引用本文： 徐鑫, 范驍宇, 吳鑫杰, 時利軍, 王培旭, 高福強, 孫偉, 李子榮. 山奈酚對激素誘導的股骨頭壞死中內皮細胞的保護作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(10): 1277-1287. doi: 10.7507/1002-1892.202204028 復制
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科難治性疾病，有多種病因[1]。中國ONFH患者累計達812萬[2]，且主要困擾勞動人口，給患者帶來極大痛苦和經濟負擔[3]。在非創傷性ONFH中，糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）誘導的ONFH（GCs induced ONFH，GIONFH）發病率占首位[4]，其病理特征主要是多種原因引起的血運障礙[5-7]，導致骨細胞及骨髓缺血壞死[8]。GCs可減少骨血管生成，因此改善股骨頭血液循環可能是預防GIONFH的關鍵[9]。
骨微血管內皮細胞（bone microvascular endothe-lial cells，BMECs）在血管生成和調節骨內微環境中發揮重要作用[10]，其襯附于骨微血管內壁表面，易成為GCs等的靶點而被損傷[11]。因此，BMECs損傷可能是缺血性病變的始動環節。研究表明，BMECs功能障礙引起的股骨頭微循環障礙在GIONFH發生發展中起重要作用[12-15]；在GIONFH中，BMECs因持續暴露于GCs導致功能紊亂，在誘導凋亡和抑制血管生成中起關鍵作用[12，16]。因此，骨保護藥物可能通過抑制內皮細胞損傷，從而預防GIONFH。中藥骨碎補已廣泛應用于治療骨質疏松等骨科疾病[17]。山奈酚是從骨碎補中提取的化合物，可通過抑制成骨細胞凋亡發揮骨保護作用，改善地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導的成骨抑制[18-20]。目前相關研究主要集中于山奈酚的抗骨質疏松作用，尚無研究探討其能否減輕Dex誘導的BMECs損傷。本研究擬通過體外實驗觀察山奈酚對Dex誘導導致的BMECs損傷的影響及其對GIONFH的保護作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
山奈酚（北京索萊寶科技有限公司）；Dex（上海源葉生物科技有限公司）。二者均保存于–20℃冰箱中，山奈酚使用前避光保存。實驗時將Dex和山奈酚分別溶于DMSO，原液濃度分別為100 mmol/L和200 mmol/L，后續實驗使用內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM）稀釋至合適濃度。
DMEM培養基、ECM、0.2% Ⅰ型膠原酶、0.1%胰蛋白酶-EDTA、FBS（GIBCO公司，美國）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑、封閉緩沖液（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（同仁公司，日本）；EdU-488細胞增殖試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒、AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Matrigel基質膠（BD Biosciences公司，美國）；Transwell小室（孔徑3 μm）、24孔培養板、96孔培養板（Corning公司，美國）；RIPA裂解液緩沖液、BCA蛋白質定量試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司）；抗CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、Cyclin D1、Cyclin E1、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、Cleaved Caspase-3、GAPDH、β-actin一抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；抗VEGFA、B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl2）、Bcl2相關蛋白X（Bcl2-associated X，Bax）、一抗（Proteintech公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗（Bioworld公司，美國）。
酶標儀、電化學發光檢測系統（Thermo Fisher Scientific公司, 美國）；熒光顯微鏡、光學顯微鏡（Casse公司，美國）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）；Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 細胞培養與鑒定
采用本課題組既往報道的方法[21]，采用酶消化、差速貼壁技術分離培養人BMECs。無菌條件下，取因股骨頸骨折接受人工全髖關節置換術患者自愿捐贈的松質骨，用咬骨鉗咬成細小骨粒，生理鹽水沖洗3～5遍，置于DMEM培養基中，6 h內提取BMECs。棄培養基，于37℃水浴條件下，0.2%Ⅰ型膠原酶消化25 min，0.1%胰蛋白酶-EDTA消化5 min，含10%FBS的DMEM培養基終止消化，100目細胞篩過濾，以離心半徑10 cm、800 r/min離心6 min，收集沉淀，ECM重懸，接種于細胞培養瓶中。光鏡下觀察細胞形態變化。待細胞生長至培養瓶面積80%時進行傳代，取第2～5代細胞用于后續實驗。
細胞鑒定：① CD31和vWF免疫熒光染色：CD31和vWF作為特異性內皮細胞標記物用于BMECs鑒定[16]。將BMECs接種于24孔板中，培養至細胞密度為50%～70%，4%多聚甲醛固定15 min；0.1%Triton X-100破膜，封閉緩沖液封閉30 min；加入一抗CD31（1∶200）及vWF（1∶1 000）4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗4℃避光孵育1 h，含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。隨機選取3個視野，統計細胞總數及CD31、vWF陽性細胞數，計算CD31及vWF陽性率。② 體外成管實驗：在預冷24孔培養板上加入289 μL Matrigel基質膠，37℃孵育30 min；以4.0×105個/mL密度接種BMECs，37℃、5%CO2培養箱孵育16 h，光鏡觀察細胞是否呈管狀分布。
1.3 山奈酚對Dex干預后BMECs的影響
1.3.1 對細胞增殖和成血管的影響
① CCK-8檢測：將100 μL含BMECs的ECM培養基加入96孔板中，每孔2×103個，分別加入不同濃度山奈酚（0、0.01、0.1、1、5、10、25 μmol/L）和Dex（0、10、25、50、100、200、300 μmol/L）干預，每組6個復孔，均以DMSO作為溶劑對照。分別于培養24、48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育，1 h后采用酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值。篩選抑制細胞活性的最佳Dex濃度和干預時間點，以及改善細胞活性的最佳山奈酚濃度和干預時間用于后續實驗。將此濃度Dex分別與不同濃度山奈酚（0、0.1、1、5、10 μmol/L）干預BMECs至最佳時間點作為實驗組（分別記為2～6組），以單純BMECs作為對照組（記為1組），DMSO作為溶劑對照組（記為7組），篩選改善Dex抑制作用的最佳山奈酚濃度。
② EdU實驗：將100 μL含BMECs的ECM培養基加入96孔板中，每孔2×103個，分為4組，分別為單純細胞組（A組）、加入最佳濃度Dex組（B組）、加入最佳濃度Dex+1 μmol/L山奈酚組（C組）和加入最佳濃度Dex+5 μmol/L山奈酚組（D組）。干預24 h后，使用EdU-488細胞增殖試劑盒處理各組細胞，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取3個視野，統計細胞總數及EdU陽性細胞數，計算細胞增殖率（公式：EdU陽性細胞數/細胞總數×100%），結果取均值，實驗重復3次。
③ 體外成管實驗：分組方法同EdU實驗，參照1.2方法行體外成管實驗，光鏡下觀察；隨機選取3個視野，使用Image J 1.53k軟件計算各組成管長度和分支點數目，取均值，數據以各組與A組的比值表示，實驗重復3次。
1.3.2 對細胞凋亡的影響
分組方法同EdU實驗，使用一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況，熒光顯微鏡下觀察；隨機取3個視野計數TUNEL陽性細胞數，并計算TUNEL陽性細胞率，取均值，實驗重復3次。根據Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒方法，采用流式細胞術評估細胞凋亡率，實驗重復3次。
1.3.3 對細胞遷移的影響
分組方法同EdU實驗，通過劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響。① 劃痕實驗：使用200 μL移液槍槍頭在融合單層細胞上制造劃痕，孵育0、24 h采集圖像，測量劃痕寬度并按以下公式計算劃痕愈合率：（0 h劃痕寬度?24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復3次。② Transwell遷移實驗：將200 μL含1×105個BMECs的無血清培養基加入上室，將600 μL含20%FBS的ECM培養基加入下室。分別按分組方法處理，孵育12 h后，Transwell小室用甲醇固定，0.1%結晶紫染色；隨后用棉簽去除每個小室上表面未遷移細胞，光鏡下觀察。隨機取3個視野計數遷移細胞，取均值，實驗重復3次。
1.3.4 對細胞蛋白表達的影響
分組方法同EdU實驗，采用Western blot法檢測山奈酚對Dex干預后BMECs蛋白表達的影響。加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑后，用RIPA裂解液緩沖液冰上裂解BMECs，BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度；蛋白裂解物經SDS-PAGE分離后，電轉移至聚偏二氟乙烯膜上；加入抗Cyclin D1、Cyclin E1、MMP2、Cleaved Caspase-3、GAPDH和β-actin一抗，抗VEGFA、Bax、Bcl2一抗；二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG。通過電化學發光檢測系統對蛋白質條帶進行可視化，并使用Image Lab 5.0軟件進行蛋白相對表達量定量分析。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism8.0.1統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMECs培養及鑒定
光鏡下觀察示細胞呈短紡錘形和鵝卵石樣形態生長。免疫熒光染色示CD31及vWF陽性率分別為99.21%±0.76%和98.66%±0.41%，均呈高表達。體外成管實驗示BMECs呈管狀分布，在體外具有血管生成特性。見圖1～3。
圖1
原代BMECs形態觀察（×100）
Figure1.
Morphological observation of primary BMECs (×100)
圖2
BMECs免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右依次為CD31/vWF、DAPI、二者重疊 a. CD31；b. vWF
Figure2. Immunofluorescence staining observation of BMECs (Fluorescence microscope×50)From left to right for CD31/vWF, DAPI, and merge a. CD31; b. vWF
圖3
第2代BMECs體外成管實驗（×100）
Figure3.
Tube formation of the second passage BMECs (×100)
2.2 山奈酚對Dex干預后BMECs的影響
2.2.1 對細胞增殖和成血管的影響
① CCK-8檢測：結果顯示，Dex抑制細胞活性呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用越強。Dex作用24 h且濃度為300 μmol/L時，對BMECs活性的抑制作用顯著強于其他濃度（P<0.05）；而當作用時間延長至48 h時，Dex對BMECs活性的抑制作用開始減弱。因此，選擇300 μmol/L Dex作用24 h進行后續實驗。而山奈酚作用48 h且濃度為1 μmol/L時，可以顯著增加BMECs活性，并改善Dex的抑制作用。因此選擇1 μmol/L山奈酚作用48 h進行后續實驗。見圖4。② EdU實驗：熒光顯微鏡觀察示A組被綠染的增殖細胞數顯著多于其余3組，C組多于B、D組。見圖5。A組細胞增殖率顯著高于其余3組，C組高于B、D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。③ 體外成管實驗：光鏡下觀察示A組細胞呈管狀分布，B～D組管狀結構均有不同程度破壞。見圖6。A組成管長度和分支點數目顯著高于其余3組，C組高于B、D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。
圖4
山奈酚對Dex干預后BMECs活性的影響
a. 不同濃度Dex干預24、48 h；b. 不同濃度山奈酚干預24、48 h；c. 不同濃度山奈酚干預48 h后、300 μmol/L Dex干預24 h
Figure4. Effect of Kaempferol on BMECs activity after Dex treatmenta. Different concentrations of Dex were treated for 24 and 48 hours;b. Different concentrations of Kaempferol were treated for 24 and 48 hours; ? c. After 48 hours treatment with different concentrations of Kaempferol, 300 μmol/L Dex was treated for 24 hours
圖5
EdU實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs增殖的影響（熒光顯微鏡×50）
從上至下依次為Hoechst、EdU、二者重疊 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure5. EdU assay to detect the effect of Kaempferol on the proliferation of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×50)From top to bottom for Hoechst, EdU, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
表1
山奈酚對Dex干預后BMECs增殖、凋亡、遷移和成血管的影響（n=3，
）
Table1.
Effects of Kaempferol on proliferation, apoptosis, migration, and angiogenesis of BMECs after Dex treatment（n=3, 
）
圖6
體外成管實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs成血管的影響（×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure6. Tube formation assay to detect the effect of Kaempferol on the angiogenesis of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 對細胞凋亡的影響
TUNEL和Annexin V/PI凋亡檢測結果示，B～D組TUNEL陽性細胞率和細胞凋亡率顯著高于A組，B、D組顯著高于C組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7、8及表1。
圖7
TUNEL染色檢測山奈酚對Dex干預后BMECs凋亡的影響（熒光顯微鏡×100）
從上至下依次為DAPI、TUNEL、二者重疊 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure7. TUNEL staining assay to detect the effect of Kaempferol on the apoptosis of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×100)From top to bottom for DAPI, TUNEL, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖8
Annexin V/PI流式細胞儀檢測山奈酚對Dex干預后BMECs凋亡的影響
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure8. Annexin V/PI flow cytometry assay to detect the effect of Kaempferol on the apoptosis of BMECs after Dex treatmenta. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.3 對細胞遷移的影響
劃痕實驗和Transwell遷移實驗結果顯示，B～D組劃痕愈合率和細胞遷移數顯著低于A組，B、D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9、10及表1。
圖9
劃痕實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響（×50）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. 0 h；b. 24 h
Figure9. Scratch healing assay to detect the effect of Kaempferol on the migration of BMECs after Dex treatment (×50)From left to right for groups A, B, C, and D a. 0 hour; b. 24 hours
圖10
Transwell遷移實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響（結晶紫×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure10. Transwell migration assay to detect the effect of Kaempferol on the migration of BMECs after Dex treatment (Crystal violet×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 對細胞蛋白表達的影響
Western blot檢測示，B～D組Cleaved Caspase-3和Bax蛋白相對表達量顯著高于A組，B、D組顯著高于C組；B～D組MMP2、Cyclin D1、Cyclin E1、VEGFA和Bcl2蛋白相對表達量顯著低于A組，B、D組顯著低于C組；差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11、12。
圖11
Western blot檢測山奈酚對Dex干預后BMECs目的蛋白表達的影響
Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組4：D組
Figure11. Western blot assay to detect the effect of Kaempferol on protein expression of BMECs after Dex treatmentMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
圖12
Western blot檢測各組各目的蛋白相對表達量
*
*
3 討論
GCs在臨床應用廣泛，已成為非創傷性ONFH最常見的原因[22]。體內外研究證實，GCs具有抑制血管生成、增加骨吸收和減少骨形成的作用。因此，促進骨形成和血管生成的藥物將是預防GCs誘導骨病的最佳選擇。山奈酚是一種重要的黃酮類化合物，通常存在于藥用植物和植物源性食品中[23]。近年來，山奈酚被認為是一種有效治療骨代謝相關疾病的天然化合物。山奈酚能保護血管免受氧化應激和炎癥引起的損傷，減輕阿霉素引起的內皮細胞毒性損傷[24-25]，改善Dex抑制成骨的活性，抑制GCs誘導的骨丟失，發揮抗骨質疏松作用[20，26]。因此，山奈酚既具有增加骨形成、抑制骨吸收的作用，同時又具有血管保護潛能，可能在治療GIONFH中發揮重要作用。然而，相關研究主要集中于山奈酚對于成骨和破骨細胞的影響及其抗骨質疏松作用，目前尚未見研究探討山奈酚對GIONFH的保護作用，對于山奈酚能否減輕Dex誘導的BMECs損傷尚不明確。本研究首次通過體外實驗研究山奈酚對Dex誘導BMECs損傷的影響及其對GIONFH的保護作用。TUNEL和Annexin V/PI凋亡檢測結果示，B、D組TUNEL陽性細胞率和細胞凋亡率顯著高于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex誘導的細胞凋亡。劃痕實驗和Transwell遷移實驗結果顯示，B、D組劃痕愈合率和細胞遷移數顯著低于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex對細胞遷移的抑制作用。EdU及成管實驗結果顯示，B、D組增殖細胞率、成管長度和分支點數目顯著低于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex對細胞增殖和成血管的抑制作用。因此，山奈酚可減輕因內皮細胞受損引起的骨內微循環障礙，對GIONFH起保護作用，這些發現有利于理解山奈酚對GIONFH的保護機制。
細胞凋亡是一種正常生理過程，在ONFH的發生、發展中起著重要作用[27]，抑制內皮細胞凋亡是維持血管完整性和血管新生所必需的環節[28]。既往研究表明，Bcl2表達增加可抑制細胞凋亡，而Cleaved Caspase-3和Bax表達增加可促進細胞凋亡[29]。因此，Bcl2和Bax表達的平衡決定了細胞死亡或存活。本研究中，Dex通過上調Bax、Cleaved Caspase-3水平，下調Bcl2水平誘導BMECs凋亡，與其他研究報道結果一致[30-31]。本研究發現山奈酚通過降低Cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平和增加Bcl2蛋白水平，在GIONFH的BMECs中發揮抗凋亡作用。提示山奈酚可能通過抑制BMECs凋亡對GIONFH起到保護作用，其上游機制需要進一步研究。研究表明PI3K-Akt-Foxo1信號通路在細胞的增殖、凋亡、炎癥和氧化應激過程中發揮重要作用，Dex可以通過PI3K-Akt-Foxo1信號通路誘導大鼠ONFH，上調Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達，下調Bcl2蛋白表達[30，32]。既往研究表明，山奈酚同樣可以調節PI3K-Akt信號通路促進BMSCs成骨，從而發揮抗骨質疏松作用[33]。因此，山奈酚可能通過PI3K-Akt-Foxo1信號通路上調Bax、Cleaved Caspase-3表達，下調Bcl2表達，從而在GIONFH的BMECs中發揮抗凋亡作用。這一假設仍需要進一步研究驗證。
Cyclin D1和Cyclin E1是調節各種細胞增殖的重要因子[34]。研究表明，山奈酚可以通過激活JNK和p38-MAPK信號通路，調節Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達，改善Dex對MC3T3-E1細胞成骨的抑制活性，從而發揮抗骨質疏松作用[20]。而Dex可以通過ROS-JNK-c-Jun信號通路誘導成骨細胞凋亡和自噬，從而導致ONFH[31]。本研究結果提示Dex可以抑制Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達，從而阻滯細胞周期，抑制BMECs增殖；而山奈酚可以上調Dex干預后BMECs中Cyclin D1和Cyclin E1的蛋白表達，促進BMECs增殖，從而促進血管生成。因此，山奈酚可能通過JNK信號通路上調Cyclin D1和Cyclin E1表達，從而在GIONFH的BMECs中發揮促增殖作用。這一假設仍需要后續實驗進行驗證。
VEGF作為一種強效血管生成因子，在內皮細胞增殖、遷移和血管生成中起著重要作用[35]。MMPs超家族由能夠降解細胞外基質的金屬蛋白酶組成，細胞外基質的降解是細胞遷移、侵襲和血管生成的基本過程[36]。研究表明，山奈酚可以增強VEGF誘導的臍靜脈血管內皮細胞中VEGF受體2、內皮一氧化氮合酶和細胞外信號調節激酶的磷酸化，并同時增強VEGF介導的MMP2和MMP9表達[37]。本研究結果提示山奈酚可以提高Dex干預后BMECs中VEGFA和MMP2的蛋白表達，從而調節細胞遷移和血管生成，進而對GIONFH起保護作用。
綜上述，本研究結果表明山奈酚通過減輕BMECs凋亡，促進BMECs增殖、遷移和成血管，減輕GIONFH的內皮損傷和功能障礙。但本研究還存在一些局限性：首先，調控細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的蛋白很多，本研究僅檢測了主要相關蛋白表達量，后續應深入研究其上游機制及相關信號通路；其次，本研究僅通過體外細胞實驗研究山奈酚對GIONFH中BMECs的保護作用，還需要體內實驗進一步驗證。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中日友好醫院倫理委員會批準（2021-16-K08）
作者貢獻聲明 徐鑫：實驗構思及實施、文章撰寫；范驍宇：數據分析和實驗結果可視化；吳鑫杰：實驗材料準備和數據收集；時利軍：實驗實施及數據收集；王培旭：實驗實施及實驗結果可視化；高福強：實驗構思和方法設計；孫偉：實驗監督和領導、初稿審閱和修改；李子榮：對文章初稿審閱和修改
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科難治性疾病，有多種病因[1]。中國ONFH患者累計達812萬[2]，且主要困擾勞動人口，給患者帶來極大痛苦和經濟負擔[3]。在非創傷性ONFH中，糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）誘導的ONFH（GCs induced ONFH，GIONFH）發病率占首位[4]，其病理特征主要是多種原因引起的血運障礙[5-7]，導致骨細胞及骨髓缺血壞死[8]。GCs可減少骨血管生成，因此改善股骨頭血液循環可能是預防GIONFH的關鍵[9]。
骨微血管內皮細胞（bone microvascular endothe-lial cells，BMECs）在血管生成和調節骨內微環境中發揮重要作用[10]，其襯附于骨微血管內壁表面，易成為GCs等的靶點而被損傷[11]。因此，BMECs損傷可能是缺血性病變的始動環節。研究表明，BMECs功能障礙引起的股骨頭微循環障礙在GIONFH發生發展中起重要作用[12-15]；在GIONFH中，BMECs因持續暴露于GCs導致功能紊亂，在誘導凋亡和抑制血管生成中起關鍵作用[12，16]。因此，骨保護藥物可能通過抑制內皮細胞損傷，從而預防GIONFH。中藥骨碎補已廣泛應用于治療骨質疏松等骨科疾病[17]。山奈酚是從骨碎補中提取的化合物，可通過抑制成骨細胞凋亡發揮骨保護作用，改善地塞米松（dexamethasone，Dex）誘導的成骨抑制[18-20]。目前相關研究主要集中于山奈酚的抗骨質疏松作用，尚無研究探討其能否減輕Dex誘導的BMECs損傷。本研究擬通過體外實驗觀察山奈酚對Dex誘導導致的BMECs損傷的影響及其對GIONFH的保護作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
山奈酚（北京索萊寶科技有限公司）；Dex（上海源葉生物科技有限公司）。二者均保存于–20℃冰箱中，山奈酚使用前避光保存。實驗時將Dex和山奈酚分別溶于DMSO，原液濃度分別為100 mmol/L和200 mmol/L，后續實驗使用內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM）稀釋至合適濃度。
DMEM培養基、ECM、0.2% Ⅰ型膠原酶、0.1%胰蛋白酶-EDTA、FBS（GIBCO公司，美國）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑、封閉緩沖液（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（同仁公司，日本）；EdU-488細胞增殖試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；TUNEL凋亡檢測試劑盒、AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Matrigel基質膠（BD Biosciences公司，美國）；Transwell小室（孔徑3 μm）、24孔培養板、96孔培養板（Corning公司，美國）；RIPA裂解液緩沖液、BCA蛋白質定量試劑盒（合肥白鯊生物科技有限公司）；抗CD31、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、Cyclin D1、Cyclin E1、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、Cleaved Caspase-3、GAPDH、β-actin一抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；抗VEGFA、B細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl2）、Bcl2相關蛋白X（Bcl2-associated X，Bax）、一抗（Proteintech公司，美國）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗（Bioworld公司，美國）。
酶標儀、電化學發光檢測系統（Thermo Fisher Scientific公司, 美國）；熒光顯微鏡、光學顯微鏡（Casse公司，美國）；流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）；Image Lab 5.0軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 細胞培養與鑒定
采用本課題組既往報道的方法[21]，采用酶消化、差速貼壁技術分離培養人BMECs。無菌條件下，取因股骨頸骨折接受人工全髖關節置換術患者自愿捐贈的松質骨，用咬骨鉗咬成細小骨粒，生理鹽水沖洗3～5遍，置于DMEM培養基中，6 h內提取BMECs。棄培養基，于37℃水浴條件下，0.2%Ⅰ型膠原酶消化25 min，0.1%胰蛋白酶-EDTA消化5 min，含10%FBS的DMEM培養基終止消化，100目細胞篩過濾，以離心半徑10 cm、800 r/min離心6 min，收集沉淀，ECM重懸，接種于細胞培養瓶中。光鏡下觀察細胞形態變化。待細胞生長至培養瓶面積80%時進行傳代，取第2～5代細胞用于后續實驗。
細胞鑒定：① CD31和vWF免疫熒光染色：CD31和vWF作為特異性內皮細胞標記物用于BMECs鑒定[16]。將BMECs接種于24孔板中，培養至細胞密度為50%～70%，4%多聚甲醛固定15 min；0.1%Triton X-100破膜，封閉緩沖液封閉30 min；加入一抗CD31（1∶200）及vWF（1∶1 000）4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗4℃避光孵育1 h，含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。隨機選取3個視野，統計細胞總數及CD31、vWF陽性細胞數，計算CD31及vWF陽性率。② 體外成管實驗：在預冷24孔培養板上加入289 μL Matrigel基質膠，37℃孵育30 min；以4.0×105個/mL密度接種BMECs，37℃、5%CO2培養箱孵育16 h，光鏡觀察細胞是否呈管狀分布。
1.3 山奈酚對Dex干預后BMECs的影響
1.3.1 對細胞增殖和成血管的影響
① CCK-8檢測：將100 μL含BMECs的ECM培養基加入96孔板中，每孔2×103個，分別加入不同濃度山奈酚（0、0.01、0.1、1、5、10、25 μmol/L）和Dex（0、10、25、50、100、200、300 μmol/L）干預，每組6個復孔，均以DMSO作為溶劑對照。分別于培養24、48 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育，1 h后采用酶標儀測定450 nm波長處吸光度（A）值。篩選抑制細胞活性的最佳Dex濃度和干預時間點，以及改善細胞活性的最佳山奈酚濃度和干預時間用于后續實驗。將此濃度Dex分別與不同濃度山奈酚（0、0.1、1、5、10 μmol/L）干預BMECs至最佳時間點作為實驗組（分別記為2～6組），以單純BMECs作為對照組（記為1組），DMSO作為溶劑對照組（記為7組），篩選改善Dex抑制作用的最佳山奈酚濃度。
② EdU實驗：將100 μL含BMECs的ECM培養基加入96孔板中，每孔2×103個，分為4組，分別為單純細胞組（A組）、加入最佳濃度Dex組（B組）、加入最佳濃度Dex+1 μmol/L山奈酚組（C組）和加入最佳濃度Dex+5 μmol/L山奈酚組（D組）。干預24 h后，使用EdU-488細胞增殖試劑盒處理各組細胞，熒光顯微鏡下觀察。隨機選取3個視野，統計細胞總數及EdU陽性細胞數，計算細胞增殖率（公式：EdU陽性細胞數/細胞總數×100%），結果取均值，實驗重復3次。
③ 體外成管實驗：分組方法同EdU實驗，參照1.2方法行體外成管實驗，光鏡下觀察；隨機選取3個視野，使用Image J 1.53k軟件計算各組成管長度和分支點數目，取均值，數據以各組與A組的比值表示，實驗重復3次。
1.3.2 對細胞凋亡的影響
分組方法同EdU實驗，使用一步法TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況，熒光顯微鏡下觀察；隨機取3個視野計數TUNEL陽性細胞數，并計算TUNEL陽性細胞率，取均值，實驗重復3次。根據Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒方法，采用流式細胞術評估細胞凋亡率，實驗重復3次。
1.3.3 對細胞遷移的影響
分組方法同EdU實驗，通過劃痕實驗和Transwell遷移實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響。① 劃痕實驗：使用200 μL移液槍槍頭在融合單層細胞上制造劃痕，孵育0、24 h采集圖像，測量劃痕寬度并按以下公式計算劃痕愈合率：（0 h劃痕寬度?24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，實驗重復3次。② Transwell遷移實驗：將200 μL含1×105個BMECs的無血清培養基加入上室，將600 μL含20%FBS的ECM培養基加入下室。分別按分組方法處理，孵育12 h后，Transwell小室用甲醇固定，0.1%結晶紫染色；隨后用棉簽去除每個小室上表面未遷移細胞，光鏡下觀察。隨機取3個視野計數遷移細胞，取均值，實驗重復3次。
1.3.4 對細胞蛋白表達的影響
分組方法同EdU實驗，采用Western blot法檢測山奈酚對Dex干預后BMECs蛋白表達的影響。加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑后，用RIPA裂解液緩沖液冰上裂解BMECs，BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度；蛋白裂解物經SDS-PAGE分離后，電轉移至聚偏二氟乙烯膜上；加入抗Cyclin D1、Cyclin E1、MMP2、Cleaved Caspase-3、GAPDH和β-actin一抗，抗VEGFA、Bax、Bcl2一抗；二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG。通過電化學發光檢測系統對蛋白質條帶進行可視化，并使用Image Lab 5.0軟件進行蛋白相對表達量定量分析。
1.4 統計學方法
采用GraphPad Prism8.0.1統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMECs培養及鑒定
光鏡下觀察示細胞呈短紡錘形和鵝卵石樣形態生長。免疫熒光染色示CD31及vWF陽性率分別為99.21%±0.76%和98.66%±0.41%，均呈高表達。體外成管實驗示BMECs呈管狀分布，在體外具有血管生成特性。見圖1～3。
圖1
原代BMECs形態觀察（×100）
Figure1.
Morphological observation of primary BMECs (×100)
圖2
BMECs免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右依次為CD31/vWF、DAPI、二者重疊 a. CD31；b. vWF
Figure2. Immunofluorescence staining observation of BMECs (Fluorescence microscope×50)From left to right for CD31/vWF, DAPI, and merge a. CD31; b. vWF
圖3
第2代BMECs體外成管實驗（×100）
Figure3.
Tube formation of the second passage BMECs (×100)
2.2 山奈酚對Dex干預后BMECs的影響
2.2.1 對細胞增殖和成血管的影響
① CCK-8檢測：結果顯示，Dex抑制細胞活性呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用越強。Dex作用24 h且濃度為300 μmol/L時，對BMECs活性的抑制作用顯著強于其他濃度（P<0.05）；而當作用時間延長至48 h時，Dex對BMECs活性的抑制作用開始減弱。因此，選擇300 μmol/L Dex作用24 h進行后續實驗。而山奈酚作用48 h且濃度為1 μmol/L時，可以顯著增加BMECs活性，并改善Dex的抑制作用。因此選擇1 μmol/L山奈酚作用48 h進行后續實驗。見圖4。② EdU實驗：熒光顯微鏡觀察示A組被綠染的增殖細胞數顯著多于其余3組，C組多于B、D組。見圖5。A組細胞增殖率顯著高于其余3組，C組高于B、D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。③ 體外成管實驗：光鏡下觀察示A組細胞呈管狀分布，B～D組管狀結構均有不同程度破壞。見圖6。A組成管長度和分支點數目顯著高于其余3組，C組高于B、D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。
圖4
山奈酚對Dex干預后BMECs活性的影響
a. 不同濃度Dex干預24、48 h；b. 不同濃度山奈酚干預24、48 h；c. 不同濃度山奈酚干預48 h后、300 μmol/L Dex干預24 h
Figure4. Effect of Kaempferol on BMECs activity after Dex treatmenta. Different concentrations of Dex were treated for 24 and 48 hours;b. Different concentrations of Kaempferol were treated for 24 and 48 hours; ? c. After 48 hours treatment with different concentrations of Kaempferol, 300 μmol/L Dex was treated for 24 hours
圖5
EdU實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs增殖的影響（熒光顯微鏡×50）
從上至下依次為Hoechst、EdU、二者重疊 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure5. EdU assay to detect the effect of Kaempferol on the proliferation of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×50)From top to bottom for Hoechst, EdU, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
表1
山奈酚對Dex干預后BMECs增殖、凋亡、遷移和成血管的影響（n=3，）
Table1.
Effects of Kaempferol on proliferation, apoptosis, migration, and angiogenesis of BMECs after Dex treatment（n=3, ）
圖6
體外成管實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs成血管的影響（×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure6. Tube formation assay to detect the effect of Kaempferol on the angiogenesis of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 對細胞凋亡的影響
TUNEL和Annexin V/PI凋亡檢測結果示，B～D組TUNEL陽性細胞率和細胞凋亡率顯著高于A組，B、D組顯著高于C組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7、8及表1。
圖7
TUNEL染色檢測山奈酚對Dex干預后BMECs凋亡的影響（熒光顯微鏡×100）
從上至下依次為DAPI、TUNEL、二者重疊 a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure7. TUNEL staining assay to detect the effect of Kaempferol on the apoptosis of BMECs after Dex treatment (Fluorescence microscope×100)From top to bottom for DAPI, TUNEL, and merge a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
圖8
Annexin V/PI流式細胞儀檢測山奈酚對Dex干預后BMECs凋亡的影響
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure8. Annexin V/PI flow cytometry assay to detect the effect of Kaempferol on the apoptosis of BMECs after Dex treatmenta. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.3 對細胞遷移的影響
劃痕實驗和Transwell遷移實驗結果顯示，B～D組劃痕愈合率和細胞遷移數顯著低于A組，B、D組顯著低于C組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9、10及表1。
圖9
劃痕實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響（×50）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. 0 h；b. 24 h
Figure9. Scratch healing assay to detect the effect of Kaempferol on the migration of BMECs after Dex treatment (×50)From left to right for groups A, B, C, and D a. 0 hour; b. 24 hours
圖10
Transwell遷移實驗檢測山奈酚對Dex干預后BMECs遷移的影響（結晶紫×100）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組
Figure10. Transwell migration assay to detect the effect of Kaempferol on the migration of BMECs after Dex treatment (Crystal violet×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.4 對細胞蛋白表達的影響
Western blot檢測示，B～D組Cleaved Caspase-3和Bax蛋白相對表達量顯著高于A組，B、D組顯著高于C組；B～D組MMP2、Cyclin D1、Cyclin E1、VEGFA和Bcl2蛋白相對表達量顯著低于A組，B、D組顯著低于C組；差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11、12。
圖11
Western blot檢測山奈酚對Dex干預后BMECs目的蛋白表達的影響
Mr：相對分子質量 1：A組 2：B組 3：C組4：D組
Figure11. Western blot assay to detect the effect of Kaempferol on protein expression of BMECs after Dex treatmentMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D
圖12
Western blot檢測各組各目的蛋白相對表達量
*
*
3 討論
GCs在臨床應用廣泛，已成為非創傷性ONFH最常見的原因[22]。體內外研究證實，GCs具有抑制血管生成、增加骨吸收和減少骨形成的作用。因此，促進骨形成和血管生成的藥物將是預防GCs誘導骨病的最佳選擇。山奈酚是一種重要的黃酮類化合物，通常存在于藥用植物和植物源性食品中[23]。近年來，山奈酚被認為是一種有效治療骨代謝相關疾病的天然化合物。山奈酚能保護血管免受氧化應激和炎癥引起的損傷，減輕阿霉素引起的內皮細胞毒性損傷[24-25]，改善Dex抑制成骨的活性，抑制GCs誘導的骨丟失，發揮抗骨質疏松作用[20，26]。因此，山奈酚既具有增加骨形成、抑制骨吸收的作用，同時又具有血管保護潛能，可能在治療GIONFH中發揮重要作用。然而，相關研究主要集中于山奈酚對于成骨和破骨細胞的影響及其抗骨質疏松作用，目前尚未見研究探討山奈酚對GIONFH的保護作用，對于山奈酚能否減輕Dex誘導的BMECs損傷尚不明確。本研究首次通過體外實驗研究山奈酚對Dex誘導BMECs損傷的影響及其對GIONFH的保護作用。TUNEL和Annexin V/PI凋亡檢測結果示，B、D組TUNEL陽性細胞率和細胞凋亡率顯著高于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex誘導的細胞凋亡。劃痕實驗和Transwell遷移實驗結果顯示，B、D組劃痕愈合率和細胞遷移數顯著低于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex對細胞遷移的抑制作用。EdU及成管實驗結果顯示，B、D組增殖細胞率、成管長度和分支點數目顯著低于C組（P<0.05），說明山奈酚可減輕Dex對細胞增殖和成血管的抑制作用。因此，山奈酚可減輕因內皮細胞受損引起的骨內微循環障礙，對GIONFH起保護作用，這些發現有利于理解山奈酚對GIONFH的保護機制。
細胞凋亡是一種正常生理過程，在ONFH的發生、發展中起著重要作用[27]，抑制內皮細胞凋亡是維持血管完整性和血管新生所必需的環節[28]。既往研究表明，Bcl2表達增加可抑制細胞凋亡，而Cleaved Caspase-3和Bax表達增加可促進細胞凋亡[29]。因此，Bcl2和Bax表達的平衡決定了細胞死亡或存活。本研究中，Dex通過上調Bax、Cleaved Caspase-3水平，下調Bcl2水平誘導BMECs凋亡，與其他研究報道結果一致[30-31]。本研究發現山奈酚通過降低Cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平和增加Bcl2蛋白水平，在GIONFH的BMECs中發揮抗凋亡作用。提示山奈酚可能通過抑制BMECs凋亡對GIONFH起到保護作用，其上游機制需要進一步研究。研究表明PI3K-Akt-Foxo1信號通路在細胞的增殖、凋亡、炎癥和氧化應激過程中發揮重要作用，Dex可以通過PI3K-Akt-Foxo1信號通路誘導大鼠ONFH，上調Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達，下調Bcl2蛋白表達[30，32]。既往研究表明，山奈酚同樣可以調節PI3K-Akt信號通路促進BMSCs成骨，從而發揮抗骨質疏松作用[33]。因此，山奈酚可能通過PI3K-Akt-Foxo1信號通路上調Bax、Cleaved Caspase-3表達，下調Bcl2表達，從而在GIONFH的BMECs中發揮抗凋亡作用。這一假設仍需要進一步研究驗證。
Cyclin D1和Cyclin E1是調節各種細胞增殖的重要因子[34]。研究表明，山奈酚可以通過激活JNK和p38-MAPK信號通路，調節Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達，改善Dex對MC3T3-E1細胞成骨的抑制活性，從而發揮抗骨質疏松作用[20]。而Dex可以通過ROS-JNK-c-Jun信號通路誘導成骨細胞凋亡和自噬，從而導致ONFH[31]。本研究結果提示Dex可以抑制Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表達，從而阻滯細胞周期，抑制BMECs增殖；而山奈酚可以上調Dex干預后BMECs中Cyclin D1和Cyclin E1的蛋白表達，促進BMECs增殖，從而促進血管生成。因此，山奈酚可能通過JNK信號通路上調Cyclin D1和Cyclin E1表達，從而在GIONFH的BMECs中發揮促增殖作用。這一假設仍需要后續實驗進行驗證。
VEGF作為一種強效血管生成因子，在內皮細胞增殖、遷移和血管生成中起著重要作用[35]。MMPs超家族由能夠降解細胞外基質的金屬蛋白酶組成，細胞外基質的降解是細胞遷移、侵襲和血管生成的基本過程[36]。研究表明，山奈酚可以增強VEGF誘導的臍靜脈血管內皮細胞中VEGF受體2、內皮一氧化氮合酶和細胞外信號調節激酶的磷酸化，并同時增強VEGF介導的MMP2和MMP9表達[37]。本研究結果提示山奈酚可以提高Dex干預后BMECs中VEGFA和MMP2的蛋白表達，從而調節細胞遷移和血管生成，進而對GIONFH起保護作用。
綜上述，本研究結果表明山奈酚通過減輕BMECs凋亡，促進BMECs增殖、遷移和成血管，減輕GIONFH的內皮損傷和功能障礙。但本研究還存在一些局限性：首先，調控細胞增殖、凋亡、遷移和血管生成的蛋白很多，本研究僅檢測了主要相關蛋白表達量，后續應深入研究其上游機制及相關信號通路；其次，本研究僅通過體外細胞實驗研究山奈酚對GIONFH中BMECs的保護作用，還需要體內實驗進一步驗證。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中日友好醫院倫理委員會批準（2021-16-K08）
作者貢獻聲明 徐鑫：實驗構思及實施、文章撰寫；范驍宇：數據分析和實驗結果可視化；吳鑫杰：實驗材料準備和數據收集；時利軍：實驗實施及數據收集；王培旭：實驗實施及實驗結果可視化；高福強：實驗構思和方法設計；孫偉：實驗監督和領導、初稿審閱和修改；李子榮：對文章初稿審閱和修改
