引用本文： 陳啟予, 王雯, 袁長永, 王鵬來. 基質剛度調控內皮細胞出芽的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(2): 202-207. doi: 10.7507/1002-1892.202210019 復制
組織工程復合物植入體內需要血管生成，只有充分血管化才能實現組織修復再生[1-4]。大量研究表明內皮細胞出芽是血管化的起始和關鍵步驟，即內皮細胞在多種促血管生成信號刺激下被激活，細胞間連接松動，細胞穿透基底膜，朝向刺激信號增殖、遷移，最終形成血管芽的過程[5-9]。尖端細胞、莖細胞、隊列細胞3種內皮細胞在該過程中起主要作用。其中，尖端細胞位于出芽部位尖端，具有運動性與侵襲性，在生成血管形態中發揮決定性作用[6, 10-12]；莖細胞在合適條件下增殖、延伸出芽血管并形成管腔[10]；隊列細胞位于出芽部位末端，是血管內皮重要組成部分[13]。
內皮細胞出芽作為血管化的重要步驟，受細胞外基質影響與調控。工程化組織中的生物材料模擬細胞外基質，其孔徑、孔隙率、結構成分、基質剛度等理化性質可以影響組織形成過程中細胞的生物學行為與功能[14-17] 。多項研究指出，生物材料的基質剛度對內皮細胞出芽具有顯著影響[10, 16, 18-20]，但機制尚不明確。現對基質剛度調控內皮細胞出芽的作用及潛在分子機制研究進展進行歸納總結，以期為相關研究提供參考。
1 調控作用
1.1 二維細胞培養條件
二維細胞培養條件即通過培養皿提供細胞水平伸展生存空間的單層系統，文獻報道在此培養條件下，生物材料高基質剛度能促進內皮細胞出芽，其作用主要表現為松動細胞間連接及促進內皮細胞增殖、遷移與侵襲兩方面[21-24]。
一方面，高基質剛度可松動細胞間連接，進而促進內皮細胞出芽。血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）是內皮細胞特異性黏附分子，為內皮細胞間連接的關鍵分子[21]。VE-cadherin隨基質剛度變化而發生改變，在剛性膠原中細胞間呈更寬的點狀連接，而在順應性膠原中細胞間呈連續性連接[23]。基質剛度可調節VE-cadherin在細胞膜上的分布，高基質剛度會破壞黏附連接的完整性，使內皮細胞間連接松動，破壞內皮屏障，增加細胞膜的通透性，從而破壞了原先穩定的血管結構以促使內皮細胞遷移，血管芽數目增多[10, 22]。
另一方面，高基質剛度亦可刺激內皮細胞增殖、遷移與侵襲，繼而促進內皮細胞出芽，血管芽數目增加。細胞遷移影響功能性血管網絡組建，是對出芽式血管生成起決定性作用的細胞行為。大量研究表明，在一定范圍內隨著基質剛度升高，尖端細胞遷移能力逐漸增強[10, 16, 24]。Guo等[10]發現在3～70 kPa范圍時，隨著基質剛度的提升，內皮細胞擴散距離與血管芽數目不斷增加。Zhao等[16]通過將A549細胞與人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）進行共培養，底物材料基質剛度分別為6、16、54、135 kPa，發現在較硬的底物上HUVECs分泌的基質金屬蛋白酶較多，展現出更強的細胞侵襲與遷移能力。Wang等[24]的研究也證實將HUVECs放置在不同基質剛度底物上培養時，高基質剛度底物上的HUVECs增殖率、遷移速度明顯高于低基質剛度底物。
以上研究提示二維細胞培養條件下，生物材料基質剛度增加會促進出芽式血管生成，且呈剛度依賴性。
1.2 三維細胞培養條件
近年來三維細胞培養體系逐漸完善，即利用支架實現細胞多向生長的多層系統，可以通過調整支架結構及環境參數（如形狀、孔隙、分子網絡等）來更好地模擬體內細胞外微環境[15, 25]。
三維細胞培養條件下，在一定范圍內隨著基質剛度的升高，內皮細胞新生血管芽數目增加。Guo等[10]利用三維內皮細胞球狀體模具發現，在1～6 kPa范圍內隨著基質剛度升高，內皮細胞球狀體上的新生血管芽數目及細胞侵襲距離均增加。Berger等[26-27]研發出一種甲基丙烯酰化明膠和Ⅰ型膠原蛋白的新型互穿網絡材料模擬細胞外基質，該水凝膠系統能在保持基質含量恒定的前提下，于彈性模量2～12 kPa范圍內獨立調節支架基質剛度，使培養細胞免受纖維密度改變的影響。采用以上這些支架模擬細胞外基質培養細胞后，內皮細胞遷移擴散、新生血管芽數目、分支、血管密度都隨基質剛度的提高而增加。
然而也有研究指出，在基質濃度較高的情況下增強基質剛度，不僅血管化程度會降低，血管長度、新生血管芽直徑、細胞連接數目和血管管腔面積均明顯降低[28-29]。
由此可見，三維細胞培養條件下生物材料基質剛度調控出芽式血管生成的作用十分復雜，不同病理情況、組織特異性、基質成分差異等都可能對出芽結果產生一定影響[15]，仍需進一步明確。
2 分子機制
2.1 YAP/TAZ相關調控機制
Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）及其同源蛋白轉錄共激活因子PDZ結合基序（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）激活后轉移入細胞核，在核內結合并激活特定轉錄因子，促進特定基因轉錄，進而調控細胞增殖、分化、遷移等行為。多項研究表明，高基質剛度促進YAP/TAZ核轉位[10, 30-34]。Guo等[10]認為高基質剛度阻止YAP/TAZ磷酸化，并激活YAP/TAZ，促進未磷酸化的YAP/TAZ從細胞質轉向細胞核內，通過機械轉導激活YAP/TAZ依賴的轉錄程序，進而促進尖端細胞遷移。Kim等[6]的研究還證實機械轉導激活YAP/TAZ可以調節肌動蛋白細胞骨架重排，引起內皮細胞在血管生成過程中的代謝改變，隨之影響尖端細胞形成。此外，高基質剛度促進內皮細胞出芽，而采用YAP抑制劑維替泊芬導致YAP/TAZ滯留在細胞質內后，新生血管芽數目和侵襲距離會顯著降低，逆轉了內皮細胞出芽增加的趨勢[10]。上述研究提示，YAP/TAZ在基質剛度調控的內皮細胞出芽中發揮重要作用。
然而，YAP/TAZ上、下游信號分子尚未明確，目前已發現p-PXN-Rac1-YAP/TAZ信號通路、VEGF/VEGFR-2-YAP/TAZ信號通路、PP2A-YAP/TAZ信號通路、YAP/TAZ-MYC信號通路、YAP/TAZ-DLC1信號通路等參與介導高基質剛度調控的促血管生成效應。
2.1.1 p-PXN、Rac1介導基質剛度調控YAP/TAZ核轉位
樁蛋白（paxillin，PXN）作為機械傳感的跨膜蛋白，輔助黏著斑激酶一同參與內皮細胞與基質的黏附[35]。基質剛度增加可以提高細胞內磷酸化PXN（phosphorylated-PXN，p-PXN）水平，p-PXN激活可以增加Y-658位VE-cadherin的磷酸化，該位點磷酸化會導致內皮細胞黏附連接紊亂，破壞了原先完整的血管結構，促進內皮細胞遷移[10]。PXN過表達還可增加尖端細胞富集基因表達，促進尖端細胞生成和出芽[36]。此外，p-PXN水平增高可激活Rac1，使更多的Rac1從非活躍的Rac1-GDP狀態轉變為活躍的Rac1-GTP狀態，而Rac1活性與基質剛度調控的內皮細胞出芽成正相關。有研究將Rac siRNA注射至小鼠體內，發現發育中的視網膜血管生成被明顯抑制，尖端細胞數目顯著減少。
進一步研究發現，p-PXN可通過激活Rac1使YAP入核增加，采用Rac1抑制劑EHT1864能減少YAP核轉位。上述研究表明YAP作為p-PXN、Rac1的下游效應器參與誘導高基質剛度條件下尖端細胞的形成與出芽式血管生成。
2.1.2 VEGF/VEGFR-2信號介導基質剛度調控YAP/TAZ核轉位
VEGF及其信號轉導受體VEGFR-2在刺激內皮細胞出芽及調節血管生成過程中發揮重要作用[24]。基質剛度增加導致基質蛋白結構發生重排，VEGF和細胞膜表面VEGFR-2的結合位點暴露，更多的VEGF與VEGFR-2 結合可激活VEGFR-2以誘導下游信號的表達[16, 37]。此外，VEGFR-2也可作為獨立的機械感受器，在不與配體結合的情況下被高基質剛度激活，發生磷酸化和內吞作用并進行機械轉導，產生細胞內的生化信號級聯反應，以促進血管生成[38]。Wang等[24]的實驗發現在HUVECs中VEGFR-2 mRNA表達隨基質剛度的增加而上調。
YAP/TAZ作為VEGFR-2的下游轉錄因子，在高基質剛度條件下被激活并移位到細胞核內，促進了新生血管芽的萌出[16]。Wang等[30]通過使用VEGFR-2功能性阻斷抗體αEGFR2刺激小鼠腦血管瘤細胞，抑制了YAP/TAZ磷酸化減少現象以及YAP/TAZ核轉位趨勢。
2.1.3 PP2A介導基質剛度調控YAP核轉位
蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一種YAP磷酸酶，參與多種信號轉導途徑，調節高基質剛度條件下內皮細胞增殖。作為YAP上游信號分子，PP2A在基質剛度調節YAP的激活與入核中起重要作用[18, 31]。采用PP2A抑制劑LB100可逆轉高基質剛度情況下HUVECs中YAP低磷酸化現象，YAP細胞質定位增加，YAP靶基因表達水平下降，最終導致HUVECs增殖減少，提示高基質剛度條件下PP2A調控YAP/TAZ核轉位，從而促進血管生成[31]。
2.1.4 YAP/TAZ可通過DLC1調控內皮細胞遷移
DLC1基因與基質剛度介導出芽式血管生成過程中的內皮細胞遷移存在密切關系。研究發現，在高基質剛度條件下HUVECs中DLC1 mRNA表達水平上調，細胞極化并集體遷移以促進內皮細胞出芽。DLC1作為YAP/TAZ的直接轉錄靶點，YAP/TAZ的激活足以驅動DLC1的表達。在高基質剛度條件下敲除基于shRNA的YAP/TAZ基因，DLC1表達明顯降低，表明DLC1可能作為YAP/TAZ下游信號參與基質剛度調控的內皮細胞遷移及出芽式血管生成[39]。
2.1.5 YAP/TAZ可通過MYC調控內皮細胞代謝
MYC基因是糖酵解、線粒體代謝和細胞生長的強大驅動力，而代謝活性在控制尖端細胞和莖細胞出芽過程中尤為重要。MYC作為YAP/TAZ下游效應因子，YAP/TAZ的激活會促進MYC蛋白表達水平上調，表明YAP/TAZ可能通過MYC信號調節尖端細胞和莖細胞在內皮細胞出芽增殖和遷移過程中的代謝，進而促進血管生成[6]。
2.2 其他調控機制
2.2.1 整合素αVβ3/SEPT9/Src/Vav2/RhoA信號通路參與調節內皮細胞增殖
Rho GTP酶是細胞骨架動力學的主要參與者，在細胞骨架重組、隨之改變細胞行為以應對機械環境變化過程中起關鍵調控作用[40]。其中，RhoA為Rho GTP酶家族的重要成員，RhoA活性改變及其對肌動蛋白分布進行調節，可能影響基質剛度調控的內皮細胞增殖和遷移[41]。Yeh等[19]發現相較于低基質剛度水凝膠（1.72 kPa），內皮細胞在高基質剛度水凝膠（21.5 kPa）中表現出更高RhoA活性，肌動蛋白水平上調，細胞增殖。
細胞外的力學信號可經細胞膜上的整合素轉導到細胞內，許多研究指出整合素對基質剛度介導的內皮細胞侵襲、遷移以及血管生成十分敏感[37, 40]。GTP結合蛋白Septin 9（SEPT9）作為負向RhoA調控分子，Src和Vav2作為正向RhoA調控分子，共同參與整合素和Rho GTP酶信號通路之間的聯系。抗體LM609阻斷整合素αVβ3能顯著增加SEPT9的表達，抑制Src和Vav2的激活與磷酸化，RhoA活性降低，從而導致內皮細胞增殖被抑制[19]。以上研究提示，高基質剛度激活整合素αVβ3，抑制SEPT9，激活Src和Vav2，進而提升RhoA活性，從而促進內皮細胞增殖。
2.2.2 整合素αVβ5/PKB/Sp1信號通路參與調節VEGFR-2表達
已有實驗發現，在高基質剛度條件下HUVECs蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的磷酸化水平和Sp1的核表達上調，而轉錄因子Sp1可與VEGFR-2基因啟動子結合，繼而促進VEGFR-2轉錄，在高基質剛度條件下高表達血管生成相關基因，以發揮促血管生成作用，提示PKB/Sp1可能與高基質剛度刺激內皮細胞中VEGFR-2高表達具有一定聯系。整合素αVβ5作為重要的剛度敏感分子，介導高基質剛度誘導VEGFR-2上調。敲除整合素αVβ5能對高基質剛度條件下內皮細胞中PKB磷酸化、Sp1核表達上調以及VEGFR-2高表達產生逆轉作用。上述研究表明，在高基質剛度條件下，整合素αVβ5被激活，催化PKB磷酸化，增加Sp1核表達，進一步刺激內皮細胞中VEGFR-2高表達以促進血管生成[24]。
3 總結與展望
二維細胞培養條件下，生物材料基質剛度對內皮細胞出芽的作用較明確，在一定范圍內提高基質剛度能促進內皮細胞出芽。然而二維細胞培養環境與細胞體內三維生長環境相差較大。隨著三維細胞培養模型的逐漸成熟與普及，三維細胞培養環境下基質剛度對內皮細胞出芽的影響正逐步揭示。大部分研究表明基質剛度增加會促進血管新生，但也有小部分研究得到相反結論。目前，三維細胞培養環境下基質剛度對內皮細胞出芽及成血管的作用及其分子機制尚不明確。
基質剛度調控內皮細胞出芽的分子機制尚未完全闡明。現階段相關研究主要聚焦于YAP/TAZ及其上、下游信號分子的作用，包括較為核心的p-PXN-Rac1-YAP/TAZ信號通路、VEGF/VEGFR2-YAP/TAZ信號通路，以及PP2A-YAP/TAZ信號通路、YAP/TAZ-MYC信號通路、YAP/TAZ-DLC1信號通路等，YAP/TAZ更多的上、下游信號分子仍需深入探索。此外，整合素αVβ3/SEPT9/Src/Vav2/RhoA信號通路和整合素αVβ5/PKB/Sp1信號通路同樣參與介導基質剛度調控內皮細胞出芽。見表1。
表1
不同分子在基質剛度調控內皮細胞出芽中對信號通路的介導機制
Table1.
The mechanism of different molecules mediating signal pathways in matrix stiffness regulating endothelial cell sprouting
綜上述，當前對于基質剛度調控內皮細胞出芽的作用及其分子機制仍不明確，需進一步研究，以期為生物材料改良、精準調控組織工程復合物血管化提供靶標，進一步提高組織工程復合物的組織再生能力。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 陳啟予：查閱文獻、內容構思、綜述撰寫；王雯：參與觀點形成，對綜述修改提出建設性意見；袁長永、王鵬來：綜述審閱、觀點補充
組織工程復合物植入體內需要血管生成，只有充分血管化才能實現組織修復再生[1-4]。大量研究表明內皮細胞出芽是血管化的起始和關鍵步驟，即內皮細胞在多種促血管生成信號刺激下被激活，細胞間連接松動，細胞穿透基底膜，朝向刺激信號增殖、遷移，最終形成血管芽的過程[5-9]。尖端細胞、莖細胞、隊列細胞3種內皮細胞在該過程中起主要作用。其中，尖端細胞位于出芽部位尖端，具有運動性與侵襲性，在生成血管形態中發揮決定性作用[6, 10-12]；莖細胞在合適條件下增殖、延伸出芽血管并形成管腔[10]；隊列細胞位于出芽部位末端，是血管內皮重要組成部分[13]。
內皮細胞出芽作為血管化的重要步驟，受細胞外基質影響與調控。工程化組織中的生物材料模擬細胞外基質，其孔徑、孔隙率、結構成分、基質剛度等理化性質可以影響組織形成過程中細胞的生物學行為與功能[14-17] 。多項研究指出，生物材料的基質剛度對內皮細胞出芽具有顯著影響[10, 16, 18-20]，但機制尚不明確。現對基質剛度調控內皮細胞出芽的作用及潛在分子機制研究進展進行歸納總結，以期為相關研究提供參考。
1 調控作用
1.1 二維細胞培養條件
二維細胞培養條件即通過培養皿提供細胞水平伸展生存空間的單層系統，文獻報道在此培養條件下，生物材料高基質剛度能促進內皮細胞出芽，其作用主要表現為松動細胞間連接及促進內皮細胞增殖、遷移與侵襲兩方面[21-24]。
一方面，高基質剛度可松動細胞間連接，進而促進內皮細胞出芽。血管內皮細胞鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）是內皮細胞特異性黏附分子，為內皮細胞間連接的關鍵分子[21]。VE-cadherin隨基質剛度變化而發生改變，在剛性膠原中細胞間呈更寬的點狀連接，而在順應性膠原中細胞間呈連續性連接[23]。基質剛度可調節VE-cadherin在細胞膜上的分布，高基質剛度會破壞黏附連接的完整性，使內皮細胞間連接松動，破壞內皮屏障，增加細胞膜的通透性，從而破壞了原先穩定的血管結構以促使內皮細胞遷移，血管芽數目增多[10, 22]。
另一方面，高基質剛度亦可刺激內皮細胞增殖、遷移與侵襲，繼而促進內皮細胞出芽，血管芽數目增加。細胞遷移影響功能性血管網絡組建，是對出芽式血管生成起決定性作用的細胞行為。大量研究表明，在一定范圍內隨著基質剛度升高，尖端細胞遷移能力逐漸增強[10, 16, 24]。Guo等[10]發現在3～70 kPa范圍時，隨著基質剛度的提升，內皮細胞擴散距離與血管芽數目不斷增加。Zhao等[16]通過將A549細胞與人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）進行共培養，底物材料基質剛度分別為6、16、54、135 kPa，發現在較硬的底物上HUVECs分泌的基質金屬蛋白酶較多，展現出更強的細胞侵襲與遷移能力。Wang等[24]的研究也證實將HUVECs放置在不同基質剛度底物上培養時，高基質剛度底物上的HUVECs增殖率、遷移速度明顯高于低基質剛度底物。
以上研究提示二維細胞培養條件下，生物材料基質剛度增加會促進出芽式血管生成，且呈剛度依賴性。
1.2 三維細胞培養條件
近年來三維細胞培養體系逐漸完善，即利用支架實現細胞多向生長的多層系統，可以通過調整支架結構及環境參數（如形狀、孔隙、分子網絡等）來更好地模擬體內細胞外微環境[15, 25]。
三維細胞培養條件下，在一定范圍內隨著基質剛度的升高，內皮細胞新生血管芽數目增加。Guo等[10]利用三維內皮細胞球狀體模具發現，在1～6 kPa范圍內隨著基質剛度升高，內皮細胞球狀體上的新生血管芽數目及細胞侵襲距離均增加。Berger等[26-27]研發出一種甲基丙烯酰化明膠和Ⅰ型膠原蛋白的新型互穿網絡材料模擬細胞外基質，該水凝膠系統能在保持基質含量恒定的前提下，于彈性模量2～12 kPa范圍內獨立調節支架基質剛度，使培養細胞免受纖維密度改變的影響。采用以上這些支架模擬細胞外基質培養細胞后，內皮細胞遷移擴散、新生血管芽數目、分支、血管密度都隨基質剛度的提高而增加。
然而也有研究指出，在基質濃度較高的情況下增強基質剛度，不僅血管化程度會降低，血管長度、新生血管芽直徑、細胞連接數目和血管管腔面積均明顯降低[28-29]。
由此可見，三維細胞培養條件下生物材料基質剛度調控出芽式血管生成的作用十分復雜，不同病理情況、組織特異性、基質成分差異等都可能對出芽結果產生一定影響[15]，仍需進一步明確。
2 分子機制
2.1 YAP/TAZ相關調控機制
Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）及其同源蛋白轉錄共激活因子PDZ結合基序（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）激活后轉移入細胞核，在核內結合并激活特定轉錄因子，促進特定基因轉錄，進而調控細胞增殖、分化、遷移等行為。多項研究表明，高基質剛度促進YAP/TAZ核轉位[10, 30-34]。Guo等[10]認為高基質剛度阻止YAP/TAZ磷酸化，并激活YAP/TAZ，促進未磷酸化的YAP/TAZ從細胞質轉向細胞核內，通過機械轉導激活YAP/TAZ依賴的轉錄程序，進而促進尖端細胞遷移。Kim等[6]的研究還證實機械轉導激活YAP/TAZ可以調節肌動蛋白細胞骨架重排，引起內皮細胞在血管生成過程中的代謝改變，隨之影響尖端細胞形成。此外，高基質剛度促進內皮細胞出芽，而采用YAP抑制劑維替泊芬導致YAP/TAZ滯留在細胞質內后，新生血管芽數目和侵襲距離會顯著降低，逆轉了內皮細胞出芽增加的趨勢[10]。上述研究提示，YAP/TAZ在基質剛度調控的內皮細胞出芽中發揮重要作用。
然而，YAP/TAZ上、下游信號分子尚未明確，目前已發現p-PXN-Rac1-YAP/TAZ信號通路、VEGF/VEGFR-2-YAP/TAZ信號通路、PP2A-YAP/TAZ信號通路、YAP/TAZ-MYC信號通路、YAP/TAZ-DLC1信號通路等參與介導高基質剛度調控的促血管生成效應。
2.1.1 p-PXN、Rac1介導基質剛度調控YAP/TAZ核轉位
樁蛋白（paxillin，PXN）作為機械傳感的跨膜蛋白，輔助黏著斑激酶一同參與內皮細胞與基質的黏附[35]。基質剛度增加可以提高細胞內磷酸化PXN（phosphorylated-PXN，p-PXN）水平，p-PXN激活可以增加Y-658位VE-cadherin的磷酸化，該位點磷酸化會導致內皮細胞黏附連接紊亂，破壞了原先完整的血管結構，促進內皮細胞遷移[10]。PXN過表達還可增加尖端細胞富集基因表達，促進尖端細胞生成和出芽[36]。此外，p-PXN水平增高可激活Rac1，使更多的Rac1從非活躍的Rac1-GDP狀態轉變為活躍的Rac1-GTP狀態，而Rac1活性與基質剛度調控的內皮細胞出芽成正相關。有研究將Rac siRNA注射至小鼠體內，發現發育中的視網膜血管生成被明顯抑制，尖端細胞數目顯著減少。
進一步研究發現，p-PXN可通過激活Rac1使YAP入核增加，采用Rac1抑制劑EHT1864能減少YAP核轉位。上述研究表明YAP作為p-PXN、Rac1的下游效應器參與誘導高基質剛度條件下尖端細胞的形成與出芽式血管生成。
2.1.2 VEGF/VEGFR-2信號介導基質剛度調控YAP/TAZ核轉位
VEGF及其信號轉導受體VEGFR-2在刺激內皮細胞出芽及調節血管生成過程中發揮重要作用[24]。基質剛度增加導致基質蛋白結構發生重排，VEGF和細胞膜表面VEGFR-2的結合位點暴露，更多的VEGF與VEGFR-2 結合可激活VEGFR-2以誘導下游信號的表達[16, 37]。此外，VEGFR-2也可作為獨立的機械感受器，在不與配體結合的情況下被高基質剛度激活，發生磷酸化和內吞作用并進行機械轉導，產生細胞內的生化信號級聯反應，以促進血管生成[38]。Wang等[24]的實驗發現在HUVECs中VEGFR-2 mRNA表達隨基質剛度的增加而上調。
YAP/TAZ作為VEGFR-2的下游轉錄因子，在高基質剛度條件下被激活并移位到細胞核內，促進了新生血管芽的萌出[16]。Wang等[30]通過使用VEGFR-2功能性阻斷抗體αEGFR2刺激小鼠腦血管瘤細胞，抑制了YAP/TAZ磷酸化減少現象以及YAP/TAZ核轉位趨勢。
2.1.3 PP2A介導基質剛度調控YAP核轉位
蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是一種YAP磷酸酶，參與多種信號轉導途徑，調節高基質剛度條件下內皮細胞增殖。作為YAP上游信號分子，PP2A在基質剛度調節YAP的激活與入核中起重要作用[18, 31]。采用PP2A抑制劑LB100可逆轉高基質剛度情況下HUVECs中YAP低磷酸化現象，YAP細胞質定位增加，YAP靶基因表達水平下降，最終導致HUVECs增殖減少，提示高基質剛度條件下PP2A調控YAP/TAZ核轉位，從而促進血管生成[31]。
2.1.4 YAP/TAZ可通過DLC1調控內皮細胞遷移
DLC1基因與基質剛度介導出芽式血管生成過程中的內皮細胞遷移存在密切關系。研究發現，在高基質剛度條件下HUVECs中DLC1 mRNA表達水平上調，細胞極化并集體遷移以促進內皮細胞出芽。DLC1作為YAP/TAZ的直接轉錄靶點，YAP/TAZ的激活足以驅動DLC1的表達。在高基質剛度條件下敲除基于shRNA的YAP/TAZ基因，DLC1表達明顯降低，表明DLC1可能作為YAP/TAZ下游信號參與基質剛度調控的內皮細胞遷移及出芽式血管生成[39]。
2.1.5 YAP/TAZ可通過MYC調控內皮細胞代謝
MYC基因是糖酵解、線粒體代謝和細胞生長的強大驅動力，而代謝活性在控制尖端細胞和莖細胞出芽過程中尤為重要。MYC作為YAP/TAZ下游效應因子，YAP/TAZ的激活會促進MYC蛋白表達水平上調，表明YAP/TAZ可能通過MYC信號調節尖端細胞和莖細胞在內皮細胞出芽增殖和遷移過程中的代謝，進而促進血管生成[6]。
2.2 其他調控機制
2.2.1 整合素αVβ3/SEPT9/Src/Vav2/RhoA信號通路參與調節內皮細胞增殖
Rho GTP酶是細胞骨架動力學的主要參與者，在細胞骨架重組、隨之改變細胞行為以應對機械環境變化過程中起關鍵調控作用[40]。其中，RhoA為Rho GTP酶家族的重要成員，RhoA活性改變及其對肌動蛋白分布進行調節，可能影響基質剛度調控的內皮細胞增殖和遷移[41]。Yeh等[19]發現相較于低基質剛度水凝膠（1.72 kPa），內皮細胞在高基質剛度水凝膠（21.5 kPa）中表現出更高RhoA活性，肌動蛋白水平上調，細胞增殖。
細胞外的力學信號可經細胞膜上的整合素轉導到細胞內，許多研究指出整合素對基質剛度介導的內皮細胞侵襲、遷移以及血管生成十分敏感[37, 40]。GTP結合蛋白Septin 9（SEPT9）作為負向RhoA調控分子，Src和Vav2作為正向RhoA調控分子，共同參與整合素和Rho GTP酶信號通路之間的聯系。抗體LM609阻斷整合素αVβ3能顯著增加SEPT9的表達，抑制Src和Vav2的激活與磷酸化，RhoA活性降低，從而導致內皮細胞增殖被抑制[19]。以上研究提示，高基質剛度激活整合素αVβ3，抑制SEPT9，激活Src和Vav2，進而提升RhoA活性，從而促進內皮細胞增殖。
2.2.2 整合素αVβ5/PKB/Sp1信號通路參與調節VEGFR-2表達
已有實驗發現，在高基質剛度條件下HUVECs蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）的磷酸化水平和Sp1的核表達上調，而轉錄因子Sp1可與VEGFR-2基因啟動子結合，繼而促進VEGFR-2轉錄，在高基質剛度條件下高表達血管生成相關基因，以發揮促血管生成作用，提示PKB/Sp1可能與高基質剛度刺激內皮細胞中VEGFR-2高表達具有一定聯系。整合素αVβ5作為重要的剛度敏感分子，介導高基質剛度誘導VEGFR-2上調。敲除整合素αVβ5能對高基質剛度條件下內皮細胞中PKB磷酸化、Sp1核表達上調以及VEGFR-2高表達產生逆轉作用。上述研究表明，在高基質剛度條件下，整合素αVβ5被激活，催化PKB磷酸化，增加Sp1核表達，進一步刺激內皮細胞中VEGFR-2高表達以促進血管生成[24]。
3 總結與展望
二維細胞培養條件下，生物材料基質剛度對內皮細胞出芽的作用較明確，在一定范圍內提高基質剛度能促進內皮細胞出芽。然而二維細胞培養環境與細胞體內三維生長環境相差較大。隨著三維細胞培養模型的逐漸成熟與普及，三維細胞培養環境下基質剛度對內皮細胞出芽的影響正逐步揭示。大部分研究表明基質剛度增加會促進血管新生，但也有小部分研究得到相反結論。目前，三維細胞培養環境下基質剛度對內皮細胞出芽及成血管的作用及其分子機制尚不明確。
基質剛度調控內皮細胞出芽的分子機制尚未完全闡明。現階段相關研究主要聚焦于YAP/TAZ及其上、下游信號分子的作用，包括較為核心的p-PXN-Rac1-YAP/TAZ信號通路、VEGF/VEGFR2-YAP/TAZ信號通路，以及PP2A-YAP/TAZ信號通路、YAP/TAZ-MYC信號通路、YAP/TAZ-DLC1信號通路等，YAP/TAZ更多的上、下游信號分子仍需深入探索。此外，整合素αVβ3/SEPT9/Src/Vav2/RhoA信號通路和整合素αVβ5/PKB/Sp1信號通路同樣參與介導基質剛度調控內皮細胞出芽。見表1。
表1
不同分子在基質剛度調控內皮細胞出芽中對信號通路的介導機制
Table1.
The mechanism of different molecules mediating signal pathways in matrix stiffness regulating endothelial cell sprouting
綜上述，當前對于基質剛度調控內皮細胞出芽的作用及其分子機制仍不明確，需進一步研究，以期為生物材料改良、精準調控組織工程復合物血管化提供靶標，進一步提高組織工程復合物的組織再生能力。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 陳啟予：查閱文獻、內容構思、綜述撰寫；王雯：參與觀點形成，對綜述修改提出建設性意見；袁長永、王鵬來：綜述審閱、觀點補充
