引用本文： 黃孟全, 樊簡, 馬子揚, 李靖, 魯亞杰. 預血管化多孔β-磷酸三鈣組織工程骨的構建及其生物學效應評價. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(5): 625-632. doi: 10.7507/1002-1892.202202010 復制
近年來，組織工程技術的發展為骨缺損修復提供了新方向[1-3]， 然而組織工程支架植入后血管化不足成為影響其廣泛用于骨缺損修復的主要原因。研究表明，組織工程骨植入后距離宿主毛細血管200 μm以上的區域血管再生匱乏，支架內部易形成“空心”區域，存在營養支持缺乏和代謝產物堆積的問題，直接影響修復效果[4]。構建預血管化組織工程支架，使其植入體內后能迅速與宿主血管對接，是解決組織工程骨存活、提高骨修復能力的有效途徑[5]。基于血管種子細胞和成骨種子細胞構建預血管化組織工程骨，有望打破支架內部血管化匱乏狀態，促進組織修復進程[6-7]。但目前關于預血管化組織工程骨植入體內后血管轉歸，以及早期血管化進程的定量評估研究報道較少。
本研究擬采用內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）聯合BMSCs與多孔β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）生物陶瓷支架直接接觸共培養的方法，構建預血管化組織工程骨，然后將其植入兔股骨髁缺損模型，采用本課題組前期建立的“骨內微血管可視化研究模型”技術[8-9]對生物陶瓷支架的血管化生物效應進行定量評估，以期為解決組織工程骨內部血管化不足的難題奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
4月齡新西蘭大白兔12只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。多孔β-TCP生物陶瓷支架（上海貝奧路生物材料有限公司），支架呈圓柱體，直徑6 mm、高12 mm，孔隙率70%±15%，大孔直徑400～500 μm，連通孔直徑120～160 μm。
兔外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）、EGM-2MV培養基（Lonza公司，瑞士）；CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC（Sigma公司，德國）；CD133、VEGF受體 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、CD34（北京博奧森生物技術有限公司）；熒光染色劑Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ（上海懋康生物科技有限公司）；BMSCs成骨、成脂誘導培養基（蘇州賽業生物科技有限公司）；Matrigel基質膠（BD公司，美國）。
倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；掃描電鏡（日立公司，日本）；Micro-CT（Bruker公司，德國）。
1.2 細胞培養及鑒定
1.2.1 細胞分離及培養
取12只兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，用骨髓穿刺針于髂后上棘穿刺，每只抽取骨髓液3～5 mL。等量PBS稀釋，將稀釋的骨髓液按照1∶1比例加至兔淋巴細胞分離液上層，以離心半徑15 cm、2 000 r/min 離心30 min。吸取單個核細胞層，加入含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、 5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。培養48 h后貼壁細胞為BMSCs，收集BMSCs以DMEM培養基繼續培養。另外收集未貼壁細胞，更換為含4%FBS、1%青霉素/鏈霉素的EGM-2MV培養基培養，用于擴增EPCs。待BMSCs、EPCs生長融合至70%～80%時，按照1∶3比例傳代，取第3代細胞用于后續實驗。
1.2.2 細胞鑒定
① 取第3代細胞，采用流式細胞儀檢測表面分子標志物，其中BMSCs表面分子標志物包括CD29、CD90、CD34、CD45、CD11b；EPCs包括CD34、CD133、VEGFR-2。② BMSCs分別行成骨、成脂誘導培養4、3周后，對應行茜素紅和油紅O染色，觀察細胞成骨和成脂分化能力。③ EPCs行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色，熒光顯微鏡下觀察紅色為Dil-Ac-LDL陽性染色，綠色為FITC-UEA-Ⅰ陽性染色，黃色為Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性染色，計算雙陽性染色細胞比例，觀察細胞吞噬功能。
1.3 EPCs/BMSCs共培養對EPCs成管能力的影響
將Matrigel基質膠置于4℃冰箱過夜溶解后，加入預冷的48孔板（100 μL/孔），37℃孵育1 h使基質膠凝固。0.25%胰蛋白酶消化EPCs和BMSCs，制備細胞懸液；EPCs/BMSCs組將兩種細胞以2∶1比例接種于48孔板（EPCs為4×104個/孔、BMSCs為2×104個/孔）共培養，加入以1∶1 比例混合的DMEM、EGM-2MV培養基；EPCs組將EPCs以4×104個/孔接種于48孔板，采用EGM-2MV培養基培養，作為對照；每組重復3孔。于3、6、9 h倒置相差顯微鏡下觀察EPCs成管效應；3 h為血管形成上升期、9 h為消退期，故本研究選擇6 h隨機取3個視野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）計數管型樣結構、分支以及測量成管總長度。
1.4 預血管化組織工程骨構建及生物學評估
將多孔β-TCP生物陶瓷支架浸沒于DMEM培養基中2 h，備用。將EPCs/BMSCs（EPCs 1×106 個，BMSCs 5×105個）接種于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs/BMSCs組），同上法選擇對應培養基共培養，制備預血管化組織工程骨。7 d后取出置于多聚甲醛固定，掃描電鏡觀察細胞黏附狀態；經FITC-CD31標記EPCs和鬼筆環肽染色細胞骨架，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在支架上的黏附、增殖和成管情況。以EPCs（1×106個）接種于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs 組）作為對照。
1.5 預血管化組織工程骨植入體內早期血管化觀測
1.5.1 兔股骨髁缺損模型建立及分組
將12只新西蘭大白兔隨機分為實驗組及對照組，每組6只。實驗組參照1.4方法制備自體來源的預血管化組織工程骨。兩組動物同上法麻醉后，于右后肢作股骨外側縱切口，暴露股骨髁，采用高速磨鉆制備直徑6 mm、深12 mm骨缺損，分別植入多孔β-TCP生物陶瓷支架（對照組）及預血管化組織工程骨（實驗組）修復。術后連續 3 d注射青霉素預防感染，不限制動物活動，正常飲食、水。見圖1。
圖1
動物模型制備
a. 骨缺損模型；b. 骨缺損修復模型
Figure1. Schematic diagram of animal model preparationa. Bone defect model; b. Bone defect repair model
1.5.2 支架內新生血管可視化研究
采用“骨內微血管可視化研究模型”技術[8-9]對植入支架的新生血管進行量化評估。術后4、8周兩組分別取3只動物，同上法麻醉后作腹部正中切口，顯露腹主動、靜脈，結扎上述血管近心端，經腹主動脈遠心端依次灌注肝素生理鹽水（100 U/L）1 000 mL、10%中性甲醛固定液300 mL、MicrofillMV-117灌注液50 mL，對下肢血管進行清洗、固定和灌注。然后，經耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥鈉（>100 mg/kg）處死動物，置于4℃冰箱中過夜。取術側股骨下段標本，置于10%中性甲醛固定72 h后，14%EDTA 脫鈣液脫鈣。采用Micro-CT對血管進行掃描和三維重建，數據導入Image-Pro Plus 6.0軟件，測算血管數量、血管直徑和面積分數。將掃描后的標本硬組織包埋，制備厚度為300 μm的切片，拋光后采用熒光背景下血管成像方法（激發光為藍色光，波長430～460 nm）觀察支架中新生血管分布及形態。熒光背景下骨及纖維組織為綠色、血管為紅色。
1.6 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行方差齊性檢驗和正態性檢驗，滿足方差齊性且呈正態分布時，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞培養及鑒定
流式細胞儀檢測示第3代BMSCs高表達CD29、CD90，低表達CD34、CD11b、CD45；第3代EPCs高表達CD133、VEGFR-2、CD34。見圖2。BMSCs成骨誘導培養4周，茜素紅染色見散在的紅色結節，提示局部鈣鹽沉積，鈣結節形成；成脂誘導培養3周，光鏡下可見部分細胞內有少量小脂滴形成，成串珠樣排列，個別細胞內脂滴較大，油紅O染色后脂滴呈紅色。見圖3。EPCs經Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色后，熒光顯微鏡下可見雙陽性染色細胞，陽性率為96.3%±1.5%。見圖4。
圖2
流式細胞儀檢測
a. BMSCs；b. EPCs
Figure2. Flow cytometry detectiona. BMSCs; b. EPCs
圖3
BMSCs功能鑒定（×40）
a. 成骨誘導后茜素紅染色；b. 成脂誘導后油紅O染色
Figure3. BMSCs functional identification (×40)a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Oil red O staining after lipogenesis induction
圖4
EPCs功能鑒定(熒光顯微鏡×40)
a. Dil-Ac-LDL染色；b. FITC-UEA-Ⅰ染色；c. 二者重疊
Figure4. EPCs functional identification (Fluorescence microscope×40)a. Dil-Ac-LDL staining; b. FITC-UEA-Ⅰ staining; c. Merge
2.2 EPCs/BMSCs共培養對EPCs成管能力的影響
培養3 h，兩組可見部分細胞變形拉長向周圍延伸，細胞間相互連接并形成少量管型樣結構。培養6 h，與EPCs組相比， EPCs/BMSCs組形成了更為廣泛的管型樣結構，且在EPCs形成的管型樣結構周圍有大量BMSCs。EPCs/BMSCs組及EPCs組形成的管型樣結構分別為（59.4±13.3）、（47.0±8.3）個，分支為（122.0±11.9）、（107.7±16.7）個，成管總長度為（11.1±1.1）、（10.2±0.7）cm，組間差異均有統計學意義（t=?2.704，P=0.014；t=?2.201，P=0.040；t=?2.317，P=0.031）。培養9 h，兩組均可見部分細胞聚集成團，管型樣結構減少，上述現象EPCs組更明顯。見圖5。
圖5
各組成管實驗觀察（倒置相差顯微鏡×40）
從左至右依次為培養3、6、9 h a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure5. Observation of lumen formation in each group (Inverted phase contrast microscope×40)From left to right for 3, 6, and 9 hours, respectivelya. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3 預血管化組織工程骨生物學評估
2.3.1 掃描電鏡觀察
支架表面：EPCs組細胞貼附于支架表面，呈膜片結構，與支架結合欠佳，支架部分區域無細胞覆蓋；EPCs/BMSCs組細胞緊緊貼附于支架表面，細胞更密集，細胞形成的膜片更厚，呈雙層結構，下層為EPCs細胞膜片，上層BMSCs伸出偽足貼附于EPCs細胞膜片上。
支架內部：EPCs組支架內部細胞較表面明顯減少，細胞貼孔內壁生長，穿過內連接進入另一孔隙，內連接處細胞與孔內貼壁細胞可形成管型樣結構。EPCs/BMSCs組孔內貼壁細胞明顯較多，多集中在內連接處周圍，孔與孔之間細胞連接較好，可見柱狀管型樣結構且長于EPCs組。見圖6。
圖6
細胞與支架共培養 7 d 掃描電鏡觀察（×500）
左：支架表面 右：支架內部 a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure6. Scanning electron microscopy observation of cells and scaffolds after 7 days of co-culture (×500)Left: Surface of scaffold Right: Interior of scaffold a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3.2 激光共聚焦顯微鏡觀察
EPCs/BMSCs組兩種細胞交織排列并在孔內貼壁生長，細胞更密集，形成膜片明顯厚于EPCs組，可見管型樣結構形成。見圖7。
圖7
細胞與支架共培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察（×100）
從左至右為CD31染色、鬼筆環肽染色、二者重疊 a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure7. Laser scanning confocal microscopy observation of cells and scaffolds at 7 days of co-culture (×100)From left to right for CD31 staining, phalloidin staining, and merge, respectively a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.4 預血管化組織工程骨植入體內早期血管化
2.4.1 Micro-CT觀測
術后4、8周標本脫鈣后，Micro-CT掃描可以清晰顯示支架內部血管網絡。術后4周，兩組標本均可見支架殘影，實驗組支架邊緣新生血管較多，血管數量從支架邊緣向中心逐漸減少；對照組僅在支架邊緣見散在分布的新生血管，近中心處無血管形成。 術后8周，兩組支架內部均有大量血管形成，僅對照組可見少量支架殘影。見圖8。 除術后4周兩組面積分數差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點實驗組血管數量、血管直徑以及面積分數均優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。
圖8
兩組Micro-CT觀察血管形成情況
左：對照組 右：實驗組 a. 術后4周；b. 術后8周
Figure8. Micro-CT observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation; b. Eight weeks after implantation
表1
兩組血管可視化研究相關指標比較（n=3，
）
Table1.
Comparison of related indicators of vascular visualization between the two groups (n=3, 
)
2.4.2 熒光背景成像觀察
術后4周，兩組均可見新生血管由骨皮質內的次級血管進入支架后形成分支，向不同方向延伸。實驗組支架周邊新生血管較多，部分新生血管長入支架內部深度可達5～6個大孔；對照組新生血管僅在支架邊緣，數量較少。8周時，兩組新生血管均已貫穿支架內部，實驗組血管更密、管徑更大，血管分支數較多，趨向成熟。見圖9。
圖9
熒光顯微鏡下觀察兩組新生血管情況
左：對照組 右：實驗組 a. 術后4周（×10）；b. 術后8周（×10）；c. 術后8周局部放大（×40）
Figure9. Fluorescence microscope observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation (×10); b. Eight weeks after implantation (×10); c. Local magnification of the image at 8 weeks after implantation (×40)
3 討論
血管化在骨愈合和修復過程中起著重要作用，新生血管可以將成骨前體細胞、相關信號分子、營養物質攜帶至局部微環境中，并清除代謝產物，從而為骨再生修復提供一種有利的生理代謝微環境[10]。既往研究表明，組織工程骨的血管化程度與新生骨組織數量和質量成正相關，血管生成細胞與成骨細胞通過復雜的內在分子機制相互作用，共同調節微血管穩態以及成骨-破骨之間的平衡[11]。因此，構建高效的組織工程骨，必須同時兼顧血管化和成骨兩者因素[12]。
目前，組織工程骨血管化策略主要有利用生長因子促進血管生成、添加血管生成相關細胞、顯微外科技術移植血管、支架預血管化等。在上述方法中，基于血管種子細胞和成骨細胞共培養構建預血管化組織工程骨越來越受重視[13-14]。BMSCs因具有多向分化性能，已被作為種子細胞廣泛應用于構建組織工程骨，但仍未克服支架內部血管化不良的缺陷[15]。既往研究多將人臍帶靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作為血管種子細胞，加快骨修復血管化進程，但HUVECs分化能力有限，且臨床實際應用中其來源受到極大限制[16-17]。EPCs是內皮細胞的前體細胞，可分化為成熟血管內皮細胞而生成血管，是組織工程支架血管化最具有潛力的種子細胞之一[18]。研究表明，可利用BMSCs和EPCs共培養的協同效應提高組織工程骨血管生成和骨修復能力[19]。Liang等[20]研究發現，BMSCs和EPCs在體外共培養后，血管生成相關基因和成骨相關基因表達水平顯著升高，復合支架植入體內后可見更多的新生血管和新生骨組織。也有研究證實，BMSCs的存在有利于EPCs在組織工程支架上的微血管網絡生成，且BMSCs也可以作為血管周細胞維持新生血管功能的穩定性[21]。因此，本研究選擇自體EPCs和BMSCs進行直接接觸共培養，體外構建預血管化組織工程骨。體外實驗結果顯示BMSCs的存在顯著提升了 EPCs成管能力，二者協同作用，促進了種子細胞在骨修復支架的黏附和功能發揮，表明EPCs/BMSCs共培養體系有助于體外預血管化組織工程骨的構建。體內實驗結果顯示預血管化組織工程骨的血管參數評估明顯優于對照組，植入8周后支架內部已基本完成整體血管化，提示預血管化組織工程骨植入體內后可以縮短新生血管網絡形成時間，提高支架內部血管化進程。這對于骨修復支架，尤其是大塊組織工程骨支架的活化和骨組織再生具有重要意義。Kawecki等[22]采用預血管化類骨組織修復大鼠顱骨缺損，結果顯示該方法顯著提高了移植骨的存活率和骨缺損修復效果。
組織工程骨支架內部血管化的精確定量評估一直是骨組織工程研究難點之一。既往研究采用免疫熒光/免疫組織化學染色技術對血管進行標記，但無法對血管全貌以及功能形態進行評價[23]。本課題組前期研究提出了基于Microfill血管灌注、Micro-CT掃描重建以及熒光背景下血管成像的“骨內微血管可視化研究模型” 構建技術[8-9]。基于該方法，本次研究體內實驗對構建的預血管化組織工程骨內微血管形成參數進行了定量評估，進一步表明了BMSCs/EPCs共培養對骨修復支架血管化進程具有顯著促進作用。有研究指出，EPCs可在體外形成預構型血管網絡，植入體內后可迅速與宿主血管形成對接，直接改善支架內部的血管參數，也可通過釋放血管生成因子招募宿主EPCs形成新生血管，間接改善支架內部的血管參數[24]。值得注意的是，本研究所采取的BMSCs和EPCs均來源于自體骨髓，應用于人體時不存在倫理問題，且操作簡便，具有很好的臨床轉化潛能。
本研究存在如下局限性：① 研究關注于骨修復血管化進程，旨在評估 EPCs/BMSCs共培養構建的預血管化組織工程骨植入動物體內后內部血運恢復效果。由于研究采取的熒光背景下血管成像技術涉及到骨脫鈣過程，因此未對骨組織進行定量評估。② 本研究尚未闡明EPCs/BMSCs促進血管化進程的具體分子機制，有待進一步深入研究。
綜上述，EPCs/BMSCs共培養可促進種子細胞的黏附、增殖和成管等生物學行為，利用二者構建的預血管化組織工程骨在植入體內后能促進骨修復血管化進程。該方法為骨缺損尤其是大段骨缺損的修復重建提供了新思路。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計學分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準（KY20193269-1）；實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2019-001
作者貢獻聲明 黃孟全：研究設計、實施及文章撰寫；樊簡、馬子揚：參與研究實施及數據收集；魯亞杰、李靖：研究設計、評估以及文章審閱
近年來，組織工程技術的發展為骨缺損修復提供了新方向[1-3]， 然而組織工程支架植入后血管化不足成為影響其廣泛用于骨缺損修復的主要原因。研究表明，組織工程骨植入后距離宿主毛細血管200 μm以上的區域血管再生匱乏，支架內部易形成“空心”區域，存在營養支持缺乏和代謝產物堆積的問題，直接影響修復效果[4]。構建預血管化組織工程支架，使其植入體內后能迅速與宿主血管對接，是解決組織工程骨存活、提高骨修復能力的有效途徑[5]。基于血管種子細胞和成骨種子細胞構建預血管化組織工程骨，有望打破支架內部血管化匱乏狀態，促進組織修復進程[6-7]。但目前關于預血管化組織工程骨植入體內后血管轉歸，以及早期血管化進程的定量評估研究報道較少。
本研究擬采用內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）聯合BMSCs與多孔β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）生物陶瓷支架直接接觸共培養的方法，構建預血管化組織工程骨，然后將其植入兔股骨髁缺損模型，采用本課題組前期建立的“骨內微血管可視化研究模型”技術[8-9]對生物陶瓷支架的血管化生物效應進行定量評估，以期為解決組織工程骨內部血管化不足的難題奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
4月齡新西蘭大白兔12只，體質量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。多孔β-TCP生物陶瓷支架（上海貝奧路生物材料有限公司），支架呈圓柱體，直徑6 mm、高12 mm，孔隙率70%±15%，大孔直徑400～500 μm，連通孔直徑120～160 μm。
兔外周血淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養基、FBS（GIBCO公司，美國）、EGM-2MV培養基（Lonza公司，瑞士）；CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC（Sigma公司，德國）；CD133、VEGF受體 2（VEGF receptor 2，VEGFR-2）、CD34（北京博奧森生物技術有限公司）；熒光染色劑Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-Ⅰ（上海懋康生物科技有限公司）；BMSCs成骨、成脂誘導培養基（蘇州賽業生物科技有限公司）；Matrigel基質膠（BD公司，美國）。
倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Zeiss公司，德國）；流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；掃描電鏡（日立公司，日本）；Micro-CT（Bruker公司，德國）。
1.2 細胞培養及鑒定
1.2.1 細胞分離及培養
取12只兔經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，用骨髓穿刺針于髂后上棘穿刺，每只抽取骨髓液3～5 mL。等量PBS稀釋，將稀釋的骨髓液按照1∶1比例加至兔淋巴細胞分離液上層，以離心半徑15 cm、2 000 r/min 離心30 min。吸取單個核細胞層，加入含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、 5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。培養48 h后貼壁細胞為BMSCs，收集BMSCs以DMEM培養基繼續培養。另外收集未貼壁細胞，更換為含4%FBS、1%青霉素/鏈霉素的EGM-2MV培養基培養，用于擴增EPCs。待BMSCs、EPCs生長融合至70%～80%時，按照1∶3比例傳代，取第3代細胞用于后續實驗。
1.2.2 細胞鑒定
① 取第3代細胞，采用流式細胞儀檢測表面分子標志物，其中BMSCs表面分子標志物包括CD29、CD90、CD34、CD45、CD11b；EPCs包括CD34、CD133、VEGFR-2。② BMSCs分別行成骨、成脂誘導培養4、3周后，對應行茜素紅和油紅O染色，觀察細胞成骨和成脂分化能力。③ EPCs行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色，熒光顯微鏡下觀察紅色為Dil-Ac-LDL陽性染色，綠色為FITC-UEA-Ⅰ陽性染色，黃色為Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙陽性染色，計算雙陽性染色細胞比例，觀察細胞吞噬功能。
1.3 EPCs/BMSCs共培養對EPCs成管能力的影響
將Matrigel基質膠置于4℃冰箱過夜溶解后，加入預冷的48孔板（100 μL/孔），37℃孵育1 h使基質膠凝固。0.25%胰蛋白酶消化EPCs和BMSCs，制備細胞懸液；EPCs/BMSCs組將兩種細胞以2∶1比例接種于48孔板（EPCs為4×104個/孔、BMSCs為2×104個/孔）共培養，加入以1∶1 比例混合的DMEM、EGM-2MV培養基；EPCs組將EPCs以4×104個/孔接種于48孔板，采用EGM-2MV培養基培養，作為對照；每組重復3孔。于3、6、9 h倒置相差顯微鏡下觀察EPCs成管效應；3 h為血管形成上升期、9 h為消退期，故本研究選擇6 h隨機取3個視野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件（Media Cybernetics公司，美國）計數管型樣結構、分支以及測量成管總長度。
1.4 預血管化組織工程骨構建及生物學評估
將多孔β-TCP生物陶瓷支架浸沒于DMEM培養基中2 h，備用。將EPCs/BMSCs（EPCs 1×106 個，BMSCs 5×105個）接種于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs/BMSCs組），同上法選擇對應培養基共培養，制備預血管化組織工程骨。7 d后取出置于多聚甲醛固定，掃描電鏡觀察細胞黏附狀態；經FITC-CD31標記EPCs和鬼筆環肽染色細胞骨架，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在支架上的黏附、增殖和成管情況。以EPCs（1×106個）接種于多孔β-TCP生物陶瓷支架（EPCs 組）作為對照。
1.5 預血管化組織工程骨植入體內早期血管化觀測
1.5.1 兔股骨髁缺損模型建立及分組
將12只新西蘭大白兔隨機分為實驗組及對照組，每組6只。實驗組參照1.4方法制備自體來源的預血管化組織工程骨。兩組動物同上法麻醉后，于右后肢作股骨外側縱切口，暴露股骨髁，采用高速磨鉆制備直徑6 mm、深12 mm骨缺損，分別植入多孔β-TCP生物陶瓷支架（對照組）及預血管化組織工程骨（實驗組）修復。術后連續 3 d注射青霉素預防感染，不限制動物活動，正常飲食、水。見圖1。
圖1
動物模型制備
a. 骨缺損模型；b. 骨缺損修復模型
Figure1. Schematic diagram of animal model preparationa. Bone defect model; b. Bone defect repair model
1.5.2 支架內新生血管可視化研究
采用“骨內微血管可視化研究模型”技術[8-9]對植入支架的新生血管進行量化評估。術后4、8周兩組分別取3只動物，同上法麻醉后作腹部正中切口，顯露腹主動、靜脈，結扎上述血管近心端，經腹主動脈遠心端依次灌注肝素生理鹽水（100 U/L）1 000 mL、10%中性甲醛固定液300 mL、MicrofillMV-117灌注液50 mL，對下肢血管進行清洗、固定和灌注。然后，經耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥鈉（>100 mg/kg）處死動物，置于4℃冰箱中過夜。取術側股骨下段標本，置于10%中性甲醛固定72 h后，14%EDTA 脫鈣液脫鈣。采用Micro-CT對血管進行掃描和三維重建，數據導入Image-Pro Plus 6.0軟件，測算血管數量、血管直徑和面積分數。將掃描后的標本硬組織包埋，制備厚度為300 μm的切片，拋光后采用熒光背景下血管成像方法（激發光為藍色光，波長430～460 nm）觀察支架中新生血管分布及形態。熒光背景下骨及纖維組織為綠色、血管為紅色。
1.6 統計學方法
采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料行方差齊性檢驗和正態性檢驗，滿足方差齊性且呈正態分布時，數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞培養及鑒定
流式細胞儀檢測示第3代BMSCs高表達CD29、CD90，低表達CD34、CD11b、CD45；第3代EPCs高表達CD133、VEGFR-2、CD34。見圖2。BMSCs成骨誘導培養4周，茜素紅染色見散在的紅色結節，提示局部鈣鹽沉積，鈣結節形成；成脂誘導培養3周，光鏡下可見部分細胞內有少量小脂滴形成，成串珠樣排列，個別細胞內脂滴較大，油紅O染色后脂滴呈紅色。見圖3。EPCs經Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色后，熒光顯微鏡下可見雙陽性染色細胞，陽性率為96.3%±1.5%。見圖4。
圖2
流式細胞儀檢測
a. BMSCs；b. EPCs
Figure2. Flow cytometry detectiona. BMSCs; b. EPCs
圖3
BMSCs功能鑒定（×40）
a. 成骨誘導后茜素紅染色；b. 成脂誘導后油紅O染色
Figure3. BMSCs functional identification (×40)a. Alizarin red staining after osteogenic induction; b. Oil red O staining after lipogenesis induction
圖4
EPCs功能鑒定(熒光顯微鏡×40)
a. Dil-Ac-LDL染色；b. FITC-UEA-Ⅰ染色；c. 二者重疊
Figure4. EPCs functional identification (Fluorescence microscope×40)a. Dil-Ac-LDL staining; b. FITC-UEA-Ⅰ staining; c. Merge
2.2 EPCs/BMSCs共培養對EPCs成管能力的影響
培養3 h，兩組可見部分細胞變形拉長向周圍延伸，細胞間相互連接并形成少量管型樣結構。培養6 h，與EPCs組相比， EPCs/BMSCs組形成了更為廣泛的管型樣結構，且在EPCs形成的管型樣結構周圍有大量BMSCs。EPCs/BMSCs組及EPCs組形成的管型樣結構分別為（59.4±13.3）、（47.0±8.3）個，分支為（122.0±11.9）、（107.7±16.7）個，成管總長度為（11.1±1.1）、（10.2±0.7）cm，組間差異均有統計學意義（t=?2.704，P=0.014；t=?2.201，P=0.040；t=?2.317，P=0.031）。培養9 h，兩組均可見部分細胞聚集成團，管型樣結構減少，上述現象EPCs組更明顯。見圖5。
圖5
各組成管實驗觀察（倒置相差顯微鏡×40）
從左至右依次為培養3、6、9 h a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure5. Observation of lumen formation in each group (Inverted phase contrast microscope×40)From left to right for 3, 6, and 9 hours, respectivelya. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3 預血管化組織工程骨生物學評估
2.3.1 掃描電鏡觀察
支架表面：EPCs組細胞貼附于支架表面，呈膜片結構，與支架結合欠佳，支架部分區域無細胞覆蓋；EPCs/BMSCs組細胞緊緊貼附于支架表面，細胞更密集，細胞形成的膜片更厚，呈雙層結構，下層為EPCs細胞膜片，上層BMSCs伸出偽足貼附于EPCs細胞膜片上。
支架內部：EPCs組支架內部細胞較表面明顯減少，細胞貼孔內壁生長，穿過內連接進入另一孔隙，內連接處細胞與孔內貼壁細胞可形成管型樣結構。EPCs/BMSCs組孔內貼壁細胞明顯較多，多集中在內連接處周圍，孔與孔之間細胞連接較好，可見柱狀管型樣結構且長于EPCs組。見圖6。
圖6
細胞與支架共培養 7 d 掃描電鏡觀察（×500）
左：支架表面 右：支架內部 a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure6. Scanning electron microscopy observation of cells and scaffolds after 7 days of co-culture (×500)Left: Surface of scaffold Right: Interior of scaffold a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.3.2 激光共聚焦顯微鏡觀察
EPCs/BMSCs組兩種細胞交織排列并在孔內貼壁生長，細胞更密集，形成膜片明顯厚于EPCs組，可見管型樣結構形成。見圖7。
圖7
細胞與支架共培養7 d激光共聚焦顯微鏡觀察（×100）
從左至右為CD31染色、鬼筆環肽染色、二者重疊 a. EPCs組；b. EPCs/BMSCs組
Figure7. Laser scanning confocal microscopy observation of cells and scaffolds at 7 days of co-culture (×100)From left to right for CD31 staining, phalloidin staining, and merge, respectively a. EPCs group; b. EPCs/BMSCs group
2.4 預血管化組織工程骨植入體內早期血管化
2.4.1 Micro-CT觀測
術后4、8周標本脫鈣后，Micro-CT掃描可以清晰顯示支架內部血管網絡。術后4周，兩組標本均可見支架殘影，實驗組支架邊緣新生血管較多，血管數量從支架邊緣向中心逐漸減少；對照組僅在支架邊緣見散在分布的新生血管，近中心處無血管形成。 術后8周，兩組支架內部均有大量血管形成，僅對照組可見少量支架殘影。見圖8。 除術后4周兩組面積分數差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點實驗組血管數量、血管直徑以及面積分數均優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。
圖8
兩組Micro-CT觀察血管形成情況
左：對照組 右：實驗組 a. 術后4周；b. 術后8周
Figure8. Micro-CT observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation; b. Eight weeks after implantation
表1
兩組血管可視化研究相關指標比較（n=3，）
Table1.
Comparison of related indicators of vascular visualization between the two groups (n=3, )
2.4.2 熒光背景成像觀察
術后4周，兩組均可見新生血管由骨皮質內的次級血管進入支架后形成分支，向不同方向延伸。實驗組支架周邊新生血管較多，部分新生血管長入支架內部深度可達5～6個大孔；對照組新生血管僅在支架邊緣，數量較少。8周時，兩組新生血管均已貫穿支架內部，實驗組血管更密、管徑更大，血管分支數較多，趨向成熟。見圖9。
圖9
熒光顯微鏡下觀察兩組新生血管情況
左：對照組 右：實驗組 a. 術后4周（×10）；b. 術后8周（×10）；c. 術后8周局部放大（×40）
Figure9. Fluorescence microscope observation of neovascularization in both groupsLeft: Control group Right: Experimental group a. Four weeks after implantation (×10); b. Eight weeks after implantation (×10); c. Local magnification of the image at 8 weeks after implantation (×40)
3 討論
血管化在骨愈合和修復過程中起著重要作用，新生血管可以將成骨前體細胞、相關信號分子、營養物質攜帶至局部微環境中，并清除代謝產物，從而為骨再生修復提供一種有利的生理代謝微環境[10]。既往研究表明，組織工程骨的血管化程度與新生骨組織數量和質量成正相關，血管生成細胞與成骨細胞通過復雜的內在分子機制相互作用，共同調節微血管穩態以及成骨-破骨之間的平衡[11]。因此，構建高效的組織工程骨，必須同時兼顧血管化和成骨兩者因素[12]。
目前，組織工程骨血管化策略主要有利用生長因子促進血管生成、添加血管生成相關細胞、顯微外科技術移植血管、支架預血管化等。在上述方法中，基于血管種子細胞和成骨細胞共培養構建預血管化組織工程骨越來越受重視[13-14]。BMSCs因具有多向分化性能，已被作為種子細胞廣泛應用于構建組織工程骨，但仍未克服支架內部血管化不良的缺陷[15]。既往研究多將人臍帶靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）作為血管種子細胞，加快骨修復血管化進程，但HUVECs分化能力有限，且臨床實際應用中其來源受到極大限制[16-17]。EPCs是內皮細胞的前體細胞，可分化為成熟血管內皮細胞而生成血管，是組織工程支架血管化最具有潛力的種子細胞之一[18]。研究表明，可利用BMSCs和EPCs共培養的協同效應提高組織工程骨血管生成和骨修復能力[19]。Liang等[20]研究發現，BMSCs和EPCs在體外共培養后，血管生成相關基因和成骨相關基因表達水平顯著升高，復合支架植入體內后可見更多的新生血管和新生骨組織。也有研究證實，BMSCs的存在有利于EPCs在組織工程支架上的微血管網絡生成，且BMSCs也可以作為血管周細胞維持新生血管功能的穩定性[21]。因此，本研究選擇自體EPCs和BMSCs進行直接接觸共培養，體外構建預血管化組織工程骨。體外實驗結果顯示BMSCs的存在顯著提升了 EPCs成管能力，二者協同作用，促進了種子細胞在骨修復支架的黏附和功能發揮，表明EPCs/BMSCs共培養體系有助于體外預血管化組織工程骨的構建。體內實驗結果顯示預血管化組織工程骨的血管參數評估明顯優于對照組，植入8周后支架內部已基本完成整體血管化，提示預血管化組織工程骨植入體內后可以縮短新生血管網絡形成時間，提高支架內部血管化進程。這對于骨修復支架，尤其是大塊組織工程骨支架的活化和骨組織再生具有重要意義。Kawecki等[22]采用預血管化類骨組織修復大鼠顱骨缺損，結果顯示該方法顯著提高了移植骨的存活率和骨缺損修復效果。
組織工程骨支架內部血管化的精確定量評估一直是骨組織工程研究難點之一。既往研究采用免疫熒光/免疫組織化學染色技術對血管進行標記，但無法對血管全貌以及功能形態進行評價[23]。本課題組前期研究提出了基于Microfill血管灌注、Micro-CT掃描重建以及熒光背景下血管成像的“骨內微血管可視化研究模型” 構建技術[8-9]。基于該方法，本次研究體內實驗對構建的預血管化組織工程骨內微血管形成參數進行了定量評估，進一步表明了BMSCs/EPCs共培養對骨修復支架血管化進程具有顯著促進作用。有研究指出，EPCs可在體外形成預構型血管網絡，植入體內后可迅速與宿主血管形成對接，直接改善支架內部的血管參數，也可通過釋放血管生成因子招募宿主EPCs形成新生血管，間接改善支架內部的血管參數[24]。值得注意的是，本研究所采取的BMSCs和EPCs均來源于自體骨髓，應用于人體時不存在倫理問題，且操作簡便，具有很好的臨床轉化潛能。
本研究存在如下局限性：① 研究關注于骨修復血管化進程，旨在評估 EPCs/BMSCs共培養構建的預血管化組織工程骨植入動物體內后內部血運恢復效果。由于研究采取的熒光背景下血管成像技術涉及到骨脫鈣過程，因此未對骨組織進行定量評估。② 本研究尚未闡明EPCs/BMSCs促進血管化進程的具體分子機制，有待進一步深入研究。
綜上述，EPCs/BMSCs共培養可促進種子細胞的黏附、增殖和成管等生物學行為，利用二者構建的預血管化組織工程骨在植入體內后能促進骨修復血管化進程。該方法為骨缺損尤其是大段骨缺損的修復重建提供了新思路。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計學分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍空軍軍醫大學第一附屬醫院倫理委員會批準（KY20193269-1）；實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2019-001
作者貢獻聲明 黃孟全：研究設計、實施及文章撰寫；樊簡、馬子揚：參與研究實施及數據收集；魯亞杰、李靖：研究設計、評估以及文章審閱
