引用本文： 熊風, 姚成, 周梁爽, 李偉峰, 魏幫國, 官建中, 毛穎基. 白藜蘆醇-固體脂質納米粒促BMSCs成骨分化實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(9): 1155-1165. doi: 10.7507/1002-1892.202205009 復制
骨穩態失衡是骨質疏松和類風濕關節炎等疾病的主要發病機制[1-2]。其中，破骨細胞主要介導體內骨吸收；成骨細胞主要介導體內骨形成，多來源于BMSCs，是骨形成過程中至關重要的功能細胞。因此，通過促進BMSCs向成骨細胞分化來增加骨形成和/或抑制破骨細胞分化來減少骨吸收，是一種很有前景的骨穩態失衡類疾病治療方法[3-4]。
研究表明，白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種天然植物類雌激素[5]，不僅能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化以及大面積骨缺損的骨再生，還能通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細胞分化和減少骨吸收，有望應用于骨穩態失衡疾病的治療[6-8]。然而Res的低水溶性和高濃度依賴性等缺點限制了其在臨床的廣泛應用[5，9-10]。因此，如何提高Res的生物利用率和藥物效率等，對Res的廣泛應用至關重要。
固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）是一種新型亞微米膠體載體，具有增強藥物溶解度、改善生物相容性、增加生物利用度和保護藥物穩定性等諸多優點[11]。Qushawy等[12]制備了負載卡馬西平的SLNs，發現卡馬西平的抗驚厥作用得到增強；Loureiro等[13]發現將Res和葡萄提取物包封到SLNs中可增強細胞攝取能力，可用于治療阿爾茨海默病。然而，目前尚未見關于負載Res的SLNs對BMSCs成骨分化影響的研究。本研究擬通過高溫乳化-低溫固化法[8，14]設計并制備Res-SLNs，研究利用SLNs的生物學特性增強Res促BMSCs體外成骨分化的效果，為骨穩態失衡疾病的治療提供一種方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2周齡SPF級雄性SD大鼠4只，體質量（80±10）g，購于濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。
Res ［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（Myrj 52）、DMSO（Sigma公司，美國）；硬脂酸、氯仿（中國醫藥集團有限公司）；卵磷脂、DAPI、茜素紅S（alizarin red S，ARS）染色液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、4%多聚甲醛溶液、青霉素-鏈霉素雙抗（合肥Biosharp公司）；成骨誘導分化培養基、活/死細胞雙染試劑盒（Cyagen公司，美國）；ALP染色試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、熒光Cy3二抗（Abcam公司，英國）；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；F12基礎培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）。
光譜儀（Malvern公司，英國）；紫外分光光度計（Varian公司，澳大利亞）； DF-101S集熱式攪拌器（江蘇科析儀器有限公司）；GZ120-S數顯型懸臂式恒速強力電動攪拌機（上海壘固儀器有限公司）；實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；大容量超速離心機（Beckman公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 Res-SLNs的合成與表征
1.2.1 Res-SLNs合成
根據我們前期研究，采用高溫乳化-低溫固化法合成Res-SLNs[8]。具體操作：在高溫水浴攪拌下，將由氯仿、硬脂酸、卵磷脂和Res組成的有機相緩慢注入由超純水和Myrj 52組成的水相；通過低溫攪拌固化、低溫離心和超純水反復洗滌純化，冷凍干燥制備Res-SLNs。另外，采用相同方法制備不添加Res的空白SLNs。
1.2.2 Res-SLNs光譜儀檢測
采用傅里葉變換紅外（fourier transform infrared，FTIR）光譜儀檢測Res-SLNs是否制備成功。稱取Res、空白SLNs、Res-SLNs各10 mg，分別與KBr粉末混合制樣，記錄樣品在FTIR光譜中400～4 000 cm?1波數范圍的紅外吸收峰。
1.2.3 Res-SLNs體外釋放實驗
稱取適量Res-SLNs溶于PBS配成1 mg/mL溶液，取2 mL加入Spectra/Por透析管 ［透析相對分子質量為（8～10）×103］ 中，密封后放入含1 L PBS溶液的燒杯中；將燒杯放入37℃搖床震搖（速率100 r/min），分別于1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h時取出透析管，吸取100 μL溶液加入無水乙醇并定容至2 mL，充分震搖裂解SLNs，再以15 000 r/min離心10 min后取上清，于217 nm處測吸光度（A）值，代入標準曲線中計算Res濃度，最終計算累積釋放率，并繪制Res-SLNs體外釋放曲線。
1.2.4 Res-SLNs粒徑分布和Zeta電位分析
稱量2 mg SLNs及Res-SLNs分別超聲溶于1 mL超純水，0.22 μm過濾后稀釋10倍；取2 mL溶液加入比色皿中，先采用光子相關光譜分析檢測二者的粒徑分布及聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）。然后將比色皿內溶液加入Zeta電位樣品池，檢測Res-SLNs的Zeta電位分布。檢測波長為635 nm，散射角為90°，溫度為25℃。
1.3 大鼠BMSCs分離、培養和鑒定
根據我們既往研究方法常規分離、培養SD大鼠BMSCs[8，15-16]，將第2～3代BMSCs用于實驗。取第3代細胞行成骨、成脂、成軟骨誘導分化，并對誘導后細胞分別行ARS、阿利辛藍和油紅O染色鑒定。
1.4 Res-SLNs促BMSCs體外成骨分化檢測
1.4.1 Res-SLNs對BMSCs細胞活性的影響
實驗分為Res組和Res-SLNs組，將BMSCs與不同濃度（0、0.1、1、5、10、20 μmol/L）[6，17]Res或Res-SLNs共同培養；以9 μg/mL SLNs作為空白對照組。所有實驗至少重復3次，取均值。① 活/死細胞染色：將BMSCs按1×105個/孔密度接種于6孔板中，24 h后更換為200 μL含不同濃度Res和Res-SLNs的完全培養基（89%DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗）。培養3 d，參照活/死細胞雙染試劑盒說明書進行染色，熒光顯微鏡下觀察，活細胞為綠色，死細胞為紅色。
② CCK-8檢測：將BMSCs按5×103個/孔密度接種于96孔板中，24 h后更換為2 mL含不同濃度Res和Res-SLNs的完全培養基。培養3 d，參照CCK-8試劑盒說明檢測A值并計算細胞活性。
1.4.2 Res-SLNs對BMSCs成骨分化的影響
同1.4.1方法分組。① ALP染色：參照成骨誘導分化培養基試劑盒，將BMSCs按2×105個/孔密度接種于0.1%明膠包被30 min 的6孔板中，待細胞匯合度達80%～90%后，將完全培養基更換成2 mL含不同濃度Res和Res-SLNs的成骨誘導培養基，此后每3天換液1次。誘導培養7 d，參照ALP染色試劑盒方法染色，熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野計算ALP陽性染色面積百分比。
② ARS染色：成骨誘導分化培養21 d行ARS染色。固定、洗滌樣本后，每孔加入800 μL ARS染液染色，室溫孵育5 min，PBS洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野計算礦化結節面積百分比。通過ALP和ARS染色確定Res-SLNs的最適濃度，用于后續基因檢測實驗（Res亦采用此最適濃度）。
1.4.3 Res-SLNs對BMSCs成骨基因表達的影響
實驗分為對照組（單純BMSCs）、SLNs組（BMSCs+SLNs）、Res組（BMSCs+最適濃度Res）、Res-SLNs組（BMSCs+最適濃度Res-SLNs）。
① OCN免疫熒光染色：成骨誘導分化培養14 d，對各組細胞進行固定、透膜和1%牛血清白蛋白封閉后，加入OCN一抗，4℃靜置過夜；然后加入Cy3二抗室溫孵育2 h；最后加入DAPI避光環境孵育15 min，熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野記錄A值，作為OCN表達量。
② RT-qPCR檢測：成骨誘導分化培養14 d，用RNA提取試劑盒提取樣品RNA并測定RNA純度，然后進行逆轉錄，步驟如下：混勻后短暫離心，50℃環境干浴15 min；升溫至85℃，2 min后終止反應；轉入?20℃環境保存cDNA。之后進行定量PCR擴增操作，反應體系：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.6 μL，模板cDNA 8.8 μL，加ddH2O至20 μL。反應參數：95.0℃、30 s；95.0℃、30 s；60.0℃、30 s，終點讀板；95.0℃、30 s，40個循環；溶解曲線從70℃至95℃，增量為每5秒終點讀板0.5℃。最后，采用2?ΔΔCt法檢測ALP和OCN mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes (5′→3′)
1.5 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Res-SLNs的表征
FTIR光譜儀檢測示，Res和Res-SLNs的FTIR光譜在3 296 cm?1處有酚羥基吸收峰，在1 605、1 588、1 511 cm?1處有苯環特征吸收峰，在964 cm?1處有順式C=C特征吸收峰；而空白SLNs未發現上述幾種特征峰。另外，SLNs和Res-SLNs的FTIR光譜中可見C-H鍵吸收峰（2 850～3 000 cm?1）。見圖1a。
圖1
Res-SLNs的表征
a. FTIR光譜圖；b. 藥物體外釋放曲線；c. 粒徑分布圖；d. Zeta電位圖
Figure1. Characterizations of Res-SLNsa. Fourier spectrogram; b. Drug
Res-SLNs體外釋放實驗顯示，Res-SLNs累積釋放率在12 h時可見一爆發性釋放，隨后釋放逐漸減緩，144 h時釋放總量達60%。見圖1b。
SLNs的粒徑為（127.0±63.1）nm，PDI為0.28± 0.01；Res-SLNs粒徑為（145.0±50.7）nm，PDI為0.23±0.01。SLNs和Res-SLNs的Zeta電位分別為（?25.00±9.64）mV和（?33.90±6.35）mV。見圖1c、d。
2.2 大鼠BMSCs鑒定
體外成骨誘導分化培養21 d，ARS染色可見大量紅染礦化鈣結節；阿利辛藍染色示細胞及細胞外基質大范圍呈不同程度的藍色；油紅O染色示細胞內有大小各異的顆粒狀紅染脂滴。三系分化結果提示所培養細胞為BMSCs。見圖2。
圖2
大鼠BMSCs鑒定（×100）
a. ARS染色；b. 阿利辛藍染色；c. 油紅O染色
Figure2. The identification of rat BMSCs (×100)a. ARS staining; b. Alcian blue staining; c. Oil red O staining
2.3 Res-SLNs對BMSCs細胞活性的影響
活/死細胞染色示，Res和Res-SLNs各濃度組內的死細胞數量無明顯差異。見圖3、4。
圖3
活/死細胞染色觀察Res組BMSCs細胞活性（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為鈣黃綠素/乙酰氧基甲酯染色、碘化丙啶染色及二者重疊 a～f. 依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組
Figure3. Living/dead cell staining to observe the activity of BMSCs in Res group (Fluorescence microscope×100)From left to right for Calcein/acetoxymethyl ester staining, propidium iodide staining, and merge, respectively a-f. The 0, 0.1, 1, 5, 10, 20 μmol/L concentration groups in sequence, respectively
圖4
活/死細胞染色觀察Res-SLNs組BMSCs細胞活性（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為黃綠素/乙酰氧基甲酯染色、碘化丙啶染色及二者重疊 a～f. 依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組
Figure4. Living/dead cell staining to observe the activity of BMSCs in Res-SLNs group (Fluorescence microscope×100)From left to right for Calcein/acetoxymethyl ester staining, propidium iodide staining, and merge, respectively a-f. The 0, 0.1, 1, 5, 10, 20 μmol/L concentration groups in sequence, respectively
CCK-8檢測示，與0 μmol/L Res組比較，低濃度（<10 μmol/L）Res組BMSCs細胞活性差異無統計學意義（P>0.05）；而20 μmol/L Res組細胞活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。Res-SLNs各濃度組間比較BMSCs細胞活性，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5。
圖5
CCK-8法檢測兩組BMSCs細胞活性
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure5. BMSCs activity of the two groups detected by CCK-8 assaya. Res group; b. Res-SLNs group
2.4 Res-SLNs對BMSCs成骨分化的影響
2.4.1 ALP染色
成骨誘導分化培養7 d，兩組ALP染色強度均呈濃度依賴性，Res組和Res-SLNs組ALP陽性染色面積百分比分別在10 μmol/L和1 μmol/L濃度時達最大值，與其他濃度比較差異有統計學意義（P<0.05），然后逐漸減小。見圖6、7。
圖6
兩組成骨誘導分化培養7 d ALP染色觀察（熒光倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組 a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure6. ALP staining observation after 7 days of osteogenic induction of the two groups (Inverted fluorescence microscopy×40)From left to right for the concentrations of 0 , 0.1, 1, 5, 10, and 20 μmol/L, respectively a. Res group; b. Res-SLNs group
圖7
兩組成骨誘導分化培養7 d ALP陽性染色面積百分比
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure7. Percentage of ALP positive staining area after 7 days of osteogenic induction of the two groupsa. Res group; b. Res-SLNs group
2.4.2 ARS染色
成骨誘導分化培養21 d，兩組ARS染色強度均呈濃度依賴性，Res組和Res-SLNs組礦化結節面積百分比分別在10 μmol/L和1 μmol/L濃度時達最大值，與其他濃度比較差異有統計學意義（P<0.05），然后逐漸減小。見圖8、9。
圖8
兩組成骨誘導分化培養21 d ARS染色觀察（熒光倒置顯微鏡×100）
從左至右依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組 a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure8. ARS staining observation after 21 days of osteogenic induction of the two groups (Inverted fluorescence microscopy×100)From left to right for the concentrations of 0 , 0.1, 1, 5, 10, and 20 μmol/L, respectively a. Res group; b. Res-SLNs group
圖9
兩組成骨誘導分化培養21 d礦化結節面積百分比
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure9. Percentage of mineralized nodule area after 21 days of osteogenic induction of the two groupsa. Res group; b. Res-SLNs group
ALP染色和ARS染色結果表明，Res-SLNs最有效濃度為1 μmol/L，選擇該濃度用于后續基因表達檢測。
2.5 Res-SLNs對BMSCs成骨基因表達的影響
2.5.1 OCN免疫熒光染色
成骨誘導分化培養14 d，對照組和SLNs組OCN表達量極低，差異無統計學意義（P>0.05）；Res組和Res-SLNs組OCN表達量顯著高于對照組和SLNs組，Res-SLNs組顯著高于Res組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10、11。
圖10
成骨誘導分化培養14 d OCN免疫熒光染色觀察（熒光倒置顯微鏡×100）
從上至下分別為OCN、DAPI及二者重疊 a. 對照組；b. SLNs組；c. Res組；d. Res-SLNs組
Figure10. OCN immunofluorescence staining after 14 days of osteogenic induction (Inverted fluorescence microscopy×100)From top to bottom for OCN staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Control group; b. SLNs group; c. Res group; d. Res-SLNs group
圖11
成骨誘導分化培養14 d OCN表達量
Figure11.
OCN expression level after 14 days of osteogenic induction
2.5.2 RT-qPCR檢測
成骨誘導分化培養14 d，Res組和Res-SLNs組ALP和OCN mRNA相對表達量均顯著高于對照組和SLNs組，Res-SLNs組顯著高于Res組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖12。
圖12
成骨誘導分化培養14 d RT-qPCR檢測成骨基因mRNA相對表達量
a. ALP；b. OCN
Figure12. The mRNA relative expression of osteogenic gene after 14 days of osteogenic induction detected by RT-qPCRa. ALP; b. OCN
3 討論
骨的再生能力隨個體年齡增長逐漸減弱[18]。這種自我更新能力由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成共同維持，這一過程稱為“骨穩態”。骨穩態失衡是骨質疏松和類風濕性關節炎等疾病的主要發病機制[1-2]。因此，通過促進成骨細胞分化來增加骨形成和/或抑制破骨細胞分化來減少骨吸收，可能是一種治療骨穩態失衡疾病的有效方法[3-4]。
Res是一種存在于多種植物中的天然植物雌激素[5]。已有多項研究報道Res具有多種生物學效應，如抗衰老、抗氧化、抗腫瘤和抗炎作用等[19]。近年有研究還發現Res能夠促進成骨分化和骨形成，并且有抑制破骨細胞形成的作用。Zhao等[6]報道Res能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化；Xiong等[7]發現Res能夠通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細胞分化，減少骨吸收；我們既往研究也發現，Res制備的骨組織工程生物活性支架可以促進BMSCs成骨分化和骨缺損內的骨再生[8]。因此，Res有望用于骨穩態失衡疾病的治療。
然而Res的水溶性極低（每100毫升水中僅溶解3 mg Res），常需將Res溶于乙醇等有機溶劑中服用。在大鼠和小鼠研究中，Res改善骨穩態失衡的有效劑量為0.7～400.0 mg/（kg·d），將提供給嚙齒動物的Res劑量按體表面積換算成人類同等劑量時，60 kg成人需Res有效劑量7～3 900 mg/（kg·d）[9]。而Res劑量超過100 mg/（kg·d）時就無法通過飲食獲取，通常需要額外補充。血液濃度是估計有效劑量指標之一，研究表明[10]，Res在機體中快速代謝和較高清除率致血漿內Res濃度通常為0～26 nmol/L，這一濃度遠低于體外刺激骨細胞增殖、分化和激活所需的劑量。因此，如何提高Res的生物利用率和藥物效率等，在治療骨穩態失衡疾病方面顯得尤為重要。
本研究首先通過高溫乳化-低溫固化法將Res包封進SLNs內制備Res-SLNs，然后通過光譜儀分析表明Res成功被SLNs包封，同時通過Res-SLNs體外釋放實驗表明SLNs包封Res后具有緩慢釋放作用。
既往研究表明，Res沒有促進BMSCs增殖的作用[6，17]。因此，本研究分別采用活/死細胞染色和CCK-8檢測評估Res和Res-SLNs對BMSCs的細胞毒性作用。結果顯示所合成的SLNs對BMSCs無明顯毒性作用，這可能是因為用于制備SLNs的成分具有良好的生物相容性。但是，當Res濃度達到20 μmol/L時，BMSCs活力明顯受到抑制，而相同濃度的Res- SLNs對BMSCs活力卻無影響。搭載藥物后SLNs的這種降低高劑量藥物毒性的作用可能與持續釋放有關，這一結果和既往報道一致[20]。
Res具有促進BMSCs成骨分化的作用。Dai等[21]發現Res的最大促成骨分化濃度為10 μmol/L，而Zhou等[17]研究表明20 μmol/L Res的促成骨作用高于10 μmol/L。為了驗證Res和SLNs包封的Res促進BMSCs成骨分化的作用，我們進行了ALP染色和ARS染色觀察，考慮到BMSCs成骨誘導過程中可能會出現漂浮現象，故對成骨分化所使用的6孔板采用0.1%明膠包被30 min。ALP染色和ARS染色結果表明，Res具有促進BMSCs內ALP和礦化結節表達的作用，呈劑量依賴性，其最適濃度為10 μmol/L；而Res-SLNs對BMSCs內ALP和礦化結節表達的促進作用更強，其最適濃度僅為1 μmol/L，我們將此濃度用于后續基因檢測實驗。OCN免疫熒光染色表明成骨誘導分化培養14 d后，將Res加載入SLNs中可以顯著增加Res上調的OCN表達；RT-qPCR檢測表明Res-SLNs可顯著增強Res上調的ALP和OCN mRNA相對表達量。以上實驗說明包封后的Res-SLNs能夠顯著提升Res的促成骨作用，提升藥物作用效率約10倍。ALP染色和ARS染色結果與Dai等[21]的研究結果一致。與Zhou等[17]研究結果的差異可能和細胞來源的供體年齡有關，據報道，BMSCs的增殖能力和分化潛能都會隨供體年齡增加而降低[22]。
SLNs給藥系統能夠提高藥物效率的主要機制，可以總結為達到納米級別的超細分散和實現了藥物與脂質的密切聯系兩個方面。粒徑大小可以影響藥物的吸收和內皮網狀系統的攝取。粒徑在120～200 nm范圍內的SLNs能夠逃避內皮網狀系統，并因此繞過肝臟和脾臟的過濾作用，在循環系統中停留更長時間緩釋藥物，最終提高藥物的生物利用度[23]。此外，脂類對藥物活性的吸收增強作用是SLNs提高藥物效率的另一個重要原因。當脂類和藥物同時給藥時，脂類在腸道內被酶降解為可以溶解難溶性藥物的具有表面活性的單甘油和二酰基甘油；隨后，其與膽鹽相互作用，形成能促進藥物吸收的混合膠束。這一過程就是脂類促進藥物吸收的主要機制[24]。SLNs正是因為同時滿足這兩個條件，才能具有提高生物利用度的作用。
綜上述，我們通過高溫乳化-低溫固化法成功制備了Res-SLNs，SLNs包封后的Res可以在更低濃度達到促BMSCs成骨分化的最佳效果，有望為骨穩態失衡疾病的治療奠定基礎。在后續實驗中，我們擬將Res-SLNs應用于SD大鼠骨質疏松模型，以測試其在動物體內的生物學效果。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經蚌埠醫學院醫學倫理委員會批準［倫動科批字（2021）第272號］；實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）20190003，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2017-001
作者貢獻聲明 官建中、毛穎基：研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；熊風、姚成、周梁爽：數據收集、統計分析；李偉峰：數據收集整理；魏幫國、熊風：論文撰寫
骨穩態失衡是骨質疏松和類風濕關節炎等疾病的主要發病機制[1-2]。其中，破骨細胞主要介導體內骨吸收；成骨細胞主要介導體內骨形成，多來源于BMSCs，是骨形成過程中至關重要的功能細胞。因此，通過促進BMSCs向成骨細胞分化來增加骨形成和/或抑制破骨細胞分化來減少骨吸收，是一種很有前景的骨穩態失衡類疾病治療方法[3-4]。
研究表明，白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種天然植物類雌激素[5]，不僅能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化以及大面積骨缺損的骨再生，還能通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細胞分化和減少骨吸收，有望應用于骨穩態失衡疾病的治療[6-8]。然而Res的低水溶性和高濃度依賴性等缺點限制了其在臨床的廣泛應用[5，9-10]。因此，如何提高Res的生物利用率和藥物效率等，對Res的廣泛應用至關重要。
固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）是一種新型亞微米膠體載體，具有增強藥物溶解度、改善生物相容性、增加生物利用度和保護藥物穩定性等諸多優點[11]。Qushawy等[12]制備了負載卡馬西平的SLNs，發現卡馬西平的抗驚厥作用得到增強；Loureiro等[13]發現將Res和葡萄提取物包封到SLNs中可增強細胞攝取能力，可用于治療阿爾茨海默病。然而，目前尚未見關于負載Res的SLNs對BMSCs成骨分化影響的研究。本研究擬通過高溫乳化-低溫固化法[8，14]設計并制備Res-SLNs，研究利用SLNs的生物學特性增強Res促BMSCs體外成骨分化的效果，為骨穩態失衡疾病的治療提供一種方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2周齡SPF級雄性SD大鼠4只，體質量（80±10）g，購于濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司。
Res ［阿拉丁試劑（上海）有限公司］；聚氧乙烯（40）硬脂酸酯（Myrj 52）、DMSO（Sigma公司，美國）；硬脂酸、氯仿（中國醫藥集團有限公司）；卵磷脂、DAPI、茜素紅S（alizarin red S，ARS）染色液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、4%多聚甲醛溶液、青霉素-鏈霉素雙抗（合肥Biosharp公司）；成骨誘導分化培養基、活/死細胞雙染試劑盒（Cyagen公司，美國）；ALP染色試劑盒 ［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］；抗骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、熒光Cy3二抗（Abcam公司，英國）；RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；F12基礎培養基、FBS、胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）。
光譜儀（Malvern公司，英國）；紫外分光光度計（Varian公司，澳大利亞）； DF-101S集熱式攪拌器（江蘇科析儀器有限公司）；GZ120-S數顯型懸臂式恒速強力電動攪拌機（上海壘固儀器有限公司）；實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；大容量超速離心機（Beckman公司，美國）。熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 Res-SLNs的合成與表征
1.2.1 Res-SLNs合成
根據我們前期研究，采用高溫乳化-低溫固化法合成Res-SLNs[8]。具體操作：在高溫水浴攪拌下，將由氯仿、硬脂酸、卵磷脂和Res組成的有機相緩慢注入由超純水和Myrj 52組成的水相；通過低溫攪拌固化、低溫離心和超純水反復洗滌純化，冷凍干燥制備Res-SLNs。另外，采用相同方法制備不添加Res的空白SLNs。
1.2.2 Res-SLNs光譜儀檢測
采用傅里葉變換紅外（fourier transform infrared，FTIR）光譜儀檢測Res-SLNs是否制備成功。稱取Res、空白SLNs、Res-SLNs各10 mg，分別與KBr粉末混合制樣，記錄樣品在FTIR光譜中400～4 000 cm?1波數范圍的紅外吸收峰。
1.2.3 Res-SLNs體外釋放實驗
稱取適量Res-SLNs溶于PBS配成1 mg/mL溶液，取2 mL加入Spectra/Por透析管 ［透析相對分子質量為（8～10）×103］ 中，密封后放入含1 L PBS溶液的燒杯中；將燒杯放入37℃搖床震搖（速率100 r/min），分別于1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144 h時取出透析管，吸取100 μL溶液加入無水乙醇并定容至2 mL，充分震搖裂解SLNs，再以15 000 r/min離心10 min后取上清，于217 nm處測吸光度（A）值，代入標準曲線中計算Res濃度，最終計算累積釋放率，并繪制Res-SLNs體外釋放曲線。
1.2.4 Res-SLNs粒徑分布和Zeta電位分析
稱量2 mg SLNs及Res-SLNs分別超聲溶于1 mL超純水，0.22 μm過濾后稀釋10倍；取2 mL溶液加入比色皿中，先采用光子相關光譜分析檢測二者的粒徑分布及聚合物分散性指數（polymer dispersity index，PDI）。然后將比色皿內溶液加入Zeta電位樣品池，檢測Res-SLNs的Zeta電位分布。檢測波長為635 nm，散射角為90°，溫度為25℃。
1.3 大鼠BMSCs分離、培養和鑒定
根據我們既往研究方法常規分離、培養SD大鼠BMSCs[8，15-16]，將第2～3代BMSCs用于實驗。取第3代細胞行成骨、成脂、成軟骨誘導分化，并對誘導后細胞分別行ARS、阿利辛藍和油紅O染色鑒定。
1.4 Res-SLNs促BMSCs體外成骨分化檢測
1.4.1 Res-SLNs對BMSCs細胞活性的影響
實驗分為Res組和Res-SLNs組，將BMSCs與不同濃度（0、0.1、1、5、10、20 μmol/L）[6，17]Res或Res-SLNs共同培養；以9 μg/mL SLNs作為空白對照組。所有實驗至少重復3次，取均值。① 活/死細胞染色：將BMSCs按1×105個/孔密度接種于6孔板中，24 h后更換為200 μL含不同濃度Res和Res-SLNs的完全培養基（89%DMEM/F12+10%FBS+1%雙抗）。培養3 d，參照活/死細胞雙染試劑盒說明書進行染色，熒光顯微鏡下觀察，活細胞為綠色，死細胞為紅色。
② CCK-8檢測：將BMSCs按5×103個/孔密度接種于96孔板中，24 h后更換為2 mL含不同濃度Res和Res-SLNs的完全培養基。培養3 d，參照CCK-8試劑盒說明檢測A值并計算細胞活性。
1.4.2 Res-SLNs對BMSCs成骨分化的影響
同1.4.1方法分組。① ALP染色：參照成骨誘導分化培養基試劑盒，將BMSCs按2×105個/孔密度接種于0.1%明膠包被30 min 的6孔板中，待細胞匯合度達80%～90%后，將完全培養基更換成2 mL含不同濃度Res和Res-SLNs的成骨誘導培養基，此后每3天換液1次。誘導培養7 d，參照ALP染色試劑盒方法染色，熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野計算ALP陽性染色面積百分比。
② ARS染色：成骨誘導分化培養21 d行ARS染色。固定、洗滌樣本后，每孔加入800 μL ARS染液染色，室溫孵育5 min，PBS洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野計算礦化結節面積百分比。通過ALP和ARS染色確定Res-SLNs的最適濃度，用于后續基因檢測實驗（Res亦采用此最適濃度）。
1.4.3 Res-SLNs對BMSCs成骨基因表達的影響
實驗分為對照組（單純BMSCs）、SLNs組（BMSCs+SLNs）、Res組（BMSCs+最適濃度Res）、Res-SLNs組（BMSCs+最適濃度Res-SLNs）。
① OCN免疫熒光染色：成骨誘導分化培養14 d，對各組細胞進行固定、透膜和1%牛血清白蛋白封閉后，加入OCN一抗，4℃靜置過夜；然后加入Cy3二抗室溫孵育2 h；最后加入DAPI避光環境孵育15 min，熒光倒置顯微鏡下觀察，并隨機選取不同視野記錄A值，作為OCN表達量。
② RT-qPCR檢測：成骨誘導分化培養14 d，用RNA提取試劑盒提取樣品RNA并測定RNA純度，然后進行逆轉錄，步驟如下：混勻后短暫離心，50℃環境干浴15 min；升溫至85℃，2 min后終止反應；轉入?20℃環境保存cDNA。之后進行定量PCR擴增操作，反應體系：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.6 μL，模板cDNA 8.8 μL，加ddH2O至20 μL。反應參數：95.0℃、30 s；95.0℃、30 s；60.0℃、30 s，終點讀板；95.0℃、30 s，40個循環；溶解曲線從70℃至95℃，增量為每5秒終點讀板0.5℃。最后，采用2?ΔΔCt法檢測ALP和OCN mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of genes (5′→3′)
1.5 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 Res-SLNs的表征
FTIR光譜儀檢測示，Res和Res-SLNs的FTIR光譜在3 296 cm?1處有酚羥基吸收峰，在1 605、1 588、1 511 cm?1處有苯環特征吸收峰，在964 cm?1處有順式C=C特征吸收峰；而空白SLNs未發現上述幾種特征峰。另外，SLNs和Res-SLNs的FTIR光譜中可見C-H鍵吸收峰（2 850～3 000 cm?1）。見圖1a。
圖1
Res-SLNs的表征
a. FTIR光譜圖；b. 藥物體外釋放曲線；c. 粒徑分布圖；d. Zeta電位圖
Figure1. Characterizations of Res-SLNsa. Fourier spectrogram; b. Drug
Res-SLNs體外釋放實驗顯示，Res-SLNs累積釋放率在12 h時可見一爆發性釋放，隨后釋放逐漸減緩，144 h時釋放總量達60%。見圖1b。
SLNs的粒徑為（127.0±63.1）nm，PDI為0.28± 0.01；Res-SLNs粒徑為（145.0±50.7）nm，PDI為0.23±0.01。SLNs和Res-SLNs的Zeta電位分別為（?25.00±9.64）mV和（?33.90±6.35）mV。見圖1c、d。
2.2 大鼠BMSCs鑒定
體外成骨誘導分化培養21 d，ARS染色可見大量紅染礦化鈣結節；阿利辛藍染色示細胞及細胞外基質大范圍呈不同程度的藍色；油紅O染色示細胞內有大小各異的顆粒狀紅染脂滴。三系分化結果提示所培養細胞為BMSCs。見圖2。
圖2
大鼠BMSCs鑒定（×100）
a. ARS染色；b. 阿利辛藍染色；c. 油紅O染色
Figure2. The identification of rat BMSCs (×100)a. ARS staining; b. Alcian blue staining; c. Oil red O staining
2.3 Res-SLNs對BMSCs細胞活性的影響
活/死細胞染色示，Res和Res-SLNs各濃度組內的死細胞數量無明顯差異。見圖3、4。
圖3
活/死細胞染色觀察Res組BMSCs細胞活性（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為鈣黃綠素/乙酰氧基甲酯染色、碘化丙啶染色及二者重疊 a～f. 依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組
Figure3. Living/dead cell staining to observe the activity of BMSCs in Res group (Fluorescence microscope×100)From left to right for Calcein/acetoxymethyl ester staining, propidium iodide staining, and merge, respectively a-f. The 0, 0.1, 1, 5, 10, 20 μmol/L concentration groups in sequence, respectively
圖4
活/死細胞染色觀察Res-SLNs組BMSCs細胞活性（熒光顯微鏡×100）
從左至右依次為黃綠素/乙酰氧基甲酯染色、碘化丙啶染色及二者重疊 a～f. 依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組
Figure4. Living/dead cell staining to observe the activity of BMSCs in Res-SLNs group (Fluorescence microscope×100)From left to right for Calcein/acetoxymethyl ester staining, propidium iodide staining, and merge, respectively a-f. The 0, 0.1, 1, 5, 10, 20 μmol/L concentration groups in sequence, respectively
CCK-8檢測示，與0 μmol/L Res組比較，低濃度（<10 μmol/L）Res組BMSCs細胞活性差異無統計學意義（P>0.05）；而20 μmol/L Res組細胞活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。Res-SLNs各濃度組間比較BMSCs細胞活性，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5。
圖5
CCK-8法檢測兩組BMSCs細胞活性
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure5. BMSCs activity of the two groups detected by CCK-8 assaya. Res group; b. Res-SLNs group
2.4 Res-SLNs對BMSCs成骨分化的影響
2.4.1 ALP染色
成骨誘導分化培養7 d，兩組ALP染色強度均呈濃度依賴性，Res組和Res-SLNs組ALP陽性染色面積百分比分別在10 μmol/L和1 μmol/L濃度時達最大值，與其他濃度比較差異有統計學意義（P<0.05），然后逐漸減小。見圖6、7。
圖6
兩組成骨誘導分化培養7 d ALP染色觀察（熒光倒置顯微鏡×40）
從左至右依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組 a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure6. ALP staining observation after 7 days of osteogenic induction of the two groups (Inverted fluorescence microscopy×40)From left to right for the concentrations of 0 , 0.1, 1, 5, 10, and 20 μmol/L, respectively a. Res group; b. Res-SLNs group
圖7
兩組成骨誘導分化培養7 d ALP陽性染色面積百分比
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure7. Percentage of ALP positive staining area after 7 days of osteogenic induction of the two groupsa. Res group; b. Res-SLNs group
2.4.2 ARS染色
成骨誘導分化培養21 d，兩組ARS染色強度均呈濃度依賴性，Res組和Res-SLNs組礦化結節面積百分比分別在10 μmol/L和1 μmol/L濃度時達最大值，與其他濃度比較差異有統計學意義（P<0.05），然后逐漸減小。見圖8、9。
圖8
兩組成骨誘導分化培養21 d ARS染色觀察（熒光倒置顯微鏡×100）
從左至右依次為0、0.1、1、5、10、20 μmol/L 濃度組 a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure8. ARS staining observation after 21 days of osteogenic induction of the two groups (Inverted fluorescence microscopy×100)From left to right for the concentrations of 0 , 0.1, 1, 5, 10, and 20 μmol/L, respectively a. Res group; b. Res-SLNs group
圖9
兩組成骨誘導分化培養21 d礦化結節面積百分比
a. Res組；b. Res-SLNs組
Figure9. Percentage of mineralized nodule area after 21 days of osteogenic induction of the two groupsa. Res group; b. Res-SLNs group
ALP染色和ARS染色結果表明，Res-SLNs最有效濃度為1 μmol/L，選擇該濃度用于后續基因表達檢測。
2.5 Res-SLNs對BMSCs成骨基因表達的影響
2.5.1 OCN免疫熒光染色
成骨誘導分化培養14 d，對照組和SLNs組OCN表達量極低，差異無統計學意義（P>0.05）；Res組和Res-SLNs組OCN表達量顯著高于對照組和SLNs組，Res-SLNs組顯著高于Res組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10、11。
圖10
成骨誘導分化培養14 d OCN免疫熒光染色觀察（熒光倒置顯微鏡×100）
從上至下分別為OCN、DAPI及二者重疊 a. 對照組；b. SLNs組；c. Res組；d. Res-SLNs組
Figure10. OCN immunofluorescence staining after 14 days of osteogenic induction (Inverted fluorescence microscopy×100)From top to bottom for OCN staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Control group; b. SLNs group; c. Res group; d. Res-SLNs group
圖11
成骨誘導分化培養14 d OCN表達量
Figure11.
OCN expression level after 14 days of osteogenic induction
2.5.2 RT-qPCR檢測
成骨誘導分化培養14 d，Res組和Res-SLNs組ALP和OCN mRNA相對表達量均顯著高于對照組和SLNs組，Res-SLNs組顯著高于Res組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖12。
圖12
成骨誘導分化培養14 d RT-qPCR檢測成骨基因mRNA相對表達量
a. ALP；b. OCN
Figure12. The mRNA relative expression of osteogenic gene after 14 days of osteogenic induction detected by RT-qPCRa. ALP; b. OCN
3 討論
骨的再生能力隨個體年齡增長逐漸減弱[18]。這種自我更新能力由破骨細胞介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成共同維持，這一過程稱為“骨穩態”。骨穩態失衡是骨質疏松和類風濕性關節炎等疾病的主要發病機制[1-2]。因此，通過促進成骨細胞分化來增加骨形成和/或抑制破骨細胞分化來減少骨吸收，可能是一種治療骨穩態失衡疾病的有效方法[3-4]。
Res是一種存在于多種植物中的天然植物雌激素[5]。已有多項研究報道Res具有多種生物學效應，如抗衰老、抗氧化、抗腫瘤和抗炎作用等[19]。近年有研究還發現Res能夠促進成骨分化和骨形成，并且有抑制破骨細胞形成的作用。Zhao等[6]報道Res能夠通過Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs成骨分化；Xiong等[7]發現Res能夠通過OPG/RANKL/RANK信號通路抑制破骨細胞分化，減少骨吸收；我們既往研究也發現，Res制備的骨組織工程生物活性支架可以促進BMSCs成骨分化和骨缺損內的骨再生[8]。因此，Res有望用于骨穩態失衡疾病的治療。
然而Res的水溶性極低（每100毫升水中僅溶解3 mg Res），常需將Res溶于乙醇等有機溶劑中服用。在大鼠和小鼠研究中，Res改善骨穩態失衡的有效劑量為0.7～400.0 mg/（kg·d），將提供給嚙齒動物的Res劑量按體表面積換算成人類同等劑量時，60 kg成人需Res有效劑量7～3 900 mg/（kg·d）[9]。而Res劑量超過100 mg/（kg·d）時就無法通過飲食獲取，通常需要額外補充。血液濃度是估計有效劑量指標之一，研究表明[10]，Res在機體中快速代謝和較高清除率致血漿內Res濃度通常為0～26 nmol/L，這一濃度遠低于體外刺激骨細胞增殖、分化和激活所需的劑量。因此，如何提高Res的生物利用率和藥物效率等，在治療骨穩態失衡疾病方面顯得尤為重要。
本研究首先通過高溫乳化-低溫固化法將Res包封進SLNs內制備Res-SLNs，然后通過光譜儀分析表明Res成功被SLNs包封，同時通過Res-SLNs體外釋放實驗表明SLNs包封Res后具有緩慢釋放作用。
既往研究表明，Res沒有促進BMSCs增殖的作用[6，17]。因此，本研究分別采用活/死細胞染色和CCK-8檢測評估Res和Res-SLNs對BMSCs的細胞毒性作用。結果顯示所合成的SLNs對BMSCs無明顯毒性作用，這可能是因為用于制備SLNs的成分具有良好的生物相容性。但是，當Res濃度達到20 μmol/L時，BMSCs活力明顯受到抑制，而相同濃度的Res- SLNs對BMSCs活力卻無影響。搭載藥物后SLNs的這種降低高劑量藥物毒性的作用可能與持續釋放有關，這一結果和既往報道一致[20]。
Res具有促進BMSCs成骨分化的作用。Dai等[21]發現Res的最大促成骨分化濃度為10 μmol/L，而Zhou等[17]研究表明20 μmol/L Res的促成骨作用高于10 μmol/L。為了驗證Res和SLNs包封的Res促進BMSCs成骨分化的作用，我們進行了ALP染色和ARS染色觀察，考慮到BMSCs成骨誘導過程中可能會出現漂浮現象，故對成骨分化所使用的6孔板采用0.1%明膠包被30 min。ALP染色和ARS染色結果表明，Res具有促進BMSCs內ALP和礦化結節表達的作用，呈劑量依賴性，其最適濃度為10 μmol/L；而Res-SLNs對BMSCs內ALP和礦化結節表達的促進作用更強，其最適濃度僅為1 μmol/L，我們將此濃度用于后續基因檢測實驗。OCN免疫熒光染色表明成骨誘導分化培養14 d后，將Res加載入SLNs中可以顯著增加Res上調的OCN表達；RT-qPCR檢測表明Res-SLNs可顯著增強Res上調的ALP和OCN mRNA相對表達量。以上實驗說明包封后的Res-SLNs能夠顯著提升Res的促成骨作用，提升藥物作用效率約10倍。ALP染色和ARS染色結果與Dai等[21]的研究結果一致。與Zhou等[17]研究結果的差異可能和細胞來源的供體年齡有關，據報道，BMSCs的增殖能力和分化潛能都會隨供體年齡增加而降低[22]。
SLNs給藥系統能夠提高藥物效率的主要機制，可以總結為達到納米級別的超細分散和實現了藥物與脂質的密切聯系兩個方面。粒徑大小可以影響藥物的吸收和內皮網狀系統的攝取。粒徑在120～200 nm范圍內的SLNs能夠逃避內皮網狀系統，并因此繞過肝臟和脾臟的過濾作用，在循環系統中停留更長時間緩釋藥物，最終提高藥物的生物利用度[23]。此外，脂類對藥物活性的吸收增強作用是SLNs提高藥物效率的另一個重要原因。當脂類和藥物同時給藥時，脂類在腸道內被酶降解為可以溶解難溶性藥物的具有表面活性的單甘油和二酰基甘油；隨后，其與膽鹽相互作用，形成能促進藥物吸收的混合膠束。這一過程就是脂類促進藥物吸收的主要機制[24]。SLNs正是因為同時滿足這兩個條件，才能具有提高生物利用度的作用。
綜上述，我們通過高溫乳化-低溫固化法成功制備了Res-SLNs，SLNs包封后的Res可以在更低濃度達到促BMSCs成骨分化的最佳效果，有望為骨穩態失衡疾病的治療奠定基礎。在后續實驗中，我們擬將Res-SLNs應用于SD大鼠骨質疏松模型，以測試其在動物體內的生物學效果。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經蚌埠醫學院醫學倫理委員會批準［倫動科批字（2021）第272號］；實驗動物生產許可證號：SCXK（魯）20190003，實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2017-001
作者貢獻聲明 官建中、毛穎基：研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；熊風、姚成、周梁爽：數據收集、統計分析；李偉峰：數據收集整理；魏幫國、熊風：論文撰寫
