引用本文： 唐珺, 談金女, 葉朝陽, 周燕, 譚文松. 三維預血管化微組織中成纖維細胞促進內皮細胞出芽及遷移的研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(7): 881-888. doi: 10.7507/1002-1892.202203028 復制
研究表明，構建預血管化骨組織對于提高其體內活性、促進骨缺損修復具有重要作用[1-2]。MSCs和內皮細胞（endothelial cells，ECs）共培養構建預血管化骨組織的研究發現，在成骨誘導培養基中兩種細胞共培養雖能促進MSCs成骨分化，但因受誘導培養基成分、成骨分化MSCs的因子表達、MSCs與ECs直接接觸等影響，ECs血管形成受到抑制[3-6]。因此，需要探索預血管化骨組織構建的新策略。
微組織是指將細胞接種到幾百微米的三維支架上，經培養后形成的微型構建物（也稱模塊組織）。我們設想分別構建骨微組織和預血管化微組織后，將兩者直接注入體內或組裝成預血管化骨組織注入體內來修復骨缺損。本團隊前期成功構建了骨微組織[7]，本次研究旨在進一步構建預血管化微組織。既往研究發現，人成纖維細胞（human fibroblasts，HFs）在ECs血管化過程中具有重要作用，通過分泌細胞因子和細胞外基質促進ECs出芽并穩定新生芽體[8]。為此，本研究擬選擇HFs和人臍靜脈ECs（human umbilical vein ECs，HUVECs）共培養，構建預血管化微組織。
共培養體系是指將兩種及以上的細胞共同培養于同一培養基或載體上所形成的體系。二維共培養體系在血管化調控機制研究中具有重要作用，但無法模擬體內復雜微環境及用于構建移植的預血管化微組織[9]。三維共培養體系是指將兩種及以上的細胞共同培養于三維體系中，盡可能減小體外與體內環境的差異。目前，體外構建預血管化微組織相關研究中，采用的三維共培養體系包括直接將ECs和HFs接種于基質膠中的共培養模型，或在兩層基質膠中接種ECs的“三明治”模型[10]，或將ECs和周細胞共培養于膠原蛋白凝膠內的腔體通道中[11]，但將這些培養組織進行移植修復時，操作存在一定難度。有研究將ECs接種于微載體上并包埋于凝膠中，但多為單一細胞培養，鮮有共培養研究相關報道[12]。本次研究將HFs和HUVECs共培養于多孔微載體上，構建三維預血管化微組織，并將其包埋于纖維蛋白凝膠中，探索在三維培養環境中HUVECs的出芽過程及HFs對HUVECs遷移的促進作用，為規模化制備預血管化微組織奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及主要試劑、儀器
嬰兒包皮來源HFs由本實驗室分離并保存[13]。HUVECs購自上海復蒙基因生物技術有限公司。
Cytopore 2微載體（GE公司，美國）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素（上海碧云天生物技術有限公司）；結晶紫、PKH26（Sigma公司，美國）；纖維蛋白原、凝血酶、抑肽酶（上海索萊寶生物科技有限公司）；綠色熒光蛋白慢病毒（pLenti-green fluorescent protein，pLenti-GFP）、紅色熒光蛋白慢病毒（pLenti-red fluorescent protein，pLenti-RFP）由中國科學院上海生命科學院惠利健教授提供。
攪拌轉瓶（Coring公司，美國）；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；超凈工作臺、CO2培養箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；離心機（Beckman Coulter公司，美國）；Image J圖像處理軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 細胞培養
HUVECs和HFs均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待生長至90%左右融合度時行細胞傳代。取第3～5代細胞備用。
1.3 二維共培養體系構建及觀測
1.3.1 PKH26染色
HFs以胰蛋白酶消化，形成單細胞懸液；以離心半徑15 cm，1 500 r/min離心5 min；無血清培養基洗1次，吸去上清，加入PKH26染色液，吹勻細胞并置于培養箱孵育3～5 min；加入等量FBS終止染色反應1 min；加入等量含10%FBS的DMEM培養基稀釋中止反應液；以離心半徑15 cm，1 500 r/min離心10 min；洗滌重懸細胞并計數，用于二維共培養。
1.3.2 二維共培養及觀測
① 取PKH26染色的HFs，調整并固定細胞密度為5.0×104個/mL，在此基礎上按照HFs∶HUVECs為1∶4、1∶1、4∶1比例取相應數量HUVECs。② 根據不同接種方法，實驗分為HF-EC組及HF&EC組。HF-EC組：順序接種2種細胞，即首先將HFs接種于24孔板（每孔1 mL），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養48 h后，再按照上述比例分別接種HUVECs。HF&EC組：取HFs及HUVECs按照上述比例直接混合接種于24孔板培養。每組重復3孔。③ 采用熒光顯微鏡自培養開始連續10 d觀察各組細胞形態，PKH26染色的HFs呈紅色，分析不同細胞比例及HFs預培養對血管網絡形成的影響。
1.4 三維共培養體系構建及觀測
1.4.1 慢病毒轉染細胞
分別取3.0×105個HUVECs和HFs，接種于直徑6 cm的平皿中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養24 h后，分別加入200 μL pLenti-GFP（HUVECs）或pLenti-RFP（HFs），以及培養基總體積1/1 000的Polybrene溶液。24 h后更換新鮮培養基并繼續培養，直至熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色或紅色熒光。
1.4.2 微組織制備及觀測
① 微組織制備方法：于攪拌轉瓶中加入濃度為2.0 mg/mL的Cytopore 2微載體，滅菌處理后于DMEM培養基中孵育過夜；取1.4.1中經慢病毒轉染的細胞（2.0×105個/mL）接種至瓶中，每瓶50 mL；加入DMEM培養基，以轉速60 r/min培養48 h后獲得微組織（圖1a）。
圖1
微組織制備及三維共培養體系構建流程圖
a. 微組織制備；b. 三維共培養體系
Figure1. Flow chart of microstructures preparation and 3D co-culture system constructiona. Microstructures preparation; b. 3D co-culture system
實驗共制備4種微組織，其中HF微組織為微載體僅接種HFs，HUVEC微組織為僅接種HUVECs；HF&EC微組織為直接混合接種兩種細胞；HF-EC微組織為先接種HFs并培養48 h后，再接種HUVECs繼續培養48 h。
② 觀測指標：采用低滲結晶紫染色法對微組織中細胞進行計數。具體方法：自接種后每隔2 d取1 mL HUVEC微組織或HF微組織，連續14 d；將微組織置于EP管中，PBS漂洗后加入0.1%結晶紫染色液，維持終體積為1 mL，37℃振蕩5 h，用血球計數板計數細胞核，計算細胞密度，表示微組織上細胞生長增殖情況。
1.4.3 三維共培養體系構建
首先取24孔板，每孔加入0.5 U/mL凝血酶和0.15 U/mL抑肽酶各5 μL，混勻后加入用DMEM培養液配置的5.0 mg/mL纖維蛋白原溶液200 μL，待其凝固，制備成鋪有纖維蛋白凝膠的孔板。然后，每孔再次添加纖維蛋白溶液200 μL，分別加入1.4.2中制備的4種微組織，每組重復3孔；迅速加入凝血酶5 μL，置于37℃培養箱中凝固30 min，構建微組織包埋于纖維蛋白凝膠的三維共培養體系。最后，每孔添加DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養（圖1b）。
1.4.4 三維共培養后觀測
培養1、3 d，激光共聚焦顯微鏡觀察HF微組織和HUVEC微組織中細胞生長及貼附情況。培養3 d，激光共聚焦顯微鏡觀察4種微組織出芽及HF-EC微組織、HF&EC微組織芽體細胞組成，采用Image J圖像處理軟件計算HF-EC微組織、HF&EC微組織出芽數量及芽體長度。
1.5 HFs分泌的細胞因子對HUVEC微組織出芽的影響
取1.4.1中標記紅色熒光的HFs接種于T150瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養，待生長至約90%融合度后，更換為無血清DMEM培養基繼續培養48 h；取培養液，添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，配制成HFs條件培養基。
取1.4.2中制備的HUVEC微組織置于24孔板，分別采用HFs條件培養基（實驗組）或含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基（對照組）培養，每組重復3孔。培養1、3、5 d，激光共聚焦顯微鏡下觀察HUVEC微組織出芽情況。
1.6 統計學方法
采用Excel軟件統計分析。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布時，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 二維共培養觀測
熒光顯微鏡下觀察示，細胞比例為1∶4時，HF&EC組細胞聚團，未能形成血管樣結構；而HF-EC組形成了明顯且穩定的血管樣結構。比例為1∶1時，HF&EC組僅在 2 d時短暫出現了血管樣結構，之后迅速退化成細胞簇；而HF-EC組培養2 d時即形成血管樣結構，直至10 d時仍能見部分血管樣結構。比例為4∶1時，HF&EC組可形成比較穩定的血管樣結構，培養至6 d時才能觀察到網狀結構形成；而HF-EC組培養至10 d時仍無網狀結構形成。見圖2。
圖2
熒光顯微鏡觀察細胞接種比例及HFs預培養對血管網絡形成的影響（×40）
從上至下分別為培養2、6、10 d；從左至右分別為HF&EC組及HF-EC組 a. 1∶4； b. 1∶1；c. 4∶1
Figure2. Effects of cell proportion and HFs pre-culturing on the vascular like structures formation under fluorescence microscope (×40)From top to bottom for 2, 6, and 10 days, respectively; from left to right for HF&EC group and HF-EC group, respectively a. 1∶4; b. 1∶1; c. 4∶1
2.2 微組織中細胞生長觀察
低滲結晶紫染色法檢測示，HUVECs和HFs均能在2 d內完全貼附于微載體。0～4 d為細胞生長延滯期，增殖緩慢；4 d后進入對數生長期，細胞快速增殖。培養至14 d時，HUVECs和HFs密度分別為17.6×105 個/mL和11.7×105 個/mL，與接種時相比分別擴增了9倍和6倍。見圖3。
圖3
微組織中細胞生長曲線
a. HUVEC微組織；b. HF微組織
Figure3. Cell growth in microstructuresa. HUVEC microstructures; b. HF microstructures
2.3 三維共培養對微組織出芽的影響
2.3.1 微組織中細胞生長貼附觀察
激光共聚焦顯微鏡下見，HUVEC微組織和HF微組織包埋后1 d細胞即均勻貼附于微載體上；培養至3 d時，HUVEC微組織上的細胞仍緊密貼附于微載體上，而HF微組織中的細胞遷出微載體，呈現出芽現象。見圖4。
圖4
激光共聚焦顯微鏡觀察微組織中細胞生長（×100）
從左至右分別為HUVEC微組織、HF微組織 a. 培養1 d；b. 培養3 d
Figure4. Cell growth and adhesion in microstructures under laser confocal microscope (×100)From left to right for HUVEC microstructures and HF microstructures, respectively a. At1 day after culture; b. At 3 days after culture
2.3.2 出芽情況觀察
培養3 d時，除HUVEC微組織沒有出芽外，其余3種微組織均有出芽現象，這些芽從微組織中伸出，呈樹枝狀伸展且分叉。其中，HF微組織出芽較少，芽體較短。而HF-EC微組織和HF&EC微組織出芽較多，芽體較長，出芽軌跡幾乎一致；芽體軸部（微組織近端）和中部均由HUVECs和HFs共同形成，但芽體頂部（微組織遠端）只有HFs，且HFs正在形成芽的分叉；HF-EC微組織芽體中部HUVECs比HF&EC微組織更多。見圖5、6。
圖5
激光共聚焦顯微鏡觀察三維共培養對微組織出芽的影響
從左至右分別為HF微組織、HUVEC微組織、HF-EC微組織、HF&EC微組織 a. 明場圖（×40）；b. 熒光圖（×100）
Figure5. The effect of 3D co-culture on sprout of microstructures under laser confocal microscopeFrom left to right for HF microstructures, HUVEC microstructures, HF-EC microstructures, and HF&EC microstructures, respectively a. Bright images (×40); b. Fluorescence images (×100)
圖6
激光共聚焦顯微鏡觀察HF-EC微組織及HF&EC微組織芽體細胞組成
從上至下分別為HF-EC微組織、HF&EC微組織 a. 芽體（×200）；b～d. 芽體軸部、中部及頂部（×500）
Figure6. Cell composition of sprout from HF-EC microstructures and HF&EC microstructures under laser confocal microscopeFrom top to bottom for HF-EC microstructures and HF&EC microstructures a. Sprout (×200); b-d. The stalk, medium, and tip of sprout, respectively (×500)
HF-EC微組織出芽數量及芽體長度分別為（24.2±2.6）個、（405.1±100.8）μm，均高于HF&EC組的（15.8±1.7）個、（349.8±106.5）μm，差異均有統計學意義（t=5.852，P=0.001；t=2.120，P=0.039）。
2.4 HFs分泌的細胞因子對HUVECs出芽的影響
激光共聚焦顯微鏡觀察示，對照組HUVECs未出芽，5 d時HUVECs遷出微組織，在微組織周圍形成細胞圈。實驗組HUVEC微組織在3 d時即有出芽，至5 d時出芽更明顯。見圖7。
圖7
HFs分泌的細胞因子對HUVEC微組織出芽的影響 （激光共聚焦顯微鏡×100）
從上至下分別為培養1、3、5 d；從左至右分別為明場圖及熒光圖 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Effect of cytokines secreted by HFs on sprout of HUVEC microstructures (Laser confocal microscope×100)From top to bottom for 1, 3, and 5 days after culture, respectively; from left to right for bright images and fluorescence images, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 討論
傳質限制是工程化骨組織體外構建和體內移植面臨的瓶頸問題之一，通過微組織工程技術能有效解決體外構建物中的傳質限制，而工程化骨組織的預血管化可進一步提高植入體內后移植物的活性，有助于骨組織缺損修復。然而，在成骨誘導環境中MSCs和ECs共培養雖可促進MSCs成骨分化，卻不利于ECs血管網絡形成，因此需要分別構建骨微組織和預血管化微組織，再進行組織修復。
為了構建預血管化微組織，研究者嘗試了多種培養體系，如將ECs包埋于纖維蛋白凝膠或其他材料組成的凝膠中[14]，但凝膠中細胞密度有限，且無法實現規模化制備。也有研究將細胞單獨培養于溫敏聚合物上形成細胞層，再將形成的細胞層膜片通過逐層堆積的方法構建三維組織；但該方法因中心傳質限制問題，構建的組織尺寸受限[15]。另有研究者采用由殼聚糖-聚賴氨酸-海藻酸鹽多層膜包封負載細胞的聚己內酯微粒[16]，該微囊內部呈液態，可以解決內部傳質限制的問題。但該構建方法復雜，且缺乏一定基質硬度，而基質硬度對體外血管化也具有一定作用。本研究采用細胞共培養于多孔微載體的方法，細胞密度高且具有基質剛性，具備規模化制備的潛力。通過引入轉瓶動態培養技術，能夠有效解決傳質限制的問題，同時給予細胞一定的機械刺激。有研究表明在生物反應器的動態培養環境中，機械刺激能夠有效促進ECs體外預血管化[17-19]。
體外構建預血管化組織模塊時，除了需要ECs之外，支持細胞的存在也同樣重要。成纖維細胞作為來源廣泛的支持細胞之一，通過分泌基質金屬蛋白酶降解細胞外基質，促進ECs遷移；分泌的細胞因子和細胞外基質，如bFGF、VEGF以及Ⅰ、Ⅵ型膠原等，有利于ECs增殖、遷移和新生血管的穩定。因此，本研究中采用HFs與HUVECs共培養，成功構建了具有血管化能力的微組織。另有研究報道了MSCs對ECs血管化的促進作用[20]，且MSCs具備更高的分化能力，為同種異體移植提供了有利條件。因此，未來可以開展采用MSCs進行預血管化模塊構建的研究。
關于HFs引導HUVECs遷移的調控機制，目前尚未明確。Costa-Almeida等[8]提到在大血管形成中，成纖維細胞通過沉積細胞外基質支持ECs遷移，也通過分泌細胞因子促進血管發生。在分泌的細胞因子中，VEGF頗受關注，其與ECs激活成為尖端細胞以及引導尖端細胞定向遷移有關[21-23]。細胞外基質成分比較復雜，其中纖連蛋白與毛細血管發生有關[24]，Ⅰ型膠原和Ⅵ型膠原蛋白與ECs出芽的數目和長度有關[25]，Ⅷ型膠原蛋白還被認為能夠促進ECs遷移[26]。本研究中HF-EC微組織出芽數目多于HF&EC微組織，可能是由于HFs預接種的HF-EC微組織中沉積了更多的細胞外基質，從而促進HUVECs出芽。因此，今后需進一步研究HFs分泌物的成分組成，探索關鍵組分對HUVECs出芽的影響及相關調控機制，以促進預血管化微組織的血管形成。
綜上述，本研究采用多孔微載體通過HFs預培養并以1∶1比例接種HUVECs，在轉瓶中成功構建了具備預血管化能力的共培養微組織，并初步證明在該微組織中HFs能夠促進和引導HUVECs出芽。今后需要進一步開展血管生成體外、體內分析檢測工作，如結合圖像分析技術，對形成的血管樣結構進行半定量表征；定量檢測HUVECs血管生成標志物的表達；基于雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型以及其他動物模型（包括組織缺損模型）進行動物實驗，為二維和三維細胞共培養對血管生成影響及相關機制的探究、組織缺損修復的應用提供更多數據支持。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 唐珺：參與實驗設計、操作，數據收集及統計分析，文章撰寫；談金女：參與實驗設計、操作；葉朝陽、周燕：實驗指導、設計，數據分析和文章修改；譚文松：實驗指導、設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱及支持性貢獻
研究表明，構建預血管化骨組織對于提高其體內活性、促進骨缺損修復具有重要作用[1-2]。MSCs和內皮細胞（endothelial cells，ECs）共培養構建預血管化骨組織的研究發現，在成骨誘導培養基中兩種細胞共培養雖能促進MSCs成骨分化，但因受誘導培養基成分、成骨分化MSCs的因子表達、MSCs與ECs直接接觸等影響，ECs血管形成受到抑制[3-6]。因此，需要探索預血管化骨組織構建的新策略。
微組織是指將細胞接種到幾百微米的三維支架上，經培養后形成的微型構建物（也稱模塊組織）。我們設想分別構建骨微組織和預血管化微組織后，將兩者直接注入體內或組裝成預血管化骨組織注入體內來修復骨缺損。本團隊前期成功構建了骨微組織[7]，本次研究旨在進一步構建預血管化微組織。既往研究發現，人成纖維細胞（human fibroblasts，HFs）在ECs血管化過程中具有重要作用，通過分泌細胞因子和細胞外基質促進ECs出芽并穩定新生芽體[8]。為此，本研究擬選擇HFs和人臍靜脈ECs（human umbilical vein ECs，HUVECs）共培養，構建預血管化微組織。
共培養體系是指將兩種及以上的細胞共同培養于同一培養基或載體上所形成的體系。二維共培養體系在血管化調控機制研究中具有重要作用，但無法模擬體內復雜微環境及用于構建移植的預血管化微組織[9]。三維共培養體系是指將兩種及以上的細胞共同培養于三維體系中，盡可能減小體外與體內環境的差異。目前，體外構建預血管化微組織相關研究中，采用的三維共培養體系包括直接將ECs和HFs接種于基質膠中的共培養模型，或在兩層基質膠中接種ECs的“三明治”模型[10]，或將ECs和周細胞共培養于膠原蛋白凝膠內的腔體通道中[11]，但將這些培養組織進行移植修復時，操作存在一定難度。有研究將ECs接種于微載體上并包埋于凝膠中，但多為單一細胞培養，鮮有共培養研究相關報道[12]。本次研究將HFs和HUVECs共培養于多孔微載體上，構建三維預血管化微組織，并將其包埋于纖維蛋白凝膠中，探索在三維培養環境中HUVECs的出芽過程及HFs對HUVECs遷移的促進作用，為規模化制備預血管化微組織奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及主要試劑、儀器
嬰兒包皮來源HFs由本實驗室分離并保存[13]。HUVECs購自上海復蒙基因生物技術有限公司。
Cytopore 2微載體（GE公司，美國）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；青霉素、鏈霉素（上海碧云天生物技術有限公司）；結晶紫、PKH26（Sigma公司，美國）；纖維蛋白原、凝血酶、抑肽酶（上海索萊寶生物科技有限公司）；綠色熒光蛋白慢病毒（pLenti-green fluorescent protein，pLenti-GFP）、紅色熒光蛋白慢病毒（pLenti-red fluorescent protein，pLenti-RFP）由中國科學院上海生命科學院惠利健教授提供。
攪拌轉瓶（Coring公司，美國）；熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；超凈工作臺、CO2培養箱（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；離心機（Beckman Coulter公司，美國）；Image J圖像處理軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 細胞培養
HUVECs和HFs均采用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，待生長至90%左右融合度時行細胞傳代。取第3～5代細胞備用。
1.3 二維共培養體系構建及觀測
1.3.1 PKH26染色
HFs以胰蛋白酶消化，形成單細胞懸液；以離心半徑15 cm，1 500 r/min離心5 min；無血清培養基洗1次，吸去上清，加入PKH26染色液，吹勻細胞并置于培養箱孵育3～5 min；加入等量FBS終止染色反應1 min；加入等量含10%FBS的DMEM培養基稀釋中止反應液；以離心半徑15 cm，1 500 r/min離心10 min；洗滌重懸細胞并計數，用于二維共培養。
1.3.2 二維共培養及觀測
① 取PKH26染色的HFs，調整并固定細胞密度為5.0×104個/mL，在此基礎上按照HFs∶HUVECs為1∶4、1∶1、4∶1比例取相應數量HUVECs。② 根據不同接種方法，實驗分為HF-EC組及HF&EC組。HF-EC組：順序接種2種細胞，即首先將HFs接種于24孔板（每孔1 mL），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養48 h后，再按照上述比例分別接種HUVECs。HF&EC組：取HFs及HUVECs按照上述比例直接混合接種于24孔板培養。每組重復3孔。③ 采用熒光顯微鏡自培養開始連續10 d觀察各組細胞形態，PKH26染色的HFs呈紅色，分析不同細胞比例及HFs預培養對血管網絡形成的影響。
1.4 三維共培養體系構建及觀測
1.4.1 慢病毒轉染細胞
分別取3.0×105個HUVECs和HFs，接種于直徑6 cm的平皿中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養24 h后，分別加入200 μL pLenti-GFP（HUVECs）或pLenti-RFP（HFs），以及培養基總體積1/1 000的Polybrene溶液。24 h后更換新鮮培養基并繼續培養，直至熒光顯微鏡下觀察細胞表達綠色或紅色熒光。
1.4.2 微組織制備及觀測
① 微組織制備方法：于攪拌轉瓶中加入濃度為2.0 mg/mL的Cytopore 2微載體，滅菌處理后于DMEM培養基中孵育過夜；取1.4.1中經慢病毒轉染的細胞（2.0×105個/mL）接種至瓶中，每瓶50 mL；加入DMEM培養基，以轉速60 r/min培養48 h后獲得微組織（圖1a）。
圖1
微組織制備及三維共培養體系構建流程圖
a. 微組織制備；b. 三維共培養體系
Figure1. Flow chart of microstructures preparation and 3D co-culture system constructiona. Microstructures preparation; b. 3D co-culture system
實驗共制備4種微組織，其中HF微組織為微載體僅接種HFs，HUVEC微組織為僅接種HUVECs；HF&EC微組織為直接混合接種兩種細胞；HF-EC微組織為先接種HFs并培養48 h后，再接種HUVECs繼續培養48 h。
② 觀測指標：采用低滲結晶紫染色法對微組織中細胞進行計數。具體方法：自接種后每隔2 d取1 mL HUVEC微組織或HF微組織，連續14 d；將微組織置于EP管中，PBS漂洗后加入0.1%結晶紫染色液，維持終體積為1 mL，37℃振蕩5 h，用血球計數板計數細胞核，計算細胞密度，表示微組織上細胞生長增殖情況。
1.4.3 三維共培養體系構建
首先取24孔板，每孔加入0.5 U/mL凝血酶和0.15 U/mL抑肽酶各5 μL，混勻后加入用DMEM培養液配置的5.0 mg/mL纖維蛋白原溶液200 μL，待其凝固，制備成鋪有纖維蛋白凝膠的孔板。然后，每孔再次添加纖維蛋白溶液200 μL，分別加入1.4.2中制備的4種微組織，每組重復3孔；迅速加入凝血酶5 μL，置于37℃培養箱中凝固30 min，構建微組織包埋于纖維蛋白凝膠的三維共培養體系。最后，每孔添加DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養（圖1b）。
1.4.4 三維共培養后觀測
培養1、3 d，激光共聚焦顯微鏡觀察HF微組織和HUVEC微組織中細胞生長及貼附情況。培養3 d，激光共聚焦顯微鏡觀察4種微組織出芽及HF-EC微組織、HF&EC微組織芽體細胞組成，采用Image J圖像處理軟件計算HF-EC微組織、HF&EC微組織出芽數量及芽體長度。
1.5 HFs分泌的細胞因子對HUVEC微組織出芽的影響
取1.4.1中標記紅色熒光的HFs接種于T150瓶中，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中采用DMEM培養基培養，待生長至約90%融合度后，更換為無血清DMEM培養基繼續培養48 h；取培養液，添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，配制成HFs條件培養基。
取1.4.2中制備的HUVEC微組織置于24孔板，分別采用HFs條件培養基（實驗組）或含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基（對照組）培養，每組重復3孔。培養1、3、5 d，激光共聚焦顯微鏡下觀察HUVEC微組織出芽情況。
1.6 統計學方法
采用Excel軟件統計分析。計量資料行正態性檢驗，符合正態分布時，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 二維共培養觀測
熒光顯微鏡下觀察示，細胞比例為1∶4時，HF&EC組細胞聚團，未能形成血管樣結構；而HF-EC組形成了明顯且穩定的血管樣結構。比例為1∶1時，HF&EC組僅在 2 d時短暫出現了血管樣結構，之后迅速退化成細胞簇；而HF-EC組培養2 d時即形成血管樣結構，直至10 d時仍能見部分血管樣結構。比例為4∶1時，HF&EC組可形成比較穩定的血管樣結構，培養至6 d時才能觀察到網狀結構形成；而HF-EC組培養至10 d時仍無網狀結構形成。見圖2。
圖2
熒光顯微鏡觀察細胞接種比例及HFs預培養對血管網絡形成的影響（×40）
從上至下分別為培養2、6、10 d；從左至右分別為HF&EC組及HF-EC組 a. 1∶4； b. 1∶1；c. 4∶1
Figure2. Effects of cell proportion and HFs pre-culturing on the vascular like structures formation under fluorescence microscope (×40)From top to bottom for 2, 6, and 10 days, respectively; from left to right for HF&EC group and HF-EC group, respectively a. 1∶4; b. 1∶1; c. 4∶1
2.2 微組織中細胞生長觀察
低滲結晶紫染色法檢測示，HUVECs和HFs均能在2 d內完全貼附于微載體。0～4 d為細胞生長延滯期，增殖緩慢；4 d后進入對數生長期，細胞快速增殖。培養至14 d時，HUVECs和HFs密度分別為17.6×105 個/mL和11.7×105 個/mL，與接種時相比分別擴增了9倍和6倍。見圖3。
圖3
微組織中細胞生長曲線
a. HUVEC微組織；b. HF微組織
Figure3. Cell growth in microstructuresa. HUVEC microstructures; b. HF microstructures
2.3 三維共培養對微組織出芽的影響
2.3.1 微組織中細胞生長貼附觀察
激光共聚焦顯微鏡下見，HUVEC微組織和HF微組織包埋后1 d細胞即均勻貼附于微載體上；培養至3 d時，HUVEC微組織上的細胞仍緊密貼附于微載體上，而HF微組織中的細胞遷出微載體，呈現出芽現象。見圖4。
圖4
激光共聚焦顯微鏡觀察微組織中細胞生長（×100）
從左至右分別為HUVEC微組織、HF微組織 a. 培養1 d；b. 培養3 d
Figure4. Cell growth and adhesion in microstructures under laser confocal microscope (×100)From left to right for HUVEC microstructures and HF microstructures, respectively a. At1 day after culture; b. At 3 days after culture
2.3.2 出芽情況觀察
培養3 d時，除HUVEC微組織沒有出芽外，其余3種微組織均有出芽現象，這些芽從微組織中伸出，呈樹枝狀伸展且分叉。其中，HF微組織出芽較少，芽體較短。而HF-EC微組織和HF&EC微組織出芽較多，芽體較長，出芽軌跡幾乎一致；芽體軸部（微組織近端）和中部均由HUVECs和HFs共同形成，但芽體頂部（微組織遠端）只有HFs，且HFs正在形成芽的分叉；HF-EC微組織芽體中部HUVECs比HF&EC微組織更多。見圖5、6。
圖5
激光共聚焦顯微鏡觀察三維共培養對微組織出芽的影響
從左至右分別為HF微組織、HUVEC微組織、HF-EC微組織、HF&EC微組織 a. 明場圖（×40）；b. 熒光圖（×100）
Figure5. The effect of 3D co-culture on sprout of microstructures under laser confocal microscopeFrom left to right for HF microstructures, HUVEC microstructures, HF-EC microstructures, and HF&EC microstructures, respectively a. Bright images (×40); b. Fluorescence images (×100)
圖6
激光共聚焦顯微鏡觀察HF-EC微組織及HF&EC微組織芽體細胞組成
從上至下分別為HF-EC微組織、HF&EC微組織 a. 芽體（×200）；b～d. 芽體軸部、中部及頂部（×500）
Figure6. Cell composition of sprout from HF-EC microstructures and HF&EC microstructures under laser confocal microscopeFrom top to bottom for HF-EC microstructures and HF&EC microstructures a. Sprout (×200); b-d. The stalk, medium, and tip of sprout, respectively (×500)
HF-EC微組織出芽數量及芽體長度分別為（24.2±2.6）個、（405.1±100.8）μm，均高于HF&EC組的（15.8±1.7）個、（349.8±106.5）μm，差異均有統計學意義（t=5.852，P=0.001；t=2.120，P=0.039）。
2.4 HFs分泌的細胞因子對HUVECs出芽的影響
激光共聚焦顯微鏡觀察示，對照組HUVECs未出芽，5 d時HUVECs遷出微組織，在微組織周圍形成細胞圈。實驗組HUVEC微組織在3 d時即有出芽，至5 d時出芽更明顯。見圖7。
圖7
HFs分泌的細胞因子對HUVEC微組織出芽的影響 （激光共聚焦顯微鏡×100）
從上至下分別為培養1、3、5 d；從左至右分別為明場圖及熒光圖 a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Effect of cytokines secreted by HFs on sprout of HUVEC microstructures (Laser confocal microscope×100)From top to bottom for 1, 3, and 5 days after culture, respectively; from left to right for bright images and fluorescence images, respectively a. Control group; b. Experimental group
3 討論
傳質限制是工程化骨組織體外構建和體內移植面臨的瓶頸問題之一，通過微組織工程技術能有效解決體外構建物中的傳質限制，而工程化骨組織的預血管化可進一步提高植入體內后移植物的活性，有助于骨組織缺損修復。然而，在成骨誘導環境中MSCs和ECs共培養雖可促進MSCs成骨分化，卻不利于ECs血管網絡形成，因此需要分別構建骨微組織和預血管化微組織，再進行組織修復。
為了構建預血管化微組織，研究者嘗試了多種培養體系，如將ECs包埋于纖維蛋白凝膠或其他材料組成的凝膠中[14]，但凝膠中細胞密度有限，且無法實現規模化制備。也有研究將細胞單獨培養于溫敏聚合物上形成細胞層，再將形成的細胞層膜片通過逐層堆積的方法構建三維組織；但該方法因中心傳質限制問題，構建的組織尺寸受限[15]。另有研究者采用由殼聚糖-聚賴氨酸-海藻酸鹽多層膜包封負載細胞的聚己內酯微粒[16]，該微囊內部呈液態，可以解決內部傳質限制的問題。但該構建方法復雜，且缺乏一定基質硬度，而基質硬度對體外血管化也具有一定作用。本研究采用細胞共培養于多孔微載體的方法，細胞密度高且具有基質剛性，具備規模化制備的潛力。通過引入轉瓶動態培養技術，能夠有效解決傳質限制的問題，同時給予細胞一定的機械刺激。有研究表明在生物反應器的動態培養環境中，機械刺激能夠有效促進ECs體外預血管化[17-19]。
體外構建預血管化組織模塊時，除了需要ECs之外，支持細胞的存在也同樣重要。成纖維細胞作為來源廣泛的支持細胞之一，通過分泌基質金屬蛋白酶降解細胞外基質，促進ECs遷移；分泌的細胞因子和細胞外基質，如bFGF、VEGF以及Ⅰ、Ⅵ型膠原等，有利于ECs增殖、遷移和新生血管的穩定。因此，本研究中采用HFs與HUVECs共培養，成功構建了具有血管化能力的微組織。另有研究報道了MSCs對ECs血管化的促進作用[20]，且MSCs具備更高的分化能力，為同種異體移植提供了有利條件。因此，未來可以開展采用MSCs進行預血管化模塊構建的研究。
關于HFs引導HUVECs遷移的調控機制，目前尚未明確。Costa-Almeida等[8]提到在大血管形成中，成纖維細胞通過沉積細胞外基質支持ECs遷移，也通過分泌細胞因子促進血管發生。在分泌的細胞因子中，VEGF頗受關注，其與ECs激活成為尖端細胞以及引導尖端細胞定向遷移有關[21-23]。細胞外基質成分比較復雜，其中纖連蛋白與毛細血管發生有關[24]，Ⅰ型膠原和Ⅵ型膠原蛋白與ECs出芽的數目和長度有關[25]，Ⅷ型膠原蛋白還被認為能夠促進ECs遷移[26]。本研究中HF-EC微組織出芽數目多于HF&EC微組織，可能是由于HFs預接種的HF-EC微組織中沉積了更多的細胞外基質，從而促進HUVECs出芽。因此，今后需進一步研究HFs分泌物的成分組成，探索關鍵組分對HUVECs出芽的影響及相關調控機制，以促進預血管化微組織的血管形成。
綜上述，本研究采用多孔微載體通過HFs預培養并以1∶1比例接種HUVECs，在轉瓶中成功構建了具備預血管化能力的共培養微組織，并初步證明在該微組織中HFs能夠促進和引導HUVECs出芽。今后需要進一步開展血管生成體外、體內分析檢測工作，如結合圖像分析技術，對形成的血管樣結構進行半定量表征；定量檢測HUVECs血管生成標志物的表達；基于雞胚絨毛尿囊膜血管生成模型以及其他動物模型（包括組織缺損模型）進行動物實驗，為二維和三維細胞共培養對血管生成影響及相關機制的探究、組織缺損修復的應用提供更多數據支持。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 唐珺：參與實驗設計、操作，數據收集及統計分析，文章撰寫；談金女：參與實驗設計、操作；葉朝陽、周燕：實驗指導、設計，數據分析和文章修改；譚文松：實驗指導、設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱及支持性貢獻
