引用本文： 董潤北, 賈宇濤, 楊厚志, 羅干, 李玉喬, 孫天威. 莫諾苷對小鼠MC3T3-E1細胞成骨分化和增殖的影響及機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(7): 889-895. doi: 10.7507/1002-1892.202202088 復制
骨質疏松癥是一種以全身骨量和骨礦物密度降低引起的代謝性骨病，好發于絕經后婦女以及中老年男性[1]。近年來，骨質疏松癥發病率逐年升高，伴隨的病理性骨折發生也逐年增多，給患者和社會帶來巨大經濟負擔[2]。現有治療手段主要有鈣劑、維生素D、抑制破骨細胞的藥物或抑制骨吸收的藥物，以及選擇性雌激素受體調節劑等藥物治療手段，存在治療效果差、副反應較大、停藥后容易復發等缺點。因此，迫切需要開發新的骨質疏松癥治療手段[3]。
山茱萸是一種傳統中藥，從山茱萸的干燥成熟果實中提取[4-5]。研究表明，來自山茱萸的類脂糖成分具有許多藥理特性，如腎保護活性[6]、心肌保護活性[7]和抗骨質疏松作用等[8]。此外，由山茱萸組成的中藥配方可以有效促進成骨分化，減緩骨質疏松癥的進展[9-10]。莫諾苷（morroniside，MOR）是山茱萸中一個主要的生物活性類脂糖成分[11]，具有多種藥理作用，如促進血管再生[12]、減少腦梗死體積[13]、抑制血小板聚集[14]、促進神經細胞增殖和分化[15]、保護心肌細胞[16]、保護腎細胞[7]以及改善葡萄糖穩態等[6]。最近研究表明，MOR具有很好的抗骨質疏松生物活性，如增強成骨細胞的骨形成[17]和抑制破骨細胞分化[18]，但其發揮功能的分子靶點和相關機制尚不清楚。
成骨細胞是促進骨形成和礦化的關鍵細胞，在骨重建中發揮重要作用[19]。骨質疏松癥患者最基本的病理生理變化為成骨細胞增殖和分化減少[16]，因此，促進成骨細胞增殖和分化是預防和治療骨質疏松癥的關鍵。本研究擬采用小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1[20-21]來評估MOR的抗骨質疏松功能，探究MOR對于成骨細胞增殖與分化的影響，并進一步探索MOR作用的具體分子機制。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及主要試劑
小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1、MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14、CL-0378）購自武漢普諾塞生命科技有限公司。
MOR標準品（上海源葉生物科技有限公司），高效液相色譜級（≥98%）；α-MEM培養基、青霉素-鏈霉素溶液（HyClone公司，美國）；FBS、DMSO（重慶博培生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GAPDH抗體、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗體、腺苷A2A受體（A2A receptor，A2AR）抗體（武漢Proteintech科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）與逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；引物設計由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 實驗分組及方法
將MC3T3-E1細胞置于含10%FBS和1×102U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養基培養，每3天更換1次成骨誘導培養基（含1×10–8mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽的α-MEM培養基），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。取第4代細胞隨機分成6組，分別為對照組（A組）、MOR低劑量組（B組）、MOR中低劑量組（C組）、MOR中劑量組（D組）、MOR中高劑量組（E組）與MOR高劑量組（F組）。根據既往關于MOR應用于體外水平的文獻[22-24]與前期預實驗結果，本研究B～F組MOR給藥濃度分別為10、20、40、80、100 μmol/L。
1.3 觀測指標
1.3.1 CCK-8檢測細胞增殖情況
取第4代MC3T3-E1細胞以5×104個/孔接種至96孔板中，同上法分組，培養24 h后加入10 μL CCK-8檢測溶液，37℃孵育2 h后測定450 nm波長處吸光度（A）值。篩選細胞增殖能力最強組別的MOR濃度干預細胞，分別于培養24、48、72 h后同上法行CCK-8檢測。實驗重復3次，取均值。
1.3.2 茜素紅染色
取第4代MC3T3-E1細胞同上法分組，以成骨誘導培養基培養21 d后，4%甲醛固定，常規行茜素紅染色觀察礦化結節形成情況；然后用10%氯化十六烷基吡啶洗脫結合至鈣結節上的染料，使用酶標儀于562 nm波長處測定A值，以各組與A組比值代表其礦化結節數量。
1.3.3 RT-qPCR檢測
取第4代MC3T3-E1細胞以1×108個/孔密度接種于6孔板，同上法分組；24 h待細胞貼壁后，棄培養基；加入含細胞增殖能力最強組別MOR濃度的新鮮α-MEM培養基，培養24 h后棄培養基。RNA提取試劑盒提取總RNA，每組取1 μg反轉錄生成cDNA后采用RT-qPCR測定周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21）、細胞周期素D1（recombinant Cyclin D1，CCND1）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mRNA相對表達量。每個基因設3個復孔，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，45個循環。采用2–ΔΔCt法并以β-actin為內參計算上述基因的相對表達量。
另外，取第4代MC3T3-E1細胞以1×108個/孔密度接種于6孔板，同上法分組；24 h待細胞貼壁后，棄去培養基，加入含各組濃度MOR的新鮮成骨誘導培養基，每2天換液1次；培養7 d后棄去培養基，同上法測定ALP、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）、BMP-2、腺苷A2AR mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各引物序列
Table1.
The primer sequence for RT-qPCR
1.3.4 Western blot檢測
取第4代MC3T3-E1細胞，同上法分組，用裂解緩沖液（RIPA∶PMSF=1 000∶1）裂解細胞，然后置冰上30 min；4℃以12 000×g離心10 min，取上清液進行蛋白質濃度測定。通過8%～10%SDS-PAGE凝膠分離等量蛋白質，轉移至聚偏二氟乙烯膜，用TBST溶解、5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別用PBST稀釋OPN、RUNX2、腺苷A2AR一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶3 000）孵育。ECL化學發光系統顯色，使用Image J軟件分析各蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CCK-8檢測細胞增殖情況
培養24 h時，B～E組A值明顯高于A、F組，其中C組A值顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、F組間差異無統計學意義（P>0.05）；因此選用C組MOR濃度（20 μmol/L）進行后續CCK-8檢測。結果顯示，培養24、48、72 h C組A值明顯高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；且隨培養時間增加，C組A值亦顯著增加。見圖1。
圖1
CCK-8檢測細胞增殖情況
a. 各組培養24 h細胞活力；b. A、C組培養各時間點細胞活力
Figure1. CCK-8 assay for cell proliferationa. Cell viability at 24 hours of culture in each group; b. Cell viability at each time point of culture in groups A and C
2.2 茜素紅染色
成骨誘導21 d各組均可見橘紅色礦化結節，其中B、C組礦化結節數量明顯多于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
茜素紅染色觀察
a. 各組茜素紅染色 從左至右依次為A～E組；b. 定量檢測礦化結節數量
Figure2. Alizarin red staining observationa. Alizarin red staining of each group From left to right for groups A to E respectively; b. Quantitative detection of mineralized nodules
2.3 RT-qPCR檢測
加入MOR培養24 h后，C組P21、CCND1、PCNA mRNA相對表達量顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）。成骨誘導培養7 d，B～E組ALP、BMP-2、COL-1、腺苷A2AR mRNA相對表達量均顯著高于A組，C組ALP、BMP-2、COL-1 mRNA相對表達量顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
RT-qPCR檢測
a. 培養24 h后A、C組P21、CCND1、PCNA mRNA相對表達量；b～e. 各組成骨誘導分化7 d后ALP、BMP-2、COL-1、腺苷A2AR mRNA相對表達量
Figure3. RT-qPCR assaya. Relative expressions of P21, CCND1, PCNA mRNAs in groups A and C after 24 hours of culture; b-e. Relative expressions of ALP, BMP-2, COL-1, adenosine A2AR mRNAs in each group after 7 days of osteogenic differentiation
2.4 Western blot檢測
與A組比較，B、C組OPN、RUNX2蛋白相對表達量顯著提高，D、E組則明顯抑制，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間與D、E組間差異均無統計學意義（P>0.05）。B～E組腺苷A2AR蛋白相對表達量均顯著高于A組，C組顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4、5。
圖4
Western blot檢測電泳圖
1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 a. RUNX2、OPN；b. 腺苷A2AR
Figure4. Electrophoresis graph of Western blot assay1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E a. RUNX2, OPN; b. Adenosine A2AR
圖5
Western blot檢測各蛋白相對表達量
a. OPN；b. RUNX2；c. 腺苷A2AR
Figure5. Western blot detection of each protein expressiona. OPN; b. RUNX2; c. Adenosine A2AR
3 討論
MOR是一種環烯醚萜類化合物，是從補腎活血方劑中的主藥山茱萸中提取的有效成分；大量臨床試驗已證實補腎活血方劑可治療骨質疏松癥[25]。成骨細胞的增殖、分化與礦化對骨量的維持以及骨重建和骨形成至關重要。Sun等[23]發現MOR能夠通過與乙二醛酶作用，緩解高糖情況下的骨量流失；Yu等[26]發現MOR能通過抑制NF-κB信號通路來阻止軟骨細胞的凋亡和焦亡，達到治療骨關節炎的效果；Xiao等[22]發現MOR能夠通過PI3K/mTOR通路抑制骨關節炎中的自噬作用，產生保護關節軟骨的作用；MOR也能通過抑制炎癥因子釋放，阻止神經細胞凋亡和緩解神經性炎癥[27]，并產生神經保護作用[15]。同時，MOR具有心肌保護功能[14]，對急性心肌梗死具有一定治療作用[28]。本研究擬通過CCK-8、RT-qPCR、茜素紅染色、Western blot實驗研究MOR對成骨細胞增殖與分化的影響。
本研究采用MOR處理MC3T3-E1細胞，參考既往文獻[22-24]與前期預實驗結果，確定MOR的有效濃度為10～100 μmol/L；為了探究MOR最適宜濃度，將其分成低劑量組、中低劑量組、中劑量組、中高劑量組與高劑量組，對應的MOR濃度分別為10、20、40、80、100 μmol/L。結果顯示，與A組比較，C組20 μmol/L MOR能夠顯著促進MC3T3-E1細胞活力，且A、F組間差異無統計學意義，表明100 μmol/L MOR不存在促進細胞活力的作用，所以我們在后續實驗中不應用MOR高劑量組；同時，C組成骨特異性蛋白OPN、RUNX2表達量增多，成骨礦化結節也明顯增多，表明MOR可以在骨形成早期階段促進成骨細胞成熟，并能夠促進其礦化形成礦化結節。此外，D、E組40、80 μmol/L的MOR對于成骨特異性蛋白表達存在一定抑制作用，考慮為MOR劑量相對較高引起的毒性作用；CCK-8檢測也顯示40～100 μmol/L濃度組出現類似的促進細胞增殖能力降低情況。上述結果表明，MOR可以明顯促進成骨細胞前體細胞MC3T3-E1的增殖和成骨分化，且MOR作用的最適宜濃度為20 μmol/L。
為了探究MOR促進成骨細胞增殖與分化的具體作用機制，我們運用SwissTargetPrediction蛋白結合預測數據庫[29]分析MOR可能的結合靶點，分析顯示一共存在4個結合可能性>0.1的潛在MOR結合靶點。其中，腺苷A2AR通路是參與骨形成與分化的關鍵通路[30]。基于此，我們推測MOR可能通過與腺苷A2AR結合，從而促進成骨細胞增殖與成骨分化。為了探究MOR能否通過影響腺苷A2AR發揮其促進骨形成的功能，我們采用Western blot實驗檢測腺苷A2AR的表達情況，結果發現B～E組腺苷A2AR蛋白相對表達量均顯著高于A組，說明腺苷A2AR可能是MOR發揮其促骨分化和礦化的作用靶點。
腺苷是一種能夠在損傷和缺氧部位釋放的核苷，其能通過特定的細胞表面受體（腺苷A1、A2A、A2B、A3受體）調節細胞功能[31]。腺苷A2AR通過PKA依賴性激活，能夠抑制NF-κB核轉位，從而抑制破骨細胞形成，并能夠減輕磨損顆粒引發的炎癥反應[32-35]。同時，腺苷A2AR的激活也能提升骨保護素（RANKL的誘餌受體）的表達水平，并降低了RANKL、巨噬細胞集落刺激因子、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的表達水平[35-36]。在體外和各種體內模型中的研究發現，腺苷A2AR的激活能促進骨再生，同時減少破骨細胞分化[31，35-37]。研究表明腺苷A2B受體在成骨細胞分化和功能中發揮了重要作用[38]。腺苷A2AR的激活對成骨細胞分化[31，39]或MSCs向骨細胞分化也存在一定促進作用[40]。Katebi等[41]研究表明，通過腺苷A2AR作用的腺苷在促進小鼠BMSCs的增殖中起著關鍵作用。然而He等[31]研究表明，刺激或阻斷腺苷A1受體、腺苷A2AR和腺苷A3受體對人類成骨細胞的分化和礦化沒有影響。腺苷A2AR能夠激活Akt信號通路與促進β-catenin的核轉位，從而發揮促進成骨細胞成骨性分化的作用[30]。本研究發現MOR能夠促進MC3T3-E1細胞內腺苷A2AR的表達，說明MOR可能通過該信號通路發揮其促進成骨的作用。
綜上述，本研究通過CCK-8、RT-qPCR、茜素紅染色、Western blot以及蛋白質結合位點預測等手段得出MOR能夠促進成骨細胞增殖和分化，并驗證了其可能是通過與腺苷A2AR相互作用而發揮作用，但仍需要完善的動物實驗來驗證，并進一步明確MOR促進成骨分化與骨形成的具體作用機制。受限于現有研究手段，我們未探究MOR與腺苷A2AR的具體作用關系與分子機制。后續實驗可通過位點敲低或抑制等手段，深入研究MOR在體內外層面促進骨形成與重建能力的具體機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 董潤北：參與研究設計、分析數據及文章撰寫；楊厚志、羅干、李玉喬：參與研究設計；賈宇濤：采集、分析數據；羅干：參與起草文章；孫天威：對文章的知識性內容作批評性審閱，為研究提供行政、技術和材料支持
骨質疏松癥是一種以全身骨量和骨礦物密度降低引起的代謝性骨病，好發于絕經后婦女以及中老年男性[1]。近年來，骨質疏松癥發病率逐年升高，伴隨的病理性骨折發生也逐年增多，給患者和社會帶來巨大經濟負擔[2]。現有治療手段主要有鈣劑、維生素D、抑制破骨細胞的藥物或抑制骨吸收的藥物，以及選擇性雌激素受體調節劑等藥物治療手段，存在治療效果差、副反應較大、停藥后容易復發等缺點。因此，迫切需要開發新的骨質疏松癥治療手段[3]。
山茱萸是一種傳統中藥，從山茱萸的干燥成熟果實中提取[4-5]。研究表明，來自山茱萸的類脂糖成分具有許多藥理特性，如腎保護活性[6]、心肌保護活性[7]和抗骨質疏松作用等[8]。此外，由山茱萸組成的中藥配方可以有效促進成骨分化，減緩骨質疏松癥的進展[9-10]。莫諾苷（morroniside，MOR）是山茱萸中一個主要的生物活性類脂糖成分[11]，具有多種藥理作用，如促進血管再生[12]、減少腦梗死體積[13]、抑制血小板聚集[14]、促進神經細胞增殖和分化[15]、保護心肌細胞[16]、保護腎細胞[7]以及改善葡萄糖穩態等[6]。最近研究表明，MOR具有很好的抗骨質疏松生物活性，如增強成骨細胞的骨形成[17]和抑制破骨細胞分化[18]，但其發揮功能的分子靶點和相關機制尚不清楚。
成骨細胞是促進骨形成和礦化的關鍵細胞，在骨重建中發揮重要作用[19]。骨質疏松癥患者最基本的病理生理變化為成骨細胞增殖和分化減少[16]，因此，促進成骨細胞增殖和分化是預防和治療骨質疏松癥的關鍵。本研究擬采用小鼠成骨細胞前體細胞MC3T3-E1[20-21]來評估MOR的抗骨質疏松功能，探究MOR對于成骨細胞增殖與分化的影響，并進一步探索MOR作用的具體分子機制。
1 材料與方法
1.1 實驗細胞及主要試劑
小鼠胚胎成骨細胞前體細胞MC3T3-E1、MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14、CL-0378）購自武漢普諾塞生命科技有限公司。
MOR標準品（上海源葉生物科技有限公司），高效液相色譜級（≥98%）；α-MEM培養基、青霉素-鏈霉素溶液（HyClone公司，美國）；FBS、DMSO（重慶博培生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western blot凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；GAPDH抗體、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）抗體、腺苷A2A受體（A2A receptor，A2AR）抗體（武漢Proteintech科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）與逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；引物設計由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 實驗分組及方法
將MC3T3-E1細胞置于含10%FBS和1×102U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養基培養，每3天更換1次成骨誘導培養基（含1×10–8mol/L地塞米松、50 mg/L抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽的α-MEM培養基），于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。取第4代細胞隨機分成6組，分別為對照組（A組）、MOR低劑量組（B組）、MOR中低劑量組（C組）、MOR中劑量組（D組）、MOR中高劑量組（E組）與MOR高劑量組（F組）。根據既往關于MOR應用于體外水平的文獻[22-24]與前期預實驗結果，本研究B～F組MOR給藥濃度分別為10、20、40、80、100 μmol/L。
1.3 觀測指標
1.3.1 CCK-8檢測細胞增殖情況
取第4代MC3T3-E1細胞以5×104個/孔接種至96孔板中，同上法分組，培養24 h后加入10 μL CCK-8檢測溶液，37℃孵育2 h后測定450 nm波長處吸光度（A）值。篩選細胞增殖能力最強組別的MOR濃度干預細胞，分別于培養24、48、72 h后同上法行CCK-8檢測。實驗重復3次，取均值。
1.3.2 茜素紅染色
取第4代MC3T3-E1細胞同上法分組，以成骨誘導培養基培養21 d后，4%甲醛固定，常規行茜素紅染色觀察礦化結節形成情況；然后用10%氯化十六烷基吡啶洗脫結合至鈣結節上的染料，使用酶標儀于562 nm波長處測定A值，以各組與A組比值代表其礦化結節數量。
1.3.3 RT-qPCR檢測
取第4代MC3T3-E1細胞以1×108個/孔密度接種于6孔板，同上法分組；24 h待細胞貼壁后，棄培養基；加入含細胞增殖能力最強組別MOR濃度的新鮮α-MEM培養基，培養24 h后棄培養基。RNA提取試劑盒提取總RNA，每組取1 μg反轉錄生成cDNA后采用RT-qPCR測定周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，P21）、細胞周期素D1（recombinant Cyclin D1，CCND1）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）mRNA相對表達量。每個基因設3個復孔，反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，45個循環。采用2–ΔΔCt法并以β-actin為內參計算上述基因的相對表達量。
另外，取第4代MC3T3-E1細胞以1×108個/孔密度接種于6孔板，同上法分組；24 h待細胞貼壁后，棄去培養基，加入含各組濃度MOR的新鮮成骨誘導培養基，每2天換液1次；培養7 d后棄去培養基，同上法測定ALP、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type Ⅰ，COL-1）、BMP-2、腺苷A2AR mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各引物序列
Table1.
The primer sequence for RT-qPCR
1.3.4 Western blot檢測
取第4代MC3T3-E1細胞，同上法分組，用裂解緩沖液（RIPA∶PMSF=1 000∶1）裂解細胞，然后置冰上30 min；4℃以12 000×g離心10 min，取上清液進行蛋白質濃度測定。通過8%～10%SDS-PAGE凝膠分離等量蛋白質，轉移至聚偏二氟乙烯膜，用TBST溶解、5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別用PBST稀釋OPN、RUNX2、腺苷A2AR一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶3 000）孵育。ECL化學發光系統顯色，使用Image J軟件分析各蛋白相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CCK-8檢測細胞增殖情況
培養24 h時，B～E組A值明顯高于A、F組，其中C組A值顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）；A、F組間差異無統計學意義（P>0.05）；因此選用C組MOR濃度（20 μmol/L）進行后續CCK-8檢測。結果顯示，培養24、48、72 h C組A值明顯高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；且隨培養時間增加，C組A值亦顯著增加。見圖1。
圖1
CCK-8檢測細胞增殖情況
a. 各組培養24 h細胞活力；b. A、C組培養各時間點細胞活力
Figure1. CCK-8 assay for cell proliferationa. Cell viability at 24 hours of culture in each group; b. Cell viability at each time point of culture in groups A and C
2.2 茜素紅染色
成骨誘導21 d各組均可見橘紅色礦化結節，其中B、C組礦化結節數量明顯多于A組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
茜素紅染色觀察
a. 各組茜素紅染色 從左至右依次為A～E組；b. 定量檢測礦化結節數量
Figure2. Alizarin red staining observationa. Alizarin red staining of each group From left to right for groups A to E respectively; b. Quantitative detection of mineralized nodules
2.3 RT-qPCR檢測
加入MOR培養24 h后，C組P21、CCND1、PCNA mRNA相對表達量顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）。成骨誘導培養7 d，B～E組ALP、BMP-2、COL-1、腺苷A2AR mRNA相對表達量均顯著高于A組，C組ALP、BMP-2、COL-1 mRNA相對表達量顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
RT-qPCR檢測
a. 培養24 h后A、C組P21、CCND1、PCNA mRNA相對表達量；b～e. 各組成骨誘導分化7 d后ALP、BMP-2、COL-1、腺苷A2AR mRNA相對表達量
Figure3. RT-qPCR assaya. Relative expressions of P21, CCND1, PCNA mRNAs in groups A and C after 24 hours of culture; b-e. Relative expressions of ALP, BMP-2, COL-1, adenosine A2AR mRNAs in each group after 7 days of osteogenic differentiation
2.4 Western blot檢測
與A組比較，B、C組OPN、RUNX2蛋白相對表達量顯著提高，D、E組則明顯抑制，差異有統計學意義（P<0.05）；B、C組間與D、E組間差異均無統計學意義（P>0.05）。B～E組腺苷A2AR蛋白相對表達量均顯著高于A組，C組顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4、5。
圖4
Western blot檢測電泳圖
1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組 a. RUNX2、OPN；b. 腺苷A2AR
Figure4. Electrophoresis graph of Western blot assay1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E a. RUNX2, OPN; b. Adenosine A2AR
圖5
Western blot檢測各蛋白相對表達量
a. OPN；b. RUNX2；c. 腺苷A2AR
Figure5. Western blot detection of each protein expressiona. OPN; b. RUNX2; c. Adenosine A2AR
3 討論
MOR是一種環烯醚萜類化合物，是從補腎活血方劑中的主藥山茱萸中提取的有效成分；大量臨床試驗已證實補腎活血方劑可治療骨質疏松癥[25]。成骨細胞的增殖、分化與礦化對骨量的維持以及骨重建和骨形成至關重要。Sun等[23]發現MOR能夠通過與乙二醛酶作用，緩解高糖情況下的骨量流失；Yu等[26]發現MOR能通過抑制NF-κB信號通路來阻止軟骨細胞的凋亡和焦亡，達到治療骨關節炎的效果；Xiao等[22]發現MOR能夠通過PI3K/mTOR通路抑制骨關節炎中的自噬作用，產生保護關節軟骨的作用；MOR也能通過抑制炎癥因子釋放，阻止神經細胞凋亡和緩解神經性炎癥[27]，并產生神經保護作用[15]。同時，MOR具有心肌保護功能[14]，對急性心肌梗死具有一定治療作用[28]。本研究擬通過CCK-8、RT-qPCR、茜素紅染色、Western blot實驗研究MOR對成骨細胞增殖與分化的影響。
本研究采用MOR處理MC3T3-E1細胞，參考既往文獻[22-24]與前期預實驗結果，確定MOR的有效濃度為10～100 μmol/L；為了探究MOR最適宜濃度，將其分成低劑量組、中低劑量組、中劑量組、中高劑量組與高劑量組，對應的MOR濃度分別為10、20、40、80、100 μmol/L。結果顯示，與A組比較，C組20 μmol/L MOR能夠顯著促進MC3T3-E1細胞活力，且A、F組間差異無統計學意義，表明100 μmol/L MOR不存在促進細胞活力的作用，所以我們在后續實驗中不應用MOR高劑量組；同時，C組成骨特異性蛋白OPN、RUNX2表達量增多，成骨礦化結節也明顯增多，表明MOR可以在骨形成早期階段促進成骨細胞成熟，并能夠促進其礦化形成礦化結節。此外，D、E組40、80 μmol/L的MOR對于成骨特異性蛋白表達存在一定抑制作用，考慮為MOR劑量相對較高引起的毒性作用；CCK-8檢測也顯示40～100 μmol/L濃度組出現類似的促進細胞增殖能力降低情況。上述結果表明，MOR可以明顯促進成骨細胞前體細胞MC3T3-E1的增殖和成骨分化，且MOR作用的最適宜濃度為20 μmol/L。
為了探究MOR促進成骨細胞增殖與分化的具體作用機制，我們運用SwissTargetPrediction蛋白結合預測數據庫[29]分析MOR可能的結合靶點，分析顯示一共存在4個結合可能性>0.1的潛在MOR結合靶點。其中，腺苷A2AR通路是參與骨形成與分化的關鍵通路[30]。基于此，我們推測MOR可能通過與腺苷A2AR結合，從而促進成骨細胞增殖與成骨分化。為了探究MOR能否通過影響腺苷A2AR發揮其促進骨形成的功能，我們采用Western blot實驗檢測腺苷A2AR的表達情況，結果發現B～E組腺苷A2AR蛋白相對表達量均顯著高于A組，說明腺苷A2AR可能是MOR發揮其促骨分化和礦化的作用靶點。
腺苷是一種能夠在損傷和缺氧部位釋放的核苷，其能通過特定的細胞表面受體（腺苷A1、A2A、A2B、A3受體）調節細胞功能[31]。腺苷A2AR通過PKA依賴性激活，能夠抑制NF-κB核轉位，從而抑制破骨細胞形成，并能夠減輕磨損顆粒引發的炎癥反應[32-35]。同時，腺苷A2AR的激活也能提升骨保護素（RANKL的誘餌受體）的表達水平，并降低了RANKL、巨噬細胞集落刺激因子、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的表達水平[35-36]。在體外和各種體內模型中的研究發現，腺苷A2AR的激活能促進骨再生，同時減少破骨細胞分化[31，35-37]。研究表明腺苷A2B受體在成骨細胞分化和功能中發揮了重要作用[38]。腺苷A2AR的激活對成骨細胞分化[31，39]或MSCs向骨細胞分化也存在一定促進作用[40]。Katebi等[41]研究表明，通過腺苷A2AR作用的腺苷在促進小鼠BMSCs的增殖中起著關鍵作用。然而He等[31]研究表明，刺激或阻斷腺苷A1受體、腺苷A2AR和腺苷A3受體對人類成骨細胞的分化和礦化沒有影響。腺苷A2AR能夠激活Akt信號通路與促進β-catenin的核轉位，從而發揮促進成骨細胞成骨性分化的作用[30]。本研究發現MOR能夠促進MC3T3-E1細胞內腺苷A2AR的表達，說明MOR可能通過該信號通路發揮其促進成骨的作用。
綜上述，本研究通過CCK-8、RT-qPCR、茜素紅染色、Western blot以及蛋白質結合位點預測等手段得出MOR能夠促進成骨細胞增殖和分化，并驗證了其可能是通過與腺苷A2AR相互作用而發揮作用，但仍需要完善的動物實驗來驗證，并進一步明確MOR促進成骨分化與骨形成的具體作用機制。受限于現有研究手段，我們未探究MOR與腺苷A2AR的具體作用關系與分子機制。后續實驗可通過位點敲低或抑制等手段，深入研究MOR在體內外層面促進骨形成與重建能力的具體機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 董潤北：參與研究設計、分析數據及文章撰寫；楊厚志、羅干、李玉喬：參與研究設計；賈宇濤：采集、分析數據；羅干：參與起草文章；孫天威：對文章的知識性內容作批評性審閱，為研究提供行政、技術和材料支持
