引用本文： 張賀龍, 魏易凡, 馬成, 李凌志, 陶志文, 任永信. 細胞外囊泡治療椎間盤退變的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(2): 208-214. doi: 10.7507/1002-1892.202210060 復制
椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是多種脊柱疾病發生發展的重要病理基礎，其引起的腰椎間盤突出、退變性腰椎管狹窄、退變性腰椎滑脫等疾病在臨床上常見，嚴重影響患者生活和工作[1]。髓核、軟骨終板、纖維環等結構的異常病理變化均可促進IVDD進展，目前臨床上針對IVDD的治療方法主要為物理治療、藥物治療和必要時手術治療，但均以緩解患者臨床癥狀為主，并不能從病因上逆轉病理狀態[2]。
細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是直徑為30 nm～3 μm的雙層脂質膜囊泡，由細胞分泌到外環境中。隨著研究的深入，人們發現EVs有著強大的生物學功能，在多種疾病的發生發展過程中起著重要作用。本文對EVs治療IVDD的作用及其機制研究進展進行綜述，以期為后續研究和治療提供新思路、新方法。
1 EVs生物學特性
1.1 EVs概況
關于EVs的研究最早可追溯到1967年，是由Wolf團隊[3]發現的具有血小板功能的脂質微粒。20世紀80年代，Pan等[4]在研究羊網織紅細胞時發現了EVs的亞型外泌體，并認為它是細胞清除胞內垃圾物質的一種方式。EVs可由人體大多數細胞分泌[5]，并且廣泛分布在生物流體中，如血漿、尿液、唾液、腹水、膽汁液、腦脊液和羊水等。近年研究發現EVs通過富集其親代細胞的活性信號分子，包括蛋白質、miRNA、mRNA及環狀RNA（circular RNA，circRNA）、脂質等[6]，改變靶細胞功能。在不同生理和病理情況下，EVs中的成分存在差異性表達，這種變化將直接影響EVs對細胞的作用機制，如炎癥、氧化應激、自噬、衰老、凋亡等（圖1）。根據直徑、標志物以及生成方式，EVs可以分為外泌體、微囊泡及凋亡小體3種亞型（表1）。
圖1
EVs對靶細胞的作用機制
Figure1.
The mechanism of EVs on target cells
表1
EVs的3種亞型分型標準
Table1.
Classification criteria for three subtypes of EVs
1.2 EVs分離提取及鑒定方法
EVs常用分離提取方法包括超速離心、密度梯度離心、尺寸排除色譜和基于磁珠的親和捕獲[7]。超速離心法是基于EVs與其他細胞器、細胞碎片的沉降系數不同，進而分離得到EVs。該提取方法簡單，但重復離心可能破壞EVs的囊泡結構。密度梯度離心法是基于EVs與其他雜質的密度差異進行離心分離的方法，與超速離心法相比，能進一步去除雜質蛋白，得到更高純度的EVs[6]。近年出現了納米技術和微流體的新興方法，如切向流過濾、非對稱流場流分選和外泌體檢測方法超快分離系統等。總的來說，現有分離提取方法中，產品純度和產量通常成反比關系。因此，分離提取方法仍需要開發或改進，以期獲得高純度和大規模EVs樣品，促進其臨床應用。
EVs鑒定方法包括生物物理技術及生化檢測方法。其中，EVs 直徑、濃度和形態等物理性狀可采用透射電鏡檢查、流式細胞術、納米顆粒跟蹤分析技術、動態光散射技術、可調電阻脈沖傳感技術等生物物理技術進行觀測。常用生化檢測方法包括ELISA、Western blot、蛋白質組學分析、PCR等，上述方法因實驗原理及操作步驟不同而各有利弊。為了確保生物樣品中EVs的純度和生物活性，有學者推薦至少使用一種生化檢測方法和生物物理技術的組合來鑒定EVs [8]，其中最常用的是Western blot與透射電鏡檢查聯合。
2 EVs與髓核
髓核處于椎間盤中心，周圍是軟骨終板和纖維環，髓核細胞（nucleus pulposus cell，NPC）處于高壓、酸性、乏營養的特殊環境，主要通過產生Ⅱ型膠原和蛋白多糖（aggrecan，ACAN）發揮作用。在炎癥、氧化應激、衰老、凋亡等不利因素影響下，NPC細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成代謝減少，分解代謝增加，ACAN含量減少，Ⅰ型膠原逐漸取代Ⅱ型膠原，導致椎間盤穩態被破壞[9]。如何挽救NPC細胞功能減退和ECM的代謝紊亂，以期恢復椎間盤正常功能，對治療IVDD具有重要意義。
2.1 EVs影響NPC炎癥與氧化應激
炎癥和氧化應激是IVDD發生的早期關鍵事件。近年研究發現，含有核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）的炎癥小體是參與炎癥、氧化應激和細胞焦亡的關鍵分子，有望成為治療IVDD的靶點[10]。Zhang等[11]研究發現miR-410能直接與NLRP3結合，而MSCs分泌的EVs（MSCs-EVs）能傳遞miR-410至NPC，抑制NLRP3的表達。MSCs-EVs通過運輸Prx2，降低NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、焦孔素D-N端的表達水平，發揮抗炎作用[12]。Yuan等[13]報道人臍帶MSCs來源的EVs通過傳遞miR-26a-5p調節NPC中METTL14/NLRP3信號通路，進而抑制下游炎癥因子IL-1β、IL-18的表達。Wen等[14]發現BMSCs來源的EVs（BMSCs-EVs）通過富集miR-199a并靶向GREM1下調TGF-β途徑來延緩IVDD的進展。另外，BMSCs-EVs可通過CIRC_0050205/miR-665/Gpx4軸和CIRC_0072464/miR-431/NRF2途徑，減輕氧化應激對NPC的損傷[15-16]。Lu等[17]研究發現將BMSCs-EVs與IVDD患者的NPC共培養21 d后，NPC合成代謝基因（ACAN、COX-2、Sox-9、基質金屬蛋白酶抑制劑 1）表達上調，基質降解相關的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）水平被抑制。活性氧由線粒體產生，能夠造成細胞器損傷并促進炎癥介質產生[18-19]，而MSCs-EVs可下調活性氧，發揮抗炎和抗氧化作用[20]。Zhou等[21]研究發現低氧環境下MSCs-EVs中miR-17-5p含量豐富，通過與TLR4結合以促進NPC增殖和ECM合成。NPC來源的EVs （NPC-EVs）對MSCs亦有影響，體外實驗顯示NPC-EVs能誘導MSCs向髓核樣細胞分化、遷移[22]。
2.2 EVs影響NPC衰老
NPC在各種病理因素刺激下易老化，并且衰老的髓核通過分泌促炎因子、基質重塑酶類、趨化因子和生長因子等物質加速退變進展，這被認為是IVDD病理基礎之一[23]。Sun等[24]發現脂肪細胞來源的EVs通過煙酰胺磷酸核糖轉移酶激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成和Sirt1信號通路，從而抑制衰老NPC分泌與衰老相關的表型因子。此外，該團隊還發現MSCs-EVs通過將miR-105-5p傳遞給衰老的NPC并激活Sirt6，發揮延緩衰老作用[25]。Liao等[26]發現二甲雙胍處理后的MSCs-EVs可顯著改善叔丁基過氧化氫誘導的NPC衰老。Chen等[27]使用衰老NPC分泌的EVs處理正常NPC，發現正常細胞增殖和集落形成能力降低，P53和P21表達增強，提示EVs可能含有來自衰老NPC的生物活性物質，并促進周圍正常細胞衰老。
2.3 EVs影響NPC凋亡
凋亡與NPC數量減少關系密切，是導致椎間盤病變的重要因素[28]。研究表明，MSCs-EVs中的miR-21激活PI3K/AKT信號通路，上調抗凋亡蛋白Bcl-2，下調凋亡相關蛋白Bax、cleaved Caspase-3[29]。Sun等[30]發現MSCs-EVs通過傳遞miR-194-5p緩解TNF-α誘導的NPC凋亡。Hu等[31]報道BMSCs-EVs通過抑制氧化應激來減輕壓縮應力負荷介導的NPC凋亡。在重度IVDD脊髓組織NPC分泌的EVs中，circRNA_0000253大量富集，且circRNA_0000253與miRNA141-5p競爭性結合并下調Sirt1，促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、解聚蛋白樣金屬蛋白酶、MMP的表達[32]。Cui等[33]發現MSCs-EVs中miR-129-5p通過靶向LRG1抑制p38/MAPK信號通路，抑制NPC凋亡。Li等[34]報道在病理性酸性環境中，MSCs-EVs能下調MMP，促進ECM的合成，保護NPC免受酸性環境誘導的細胞凋亡。 Liao等[35]發現MSCs-EVs激活AKT/ERK通路，抑制NPC中晚期糖基化終末產物積累以及與其相關的內質網應激，發揮抗凋亡作用。Xiang等[36]亦發現尿源性干細胞分泌的EVs通過AKT/ERK途徑改善內質網應激。
2.4 EVs影響NPC自噬
自噬與IVDD及EVs的生物發生和分泌活動有關[26, 37]。Zhang等[38]報道在自噬激活劑處理下，NPC分泌的EVs增多，且其高表達的miR-27A靶向MMP-13，抑制ECM降解。Hu等[39]發現自噬可以正向調節細胞骨架蛋白RhoC、ROCK2的表達水平，在NPCs分泌EVs的過程中發揮重要作用。
3 EVs與軟骨終板
軟骨終板由軟骨細胞和ECM構成，位于椎間盤與椎體之間，發揮著提供營養、力學緩沖和維持椎體形態等重要作用[40]。因此，當軟骨終板功能減退后，椎間盤營養供應障礙，促進IVDD的發生發展[41]。近年來，軟骨終板退變機制成為IVDD治療領域研究新方向，而軟骨終板細胞過度凋亡和鈣化是軟骨終板病理改變的兩個主要過程[42] ，受到了越來越多學者關注。
Xie等[43]使用MSCs-EVs與叔丁基過氧化氫誘導的軟骨終板細胞共處理，結果顯示其能顯著下調細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9及鈣化相關蛋白Runx2、BMP-2的表達。此外，EVs中miR-31-5p通過靶向ATF6相關的內質網應激來減輕細胞凋亡和鈣化。Yuan等[44]報道雙氧水誘導的氧化應激促進鈣化并增加EVs的產生，但該EVs協同雙氧水增強鈣化相關基因ALP、骨鈣素、RUNX2的表達，促進軟骨終板礦物質沉積。
Luo等[45]報道軟骨終板干細胞（cartilage endplate stem cell，CESCs）分泌的EVs（CESCs-EVs）促進NPC增殖，并且通過激活PI3K/AKT通路抑制細胞凋亡。此外，該團隊后續研究[46]報道CESCs-EVs也可以通過自分泌途徑作用于其母細胞，激活HIF-1α/Wnt途徑，使CESCs向NPC遷移和分化，產生修復作用。Chen等[47]發現CESCs-EVs富載miR-125-5p，并通過靶向 SUV39H1基因促進NPC自噬，抑制其凋亡。
4 EVs與纖維環
纖維環由纖維環細胞和ECM構成，位于椎間盤外層，在維持椎間盤穩態及脊柱生物力學穩定性中發揮重要作用，并且作為物理屏障，將內部髓核與外部血管和免疫系統隔離開來。
正常椎間盤由于其高濃度蛋白多糖和高壓力的微環境，能抑制血管形成[48]，但是纖維環裂隙和撕裂的形成會削弱其作為物理屏障的作用，促進血管浸潤[49]。Wiet等[50]發現健康纖維環細胞的培養上清可抑制肥大細胞誘導的血管生成。Sun等[51]報道發生退行性變的纖維環細胞分泌的EVs會促進細胞遷移和炎癥因子表達，對人臍靜脈內皮細胞具有促血管生成作用，而正常纖維環細胞分泌的EVs則顯示相反作用，表現出抑制血管生長、維持健康椎間盤的無血管狀態。Sun等[52]報道0.5 MPa壓縮負荷下培養的脊索細胞分泌的EVs高表達miR-140-5p，具有抗血管生成作用。Li等[53]發現BMSCs-EVs通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路減輕纖維環細胞的炎癥和凋亡。
5 EVs應用前景
EVs作為一種新型生物載體在多種疾病治療中有著巨大應用潛力，吸引了科研及臨床轉化領域的廣泛關注。采用EVs傳遞生物活性物質具有以下優勢：① 脂質雙分子層結構可保護傳遞的生物活性物質，避免其降解；② 脂質層上的膜蛋白具有靶向性；③ 為自體細胞產物，生物相容性良好；④ 較高的安全性，能避免細胞移植療法帶來的免疫排斥反應、小血管堵塞、惡性轉化等副作用。
EVs可作為納米載體富集其來源母細胞的生物信息成分或運載特定分子，如mRNA、miRNA、circRNA、蛋白質或藥物等，通過膜融合、細胞表面受體或者內吞方式將內容物傳遞給靶細胞[54-55]。有研究報道，MSCs-EVs可向髓核提供線粒體蛋白，恢復受損線粒體[20]。Guo等[56]報道在退變的椎間盤中人母系蛋白（matrilin，MATN）含量降低，以MATN3下降最顯著，而尿源性干細胞分泌的EVs富含MATN3并將其傳遞給NPC，進而激活TGF-β途徑，促進NPC增殖和ECM合成。Zhu等[57]發現退變髓核中miR-532-5p含量減少，而BMSCs-EVs傳遞的miR-532-5p能負調節RASSF5基因，抑制細胞凋亡和ECM降解。Yuan等[58]發現miR-4450通過下調ZNF121，促進NPC凋亡和炎癥反應，而人臍帶MSCs來源的EVs通過其攜帶的AntagomiR-4450降低Caspase-3、MMP-13、IL-6、IL-1β表達，促進Ⅱ型膠原和ACAN表達。類似報道還有MSCs-EVs通過傳遞miR-142-3p，抑制MLK3/MAPK通路激活，從而減輕IL-1β介導的NPC損傷[59]。
工程化EVs是指對EVs來源的細胞進行改造或對EVs本身進行改造，以增強EVs表面蛋白和內容物的含量，從而提高EVs的靶向能力及治療疾病能力。Liao等[12]報道EVs與TNF-α預處理的NPC共孵育后，會減弱NPC對EVs的攝取及EVs下調NPC焦亡相關蛋白的作用，并發現NPC對EVs攝取是由小泡依賴的內吞作用介導的，而Cavin-2在這一過程中發揮關鍵作用。該團隊通過構建Cavin-2表達載體轉染MSCs，從而獲取高表達Cavin-2的工程化EVs。結果表明該工程化EVs能恢復NPC對EVs的攝取，對受損靶細胞展現出更好的治療效果，提示工程化EVs可能是治療IVDD的一種潛在方法。
水凝膠具有力學性能優良、免疫排斥反應低、親水性好等優點，是再生醫學研究中的熱門材料[60]。Xing等[61]通過構建負載EVs的溫敏水凝膠來治療IVDD，結果顯示該水凝膠不僅能彌補髓核組織ECM的丟失，還可通過持續釋放EVs來抑制NLRP3炎性小體和焦亡，促進NPC增殖，為開發IVDD生物療法提供了新策略。
6 總結與展望
EVs可通過其內容物參與調節椎間盤中髓核、軟骨終板、纖維環功能，維持ECM穩態，減輕炎癥反應。然而，關于EVs治療IVDD的具體機制還有待進一步研究。EVs具有顯著優勢，包括小體積、無免疫原性、低異常分化風險、優良生物相容性和穩定性等，被視為納米醫學和再生醫學中最具前景的候選者之一。但將EVs 用于臨床治療IVDD仍有較長距離，目前臨床研究樣本量有限，相關研究也以動物和細胞實驗為主，均與臨床有一定差異，且存在分離純化、產量有限、儲存的穩定性、工程化的安全性等問題。相信隨著對椎間盤及EVs研究的不斷深入，EVs在IVDD領域的應用前景將更加廣闊。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點及報道
作者貢獻聲明 張賀龍：綜述構思及撰寫論文；魏易凡、馬成：設計文章整體框架，修改整理文章內容；李凌志、陶志文：查閱文獻；任永信：修改并審核全文
椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是多種脊柱疾病發生發展的重要病理基礎，其引起的腰椎間盤突出、退變性腰椎管狹窄、退變性腰椎滑脫等疾病在臨床上常見，嚴重影響患者生活和工作[1]。髓核、軟骨終板、纖維環等結構的異常病理變化均可促進IVDD進展，目前臨床上針對IVDD的治療方法主要為物理治療、藥物治療和必要時手術治療，但均以緩解患者臨床癥狀為主，并不能從病因上逆轉病理狀態[2]。
細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是直徑為30 nm～3 μm的雙層脂質膜囊泡，由細胞分泌到外環境中。隨著研究的深入，人們發現EVs有著強大的生物學功能，在多種疾病的發生發展過程中起著重要作用。本文對EVs治療IVDD的作用及其機制研究進展進行綜述，以期為后續研究和治療提供新思路、新方法。
1 EVs生物學特性
1.1 EVs概況
關于EVs的研究最早可追溯到1967年，是由Wolf團隊[3]發現的具有血小板功能的脂質微粒。20世紀80年代，Pan等[4]在研究羊網織紅細胞時發現了EVs的亞型外泌體，并認為它是細胞清除胞內垃圾物質的一種方式。EVs可由人體大多數細胞分泌[5]，并且廣泛分布在生物流體中，如血漿、尿液、唾液、腹水、膽汁液、腦脊液和羊水等。近年研究發現EVs通過富集其親代細胞的活性信號分子，包括蛋白質、miRNA、mRNA及環狀RNA（circular RNA，circRNA）、脂質等[6]，改變靶細胞功能。在不同生理和病理情況下，EVs中的成分存在差異性表達，這種變化將直接影響EVs對細胞的作用機制，如炎癥、氧化應激、自噬、衰老、凋亡等（圖1）。根據直徑、標志物以及生成方式，EVs可以分為外泌體、微囊泡及凋亡小體3種亞型（表1）。
圖1
EVs對靶細胞的作用機制
Figure1.
The mechanism of EVs on target cells
表1
EVs的3種亞型分型標準
Table1.
Classification criteria for three subtypes of EVs
1.2 EVs分離提取及鑒定方法
EVs常用分離提取方法包括超速離心、密度梯度離心、尺寸排除色譜和基于磁珠的親和捕獲[7]。超速離心法是基于EVs與其他細胞器、細胞碎片的沉降系數不同，進而分離得到EVs。該提取方法簡單，但重復離心可能破壞EVs的囊泡結構。密度梯度離心法是基于EVs與其他雜質的密度差異進行離心分離的方法，與超速離心法相比，能進一步去除雜質蛋白，得到更高純度的EVs[6]。近年出現了納米技術和微流體的新興方法，如切向流過濾、非對稱流場流分選和外泌體檢測方法超快分離系統等。總的來說，現有分離提取方法中，產品純度和產量通常成反比關系。因此，分離提取方法仍需要開發或改進，以期獲得高純度和大規模EVs樣品，促進其臨床應用。
EVs鑒定方法包括生物物理技術及生化檢測方法。其中，EVs 直徑、濃度和形態等物理性狀可采用透射電鏡檢查、流式細胞術、納米顆粒跟蹤分析技術、動態光散射技術、可調電阻脈沖傳感技術等生物物理技術進行觀測。常用生化檢測方法包括ELISA、Western blot、蛋白質組學分析、PCR等，上述方法因實驗原理及操作步驟不同而各有利弊。為了確保生物樣品中EVs的純度和生物活性，有學者推薦至少使用一種生化檢測方法和生物物理技術的組合來鑒定EVs [8]，其中最常用的是Western blot與透射電鏡檢查聯合。
2 EVs與髓核
髓核處于椎間盤中心，周圍是軟骨終板和纖維環，髓核細胞（nucleus pulposus cell，NPC）處于高壓、酸性、乏營養的特殊環境，主要通過產生Ⅱ型膠原和蛋白多糖（aggrecan，ACAN）發揮作用。在炎癥、氧化應激、衰老、凋亡等不利因素影響下，NPC細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成代謝減少，分解代謝增加，ACAN含量減少，Ⅰ型膠原逐漸取代Ⅱ型膠原，導致椎間盤穩態被破壞[9]。如何挽救NPC細胞功能減退和ECM的代謝紊亂，以期恢復椎間盤正常功能，對治療IVDD具有重要意義。
2.1 EVs影響NPC炎癥與氧化應激
炎癥和氧化應激是IVDD發生的早期關鍵事件。近年研究發現，含有核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）的炎癥小體是參與炎癥、氧化應激和細胞焦亡的關鍵分子，有望成為治療IVDD的靶點[10]。Zhang等[11]研究發現miR-410能直接與NLRP3結合，而MSCs分泌的EVs（MSCs-EVs）能傳遞miR-410至NPC，抑制NLRP3的表達。MSCs-EVs通過運輸Prx2，降低NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、焦孔素D-N端的表達水平，發揮抗炎作用[12]。Yuan等[13]報道人臍帶MSCs來源的EVs通過傳遞miR-26a-5p調節NPC中METTL14/NLRP3信號通路，進而抑制下游炎癥因子IL-1β、IL-18的表達。Wen等[14]發現BMSCs來源的EVs（BMSCs-EVs）通過富集miR-199a并靶向GREM1下調TGF-β途徑來延緩IVDD的進展。另外，BMSCs-EVs可通過CIRC_0050205/miR-665/Gpx4軸和CIRC_0072464/miR-431/NRF2途徑，減輕氧化應激對NPC的損傷[15-16]。Lu等[17]研究發現將BMSCs-EVs與IVDD患者的NPC共培養21 d后，NPC合成代謝基因（ACAN、COX-2、Sox-9、基質金屬蛋白酶抑制劑 1）表達上調，基質降解相關的基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）水平被抑制。活性氧由線粒體產生，能夠造成細胞器損傷并促進炎癥介質產生[18-19]，而MSCs-EVs可下調活性氧，發揮抗炎和抗氧化作用[20]。Zhou等[21]研究發現低氧環境下MSCs-EVs中miR-17-5p含量豐富，通過與TLR4結合以促進NPC增殖和ECM合成。NPC來源的EVs （NPC-EVs）對MSCs亦有影響，體外實驗顯示NPC-EVs能誘導MSCs向髓核樣細胞分化、遷移[22]。
2.2 EVs影響NPC衰老
NPC在各種病理因素刺激下易老化，并且衰老的髓核通過分泌促炎因子、基質重塑酶類、趨化因子和生長因子等物質加速退變進展，這被認為是IVDD病理基礎之一[23]。Sun等[24]發現脂肪細胞來源的EVs通過煙酰胺磷酸核糖轉移酶激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成和Sirt1信號通路，從而抑制衰老NPC分泌與衰老相關的表型因子。此外，該團隊還發現MSCs-EVs通過將miR-105-5p傳遞給衰老的NPC并激活Sirt6，發揮延緩衰老作用[25]。Liao等[26]發現二甲雙胍處理后的MSCs-EVs可顯著改善叔丁基過氧化氫誘導的NPC衰老。Chen等[27]使用衰老NPC分泌的EVs處理正常NPC，發現正常細胞增殖和集落形成能力降低，P53和P21表達增強，提示EVs可能含有來自衰老NPC的生物活性物質，并促進周圍正常細胞衰老。
2.3 EVs影響NPC凋亡
凋亡與NPC數量減少關系密切，是導致椎間盤病變的重要因素[28]。研究表明，MSCs-EVs中的miR-21激活PI3K/AKT信號通路，上調抗凋亡蛋白Bcl-2，下調凋亡相關蛋白Bax、cleaved Caspase-3[29]。Sun等[30]發現MSCs-EVs通過傳遞miR-194-5p緩解TNF-α誘導的NPC凋亡。Hu等[31]報道BMSCs-EVs通過抑制氧化應激來減輕壓縮應力負荷介導的NPC凋亡。在重度IVDD脊髓組織NPC分泌的EVs中，circRNA_0000253大量富集，且circRNA_0000253與miRNA141-5p競爭性結合并下調Sirt1，促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9、解聚蛋白樣金屬蛋白酶、MMP的表達[32]。Cui等[33]發現MSCs-EVs中miR-129-5p通過靶向LRG1抑制p38/MAPK信號通路，抑制NPC凋亡。Li等[34]報道在病理性酸性環境中，MSCs-EVs能下調MMP，促進ECM的合成，保護NPC免受酸性環境誘導的細胞凋亡。 Liao等[35]發現MSCs-EVs激活AKT/ERK通路，抑制NPC中晚期糖基化終末產物積累以及與其相關的內質網應激，發揮抗凋亡作用。Xiang等[36]亦發現尿源性干細胞分泌的EVs通過AKT/ERK途徑改善內質網應激。
2.4 EVs影響NPC自噬
自噬與IVDD及EVs的生物發生和分泌活動有關[26, 37]。Zhang等[38]報道在自噬激活劑處理下，NPC分泌的EVs增多，且其高表達的miR-27A靶向MMP-13，抑制ECM降解。Hu等[39]發現自噬可以正向調節細胞骨架蛋白RhoC、ROCK2的表達水平，在NPCs分泌EVs的過程中發揮重要作用。
3 EVs與軟骨終板
軟骨終板由軟骨細胞和ECM構成，位于椎間盤與椎體之間，發揮著提供營養、力學緩沖和維持椎體形態等重要作用[40]。因此，當軟骨終板功能減退后，椎間盤營養供應障礙，促進IVDD的發生發展[41]。近年來，軟骨終板退變機制成為IVDD治療領域研究新方向，而軟骨終板細胞過度凋亡和鈣化是軟骨終板病理改變的兩個主要過程[42] ，受到了越來越多學者關注。
Xie等[43]使用MSCs-EVs與叔丁基過氧化氫誘導的軟骨終板細胞共處理，結果顯示其能顯著下調細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9及鈣化相關蛋白Runx2、BMP-2的表達。此外，EVs中miR-31-5p通過靶向ATF6相關的內質網應激來減輕細胞凋亡和鈣化。Yuan等[44]報道雙氧水誘導的氧化應激促進鈣化并增加EVs的產生，但該EVs協同雙氧水增強鈣化相關基因ALP、骨鈣素、RUNX2的表達，促進軟骨終板礦物質沉積。
Luo等[45]報道軟骨終板干細胞（cartilage endplate stem cell，CESCs）分泌的EVs（CESCs-EVs）促進NPC增殖，并且通過激活PI3K/AKT通路抑制細胞凋亡。此外，該團隊后續研究[46]報道CESCs-EVs也可以通過自分泌途徑作用于其母細胞，激活HIF-1α/Wnt途徑，使CESCs向NPC遷移和分化，產生修復作用。Chen等[47]發現CESCs-EVs富載miR-125-5p，并通過靶向 SUV39H1基因促進NPC自噬，抑制其凋亡。
4 EVs與纖維環
纖維環由纖維環細胞和ECM構成，位于椎間盤外層，在維持椎間盤穩態及脊柱生物力學穩定性中發揮重要作用，并且作為物理屏障，將內部髓核與外部血管和免疫系統隔離開來。
正常椎間盤由于其高濃度蛋白多糖和高壓力的微環境，能抑制血管形成[48]，但是纖維環裂隙和撕裂的形成會削弱其作為物理屏障的作用，促進血管浸潤[49]。Wiet等[50]發現健康纖維環細胞的培養上清可抑制肥大細胞誘導的血管生成。Sun等[51]報道發生退行性變的纖維環細胞分泌的EVs會促進細胞遷移和炎癥因子表達，對人臍靜脈內皮細胞具有促血管生成作用，而正常纖維環細胞分泌的EVs則顯示相反作用，表現出抑制血管生長、維持健康椎間盤的無血管狀態。Sun等[52]報道0.5 MPa壓縮負荷下培養的脊索細胞分泌的EVs高表達miR-140-5p，具有抗血管生成作用。Li等[53]發現BMSCs-EVs通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路減輕纖維環細胞的炎癥和凋亡。
5 EVs應用前景
EVs作為一種新型生物載體在多種疾病治療中有著巨大應用潛力，吸引了科研及臨床轉化領域的廣泛關注。采用EVs傳遞生物活性物質具有以下優勢：① 脂質雙分子層結構可保護傳遞的生物活性物質，避免其降解；② 脂質層上的膜蛋白具有靶向性；③ 為自體細胞產物，生物相容性良好；④ 較高的安全性，能避免細胞移植療法帶來的免疫排斥反應、小血管堵塞、惡性轉化等副作用。
EVs可作為納米載體富集其來源母細胞的生物信息成分或運載特定分子，如mRNA、miRNA、circRNA、蛋白質或藥物等，通過膜融合、細胞表面受體或者內吞方式將內容物傳遞給靶細胞[54-55]。有研究報道，MSCs-EVs可向髓核提供線粒體蛋白，恢復受損線粒體[20]。Guo等[56]報道在退變的椎間盤中人母系蛋白（matrilin，MATN）含量降低，以MATN3下降最顯著，而尿源性干細胞分泌的EVs富含MATN3并將其傳遞給NPC，進而激活TGF-β途徑，促進NPC增殖和ECM合成。Zhu等[57]發現退變髓核中miR-532-5p含量減少，而BMSCs-EVs傳遞的miR-532-5p能負調節RASSF5基因，抑制細胞凋亡和ECM降解。Yuan等[58]發現miR-4450通過下調ZNF121，促進NPC凋亡和炎癥反應，而人臍帶MSCs來源的EVs通過其攜帶的AntagomiR-4450降低Caspase-3、MMP-13、IL-6、IL-1β表達，促進Ⅱ型膠原和ACAN表達。類似報道還有MSCs-EVs通過傳遞miR-142-3p，抑制MLK3/MAPK通路激活，從而減輕IL-1β介導的NPC損傷[59]。
工程化EVs是指對EVs來源的細胞進行改造或對EVs本身進行改造，以增強EVs表面蛋白和內容物的含量，從而提高EVs的靶向能力及治療疾病能力。Liao等[12]報道EVs與TNF-α預處理的NPC共孵育后，會減弱NPC對EVs的攝取及EVs下調NPC焦亡相關蛋白的作用，并發現NPC對EVs攝取是由小泡依賴的內吞作用介導的，而Cavin-2在這一過程中發揮關鍵作用。該團隊通過構建Cavin-2表達載體轉染MSCs，從而獲取高表達Cavin-2的工程化EVs。結果表明該工程化EVs能恢復NPC對EVs的攝取，對受損靶細胞展現出更好的治療效果，提示工程化EVs可能是治療IVDD的一種潛在方法。
水凝膠具有力學性能優良、免疫排斥反應低、親水性好等優點，是再生醫學研究中的熱門材料[60]。Xing等[61]通過構建負載EVs的溫敏水凝膠來治療IVDD，結果顯示該水凝膠不僅能彌補髓核組織ECM的丟失，還可通過持續釋放EVs來抑制NLRP3炎性小體和焦亡，促進NPC增殖，為開發IVDD生物療法提供了新策略。
6 總結與展望
EVs可通過其內容物參與調節椎間盤中髓核、軟骨終板、纖維環功能，維持ECM穩態，減輕炎癥反應。然而，關于EVs治療IVDD的具體機制還有待進一步研究。EVs具有顯著優勢，包括小體積、無免疫原性、低異常分化風險、優良生物相容性和穩定性等，被視為納米醫學和再生醫學中最具前景的候選者之一。但將EVs 用于臨床治療IVDD仍有較長距離，目前臨床研究樣本量有限，相關研究也以動物和細胞實驗為主，均與臨床有一定差異，且存在分離純化、產量有限、儲存的穩定性、工程化的安全性等問題。相信隨著對椎間盤及EVs研究的不斷深入，EVs在IVDD領域的應用前景將更加廣闊。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點及報道
作者貢獻聲明 張賀龍：綜述構思及撰寫論文；魏易凡、馬成：設計文章整體框架，修改整理文章內容；李凌志、陶志文：查閱文獻；任永信：修改并審核全文
