引用本文： 徐松山, 趙少華, 菅炎鵬, 徐勇, 劉偉杰, 邵欣慰, 樊俊, 王一公. 載黃腐酚抗炎支架對羊體內軟骨再生的影響研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(10): 1296-1304. doi: 10.7507/1002-1892.202204044 復制
近年來，臨床上因炎癥、外傷、腫瘤等引起的關節、耳、鼻、氣管等部位軟骨損傷不斷增多[1]。但是軟骨因缺乏血管、神經和淋巴管，自愈能力差，如何修復軟骨損傷是臨床一大難點[2]。軟骨組織工程將細胞、支架及誘導因子結合，以促進軟骨組織再生，達到修復軟骨目的，為軟骨損傷治療帶來希望。
自1994年Brittberg等[3]首次使用自體軟骨細胞修復軟骨缺損以來，軟骨細胞成為軟骨組織工程領域應用最廣泛的種子細胞，但存在來源有限、供區損傷較大、體外培養易去分化等問題。為此，BMSCs代替軟骨細胞成為熱門種子細胞選擇[4]。但是，研究表明基于BMSCs構建的組織工程軟骨（BMSCs engineered cartilage，BEC）植入動物體內后，往往出現嚴重炎癥反應[5]，使軟骨細胞外基質遭受破壞，軟骨力學性能變差[6]，最終導致軟骨缺損修復失敗，成為阻礙BEC臨床應用的關鍵因素。因此，構建具有抗炎功能的支架，對軟骨組織工程發展具有重要意義。
黃腐酚是從啤酒花中提取的一種異戊烯類黃酮化合物，具有多種生物活性，因具有抗癌功能受到廣泛關注[7]。近年來，大量研究證明黃腐酚能抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子[8]。但目前基于黃腐酚制作具有抗炎功能支架并用于構建組織工程軟骨的研究較少。為此，本研究擬用黃腐酚與聚乳酸-羥基乙酸 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］ 制備具有抗炎功能的支架，然后接種BMSCs后體外誘導6周制備BEC，最后將其植入羊體內，觀測該支架體內抗炎和促進軟骨再生的能力，為軟骨組織工程用于臨床奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡健康雌性山羊1只，體質量25 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供。RAW264.7巨噬細胞（上海紀寧實業有限公司）。
PLGA、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、0.15%Ⅱ型膠原酶、RPMI1640培養基、RT-PCR試劑盒（GIBCO公司，美國）；黃腐酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、木瓜蛋白酶溶液（Sigma公司，美國）；TRIzol裂解試劑、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒（EZbioscience公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、Ⅱ型膠原染色試劑盒、阿利新藍試劑盒、ELISA試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、DMEM培養基、RIPA裂解緩沖液（HyClone公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，美國）。
凍干機（上海田楓實業有限公司）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；力學測試儀（蘇州檢卓儀器科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；酶標儀（Thermo Fisher公司，美國）；傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜儀（ABB Bomem公司，加拿大）；RT-PCR分析儀（Applied Biosystems公司，美國）；蛋白印跡成像系統（Bio-Rad公司，美國）；Image Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及傳代
將舒泰TM50與陸眠寧以8∶1（V/V）比例混合后，按照0.3 mL/kg劑量肌肉注射麻醉山羊；穿刺抽取骨髓，將其與PBS按1∶2比例混合后，以離心半徑30 cm，3 000 r/min離心5 min；棄上清液，使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸后，按照1∶3比例傳代。經流式細胞檢測鑒定培養細胞為BMSCs后，取第2代細胞用于后續實驗。
1.3 支架制備及觀測
1.3.1 支架制備
取PLGA采用致孔劑浸出法[9]，基于特制模具（直徑6 mm，厚度2 mm）制備多孔支架，凍干48 h以增強支架穩定性。將PLGA支架用環氧乙烷消毒后，置于濃度為40 μmol/L的黃腐酚溶液中，37℃振搖24 h，使黃腐酚溶液充分浸潤PLGA支架，然后取出置于通風櫥干燥，制備黃腐酚-PLGA支架（以下簡稱“載藥支架”）。
1.3.2 支架觀測
① 支架孔徑及孔隙率測算：取單純PLGA支架及載藥支架真空噴金處理，掃描電鏡觀察微觀形貌并測量孔徑。使用液體置換法計算支架孔隙率，具體步驟：干燥支架稱重（W0）后浸至無水乙醇中，待無氣泡產生后取出稱重（W1），按以下公式計算支架孔隙率：（W1?W0）/（ρ×V）×100%。其中，ρ為無水乙醇在20℃時密度（0.789 g/mL），V為支架體積。
② 支架紅外光譜測定：采用FTIR光譜儀分別檢測黃腐酚、單純PLGA支架和載藥支架的紅外光譜，以檢測黃腐酚是否負載至PLGA支架。
③ 支架體外抗炎性能評價：取RAW264.7巨噬細胞以LPS（1 μg/mL）進行炎癥誘導24 h后，分別接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為5×105個），構建兩種巨噬細胞-支架復合物；將其置于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的RPMI1640培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h。采用RT-PCR及Western blot檢測RAW264.7巨噬細胞的炎癥因子（IL-1β、TNF-α）基因及蛋白表達水平。
RT-PCR檢測：采用TRIzol試劑從巨噬細胞-支架復合物提取總RNA，于260 nm波長處測定RNA濃度，驗證提取RNA的質量和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄成cDNA。按照試劑盒說明書，通過RT-PCR 分析儀檢測IL-1β、TNF-α基因表達情況，以GAPDH作為內參，計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-PCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of RT-PCR (5′→3′)
Western blot檢測：首先將PMSF（1 mmol/L）與RIPA裂解緩沖液混合，提取兩組RAW264.7巨噬細胞總蛋白。然后用BCA蛋白定量試劑盒計算蛋白含量。利用聚偏氟乙烯膜和SDS-PAGE凝膠電泳，分別呈遞40 ng蛋白。阻斷2 h后，用5%脫脂牛奶與一抗在4℃下孵育過夜，其中IL-1β（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）；TBST洗膜，再用相應二抗在室溫下孵化2 h，TBST洗滌后觀察蛋白條帶。采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析條帶強度，以與β-actin強度的比值作為目的蛋白相對表達量。
④ 支架細胞相容性評價：取第2代BMSCs，以含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸，制備濃度為5.0×105個/mL的細胞懸液，均勻接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為1×106個），置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱培養，隔天換液。培養1、4、7 d取兩組支架，活/死細胞染色后于激光共聚焦顯微鏡下觀察BMSCs存活情況，紅細胞為綠色熒光，死細胞為紅色熒光；CCK-8試劑盒檢測BMSCs細胞活力。
1.4 體內外軟骨再生評價
1.4.1 體外實驗
取第2代BMSCs，以含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸，制備濃度為1.0×108個/mL的細胞懸液；分別接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為2×107個），置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱培養4 h，制備BMSCs-支架復合物。將兩組復合物置于軟骨誘導培養基（含10%牛血清白蛋白、維生素C、脯氨酸、TGF-β、亞油酸、IGF、地塞米松、胰島素-轉鐵蛋白-硒-X的DMEM培養基），繼續培養6周后收集標本進行體外軟骨再生評價。
觀測指標：① 大體觀察兩組標本形狀、質地及顏色。② 組織學觀察：取兩組標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，制備片厚5 μm切片。取部分切片行HE染色及番紅O染色，光鏡下觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。③ Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：取組織學觀察中制備的部分切片，行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色并光鏡下觀察。④ 生化檢測：將兩組樣品置于木瓜蛋白酶溶液，于65℃消化12 h；采用阿利新藍試劑盒檢測糖胺聚糖 （glycosaminoglycan，GAG）含量，ELISA試劑盒檢測Ⅱ型膠原含量。實驗均重復3次。
1.4.2 體內實驗
① 實驗分組及方法：將山羊同上法再次麻醉后，無菌條件下于背部左、右兩側對稱部位分別作3個長1.5 cm切口并形成腔隙，分別植入1.4.1中體外培養6周的BMSCs-載藥支架復合物（左側）、BMSCs-PLGA支架復合物（右側），用5-0可吸收縫線縫合切口。術后連續3 d肌肉注射200萬U青霉素預防感染。4周后取出標本進行體內軟骨再生及炎癥相關情況評價。
② 觀測指標：參照1.4.1觀測指標對兩組標本進行大體、組織學以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察，檢測GAG及Ⅱ型膠原含量；參照1.3.2 RT-PCR法檢測兩組標本IL-1β和TNF-α基因相對表達量。實驗均重復3次。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架觀測
2.1.1 支架形貌表征
載藥支架和PLGA支架均為白色多孔結構，掃描電鏡下可見豐富、連續且均勻的孔隙結構。其中，載藥支架孔徑為（200.65±4.13）μm、孔隙率為85.56%±1.52%，PLGA支架分別為（198.19±6.44）μm、85.45%±1.05%，兩組差異均無統計學意義（t=0.642，P=0.539；t=0.113，P=0.913）。
FTIR光譜儀檢測示PLGA支架及載藥支架均在1 750～1 760 cm?1處出現1個典型峰，其由3 000 cm?1處C＝O基團延伸產生；在1626 cm?1處出現C＝O延伸譜帶，以及1545 cm?1和1514 cm?1處-C＝C-譜帶。單純黃腐酚在3400 cm?1處存在-OH峰，但由于PLGA支架中存在具有相同波長的譜帶，所以此峰在載藥支架譜帶中不明顯。結果提示黃腐酚負載至PLGA支架。見圖1。
圖1
支架觀測
a. 大體觀察 從上至下為載藥支架、PLGA支架；b、c. 于放大50、100倍掃描電鏡觀察 從上至下為載藥支架、PLGA支架；d. 支架紅外光譜
Figure1. Scaffold observationa. General observation From top to bottom for drug-loaded scaffold and PLGA scaffold, respectively; b, c. Observation by scanning electron microscope at 50 and 100 times magnifications From top to bottom for drug-loaded scaffold and PLGA scaffold, respectively; d. Infrared spectrum of the scaffolds
2.1.2 支架體外抗炎性能評價
培養24 h后，RT-PCR檢測示載藥支架IL-1β、TNF-α基因相對表達量分別為1.49±0.14、3.46±0.29，低于PLGA支架的5.71±0.18、8.57±0.15，差異有統計學意義（t=25.800，P<0.001；t=21.880，P<0.001）。
Western blot檢測示，載藥支架IL-1β、TNF-α蛋白相對表達量分別為0.19±0.02、0.31±0.01，低于PLGA支架的0.86±0.02、0.88±0.052，差異有統計學意義（t=41.910，P<0.001；t=18.550，P<0.001）。見圖2。
圖2
Western blot檢測支架IL-1β、TNF-α蛋白表達
1：載藥支架 2：PLGA支架
Figure2. Expressions of IL-1β and TNF-α proteins detected by Western blot1: Drug-loaded scaffold 2: PLGA scaffold
2.1.3 支架細胞相容性評價
① 活/死細胞染色：激光共聚焦顯微鏡下見兩組支架上細胞均存活良好，未見明顯死細胞，且隨培養時間延長活細胞明顯增多，兩組間無明顯差異。② CCK-8檢測示，隨培養時間延長，兩組支架上細胞均增殖良好；各時間點兩組吸光度（A）值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
支架細胞相容性觀觀測
a. 活/死細胞染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） 從左至右分別為培養1、4、7 d 從上至下分別為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物；b. CCK-8檢測細胞生長曲線
Figure3. In vitro cytocompatibility evaluation of scaffoldsa. Living/dead cells staining observation (Laser confocal microscope×40) From left to right for 1, 4, and 7 days after culture, respectively; from top to bottom for BMSCs-drug-loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively; b. Cell growth curve by CCK-8 assay
2.2 體內外軟骨再生評價
2.2.1 體外軟骨再生評價
體外培養6周后，大體觀察見兩組BMSCs-支架復合物均呈光滑、半透明淡黃色，與培養前形態、大小無明顯差異；組織學染色示兩組支架中均出現典型的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色可見軟骨組織特異性細胞外基質表達。BMSCs-載藥支架復合物軟骨特異性GAG和Ⅱ型膠原含量分別為12.96±0.27、0.20±0.01，BMSCs-PLGA支架復合物為12.78±0.16、0.21±0.01，差異均無統計學意義（t=0.810，P=0.463；t=0.443，P=0.681）。見圖4。
圖4
體外軟骨再生評價
從上至下為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物 a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure4. In vitro cartilage regeneration observationFrom top to bottom for BMSCs-drug-loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin O staining (×40); d. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining (×40)
2.2.2 體內軟骨再生評價
植入羊體內4周后，大體觀察示BMSCs-載藥支架復合物基本維持植入前形狀和大小，表面光滑，呈典型象牙白狀軟骨樣外觀；而BMSCs-PLGA支架復合物嚴重變形，外表粗糙，呈紅黃相間炎癥樣外觀。見圖5a。
組織學染色示，BMSCs-載藥支架復合物具有典型的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，且未出現明顯炎癥細胞浸潤；BMSCs- PLGA支架復合物為雜亂的纖維狀結構，可見明顯炎癥反應。見圖5b、c。
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，BMSCs-載藥支架復合物顯著表達軟骨特異性Ⅱ型膠原，而BMSCs-PLGA支架復合物Ⅱ型膠原表達極少。BMSCs-載藥支架復合物軟骨特異性GAG和Ⅱ型膠原含量分別為20.47±0.76、1.54±0.05，BMSCs-PLGA支架復合物為4.09±0.44、0.11±0.01，差異均有統計學意義（t=26.340，P<0.001；t=38.300，P<0.001）。見圖5d。
圖5
體內軟骨再生評價
從上至下為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物 a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure5. In vivo cartilage regeneration observationFrom top to bottom for BMSCs-drug loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin O staining (×40); d. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining (×40)
RT-PCR檢測BMSCs-載藥支架復合物IL-1β、TNF-α基因相對表達量分別為2.37±0.29、3.65±0.16，低于BMSCs-PLGA支架復合物的8.04±0.14、9.11±0.16，差異均有統計學意義（t=24.800，P<0.001；t=34.490，P<0.001）。
3 討論
BEC植入動物體內后，炎癥反應往往難以避免，雖然適度的炎癥反應有利于控制感染、清除壞死物質，但過度的炎癥反應會直接導致軟骨再生失敗。① 植入手術產生的創傷以及支架材料的免疫反應均會引起嚴重炎癥反應；② 過度炎癥反應會降低BMSCs活性和分化能力，使BEC植入體內后出現血管化與骨化，最終導致軟骨再生失敗[10-11]；③ 炎癥會使巨噬細胞及成纖維細胞等在支架表面形成纖維囊，將支架與組織分隔，導致軟骨再生失敗[12]。
為了解決BEC植入體內引起的炎癥問題，研究人員進行了許多探索，并取得了一些成果。例如，制備特異性復合生物材料以抑制炎癥介質的產生[13-16]。Liang等[17]使用聚二甲基硅氧烷微珠負載地塞米松和雌二醇，構建了一個可控的雙藥物負載支架，通過地塞米松與雌二醇共同作用，抑制炎癥細胞浸潤，提高血管再生能力；Go等[18]將抗炎激素A-黑素細胞刺激素物理吸附至可生物降解的PLGA微球表面，達到減少炎癥細胞浸潤的效果。上述研究提示通過構建負載抗炎藥物的功能性支架，有利于體內軟骨再生。為使載藥支架在體內持續釋放藥物，保持藥物濃度，Ziadlou等[19]基于絲素蛋白和透明質酸-酪氨酸溶液的酶促交聯，開發了一種可注射水凝膠，用于軟骨組織工程的藥物輸送。結果顯示該水凝膠藥物釋放能力持久，有助于降低體內炎癥程度，促進體內軟骨再生。
選擇合適的抗炎藥物是構建載藥功能性支架的核心之一。大量研究表明，黃腐酚具有卓越的抗炎性能，與其能影響多種炎癥通路有關。① 通過介導Gas5/miR-27A信號通路，對炎癥和外來刺激引起的軟骨細胞細胞外基質降解具有保護作用[20]；② 通過介導軟骨細胞炎癥的HO-1和C/EBP-β信號通路來減輕炎癥反應和細胞外基質的降解[21]；③ 減少巨噬細胞中LSP受體TLR4和MD2的表達，從而抑制巨噬細胞中NF-κB的活化，同時抑制STAT-1α與IRF-1的結合活性[22]；④ 抑制軟骨細胞中由IL-1β誘導的TNF-α和IL-6表達，也能逆轉被IL-1β抑制的Ⅱ型膠原表達 [8]。以上研究說明，黃腐酚對影響軟骨再生的多條炎癥通路具有直接抑制作用，可以應用于軟骨組織工程構建抗炎支架，促進軟骨再生。
高分子合成材料PLGA具有生物降解速率可控、生物相容性好、力學強度高等優點，在組織工程領域應用十分廣泛[23]。因此，本研究將黃腐酚負載于安全無毒、穩定的多孔PLGA支架上，制備了黃腐酚-PLGA支架。紅外光譜圖顯示黃腐酚能穩固負載至PLGA支架，分析與黃腐酚結構中含有大量-OH，能與PLGA發生交聯有關[24]。大體觀察以及掃描電鏡觀察示，負載的黃腐酚對PLGA支架外觀、孔徑和孔隙率無明顯影響，分析PLGA支架與黃腐酚均為性質穩定的化合物，負載黃腐酚并不會改變PLGA支架的物理化學性質。而且黃腐酚-PLGA支架與RAW264.7巨噬細胞體外共培養后，RT-PCR和Western blot檢測結果均表明炎癥相關因子（TNF-α和IL-1β）表達量明顯下降，體現了黃腐酚強大的抗炎性能。活/死細胞染色和CCK-8檢測表明負載黃腐酚安全、無毒，而且體外軟骨再生實驗顯示引入黃腐酚沒有影響PLGA支架的體外軟骨再生能力，分析與PLGA穩定的化學性質和多孔結構，以及黃腐酚為天然異戊烯類黃酮化合物，安全、無毒，不會對軟骨再生造成負面影響有關[25]。
軟骨組織工程的核心目標是實現體內軟骨再生，然而既往研究的多種BMSCs-支架結構在體外能成功再生軟骨，但植入動物體內后再生軟骨常發生塌陷、變形甚至消失，導致軟骨再生失敗，尤其是在免疫系統完善的大型動物體內，軟骨再生效果更不理想，炎癥反應是體內軟骨再生失敗的重要原因[26-28]。IL-1β和TNF-α是軟骨炎癥反應的主要參與者，其中IL-1β會直接破壞軟骨細胞，而TNF-α能推動炎癥級聯反應[29]。IL-1β和TNF-α參與了多條軟骨炎癥通路：① 上調一氧化氮合酶、環氧合酶 2基因的表達，并刺激NO和前列腺素E2的釋放[30]；② 誘導超氧自由基產生，并抑制超氧自由基抗氧化酶的表達[31]；③ 抑制軟骨特異性細胞外基質中Ⅱ型膠原和GAG的表達[32]；④ 刺激基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）、MMP-3和MMP-13的釋放，誘導IL-6、趨化因子（如IL-8、單核細胞趨化蛋白 1）和趨化因子配體5的產生[33]。本研究體內實驗結果顯示負載黃腐酚的PLGA支架表現出更好的軟骨再生效果，而且炎癥因子IL-1β和TNF-α表達明顯下降。同時，本研究選擇免疫系統完善的大型動物進行體內實驗，與既往采用免疫缺陷的裸鼠及小動物（如小鼠、兔）研究相比，進一步說明該支架具有良好抗炎功能。
綜上述，本研究構建的載藥支架具有良好抗炎性能，植入羊體內后可以有效促進軟骨再生。后續需要進一步研究黃腐酚在PLGA支架上載荷最佳濃度、構建具有持久、均勻緩釋效果的負載黃腐酚功能性支架，以期為BEC的臨床轉化奠定實驗基礎。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經河南科技大學附屬許昌市中心醫院保護委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）-2019-0002
作者貢獻聲明 徐松山、趙少華：研究設計、文章撰寫；趙少華、徐勇：研究實施；菅炎鵬、劉偉杰、邵欣慰：數據收集整理及統計分析；樊俊：行政支持；王一公：經費支持
近年來，臨床上因炎癥、外傷、腫瘤等引起的關節、耳、鼻、氣管等部位軟骨損傷不斷增多[1]。但是軟骨因缺乏血管、神經和淋巴管，自愈能力差，如何修復軟骨損傷是臨床一大難點[2]。軟骨組織工程將細胞、支架及誘導因子結合，以促進軟骨組織再生，達到修復軟骨目的，為軟骨損傷治療帶來希望。
自1994年Brittberg等[3]首次使用自體軟骨細胞修復軟骨缺損以來，軟骨細胞成為軟骨組織工程領域應用最廣泛的種子細胞，但存在來源有限、供區損傷較大、體外培養易去分化等問題。為此，BMSCs代替軟骨細胞成為熱門種子細胞選擇[4]。但是，研究表明基于BMSCs構建的組織工程軟骨（BMSCs engineered cartilage，BEC）植入動物體內后，往往出現嚴重炎癥反應[5]，使軟骨細胞外基質遭受破壞，軟骨力學性能變差[6]，最終導致軟骨缺損修復失敗，成為阻礙BEC臨床應用的關鍵因素。因此，構建具有抗炎功能的支架，對軟骨組織工程發展具有重要意義。
黃腐酚是從啤酒花中提取的一種異戊烯類黃酮化合物，具有多種生物活性，因具有抗癌功能受到廣泛關注[7]。近年來，大量研究證明黃腐酚能抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子[8]。但目前基于黃腐酚制作具有抗炎功能支架并用于構建組織工程軟骨的研究較少。為此，本研究擬用黃腐酚與聚乳酸-羥基乙酸 ［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］ 制備具有抗炎功能的支架，然后接種BMSCs后體外誘導6周制備BEC，最后將其植入羊體內，觀測該支架體內抗炎和促進軟骨再生的能力，為軟骨組織工程用于臨床奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6月齡健康雌性山羊1只，體質量25 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供。RAW264.7巨噬細胞（上海紀寧實業有限公司）。
PLGA、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、0.15%Ⅱ型膠原酶、RPMI1640培養基、RT-PCR試劑盒（GIBCO公司，美國）；黃腐酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、木瓜蛋白酶溶液（Sigma公司，美國）；TRIzol裂解試劑、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒（EZbioscience公司，美國）；活/死細胞染色試劑盒、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、HE染色試劑盒、番紅O染色試劑盒、Ⅱ型膠原染色試劑盒、阿利新藍試劑盒、ELISA試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、DMEM培養基、RIPA裂解緩沖液（HyClone公司，美國）；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司，美國）。
凍干機（上海田楓實業有限公司）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；力學測試儀（蘇州檢卓儀器科技有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；酶標儀（Thermo Fisher公司，美國）；傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，FTIR）光譜儀（ABB Bomem公司，加拿大）；RT-PCR分析儀（Applied Biosystems公司，美國）；蛋白印跡成像系統（Bio-Rad公司，美國）；Image Pro Plus 6.0 軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 BMSCs分離培養及傳代
將舒泰TM50與陸眠寧以8∶1（V/V）比例混合后，按照0.3 mL/kg劑量肌肉注射麻醉山羊；穿刺抽取骨髓，將其與PBS按1∶2比例混合后，以離心半徑30 cm，3 000 r/min離心5 min；棄上清液，使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸后，按照1∶3比例傳代。經流式細胞檢測鑒定培養細胞為BMSCs后，取第2代細胞用于后續實驗。
1.3 支架制備及觀測
1.3.1 支架制備
取PLGA采用致孔劑浸出法[9]，基于特制模具（直徑6 mm，厚度2 mm）制備多孔支架，凍干48 h以增強支架穩定性。將PLGA支架用環氧乙烷消毒后，置于濃度為40 μmol/L的黃腐酚溶液中，37℃振搖24 h，使黃腐酚溶液充分浸潤PLGA支架，然后取出置于通風櫥干燥，制備黃腐酚-PLGA支架（以下簡稱“載藥支架”）。
1.3.2 支架觀測
① 支架孔徑及孔隙率測算：取單純PLGA支架及載藥支架真空噴金處理，掃描電鏡觀察微觀形貌并測量孔徑。使用液體置換法計算支架孔隙率，具體步驟：干燥支架稱重（W0）后浸至無水乙醇中，待無氣泡產生后取出稱重（W1），按以下公式計算支架孔隙率：（W1?W0）/（ρ×V）×100%。其中，ρ為無水乙醇在20℃時密度（0.789 g/mL），V為支架體積。
② 支架紅外光譜測定：采用FTIR光譜儀分別檢測黃腐酚、單純PLGA支架和載藥支架的紅外光譜，以檢測黃腐酚是否負載至PLGA支架。
③ 支架體外抗炎性能評價：取RAW264.7巨噬細胞以LPS（1 μg/mL）進行炎癥誘導24 h后，分別接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為5×105個），構建兩種巨噬細胞-支架復合物；將其置于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的RPMI1640培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h。采用RT-PCR及Western blot檢測RAW264.7巨噬細胞的炎癥因子（IL-1β、TNF-α）基因及蛋白表達水平。
RT-PCR檢測：采用TRIzol試劑從巨噬細胞-支架復合物提取總RNA，于260 nm波長處測定RNA濃度，驗證提取RNA的質量和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA反轉錄成cDNA。按照試劑盒說明書，通過RT-PCR 分析儀檢測IL-1β、TNF-α基因表達情況，以GAPDH作為內參，計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-PCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequence of RT-PCR (5′→3′)
Western blot檢測：首先將PMSF（1 mmol/L）與RIPA裂解緩沖液混合，提取兩組RAW264.7巨噬細胞總蛋白。然后用BCA蛋白定量試劑盒計算蛋白含量。利用聚偏氟乙烯膜和SDS-PAGE凝膠電泳，分別呈遞40 ng蛋白。阻斷2 h后，用5%脫脂牛奶與一抗在4℃下孵育過夜，其中IL-1β（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、β-actin（1∶5 000）；TBST洗膜，再用相應二抗在室溫下孵化2 h，TBST洗滌后觀察蛋白條帶。采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析條帶強度，以與β-actin強度的比值作為目的蛋白相對表達量。
④ 支架細胞相容性評價：取第2代BMSCs，以含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸，制備濃度為5.0×105個/mL的細胞懸液，均勻接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為1×106個），置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱培養，隔天換液。培養1、4、7 d取兩組支架，活/死細胞染色后于激光共聚焦顯微鏡下觀察BMSCs存活情況，紅細胞為綠色熒光，死細胞為紅色熒光；CCK-8試劑盒檢測BMSCs細胞活力。
1.4 體內外軟骨再生評價
1.4.1 體外實驗
取第2代BMSCs，以含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B的DMEM培養基重懸，制備濃度為1.0×108個/mL的細胞懸液；分別接種于單純PLGA支架及載藥支架（接種細胞數均為2×107個），置于37℃、5%CO2及飽和濕度細胞培養箱培養4 h，制備BMSCs-支架復合物。將兩組復合物置于軟骨誘導培養基（含10%牛血清白蛋白、維生素C、脯氨酸、TGF-β、亞油酸、IGF、地塞米松、胰島素-轉鐵蛋白-硒-X的DMEM培養基），繼續培養6周后收集標本進行體外軟骨再生評價。
觀測指標：① 大體觀察兩組標本形狀、質地及顏色。② 組織學觀察：取兩組標本以4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋，制備片厚5 μm切片。取部分切片行HE染色及番紅O染色，光鏡下觀察組織結構及細胞外基質分泌情況。③ Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：取組織學觀察中制備的部分切片，行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色并光鏡下觀察。④ 生化檢測：將兩組樣品置于木瓜蛋白酶溶液，于65℃消化12 h；采用阿利新藍試劑盒檢測糖胺聚糖 （glycosaminoglycan，GAG）含量，ELISA試劑盒檢測Ⅱ型膠原含量。實驗均重復3次。
1.4.2 體內實驗
① 實驗分組及方法：將山羊同上法再次麻醉后，無菌條件下于背部左、右兩側對稱部位分別作3個長1.5 cm切口并形成腔隙，分別植入1.4.1中體外培養6周的BMSCs-載藥支架復合物（左側）、BMSCs-PLGA支架復合物（右側），用5-0可吸收縫線縫合切口。術后連續3 d肌肉注射200萬U青霉素預防感染。4周后取出標本進行體內軟骨再生及炎癥相關情況評價。
② 觀測指標：參照1.4.1觀測指標對兩組標本進行大體、組織學以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察，檢測GAG及Ⅱ型膠原含量；參照1.3.2 RT-PCR法檢測兩組標本IL-1β和TNF-α基因相對表達量。實驗均重復3次。
1.5 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架觀測
2.1.1 支架形貌表征
載藥支架和PLGA支架均為白色多孔結構，掃描電鏡下可見豐富、連續且均勻的孔隙結構。其中，載藥支架孔徑為（200.65±4.13）μm、孔隙率為85.56%±1.52%，PLGA支架分別為（198.19±6.44）μm、85.45%±1.05%，兩組差異均無統計學意義（t=0.642，P=0.539；t=0.113，P=0.913）。
FTIR光譜儀檢測示PLGA支架及載藥支架均在1 750～1 760 cm?1處出現1個典型峰，其由3 000 cm?1處C＝O基團延伸產生；在1626 cm?1處出現C＝O延伸譜帶，以及1545 cm?1和1514 cm?1處-C＝C-譜帶。單純黃腐酚在3400 cm?1處存在-OH峰，但由于PLGA支架中存在具有相同波長的譜帶，所以此峰在載藥支架譜帶中不明顯。結果提示黃腐酚負載至PLGA支架。見圖1。
圖1
支架觀測
a. 大體觀察 從上至下為載藥支架、PLGA支架；b、c. 于放大50、100倍掃描電鏡觀察 從上至下為載藥支架、PLGA支架；d. 支架紅外光譜
Figure1. Scaffold observationa. General observation From top to bottom for drug-loaded scaffold and PLGA scaffold, respectively; b, c. Observation by scanning electron microscope at 50 and 100 times magnifications From top to bottom for drug-loaded scaffold and PLGA scaffold, respectively; d. Infrared spectrum of the scaffolds
2.1.2 支架體外抗炎性能評價
培養24 h后，RT-PCR檢測示載藥支架IL-1β、TNF-α基因相對表達量分別為1.49±0.14、3.46±0.29，低于PLGA支架的5.71±0.18、8.57±0.15，差異有統計學意義（t=25.800，P<0.001；t=21.880，P<0.001）。
Western blot檢測示，載藥支架IL-1β、TNF-α蛋白相對表達量分別為0.19±0.02、0.31±0.01，低于PLGA支架的0.86±0.02、0.88±0.052，差異有統計學意義（t=41.910，P<0.001；t=18.550，P<0.001）。見圖2。
圖2
Western blot檢測支架IL-1β、TNF-α蛋白表達
1：載藥支架 2：PLGA支架
Figure2. Expressions of IL-1β and TNF-α proteins detected by Western blot1: Drug-loaded scaffold 2: PLGA scaffold
2.1.3 支架細胞相容性評價
① 活/死細胞染色：激光共聚焦顯微鏡下見兩組支架上細胞均存活良好，未見明顯死細胞，且隨培養時間延長活細胞明顯增多，兩組間無明顯差異。② CCK-8檢測示，隨培養時間延長，兩組支架上細胞均增殖良好；各時間點兩組吸光度（A）值比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖3。
圖3
支架細胞相容性觀觀測
a. 活/死細胞染色觀察（激光共聚焦顯微鏡×40） 從左至右分別為培養1、4、7 d 從上至下分別為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物；b. CCK-8檢測細胞生長曲線
Figure3. In vitro cytocompatibility evaluation of scaffoldsa. Living/dead cells staining observation (Laser confocal microscope×40) From left to right for 1, 4, and 7 days after culture, respectively; from top to bottom for BMSCs-drug-loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively; b. Cell growth curve by CCK-8 assay
2.2 體內外軟骨再生評價
2.2.1 體外軟骨再生評價
體外培養6周后，大體觀察見兩組BMSCs-支架復合物均呈光滑、半透明淡黃色，與培養前形態、大小無明顯差異；組織學染色示兩組支架中均出現典型的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色可見軟骨組織特異性細胞外基質表達。BMSCs-載藥支架復合物軟骨特異性GAG和Ⅱ型膠原含量分別為12.96±0.27、0.20±0.01，BMSCs-PLGA支架復合物為12.78±0.16、0.21±0.01，差異均無統計學意義（t=0.810，P=0.463；t=0.443，P=0.681）。見圖4。
圖4
體外軟骨再生評價
從上至下為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物 a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure4. In vitro cartilage regeneration observationFrom top to bottom for BMSCs-drug-loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin O staining (×40); d. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining (×40)
2.2.2 體內軟骨再生評價
植入羊體內4周后，大體觀察示BMSCs-載藥支架復合物基本維持植入前形狀和大小，表面光滑，呈典型象牙白狀軟骨樣外觀；而BMSCs-PLGA支架復合物嚴重變形，外表粗糙，呈紅黃相間炎癥樣外觀。見圖5a。
組織學染色示，BMSCs-載藥支架復合物具有典型的軟骨陷窩結構和軟骨特異性細胞外基質，且未出現明顯炎癥細胞浸潤；BMSCs- PLGA支架復合物為雜亂的纖維狀結構，可見明顯炎癥反應。見圖5b、c。
Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，BMSCs-載藥支架復合物顯著表達軟骨特異性Ⅱ型膠原，而BMSCs-PLGA支架復合物Ⅱ型膠原表達極少。BMSCs-載藥支架復合物軟骨特異性GAG和Ⅱ型膠原含量分別為20.47±0.76、1.54±0.05，BMSCs-PLGA支架復合物為4.09±0.44、0.11±0.01，差異均有統計學意義（t=26.340，P<0.001；t=38.300，P<0.001）。見圖5d。
圖5
體內軟骨再生評價
從上至下為BMSCs-載藥支架復合物、BMSCs-PLGA支架復合物 a. 大體觀察；b. HE染色（×40）；c. 番紅O染色（×40）；d. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色（×40）
Figure5. In vivo cartilage regeneration observationFrom top to bottom for BMSCs-drug loaded scaffold and BMSCs-PLGA scaffold, respectively a. Gross observation; b. HE staining (×40); c. Safranin O staining (×40); d. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining (×40)
RT-PCR檢測BMSCs-載藥支架復合物IL-1β、TNF-α基因相對表達量分別為2.37±0.29、3.65±0.16，低于BMSCs-PLGA支架復合物的8.04±0.14、9.11±0.16，差異均有統計學意義（t=24.800，P<0.001；t=34.490，P<0.001）。
3 討論
BEC植入動物體內后，炎癥反應往往難以避免，雖然適度的炎癥反應有利于控制感染、清除壞死物質，但過度的炎癥反應會直接導致軟骨再生失敗。① 植入手術產生的創傷以及支架材料的免疫反應均會引起嚴重炎癥反應；② 過度炎癥反應會降低BMSCs活性和分化能力，使BEC植入體內后出現血管化與骨化，最終導致軟骨再生失敗[10-11]；③ 炎癥會使巨噬細胞及成纖維細胞等在支架表面形成纖維囊，將支架與組織分隔，導致軟骨再生失敗[12]。
為了解決BEC植入體內引起的炎癥問題，研究人員進行了許多探索，并取得了一些成果。例如，制備特異性復合生物材料以抑制炎癥介質的產生[13-16]。Liang等[17]使用聚二甲基硅氧烷微珠負載地塞米松和雌二醇，構建了一個可控的雙藥物負載支架，通過地塞米松與雌二醇共同作用，抑制炎癥細胞浸潤，提高血管再生能力；Go等[18]將抗炎激素A-黑素細胞刺激素物理吸附至可生物降解的PLGA微球表面，達到減少炎癥細胞浸潤的效果。上述研究提示通過構建負載抗炎藥物的功能性支架，有利于體內軟骨再生。為使載藥支架在體內持續釋放藥物，保持藥物濃度，Ziadlou等[19]基于絲素蛋白和透明質酸-酪氨酸溶液的酶促交聯，開發了一種可注射水凝膠，用于軟骨組織工程的藥物輸送。結果顯示該水凝膠藥物釋放能力持久，有助于降低體內炎癥程度，促進體內軟骨再生。
選擇合適的抗炎藥物是構建載藥功能性支架的核心之一。大量研究表明，黃腐酚具有卓越的抗炎性能，與其能影響多種炎癥通路有關。① 通過介導Gas5/miR-27A信號通路，對炎癥和外來刺激引起的軟骨細胞細胞外基質降解具有保護作用[20]；② 通過介導軟骨細胞炎癥的HO-1和C/EBP-β信號通路來減輕炎癥反應和細胞外基質的降解[21]；③ 減少巨噬細胞中LSP受體TLR4和MD2的表達，從而抑制巨噬細胞中NF-κB的活化，同時抑制STAT-1α與IRF-1的結合活性[22]；④ 抑制軟骨細胞中由IL-1β誘導的TNF-α和IL-6表達，也能逆轉被IL-1β抑制的Ⅱ型膠原表達 [8]。以上研究說明，黃腐酚對影響軟骨再生的多條炎癥通路具有直接抑制作用，可以應用于軟骨組織工程構建抗炎支架，促進軟骨再生。
高分子合成材料PLGA具有生物降解速率可控、生物相容性好、力學強度高等優點，在組織工程領域應用十分廣泛[23]。因此，本研究將黃腐酚負載于安全無毒、穩定的多孔PLGA支架上，制備了黃腐酚-PLGA支架。紅外光譜圖顯示黃腐酚能穩固負載至PLGA支架，分析與黃腐酚結構中含有大量-OH，能與PLGA發生交聯有關[24]。大體觀察以及掃描電鏡觀察示，負載的黃腐酚對PLGA支架外觀、孔徑和孔隙率無明顯影響，分析PLGA支架與黃腐酚均為性質穩定的化合物，負載黃腐酚并不會改變PLGA支架的物理化學性質。而且黃腐酚-PLGA支架與RAW264.7巨噬細胞體外共培養后，RT-PCR和Western blot檢測結果均表明炎癥相關因子（TNF-α和IL-1β）表達量明顯下降，體現了黃腐酚強大的抗炎性能。活/死細胞染色和CCK-8檢測表明負載黃腐酚安全、無毒，而且體外軟骨再生實驗顯示引入黃腐酚沒有影響PLGA支架的體外軟骨再生能力，分析與PLGA穩定的化學性質和多孔結構，以及黃腐酚為天然異戊烯類黃酮化合物，安全、無毒，不會對軟骨再生造成負面影響有關[25]。
軟骨組織工程的核心目標是實現體內軟骨再生，然而既往研究的多種BMSCs-支架結構在體外能成功再生軟骨，但植入動物體內后再生軟骨常發生塌陷、變形甚至消失，導致軟骨再生失敗，尤其是在免疫系統完善的大型動物體內，軟骨再生效果更不理想，炎癥反應是體內軟骨再生失敗的重要原因[26-28]。IL-1β和TNF-α是軟骨炎癥反應的主要參與者，其中IL-1β會直接破壞軟骨細胞，而TNF-α能推動炎癥級聯反應[29]。IL-1β和TNF-α參與了多條軟骨炎癥通路：① 上調一氧化氮合酶、環氧合酶 2基因的表達，并刺激NO和前列腺素E2的釋放[30]；② 誘導超氧自由基產生，并抑制超氧自由基抗氧化酶的表達[31]；③ 抑制軟骨特異性細胞外基質中Ⅱ型膠原和GAG的表達[32]；④ 刺激基質金屬蛋白酶1（matrix metalloproteinase 1，MMP-1）、MMP-3和MMP-13的釋放，誘導IL-6、趨化因子（如IL-8、單核細胞趨化蛋白 1）和趨化因子配體5的產生[33]。本研究體內實驗結果顯示負載黃腐酚的PLGA支架表現出更好的軟骨再生效果，而且炎癥因子IL-1β和TNF-α表達明顯下降。同時，本研究選擇免疫系統完善的大型動物進行體內實驗，與既往采用免疫缺陷的裸鼠及小動物（如小鼠、兔）研究相比，進一步說明該支架具有良好抗炎功能。
綜上述，本研究構建的載藥支架具有良好抗炎性能，植入羊體內后可以有效促進軟骨再生。后續需要進一步研究黃腐酚在PLGA支架上載荷最佳濃度、構建具有持久、均勻緩釋效果的負載黃腐酚功能性支架，以期為BEC的臨床轉化奠定實驗基礎。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經河南科技大學附屬許昌市中心醫院保護委員會批準；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）-2019-0002
作者貢獻聲明 徐松山、趙少華：研究設計、文章撰寫；趙少華、徐勇：研究實施；菅炎鵬、劉偉杰、邵欣慰：數據收集整理及統計分析；樊俊：行政支持；王一公：經費支持
