引用本文： 叢雨軒, 張斌飛, 付亞輝, 魏星, 王虎, 鄧洪利, 莊巖, 張堃, 雷金來. 重組人BMP-2/多孔磷酸鈣人工骨/自體骨結合富血小板血漿在Masquelet技術修復兔大段骨缺損中的應用研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(10): 1288-1295. doi: 10.7507/1002-1892.202204112 復制
骨缺損刻有創傷、感染、結核、骨腫瘤切除等原因導致，是臨床常見疾病之一[1]。大段骨缺損無法通過自身修復重建愈合[2]，進而造成肢體功能障礙，嚴重影響患者生活質量。Masquelet技術因具有術后愈合快、負重時間早、無需顯微外科吻合血管、治療費用少等優點，尤其適用于治療創傷后大段骨缺損[3]。但該技術二期需植入大量自體松質骨，而自體松質骨來源有限，制約了其在臨床上的廣泛應用。磷酸鈣人工骨（calcium phosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性和降解性能，能促進新骨生成，固化后成分轉化為低結晶度羥基磷酸鈣，與正常人體骨骼無機鹽成分相似[4]。重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）可以促進BMSCs分化為成骨樣細胞，并促進成骨細胞增殖，從而誘導成骨[5]。將rhBMP-2和多孔CPC（porous CPC，PCPC）固化體通過低溫吸附凍干保護技術制成rhBMP-2/PCPC復合材料，可以控制rhBMP-2 的釋放速度，使其更好地發揮生物活性，有效促進骨生長，加速骨折愈合，可用于骨缺損的填充[6]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）含有高濃度生長因子[7]，可以促進骨折愈合，已在創傷修復領域得到廣泛應用。
本研究擬通過動物實驗，采用rhBMP-2/PCPC復合材料與自體骨混合物作為Masquelet技術二期植骨材料，探索其具有最佳成骨能力時的混合比例，從而減少植骨過程中自體骨的使用，解決自體骨來源不足的問題；同時將PRP與rhBMP-2/PCPC、自體骨結合，以期解決混合材料成骨能力不足的缺點，為大段骨缺損修復探索一種有效治療方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔54只，雌雄不限，體質量3.0～3.8 kg，平均3.5 kg，由天津裕達實驗動物養殖有限公司提供。實驗動物以標準飲食單籠飼養，研究期間可自由活動。
rhBMP-2/PCPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；ALP活性檢測試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）。TE2000-U光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；紫外可見光分光光度計（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；HY-0230機械試驗機（上海衡翼精密儀器有限公司）。
1.2 確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
1.2.1 骨缺損模型建立
取36只實驗動物，以速眠新（0.2 mL/kg）肌肉注射麻醉后固定于手術臺，右前肢備皮，常規消毒、鋪巾，作前肢側向4～5 cm長切口，切開皮膚及皮下淺、深筋膜，盡量避開皮下血管，沿肌肉間隙分離，逐步暴露尺骨。剝離尺骨骨膜，在尺骨中段用無菌小擺鋸鋸開，生理鹽水沖洗以減少骨壞死；再向近端距第1條截骨線約2.5 cm處作第2條截骨線，連同骨膜去除兩線之間的骨段，制備2 cm長骨缺損模型。
1.2.2 Masquelet技術治療過程
生理鹽水沖洗斷端骨碎屑、淤血及骨髓腔內骨髓組織等，按照Masquelet技術第一階段方案，用聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）骨水泥填充骨缺損，沖洗后縫合軟組織及皮膚。因橈骨為兔的主要負重骨，可以提供足夠穩定性，故尺骨無需固定。術后禁食、水12 h，單籠飼養，并給予抗生素（青霉素40萬U/只，肌肉注射，2次/d，連續3 d）預防感染。術后3、5 d切口換藥；檢查體溫、體質量和一般情況，直至切口愈合。術后實驗動物可正常負重，活動不受限制。
術后4周對實驗動物同上法麻醉后，從左側髂骨翼取自體骨（15 mm×4 mm×2 mm），制成自體骨顆粒備用。沿右上肢原切口切開皮膚及軟組織，按照Masquelet技術第二階段方案切開已形成的誘導膜，取出PMMA骨水泥；于誘導膜內植入不同質量比的自體骨和rhBMP-2/PCPC混合物，縫合誘導膜、軟組織及皮膚。見圖1。術后護理同前。
圖1
骨缺損模型建立及Masquelet技術治療過程
a. 沿右前肢側向切開逐層顯露尺骨；b. 用小擺鋸截骨形成骨缺損；c. PMMA骨水泥填充骨缺損；d. 4周后取出PMMA骨水泥，保留誘導膜；e. 植入自體骨與rhBMP-2/PCPC混合物
Figure1. Process of bone defect model establishment and Masquelet technique treatmenta. Lateral incision along the right forelimb to reveal the ulna; b. Osteotomy to form the bone defect; c. PMMA cement filling of the bone defect; d. Removal of PMMA cement after 4 weeks, preserving the induced membrane; e. Implantation of autologous bone with rhBMP-2/PCPC mixture
1.2.3 實驗分組
根據植入自體骨及rhBMP-2/PCPC質量比不同，將36只已造模的實驗動物隨機分為4組，每組9只。A組：自體骨（100%）；B組：25%自體骨+75%rhBMP-2/PCPC；C組：50%自體骨+50%rhBMP-2/PCPC；D組：75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC。
1.2.4 觀測指標
分別于術后4、8、12周同上法麻醉，每組處死實驗動物3只。① 大體觀察：術后各時間點于右尺骨原手術部位取材，大體觀察骨缺損愈合情況。② 影像學檢查：術后各時間點攝尺骨標本正側位X線片，觀察骨缺損愈合情況。③ 組織學觀察：術后各時間點取尺骨標本，經生理鹽水沖洗、固定、脫水后，石蠟包埋、切片（厚5 μm），常規HE染色，光鏡下觀察。④ ALP活性檢測：術后各時間點取尺骨標本，按照ALP活性檢測試劑盒操作方法，使用紫外可見光分光光度計檢測570 nm波長下吸光度（A）值，根據標準曲線計算樣本ALP活性。⑤ 三點彎曲生物力學試驗：術后各時間點取各組完整右上肢標本，維持22℃、62%相對濕度環境下，將標本放置于間距為20 mm的2個支架上，使用機械試驗機以5 mm/min恒定位移率在缺損中點施加彎曲載荷直至樣本破損，自動記錄此時的最大載荷。通過上述觀測指標結果確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例。
1.3 最佳比例混合骨結合PRP成骨能力檢測
1.3.1 PRP制備
取18只實驗動物，同上法麻醉，抽取兔耳中央靜脈血10 mL，以179×g離心10 min；離心產物分為3層，棄下層紅細胞，將中間層（白細胞和炎癥細胞因子）和上層（血漿）再次以1 029×g離心10 min；產物分為2層，棄上層透明血漿層，最終得到下層約1 mL血小板和白細胞沉積層，即為PRP。
1.3.2 實驗分組
將18只實驗動物同上法制備尺骨骨缺損模型并采用Masquelet技術治療后，隨機分為2組，每組9只。對照組植入最佳混合比例自體骨+rhBMP-2/PCPC，實驗組植入最佳混合比例自體骨+rhBMP-2/PCPC+PRP。
1.3.3 觀測指標
分別于術后4、8、12周同上法麻醉，每組處死實驗動物3只，同1.2.4方法進行各項指標觀測。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，多組間比較以及組內多時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，兩組間比較比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的數據以M（Q1，Q3）表示，組間及組內比較采用Mann-Whitney U檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
2.1.1 大體觀察
術后新西蘭大白兔均成活至實驗完成。2只動物出現切口部分裂開，經換藥后痊愈；無感染發生。術后4周，A、C、D組均可觀察到尺骨缺損處斷端膨大，B組斷端局部出現凹陷；8周，各組均可見骨痂形成，斷端無明顯缺損；12周，各組均可見缺損處新骨與兩側骨皮質發生連接，B組缺損處被軟組織包繞，斷端膨大。見圖2。
圖2
術后12周A～D組大體觀察
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure2. General observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.2 影像學檢查
術后4周，各組X線片示骨缺損斷端均有新骨生長，新骨密度較低；8周，各組新骨生長較4周時強烈，兩端與正常宿主骨質形成橋接，骨密度低于正常骨組織，側位X線片示B組新骨橫向寬度最細；12周，各組形成新骨重塑，與兩端宿主骨皮質連續，新骨密度同正常部位骨密度一致，側位X線片示B組單側骨皮質連續。見圖3。
圖3
術后12周A～D組X線片
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure3. X-ray flims of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.3 組織學觀察
術后4周，各組均可觀察到骨細胞、纖維結締組織、透明軟骨、少量新骨、部分新生不規則血管結構，其中B、C組可見較多纖維結締組織和透明軟骨。8周，各組可見新形成編織骨、毛細血管增多，并可見新骨內骨髓腔形成，纖維結締組織、透明軟骨減少。12周，A、D組可見成熟骨組織形成，具有良好骨髓、血管等結構；B、C組新形成骨組織較其他組少，可見纖維結締組織、透明軟骨。見圖4。
圖4
術后12周A～D組組織學觀察（HE×200）
黑箭頭示新生骨組織，藍箭頭示髓腔結構，白箭頭示纖維結締組織，紅箭頭示軟骨組織 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure4. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed marrow cavity structure, white arrow showed fibrous connective tissue, red arrow showed cartilage tissue a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.4 ALP活性檢測
隨時間延長，各組ALP活性均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點A組ALP活性顯著高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
A～D組術后ALP活性檢測比較（n=3，
，U/gprot）
Table1.
Comparison of ALP activity after operation between groups A-D (n=3, 
, U/gprot)
2.1.5 生物力學檢測
隨時間延長，各組最大載荷均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點A、D組最大載荷顯著高于B、C組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
A～D組術后三點彎曲試驗最大載荷比較（n=3，
，N）
Table2.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between groups A-D (n=3, 
, N)
根據上述檢測，得出最佳混合比例為75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC。
2.2 最佳比例混合骨結合PRP成骨能力檢測
2.2.1 大體觀察
術后4周，兩組均可見缺損斷端膨大；8周，兩組均可見骨痂及軟組織增生包繞缺損處；12周，兩組均可見缺損處新骨與兩端皮質骨連續，其中實驗組有少量軟組織包繞，輕微膨大。見圖5。
圖5
術后12周對照組和實驗組大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. General observation of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.2 影像學檢查
術后4周，兩組X線片示骨缺損處被骨痂包繞，新骨形成；8周，新骨與兩端正常宿主骨質形成橋接；12周，新骨與兩端宿主骨骨皮質連續，其中實驗組骨質膨大。見圖6。
圖6
術后12周對照組和實驗組X線片
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. X-ray films of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.3 組織學觀察
術后4周，兩組骨細胞、纖維結締組織、新骨、新生血管等無明顯差別；8、12周，與對照組相比，實驗組可見更多骨組織、更少纖維結締組織。見圖7。
圖7
術后12周對照組和實驗組組織學觀察（HE×200）
黑箭頭示新生骨組織，藍箭頭示髓腔結構 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Histological observation of control and experimental groups at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed the structure of the medullary cavity a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 ALP活性檢測
隨時間延長，兩組ALP活性均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點實驗組ALP活性均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
實驗組和對照組術后ALP活性檢測比較（n=3，
，U/gprot）
Table3.
Comparison of ALP activity after operation between experimental and control groups (n=3, 
, U/gprot)
2.2.5 生物力學檢測
隨時間延長，兩組最大載荷均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點實驗組最大載荷均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。與術后12周A組最大載荷比較，術后12周實驗組最大載荷顯著增加，差異有統計學意義（t=?72.975，P<0.001）。
表4
實驗組和對照組術后三點彎曲試驗最大載荷比較（n=3，
，N）
Table4.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between experimental and control groups (n=3, 
, N)
3 討論
大段骨缺損的治療是骨科醫生面臨的重大臨床挑戰[8]。Masquelet技術是目前解決大段骨缺損的有效方法之一，而制約其臨床應用的最主要因素是在第二階段手術中需要填充大量自體松質骨。自體骨是治療骨缺損的金標準[9]，但其來源及取骨量有限。作為自體骨的替代物，人工骨材料無免疫排斥反應、來源廣泛，是臨床重要的骨修復重建材料[10]。PCPC具有優良生物相容性、可降解和易成型的優點，但無骨誘導活性；將其與rhBMP-2復合后，不僅具有骨傳導性，還具骨誘導活性，能夠提高組織工程骨的成骨能力[11]，是目前應用較多的提高骨缺損修復效果手段[5，12]。
自體骨與同種異體骨混合移植的方式，可以減少自體骨使用。在Masquelet技術第二階段手術中，有研究表明自體骨與同種異體骨混合比例需超過3∶1[13]。張一等[14]將硫酸鈣顆粒與自體松質骨混合填入骨缺損中，結果顯示硫酸鈣顆粒與自體松質骨比例可超過1∶3，甚至可完全由硫酸鈣顆粒填充（骨缺損<5 cm）。rhBMP-2/PCPC與自體骨的最佳混合比例目前尚無相關研究。本研究結果顯示，D組75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC成骨能力最佳。以A組100%自體骨作為實驗驗證標準，雖然D組與A組在ALP活性及生物力學性能上存在一定差距，但大體觀察及影像學檢查結果顯示D組樣本填充骨缺損后均達到骨愈合，組織學觀察也表明缺損處新骨形成并連接兩側斷端骨皮質，骨組織結構及血管結構與A組無明顯差異。rhBMP-2/PCPC占25%的比例無法再提高，我們分析原因是PCPC具有骨傳導性但無骨誘導性，雖然復合rhBMP-2后具備了一定骨誘導活性，但成骨細胞等仍需由自體骨組織提供，當自體骨含量比例較小時，成骨相關細胞數量不足會影響成骨能力。
在骨缺損治療中常提到“鉆石學說”[15]，該學說的四要素包括穩定的力學環境、骨傳導支架、成骨細胞與生長因子。生長因子的使用有利于骨缺損愈合，在自體骨相對不足情況下，可以通過復合生長因子來提高骨愈合率。BMP-2與BMP-7是目前臨床上常用的兩種生長因子，有研究表明單獨BMP-2治療骨缺損患者的愈合率高于接受BMP-7治療的患者[16]。PCPC的自身特點使其可以充當BMP的理想載體。當與PCPC結合時，rhBMP-2保留時間可以延長，以避免蛋白酶的酶解。本研究將PCPC和rhBMP-2復合，與自體骨植入Masquelet兔尺骨缺損模型，術后12周B～D組可觀察到新生骨組織形成，影像學觀察達到骨愈合標準，說明PCPC與rhBMP-2發揮了良好成骨能力，在動物實驗中與不同比例自體骨混合均可以修復大段骨缺損。D組與A組在ALP活性及生物力學測試上仍存在差距，如果將實驗時間延長，這種區別能否縮小需要進一步研究。
PRP是通過離心方法從自體血中提取的血小板濃縮物，含有高濃度血小板、白細胞和纖維蛋白。血小板激活后能釋放出多種生長因子，這些生長因子可促進細胞增殖分化，促進骨與軟組織修復；高濃度白細胞能起到較好的抗感染作用；纖維蛋白可為組織修復提供良好網絡結構，為修復細胞的爬行提供支架。目前研究表明，PRP可以促進骨愈合，治療骨不連[17]，其作用于骨缺損局部，使得PDGF及TGF-β含量增加，成骨細胞數量增加，并使巨噬細胞聚集到骨折斷端，持續釋放生長因子，使生長因子在3個月內維持較高水平，從而達到促進新骨形成的作用。Kanthan等[18]制作了兔脛骨骨折延遲愈合模型，發現PRP復合人工骨能促進骨修復，而單獨使用PRP卻不能達到最好效果；Dong等[19]也在新西蘭白兔實驗模型中證實自體PRP能有效促進組織工程骨愈合過程中血管發生和骨形成，具有潛在臨床應用意義。
本研究將PRP與最佳混合比例植骨組（75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC）聯合應用，結果表明實驗組ALP活性明顯高于對照組；在生物力學研究中，術后8、12周實驗組最大載荷明顯優于對照組，12周時實驗組最大載荷明顯高于A組（100%自體骨）。表明在PRP促進下，實驗組骨強度已超過A組，PRP明顯改善了新生骨的力學強度。我們分析原因是PRP可與誘導膜內微血管系統和成骨相關因子發揮協同作用，共同促進移植骨再血管化，誘導成骨細胞增殖，加快骨缺損區骨痂形成和植骨后骨愈合質量，通過增加新骨強度對長骨缺損發揮治療作用[20]。由于血管生成和血管內皮細胞穿透軟骨痂是由促血管生成因子刺激的，PRP可能啟動骨折愈合過程，并且PRP中存在或釋放的生長因子可能提供了誘導新骨形成的細胞信號，在骨愈合早期階段起作用[21]。BMP的誘導作用是個級聯過程，因此BMP在骨愈合中起主要作用[22-23]。聯合BMP和自體PRP治療骨缺損，在骨愈合的各個時期促進成骨，是目前可提供的最優治療選擇[24-25]。
本研究仍存在一些不足之處。首先，實驗動物樣本量較少，數據容易產生偏倚，進而影響實驗結果；其次，PRP與rhBMP-2/PCPC復合材料及自體骨進行混合，PRP的最佳濃度和使用劑量尚不能明確；最后，rhBMP-2/PCPC復合材料與自體骨混合，需要更長期觀察來驗證其最佳混合比例。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經西安交通大學醫學院動物倫理委員會批準（2019-175-115）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（津）2021-0001，使用許可證批準號：SYXK2021-0015
作者貢獻聲明 叢雨軒：研究設計及實施、文章撰寫；張斌飛、付亞輝：研究實施，數據收集；魏星：統計分析；王虎：文獻回顧，起草文章；莊巖：對文章的知識性內容作批評性審閱；張堃：行政支持；雷金來：研究設計，經費支持；鄧洪利：文獻回顧
骨缺損刻有創傷、感染、結核、骨腫瘤切除等原因導致，是臨床常見疾病之一[1]。大段骨缺損無法通過自身修復重建愈合[2]，進而造成肢體功能障礙，嚴重影響患者生活質量。Masquelet技術因具有術后愈合快、負重時間早、無需顯微外科吻合血管、治療費用少等優點，尤其適用于治療創傷后大段骨缺損[3]。但該技術二期需植入大量自體松質骨，而自體松質骨來源有限，制約了其在臨床上的廣泛應用。磷酸鈣人工骨（calcium phosphate cement，CPC）具有良好的生物相容性和降解性能，能促進新骨生成，固化后成分轉化為低結晶度羥基磷酸鈣，與正常人體骨骼無機鹽成分相似[4]。重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）可以促進BMSCs分化為成骨樣細胞，并促進成骨細胞增殖，從而誘導成骨[5]。將rhBMP-2和多孔CPC（porous CPC，PCPC）固化體通過低溫吸附凍干保護技術制成rhBMP-2/PCPC復合材料，可以控制rhBMP-2 的釋放速度，使其更好地發揮生物活性，有效促進骨生長，加速骨折愈合，可用于骨缺損的填充[6]。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）含有高濃度生長因子[7]，可以促進骨折愈合，已在創傷修復領域得到廣泛應用。
本研究擬通過動物實驗，采用rhBMP-2/PCPC復合材料與自體骨混合物作為Masquelet技術二期植骨材料，探索其具有最佳成骨能力時的混合比例，從而減少植骨過程中自體骨的使用，解決自體骨來源不足的問題；同時將PRP與rhBMP-2/PCPC、自體骨結合，以期解決混合材料成骨能力不足的缺點，為大段骨缺損修復探索一種有效治療方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡新西蘭大白兔54只，雌雄不限，體質量3.0～3.8 kg，平均3.5 kg，由天津裕達實驗動物養殖有限公司提供。實驗動物以標準飲食單籠飼養，研究期間可自由活動。
rhBMP-2/PCPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；ALP活性檢測試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）。TE2000-U光學顯微鏡（Nikon公司，日本）；紫外可見光分光光度計（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；HY-0230機械試驗機（上海衡翼精密儀器有限公司）。
1.2 確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
1.2.1 骨缺損模型建立
取36只實驗動物，以速眠新（0.2 mL/kg）肌肉注射麻醉后固定于手術臺，右前肢備皮，常規消毒、鋪巾，作前肢側向4～5 cm長切口，切開皮膚及皮下淺、深筋膜，盡量避開皮下血管，沿肌肉間隙分離，逐步暴露尺骨。剝離尺骨骨膜，在尺骨中段用無菌小擺鋸鋸開，生理鹽水沖洗以減少骨壞死；再向近端距第1條截骨線約2.5 cm處作第2條截骨線，連同骨膜去除兩線之間的骨段，制備2 cm長骨缺損模型。
1.2.2 Masquelet技術治療過程
生理鹽水沖洗斷端骨碎屑、淤血及骨髓腔內骨髓組織等，按照Masquelet技術第一階段方案，用聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）骨水泥填充骨缺損，沖洗后縫合軟組織及皮膚。因橈骨為兔的主要負重骨，可以提供足夠穩定性，故尺骨無需固定。術后禁食、水12 h，單籠飼養，并給予抗生素（青霉素40萬U/只，肌肉注射，2次/d，連續3 d）預防感染。術后3、5 d切口換藥；檢查體溫、體質量和一般情況，直至切口愈合。術后實驗動物可正常負重，活動不受限制。
術后4周對實驗動物同上法麻醉后，從左側髂骨翼取自體骨（15 mm×4 mm×2 mm），制成自體骨顆粒備用。沿右上肢原切口切開皮膚及軟組織，按照Masquelet技術第二階段方案切開已形成的誘導膜，取出PMMA骨水泥；于誘導膜內植入不同質量比的自體骨和rhBMP-2/PCPC混合物，縫合誘導膜、軟組織及皮膚。見圖1。術后護理同前。
圖1
骨缺損模型建立及Masquelet技術治療過程
a. 沿右前肢側向切開逐層顯露尺骨；b. 用小擺鋸截骨形成骨缺損；c. PMMA骨水泥填充骨缺損；d. 4周后取出PMMA骨水泥，保留誘導膜；e. 植入自體骨與rhBMP-2/PCPC混合物
Figure1. Process of bone defect model establishment and Masquelet technique treatmenta. Lateral incision along the right forelimb to reveal the ulna; b. Osteotomy to form the bone defect; c. PMMA cement filling of the bone defect; d. Removal of PMMA cement after 4 weeks, preserving the induced membrane; e. Implantation of autologous bone with rhBMP-2/PCPC mixture
1.2.3 實驗分組
根據植入自體骨及rhBMP-2/PCPC質量比不同，將36只已造模的實驗動物隨機分為4組，每組9只。A組：自體骨（100%）；B組：25%自體骨+75%rhBMP-2/PCPC；C組：50%自體骨+50%rhBMP-2/PCPC；D組：75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC。
1.2.4 觀測指標
分別于術后4、8、12周同上法麻醉，每組處死實驗動物3只。① 大體觀察：術后各時間點于右尺骨原手術部位取材，大體觀察骨缺損愈合情況。② 影像學檢查：術后各時間點攝尺骨標本正側位X線片，觀察骨缺損愈合情況。③ 組織學觀察：術后各時間點取尺骨標本，經生理鹽水沖洗、固定、脫水后，石蠟包埋、切片（厚5 μm），常規HE染色，光鏡下觀察。④ ALP活性檢測：術后各時間點取尺骨標本，按照ALP活性檢測試劑盒操作方法，使用紫外可見光分光光度計檢測570 nm波長下吸光度（A）值，根據標準曲線計算樣本ALP活性。⑤ 三點彎曲生物力學試驗：術后各時間點取各組完整右上肢標本，維持22℃、62%相對濕度環境下，將標本放置于間距為20 mm的2個支架上，使用機械試驗機以5 mm/min恒定位移率在缺損中點施加彎曲載荷直至樣本破損，自動記錄此時的最大載荷。通過上述觀測指標結果確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例。
1.3 最佳比例混合骨結合PRP成骨能力檢測
1.3.1 PRP制備
取18只實驗動物，同上法麻醉，抽取兔耳中央靜脈血10 mL，以179×g離心10 min；離心產物分為3層，棄下層紅細胞，將中間層（白細胞和炎癥細胞因子）和上層（血漿）再次以1 029×g離心10 min；產物分為2層，棄上層透明血漿層，最終得到下層約1 mL血小板和白細胞沉積層，即為PRP。
1.3.2 實驗分組
將18只實驗動物同上法制備尺骨骨缺損模型并采用Masquelet技術治療后，隨機分為2組，每組9只。對照組植入最佳混合比例自體骨+rhBMP-2/PCPC，實驗組植入最佳混合比例自體骨+rhBMP-2/PCPC+PRP。
1.3.3 觀測指標
分別于術后4、8、12周同上法麻醉，每組處死實驗動物3只，同1.2.4方法進行各項指標觀測。
1.4 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差表示，多組間比較以及組內多時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，兩組間比較比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的數據以M（Q1，Q3）表示，組間及組內比較采用Mann-Whitney U檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 確定自體骨和rhBMP-2/PCPC最佳混合比例
2.1.1 大體觀察
術后新西蘭大白兔均成活至實驗完成。2只動物出現切口部分裂開，經換藥后痊愈；無感染發生。術后4周，A、C、D組均可觀察到尺骨缺損處斷端膨大，B組斷端局部出現凹陷；8周，各組均可見骨痂形成，斷端無明顯缺損；12周，各組均可見缺損處新骨與兩側骨皮質發生連接，B組缺損處被軟組織包繞，斷端膨大。見圖2。
圖2
術后12周A～D組大體觀察
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure2. General observation of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.2 影像學檢查
術后4周，各組X線片示骨缺損斷端均有新骨生長，新骨密度較低；8周，各組新骨生長較4周時強烈，兩端與正常宿主骨質形成橋接，骨密度低于正常骨組織，側位X線片示B組新骨橫向寬度最細；12周，各組形成新骨重塑，與兩端宿主骨皮質連續，新骨密度同正常部位骨密度一致，側位X線片示B組單側骨皮質連續。見圖3。
圖3
術后12周A～D組X線片
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure3. X-ray flims of groups A-D at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.3 組織學觀察
術后4周，各組均可觀察到骨細胞、纖維結締組織、透明軟骨、少量新骨、部分新生不規則血管結構，其中B、C組可見較多纖維結締組織和透明軟骨。8周，各組可見新形成編織骨、毛細血管增多，并可見新骨內骨髓腔形成，纖維結締組織、透明軟骨減少。12周，A、D組可見成熟骨組織形成，具有良好骨髓、血管等結構；B、C組新形成骨組織較其他組少，可見纖維結締組織、透明軟骨。見圖4。
圖4
術后12周A～D組組織學觀察（HE×200）
黑箭頭示新生骨組織，藍箭頭示髓腔結構，白箭頭示纖維結締組織，紅箭頭示軟骨組織 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure4. Histological observation of groups A-D at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed marrow cavity structure, white arrow showed fibrous connective tissue, red arrow showed cartilage tissue a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.1.4 ALP活性檢測
隨時間延長，各組ALP活性均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點A組ALP活性顯著高于其余3組，C、D組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；C、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
A～D組術后ALP活性檢測比較（n=3，，U/gprot）
Table1.
Comparison of ALP activity after operation between groups A-D (n=3, , U/gprot)
2.1.5 生物力學檢測
隨時間延長，各組最大載荷均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點A、D組最大載荷顯著高于B、C組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
表2
A～D組術后三點彎曲試驗最大載荷比較（n=3，，N）
Table2.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between groups A-D (n=3, , N)
根據上述檢測，得出最佳混合比例為75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC。
2.2 最佳比例混合骨結合PRP成骨能力檢測
2.2.1 大體觀察
術后4周，兩組均可見缺損斷端膨大；8周，兩組均可見骨痂及軟組織增生包繞缺損處；12周，兩組均可見缺損處新骨與兩端皮質骨連續，其中實驗組有少量軟組織包繞，輕微膨大。見圖5。
圖5
術后12周對照組和實驗組大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure5. General observation of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.2 影像學檢查
術后4周，兩組X線片示骨缺損處被骨痂包繞，新骨形成；8周，新骨與兩端正常宿主骨質形成橋接；12周，新骨與兩端宿主骨骨皮質連續，其中實驗組骨質膨大。見圖6。
圖6
術后12周對照組和實驗組X線片
a. 對照組；b. 實驗組
Figure6. X-ray films of control and experimental groups at 12 weeks after operationa. Control group; b. Experimental group
2.2.3 組織學觀察
術后4周，兩組骨細胞、纖維結締組織、新骨、新生血管等無明顯差別；8、12周，與對照組相比，實驗組可見更多骨組織、更少纖維結締組織。見圖7。
圖7
術后12周對照組和實驗組組織學觀察（HE×200）
黑箭頭示新生骨組織，藍箭頭示髓腔結構 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Histological observation of control and experimental groups at 12 weeks after operation (HE×200)Black arrow showed new bone tissue, blue arrow showed the structure of the medullary cavity a. Control group; b. Experimental group
2.2.4 ALP活性檢測
隨時間延長，兩組ALP活性均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點實驗組ALP活性均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
實驗組和對照組術后ALP活性檢測比較（n=3，，U/gprot）
Table3.
Comparison of ALP activity after operation between experimental and control groups (n=3, , U/gprot)
2.2.5 生物力學檢測
隨時間延長，兩組最大載荷均逐漸增加，差異有統計學意義（P<0.05）。術后各時間點實驗組最大載荷均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表4。與術后12周A組最大載荷比較，術后12周實驗組最大載荷顯著增加，差異有統計學意義（t=?72.975，P<0.001）。
表4
實驗組和對照組術后三點彎曲試驗最大載荷比較（n=3，，N）
Table4.
Comparison of the maximum load of three-point bending test after operation between experimental and control groups (n=3, , N)
3 討論
大段骨缺損的治療是骨科醫生面臨的重大臨床挑戰[8]。Masquelet技術是目前解決大段骨缺損的有效方法之一，而制約其臨床應用的最主要因素是在第二階段手術中需要填充大量自體松質骨。自體骨是治療骨缺損的金標準[9]，但其來源及取骨量有限。作為自體骨的替代物，人工骨材料無免疫排斥反應、來源廣泛，是臨床重要的骨修復重建材料[10]。PCPC具有優良生物相容性、可降解和易成型的優點，但無骨誘導活性；將其與rhBMP-2復合后，不僅具有骨傳導性，還具骨誘導活性，能夠提高組織工程骨的成骨能力[11]，是目前應用較多的提高骨缺損修復效果手段[5，12]。
自體骨與同種異體骨混合移植的方式，可以減少自體骨使用。在Masquelet技術第二階段手術中，有研究表明自體骨與同種異體骨混合比例需超過3∶1[13]。張一等[14]將硫酸鈣顆粒與自體松質骨混合填入骨缺損中，結果顯示硫酸鈣顆粒與自體松質骨比例可超過1∶3，甚至可完全由硫酸鈣顆粒填充（骨缺損<5 cm）。rhBMP-2/PCPC與自體骨的最佳混合比例目前尚無相關研究。本研究結果顯示，D組75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC成骨能力最佳。以A組100%自體骨作為實驗驗證標準，雖然D組與A組在ALP活性及生物力學性能上存在一定差距，但大體觀察及影像學檢查結果顯示D組樣本填充骨缺損后均達到骨愈合，組織學觀察也表明缺損處新骨形成并連接兩側斷端骨皮質，骨組織結構及血管結構與A組無明顯差異。rhBMP-2/PCPC占25%的比例無法再提高，我們分析原因是PCPC具有骨傳導性但無骨誘導性，雖然復合rhBMP-2后具備了一定骨誘導活性，但成骨細胞等仍需由自體骨組織提供，當自體骨含量比例較小時，成骨相關細胞數量不足會影響成骨能力。
在骨缺損治療中常提到“鉆石學說”[15]，該學說的四要素包括穩定的力學環境、骨傳導支架、成骨細胞與生長因子。生長因子的使用有利于骨缺損愈合，在自體骨相對不足情況下，可以通過復合生長因子來提高骨愈合率。BMP-2與BMP-7是目前臨床上常用的兩種生長因子，有研究表明單獨BMP-2治療骨缺損患者的愈合率高于接受BMP-7治療的患者[16]。PCPC的自身特點使其可以充當BMP的理想載體。當與PCPC結合時，rhBMP-2保留時間可以延長，以避免蛋白酶的酶解。本研究將PCPC和rhBMP-2復合，與自體骨植入Masquelet兔尺骨缺損模型，術后12周B～D組可觀察到新生骨組織形成，影像學觀察達到骨愈合標準，說明PCPC與rhBMP-2發揮了良好成骨能力，在動物實驗中與不同比例自體骨混合均可以修復大段骨缺損。D組與A組在ALP活性及生物力學測試上仍存在差距，如果將實驗時間延長，這種區別能否縮小需要進一步研究。
PRP是通過離心方法從自體血中提取的血小板濃縮物，含有高濃度血小板、白細胞和纖維蛋白。血小板激活后能釋放出多種生長因子，這些生長因子可促進細胞增殖分化，促進骨與軟組織修復；高濃度白細胞能起到較好的抗感染作用；纖維蛋白可為組織修復提供良好網絡結構，為修復細胞的爬行提供支架。目前研究表明，PRP可以促進骨愈合，治療骨不連[17]，其作用于骨缺損局部，使得PDGF及TGF-β含量增加，成骨細胞數量增加，并使巨噬細胞聚集到骨折斷端，持續釋放生長因子，使生長因子在3個月內維持較高水平，從而達到促進新骨形成的作用。Kanthan等[18]制作了兔脛骨骨折延遲愈合模型，發現PRP復合人工骨能促進骨修復，而單獨使用PRP卻不能達到最好效果；Dong等[19]也在新西蘭白兔實驗模型中證實自體PRP能有效促進組織工程骨愈合過程中血管發生和骨形成，具有潛在臨床應用意義。
本研究將PRP與最佳混合比例植骨組（75%自體骨+25%rhBMP-2/PCPC）聯合應用，結果表明實驗組ALP活性明顯高于對照組；在生物力學研究中，術后8、12周實驗組最大載荷明顯優于對照組，12周時實驗組最大載荷明顯高于A組（100%自體骨）。表明在PRP促進下，實驗組骨強度已超過A組，PRP明顯改善了新生骨的力學強度。我們分析原因是PRP可與誘導膜內微血管系統和成骨相關因子發揮協同作用，共同促進移植骨再血管化，誘導成骨細胞增殖，加快骨缺損區骨痂形成和植骨后骨愈合質量，通過增加新骨強度對長骨缺損發揮治療作用[20]。由于血管生成和血管內皮細胞穿透軟骨痂是由促血管生成因子刺激的，PRP可能啟動骨折愈合過程，并且PRP中存在或釋放的生長因子可能提供了誘導新骨形成的細胞信號，在骨愈合早期階段起作用[21]。BMP的誘導作用是個級聯過程，因此BMP在骨愈合中起主要作用[22-23]。聯合BMP和自體PRP治療骨缺損，在骨愈合的各個時期促進成骨，是目前可提供的最優治療選擇[24-25]。
本研究仍存在一些不足之處。首先，實驗動物樣本量較少，數據容易產生偏倚，進而影響實驗結果；其次，PRP與rhBMP-2/PCPC復合材料及自體骨進行混合，PRP的最佳濃度和使用劑量尚不能明確；最后，rhBMP-2/PCPC復合材料與自體骨混合，需要更長期觀察來驗證其最佳混合比例。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經西安交通大學醫學院動物倫理委員會批準（2019-175-115）；實驗動物生產許可證批準號：SCXK（津）2021-0001，使用許可證批準號：SYXK2021-0015
作者貢獻聲明 叢雨軒：研究設計及實施、文章撰寫；張斌飛、付亞輝：研究實施，數據收集；魏星：統計分析；王虎：文獻回顧，起草文章；莊巖：對文章的知識性內容作批評性審閱；張堃：行政支持；雷金來：研究設計，經費支持；鄧洪利：文獻回顧
