顯著增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后12周，實驗組骨密度、骨體積分數顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組骨小梁厚度差異無統計學意義（P>0.05）。術后26周，實驗組骨密度顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；兩組骨體積分數、骨小梁厚度差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
術后各時間點兩組骨形態計量學參數比較（n=4，）
Table1.
Comparison of bone morphometric parameters between the two groups at different time points after operation (n=4, )
3 討論
為滿足骨缺損部位的快速成骨要求，理想骨填充材料應同時具有優秀的骨誘導和骨傳導性能，這就要求骨填充材料需要含有骨誘導活性物質，同時應具有多孔三維結構。新型可塑形骨填充材料是由人骨制備，其中的BMG及DBM均含有BMP等骨誘導活性物質，因此具有良好的骨誘導活性。DBM顆粒具有天然三維結構，有良好的骨傳導性能；顆粒之間的縫隙形成了孔隙結構，能夠促進細胞增殖、分化以及組織再生[19-20]。同種DBM鈣含量約為2%時最有利于其吸收，能展現出更高的骨誘導性能[6，21-23]。
裸小鼠（BALB/C品系）是一種免疫系統遺傳缺陷的小鼠模型，由于天生缺少胸腺，其T細胞免疫缺陷，B淋巴細胞正常但是功能缺陷，所以裸小鼠無接觸敏感性和移植排斥反應，適合進行同種異體骨異位誘導成骨實驗[24-25]。Dozza等[26]和Sutha等[27]將DBM植入裸小鼠體內，證明其具有良好的骨誘導活性。因此，本研究選擇裸小鼠肌袋異位成骨實驗，評價新型可塑形骨填充材料的骨誘導活性。新型可塑形骨填充材料以人骨為原料，且制備過程使得材料中的BMP等誘導成骨的活性物質得以暴露，展現出良好的骨誘導性能。將新型可塑形骨填充材料植入裸鼠肌袋中，結果顯示1周后植入物即可在其周圍招募大量MSCs并且誘導其轉化為軟骨細胞，可能是因為BMG中BMP的骨誘導效果；植入6周后，BMG幾乎被完全吸收，隨著DBM顆粒的逐步暴露和吸收，其中的BMP等成骨活性物質得以緩慢釋放，持續促進成骨。BMG中的成骨因子在成骨前期起到了主要骨誘導作用；DBM降解相對緩慢，其中的成骨活性物質釋放較慢，而在成骨后期發揮骨傳導及骨誘導作用；二者相輔相成，在成骨過程中最大化發揮成骨效果。
新型可塑形骨填充材料在制備過程中去除了細胞碎片、核酸等具有免疫原性的成分，生物相容性良好。將材料植入兔髁骨后未觀察到明顯免疫排斥反應，說明了材料的安全性。材料填充入缺損部位后，BMG中的BMP快速誘導MSCs轉化為成骨細胞；隨著BMG逐漸被吸收，DBM顆粒的三維孔隙結構及BMP得以暴露，其骨誘導及骨傳導能力共同促進機體快速成骨。兔髁骨成骨實驗結果表明，與僅填充DBM顆粒的對照組相比，混合有BMG的可塑形材料組在術后12周形成了更成熟的骨小梁、編織骨結構，術后26周已經生成初級骨單元結構，展現出更好的成骨效果及更快的成骨速度，這與Micro-CT評價骨形態計量學參數結果一致。說明新型可塑形骨填充材料中的BMG除了發揮其黏性載體作用外，還能夠誘導機體更快地成骨，縮短成骨周期。
本研究中，觀察期末仍可見部分材料未被吸收，由于植入物的量與其被新骨替代的時間成正相關，隨著時間延長，該新型可塑形骨填充材料應該最終會被新骨替代。
綜上述，本研究表明以DBM為基質顆粒、以BMG為黏性載體制備的新型可塑形骨填充材料具有良好的生物安全性及骨誘導活性，可用于不規則骨缺損的填充，為其下一步臨床試驗提供了一定依據。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經中國輻射防護研究院實驗動物管理和使用倫理委員會批準［CIRP-IACU-（R）2020006、CIRP-IACU-（R）2020007］
作者貢獻聲明 李晶：提出科研設計方案、參加實驗操作、數據收集分析及文章撰寫；任曉琦、喬瑋：參與科研設計、動物實驗實施，圖片處理及數據收集整理；石浩：參與數據整理及統計分析；楊婷：參與文章科研設計及討論部分分析；馬紹英、李寶興、趙亞平：對研究設計及實施提出建議，修改文章
