引用本文： 王東芝, 郭益冰, 黃?, 朱必文, 潘浩鵬, 王志偉. 殼寡糖構建的胰島仿生微環境通過降低細胞內活性氧保護胰島免受低氧誘導損傷. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(5): 633-642. doi: 10.7507/1002-1892.202201063 復制
胰島移植是一種很有希望治愈1型糖尿病的方法[1]。在胰島分離、培養及移植后早期，胰島因缺氧而產生氧化應激[2]。氧化應激所產生的活性氧可以與活細胞中的生物分子反應，進而通過膜脂質過氧化、蛋白質氧化和核酸裂解，導致細胞活性和功能的廣泛損害[3-4]。因此，構建適宜的胰島微環境，能夠減少低氧導致的胰島內活性氧的產生，是保護胰島活性與功能和避免移植失敗的理想方法[5-6]。
目前，通過構建生物材料改善低氧引起的胰島損傷得到越來越多關注。Lee等[7]通過將過氧化鈣（CaO2）與聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）混合制備了一種產氧支架，結果顯示PDMS+CaO2支架中的胰島表現出更高的細胞活力和胰島素分泌能力。Liang等[8]在此基礎上，將PDMS和CaO2制備成微珠，并進一步整合到大孔PDMS支架中，用于提高胰島的移植效果。Razavi等[9]將CaO2摻入基于膠原蛋白的冷凍凝膠生物支架中，制作了一種新型產氧生物材料，通過持續產氧提高移植胰島的活力。目前大多數研究都集中在構建產氧生物材料用于胰島移植，但是CaO2的性質并不穩定，不能控制產氧速度和氧氣濃度，同時體內安全性和長期療效還有待進一步研究。
殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）能有效清除自由基，降低細胞內活性氧水平從而保護細胞活性[10-11]。此外，COS來源于殼聚糖，性質穩定，具有優異的生物安全性。因此，COS為改善移植胰島活性帶來了希望。但是COS作為單一成分不具備構建細胞外基質的能力，因此需要與水凝膠相結合。透明質酸和明膠是不同組織細胞外基質的主要成分，具有優異的生物相容性[12-13]。經甲基丙烯酸酯改性后的甲基丙烯酰化透明質酸（hyaluronic acid methacryloyl，HAMA）和甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）作為生物墨水，目前被廣泛應用于水凝膠3D打印[14-16]。GelMA可以為水凝膠提供足夠的結構支撐，HAMA為細胞的包埋和增殖提供了適宜的環境。重要的是，兩者可以在相同的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸鋰作用下，通過紫外線照射快速成膠，實現無縫的結構整合[17]。
本研究將COS加入GelMA/HAMA中，制備不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠，用于胰島仿生微環境的構建，體外共培養評價GelMA/HAMA/COS水凝膠對低氧條件下胰島內活性氧的抑制作用以及對胰島活性和功能的保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、細胞及主要試劑、儀器
8周齡SPF級雄性健康SD大鼠50只，體質量200～250 g，購自南通大學實驗動物中心。小鼠上皮樣成纖維細胞（L929細胞）購自上海ATCC細胞庫。
COS（上海源葉生物科技有限公司）；GelMA、HAMA（蘇州永沁泉智能設備有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；膠原酶P、大鼠/小鼠胰島素ELISA試劑盒（Sigma公司，美國）；FBS、DMEM/F12完全培養基、Hank液、淋巴細胞分離液（GIBCO公司，美國）；活性氧試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；雙硫腙、克-林二氏重碳酸鹽緩沖液（KRB緩沖液）、活/死細胞染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；胰島素抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；抗胰高血糖素抗體（Abcam公司，英國）。掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；流變儀（ThermoFisher Scientific公司，德國）；ELISA 酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 GelMA/HAMA/COS水凝膠相關觀測
1.2.1 GelMA/HAMA/COS水凝膠的制備
將6%（W/V）GelMA溶液與4%（W/V）HAMA溶液均勻混合，加入等體積不同濃度的COS溶液，通過紫外線（365 nm，185 mW/cm2）照射20 s成膠。以組織培養板為對照組，COS濃度分別為0、1、5、10、20 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠為實驗組。
1.2.2 GelMA/HAMA/COS水凝膠的表征
通過掃描電鏡觀察水凝膠微觀形態并測量孔徑；流變儀檢測水凝膠儲能模量（G’）和耗能模量（G’’），反映水凝膠的成膠能力；測量水凝膠的接觸角，以評估水凝膠的親水性和對細胞的黏附性。以上檢測樣本量均為3。
1.2.3 GelMA/HAMA/COS水凝膠的細胞毒性檢測
將1 mL GelMA/HAMA/COS水凝膠加入5 mL 完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12培養液）中，37℃浸泡24 h，得到水凝膠浸出液。將L929細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，用GelMA/HAMA/COS水凝膠浸出液培養48 h，加入10 μL CCK-8溶液后使用ELISA酶標儀于450 nm處檢測吸光度（A）值（n=5），表示細胞活力。
1.3 大鼠胰島相關觀測
1.3.1 胰島的提取、培養與鑒定
取SD大鼠行腹部正中切口，充分暴露胰腺，近十二指腸乳頭處結扎膽總管，于膽總管起始部注射膠原酶P 10 mL，沿充盈胰腺邊緣剪斷系膜，完整取出胰腺。37℃水浴消化15 min，Hank液終止消化并洗滌；8 mL淋巴細胞分離液吹打混勻后，上層加入2 mL Hank液，以離心半徑15 cm、2 000 r/min離心30 min獲得胰島，光鏡下觀察胰島形態。用完全培養基培養胰島，雙硫腙染色對胰島純度進行鑒定。
1.3.2 葡萄糖刺激胰島素釋放（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）實驗
采用GSIS實驗檢測大鼠胰島的胰島素分泌功能。將提取的胰島用完全培養基穩定培養24 h，經PBS溶液沖洗后加入KRB緩沖液孵育2 h，依次加入低糖（5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）的KRB緩沖液孵育30 min；收集上清，根據大鼠/小鼠胰島素ELISA試劑盒說明，利用ELISA酶標儀于450 nm處檢測A值（n=3），通過擬合曲線計算胰島素分泌量。
1.3.3 低氧對胰島活性的影響
將提取的胰島在低氧（1%O2）下分別培養24、48、72 h，使用鈣黃綠素（Calcein）-乙酰甲氧基甲酯（acetyl methyl，AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）進行活/死細胞染色檢測胰島活性（n=3），并計算死細胞比例，以未經低氧處理的胰島作為對照。
1.4 GelMA/HAMA/COS水凝膠對大鼠胰島活性和功能的影響
1.4.1 包封胰島的GelMA/HAMA/COS水凝膠制備
將200 μL含不同濃度COS的無菌GelMA/HAMA/COS混合液與200%±10%胰島當量混合，得到均勻的水凝膠和細胞混懸液，注入底部直徑8 mm的圓形模具，紫外線（365 nm，185 mW/cm2）照射20 s成膠，得到包封胰島的GelMA/HAMA/COS水凝膠，置入24孔板，加入完全培養基后于37℃細胞培養箱內培養。
1.4.2 水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響
將不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠中的胰島在常氧（20%O2）和低氧（1%O2）條件下培養48 h，通過活性氧試劑盒檢測細胞內積累的活性氧水平。按照1∶1 000用無血清培養液稀釋活性氧熒光探針（DCFH-DA），使其終濃度為10 μmol/L，加入胰島后37℃細胞培養箱內孵育20 min，通過熒光顯微鏡對細胞內DCFH-DA進行檢測和統計。以單純的GelMA/HAMA水凝膠作為對照組（n=3）。
1.4.3 水凝膠對低氧下胰島活性的影響
將大鼠胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h，使用Calcein-AM/PI進行活/死細胞染色檢測胰島活性（n=3）。
1.4.4 水凝膠對低氧下胰島功能的影響
實驗分為3組，單純胰島作為對照（A組），GelMA/HAMA水凝膠為B組，GelMA/HAMA/COS水凝膠為C組；其中C組COS濃度的選擇結合水凝膠表征以及活性氧和活/死細胞染色結果確定。① 免疫熒光染色：胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h，4%多聚甲醛固定和5%驢血清封閉，加入一抗兔抗胰島素抗體（1∶100）和小鼠抗胰高血糖素抗體（1∶400）4℃孵育過夜，二抗山羊抗小鼠IgG（AlexaFluor?488）（1∶500）和驢抗兔IgG（AlexaFluor?555）（1∶500）室溫孵育1 h，DAPI染核。檢測相關基因表達水平，并使用Image J軟件對相關基因的熒光強度進行量化。② GSIS實驗：胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h后，同1.3.2方法計算低糖和高糖條件下各組胰島素分泌量，檢測各組胰島對葡萄糖刺激的反應性。
1.5 統計學方法
應用GraphPad Prism 8統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GelMA/HAMA/COS水凝膠相關觀測
① 掃描電鏡觀察：GelMA/HAMA/COS水凝膠內部呈現多孔結構，單純GelMA/HAMA水凝膠（0 mg/mL COS濃度組）孔徑較小，隨著COS濃度增加，水凝膠孔徑逐漸增大且凝膠纖維增粗，COS濃度為20 mg/mL時水凝膠孔徑顯著大于其余各濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。② 流變儀檢測：所有樣品給予紫外線照射后，G’和G’’均迅速升高，G’保持在1×104 Pa左右，G’’保持在1～100 Pa之間；G’大于G’’，提示成功形成水凝膠。③ 接觸角檢測：隨著COS濃度增加，水凝膠的接觸角稍有增加，親水性稍有下降，但各組接觸角均<90°。COS濃度為5、10、20 mg/mL的水凝膠接觸角大于COS濃度為0 mg/mL的水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。④ 細胞毒性檢測：CCK-8檢測示，不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠A值差異均無統計學意義（P>0.05），均無明顯細胞毒性，能夠促進水凝膠表面生長的L929細胞黏附和增殖。見圖1。
圖1
GelMA/HAMA/COS水凝膠的表征和細胞毒性檢測
a. 掃描電鏡觀察（×300） 從左至右依次為0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組；b. 流變儀檢測 從左至右依次為0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組；c. 水凝膠孔徑；d. 接觸角檢測；e. 接觸角定量檢測；f. CCK-8法檢測細胞毒性
Figure1. Characterization and cytotoxicity detection of GelMA/HAMA/COS hydrogelsa. Scanning electron microscopy observation (×300) From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups; b. Rheological analysis From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups, respectively; c. Hydrogel pore size; d. Contact angle measurement; e. Quantitative detection of contact angle; f. CCK-8 assay for cytotoxicity
2.2 大鼠胰島相關觀測
① 胰島提取及鑒定：大鼠胰島在光鏡下呈類圓形，細胞質豐富，為黃褐色，半透明，邊緣清晰。雙硫腙染色示超過95%的胰島變為棕紅色，提示胰島有較高純度。見圖2。② GSIS實驗：胰島對低糖和高糖的刺激均具有較好響應，胰島素分泌量分別為（14.81±1.04）ng/mL和（28.01±2.07）ng/mL，差異有統計學意義（t=9.896，P<0.001）。③ 低氧對胰島活性的影響：隨著低氧培養時間延長，胰島活性逐漸降低，死細胞逐漸增多（圖3）。低氧處理24、48、72 h時，死細胞比例分別達17.00%±1.42%、29.39%±2.84%、43.70%±3.25%，與對照組0.89%±0.71%比較差異均有統計學意義（P<0.001）。
圖2
大鼠胰島形態及鑒定（×10）
a. 胰島形態；b. 雙硫腙染色
Figure2. Morphology and identification of rat islets (×10)a. Islet morphology; b. Dithizone staining
圖3
活/死細胞染色觀察低氧對大鼠胰島活性的影響（熒光顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞及二者合并 a. 對照組；b. 低氧處理24 h；c. 低氧處理48 h；d. 低氧處理72 h
Figure3. Live/dead cell staining to detect the effect of hypoxia on rat islet viability (Fluorescence microscope×40)From top to bottom for live cells, dead cells, and merge, respectively a. Control group; b. Hypoxic treatment for 24 hours; c. Hypoxic treatment for 48 hours; d. Hypoxic treatment for 72 hours
2.3 GelMA/HAMA/COS水凝膠對大鼠胰島活性和功能的影響
2.3.1 水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響
胰島在常氧和低氧狀態下都會產生活性氧，其中低氧條件下活性氧更多。對照組單純的GelMA/HAMA水凝膠并不能降低細胞活性氧，而GelMA/HAMA/COS水凝膠降低細胞內活性氧具有COS濃度依賴性，隨著COS濃度的增高活性氧清除能力逐漸增強。COS濃度達到5 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠能降低常氧條件下胰島內的活性氧，COS濃度達到10 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠顯著降低了低氧條件下胰島內的活性氧水平。見圖4。
圖4
水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為對照組及0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組a. 常氧條件；b. 低氧條件
Figure4. Effect of hydrogel on reactive oxygen species in islet under hypoxia (Fluorescence microscope×40)From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups, respectively a. Normoxic conditions; b. Hypoxic conditions
2.3.2 水凝膠對低氧下胰島活性的影響
GelMA/HAMA/COS水凝膠能提高胰島活性，且與COS濃度成正相關，隨著COS濃度增高胰島死細胞數量逐漸減少，當COS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時，未見明顯凋亡細胞。見圖5。因此，結合水凝膠表征以及活性氧和活死細胞染色結果，選擇COS濃度為10 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠進行后續功能實驗。
圖5
活/死細胞染色觀察低氧對各組水凝膠中大鼠胰島活性的影響（熒光顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞及二者合并 a. 對照組；b. 0 mg/mL COS濃度組；c. 1 mg/mL COS濃度組；d. 5 mg/mL COS濃度組；e. 10 mg/mL COS濃度組；f. 20 mg/mL COS濃度組
Figure5. Live/dead cells staining to detect the effect of hypoxia on the activity of rat islet in hydrogel (Fluorescence microscope×40)From top to bottom for live cells, dead cells, and merge, respectively a. Control group; b. 0 mg/mL COS concentration group; c. 1 mg/mL COS concentration group; d. 5 mg/mL COS concentration group; e. 10 mg/mL COS concentration group; f. 20 mg/mL COS concentration group2.3.3 水凝膠對低氧下胰島功能的影響
① 免疫熒光染色：C組胰島素基因和胰高血糖素基因表達量明顯高于A、B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B組胰高血糖素基因表達量明顯高于A組（P<0.05），但A、B組間胰島素基因表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6、7a。② GSIS實驗：低糖及高糖刺激下，C組胰島素分泌量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖7b。
圖6
免疫熒光染色觀察水凝膠對低氧下胰島功能的影響（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為胰島素、胰高血糖素、細胞核及三者合并 a. A組；b. B組；c. C組
Figure6. Effect of hydrogel on the function of islet under hypoxic condition by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for insulin, glucagon, nucleus, and merge, respectively a. Group A; ? b. Group B; ? c. Group C
圖7
水凝膠對低氧下胰島功能的影響
a. 免疫熒光染色定量檢測；b. GSIS實驗檢測胰島素分泌量
Figure7. The effect of hydrogel on islet function under hypoxiaa. Quantitative detection by immunofluorescence staining; b. GSIS assay to detect insulin secretion
3 討論
1型糖尿病是一種選擇性破壞胰島β細胞的自身免疫性疾病[18]。皮下胰島素注射作為臨床治療最常用的方法，不能實現血糖的生理性調控和延緩長期糖尿病的并發癥，因此胰島移植作為內源性胰島素分泌系統是一種有效的β細胞替代療法[19]。然而，在胰島分離和移植過程中，細胞外基質的破壞會使胰島長期處于缺氧狀態，并且胰島缺乏抗氧化酶的表達，缺氧條件下極易受到活性氧的攻擊[20]。此外，胰島具有高度的代謝活性，胰島素的分泌需要大量氧供來維持[21]。因此，缺氧是導致胰島損傷和移植失敗的主要原因，改善缺氧引起的氧化應激損傷是提高胰島移植效率的關鍵[22]。
COS可以直接清除細胞內的羥自由基、超氧陰離子等反應性自由基，抑制DNA損傷，從而保護細胞免受氧化應激損傷[23-24]。COS的抗氧化能力可能和抑制絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，并激活Nrf2信號通路有關[25]。研究表明COS能顯著降低雙氧水誘導的細胞凋亡和細胞內活性氧的產生，同時提高細胞的抗氧化能力，通過調節Nrf2/ARE信號通路保護細胞免受氧化損傷和凋亡[11]。在COS改善阿霉素誘導的心臟毒性的研究中，COS可以通過降低細胞內活性氧，增加線粒體膜電位和降低凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達，從而逆轉阿霉素引起的細胞活力下降，保護心肌細胞免受阿霉素誘導的凋亡[26]。因此，我們實驗將COS和胰島相結合，利用COS的抗氧化能力改善缺氧誘導的胰島損傷。但是，COS作為單一成分不能完整重建胰島細胞外基質仿生微環境，因此需要水凝膠參與構建細胞外基質的結構部分。
GelMA和HAMA因其較低的細胞毒性和快速光固化成膠特性，目前廣泛應用于細胞移植載體[27]、3D生物打印[28]以及類器官的構建[29]等。結合GelMA的力學性能和HAMA親水性的優點，構建的GelMA/HAMA水凝膠同時具備良好的機械性能和優異親水性，有利于維持3D打印水凝膠的基本結構和形態，同時為細胞體內移植后提供適宜和濕潤的微環境。此外，GelMA/HAMA水凝膠的多孔結構利于細胞黏附和營養物質運輸。雖然GelMA和HAMA構建的復合水凝膠作為細胞外基質能夠為胰島移植提供力學支撐和細胞黏附位點，但并不能改善長期移植面臨的細胞凋亡和功能失活。因此，我們實驗創新性地將COS與GelMA/HAMA水凝膠相結合，發揮各自優勢，構建具有抗氧化功能的GelMA/HAMA/COS復合水凝膠，用于模擬胰島細胞外基質仿生微環境。
本研究中構建了模擬體內胰島仿生微環境的GelMA/HAMA/COS水凝膠。掃描電鏡結果顯示，與GelMA/HAMA相比，實驗組隨COS濃度增加，凝膠纖維增粗且孔徑增大，纖維增粗利于胰島附著，胰島的大小為50～200 μm，較小孔徑不利于胰島形態的維持，當COS濃度達到10 mg/mL和20 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠孔徑大小足以容納絕大多數胰島。接觸角實驗結果顯示，隨著COS濃度增加，水凝膠的親水性有所降低，雖然COS有很好的水溶性，但是其親水性弱于GelMA和HAMA。但即使是COS濃度為20 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠，其接觸角仍然<90°，具有很好的生物相容性。
我們將提取的胰島在低氧條件下培養，證明了低氧會持續誘導胰島凋亡。使用GelMA/HAMA/COS水凝膠進一步培養胰島，活性氧染色結果表明，COS下調了胰島在低氧條件下活性氧的生成，且活性氧的清除能力與COS濃度成正相關。活/死細胞染色結果表明，細胞內活性氧的積累是導致胰島細胞凋亡的重要原因，且活性氧水平和細胞凋亡數量具有正相關性，而COS能降低活性氧引起的細胞凋亡。其中，COS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠在常氧和低氧下均能有效清除細胞內的活性氧，從而改善胰島活性。結合水凝膠表征的實驗結果，COS濃度為10 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠是模擬胰島仿生微環境的最佳濃度。通過胰島免疫熒光染色和GSIS實驗進一步提示該COS濃度水凝膠對胰島功能具有積極影響。
綜上述，GelMA/HAMA/COS水凝膠具有良好的生物相容性和活性氧清除能力，在低氧和常氧條件下均能通過減輕活性氧提高胰島的存活和功能。因此，該復合水凝膠可用于胰島仿生微環境構建，提高胰島功能和移植效果。本研究不僅為開發抗氧化的COS生物材料提供了新的線索，而且為提高功能性移植物的存活率和擴大臨床胰島移植的可用性提供了理論依據。后續將進一步通過3D打印構建胰島類器官，并通過轉錄組測序、分子生物學功能實驗闡明其可能的作用機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南通大學動物實驗倫理委員會批準（S20210201-907），研究過程遵循國際通行的動物福利和倫理準則；實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0046
作者貢獻聲明 王東芝、郭益冰：實驗操作、論文撰寫；朱必文、潘浩鵬：數據整理、統計學分析；黃?、王志偉：課題設計、研究指導、論文修改、經費支持
胰島移植是一種很有希望治愈1型糖尿病的方法[1]。在胰島分離、培養及移植后早期，胰島因缺氧而產生氧化應激[2]。氧化應激所產生的活性氧可以與活細胞中的生物分子反應，進而通過膜脂質過氧化、蛋白質氧化和核酸裂解，導致細胞活性和功能的廣泛損害[3-4]。因此，構建適宜的胰島微環境，能夠減少低氧導致的胰島內活性氧的產生，是保護胰島活性與功能和避免移植失敗的理想方法[5-6]。
目前，通過構建生物材料改善低氧引起的胰島損傷得到越來越多關注。Lee等[7]通過將過氧化鈣（CaO2）與聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）混合制備了一種產氧支架，結果顯示PDMS+CaO2支架中的胰島表現出更高的細胞活力和胰島素分泌能力。Liang等[8]在此基礎上，將PDMS和CaO2制備成微珠，并進一步整合到大孔PDMS支架中，用于提高胰島的移植效果。Razavi等[9]將CaO2摻入基于膠原蛋白的冷凍凝膠生物支架中，制作了一種新型產氧生物材料，通過持續產氧提高移植胰島的活力。目前大多數研究都集中在構建產氧生物材料用于胰島移植，但是CaO2的性質并不穩定，不能控制產氧速度和氧氣濃度，同時體內安全性和長期療效還有待進一步研究。
殼寡糖（chitosan oligosaccharide，COS）能有效清除自由基，降低細胞內活性氧水平從而保護細胞活性[10-11]。此外，COS來源于殼聚糖，性質穩定，具有優異的生物安全性。因此，COS為改善移植胰島活性帶來了希望。但是COS作為單一成分不具備構建細胞外基質的能力，因此需要與水凝膠相結合。透明質酸和明膠是不同組織細胞外基質的主要成分，具有優異的生物相容性[12-13]。經甲基丙烯酸酯改性后的甲基丙烯酰化透明質酸（hyaluronic acid methacryloyl，HAMA）和甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）作為生物墨水，目前被廣泛應用于水凝膠3D打印[14-16]。GelMA可以為水凝膠提供足夠的結構支撐，HAMA為細胞的包埋和增殖提供了適宜的環境。重要的是，兩者可以在相同的光引發劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸鋰作用下，通過紫外線照射快速成膠，實現無縫的結構整合[17]。
本研究將COS加入GelMA/HAMA中，制備不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠，用于胰島仿生微環境的構建，體外共培養評價GelMA/HAMA/COS水凝膠對低氧條件下胰島內活性氧的抑制作用以及對胰島活性和功能的保護作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、細胞及主要試劑、儀器
8周齡SPF級雄性健康SD大鼠50只，體質量200～250 g，購自南通大學實驗動物中心。小鼠上皮樣成纖維細胞（L929細胞）購自上海ATCC細胞庫。
COS（上海源葉生物科技有限公司）；GelMA、HAMA（蘇州永沁泉智能設備有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）（Dojindo公司，日本）；膠原酶P、大鼠/小鼠胰島素ELISA試劑盒（Sigma公司，美國）；FBS、DMEM/F12完全培養基、Hank液、淋巴細胞分離液（GIBCO公司，美國）；活性氧試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；雙硫腙、克-林二氏重碳酸鹽緩沖液（KRB緩沖液）、活/死細胞染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；胰島素抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）；抗胰高血糖素抗體（Abcam公司，英國）。掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；流變儀（ThermoFisher Scientific公司，德國）；ELISA 酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 GelMA/HAMA/COS水凝膠相關觀測
1.2.1 GelMA/HAMA/COS水凝膠的制備
將6%（W/V）GelMA溶液與4%（W/V）HAMA溶液均勻混合，加入等體積不同濃度的COS溶液，通過紫外線（365 nm，185 mW/cm2）照射20 s成膠。以組織培養板為對照組，COS濃度分別為0、1、5、10、20 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠為實驗組。
1.2.2 GelMA/HAMA/COS水凝膠的表征
通過掃描電鏡觀察水凝膠微觀形態并測量孔徑；流變儀檢測水凝膠儲能模量（G’）和耗能模量（G’’），反映水凝膠的成膠能力；測量水凝膠的接觸角，以評估水凝膠的親水性和對細胞的黏附性。以上檢測樣本量均為3。
1.2.3 GelMA/HAMA/COS水凝膠的細胞毒性檢測
將1 mL GelMA/HAMA/COS水凝膠加入5 mL 完全培養基（含10%FBS的DMEM/F12培養液）中，37℃浸泡24 h，得到水凝膠浸出液。將L929細胞以5 000個/孔接種于96孔板中，用GelMA/HAMA/COS水凝膠浸出液培養48 h，加入10 μL CCK-8溶液后使用ELISA酶標儀于450 nm處檢測吸光度（A）值（n=5），表示細胞活力。
1.3 大鼠胰島相關觀測
1.3.1 胰島的提取、培養與鑒定
取SD大鼠行腹部正中切口，充分暴露胰腺，近十二指腸乳頭處結扎膽總管，于膽總管起始部注射膠原酶P 10 mL，沿充盈胰腺邊緣剪斷系膜，完整取出胰腺。37℃水浴消化15 min，Hank液終止消化并洗滌；8 mL淋巴細胞分離液吹打混勻后，上層加入2 mL Hank液，以離心半徑15 cm、2 000 r/min離心30 min獲得胰島，光鏡下觀察胰島形態。用完全培養基培養胰島，雙硫腙染色對胰島純度進行鑒定。
1.3.2 葡萄糖刺激胰島素釋放（glucose-stimulated insulin secretion，GSIS）實驗
采用GSIS實驗檢測大鼠胰島的胰島素分泌功能。將提取的胰島用完全培養基穩定培養24 h，經PBS溶液沖洗后加入KRB緩沖液孵育2 h，依次加入低糖（5 mmol/L葡萄糖）和高糖（30 mmol/L葡萄糖）的KRB緩沖液孵育30 min；收集上清，根據大鼠/小鼠胰島素ELISA試劑盒說明，利用ELISA酶標儀于450 nm處檢測A值（n=3），通過擬合曲線計算胰島素分泌量。
1.3.3 低氧對胰島活性的影響
將提取的胰島在低氧（1%O2）下分別培養24、48、72 h，使用鈣黃綠素（Calcein）-乙酰甲氧基甲酯（acetyl methyl，AM）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）進行活/死細胞染色檢測胰島活性（n=3），并計算死細胞比例，以未經低氧處理的胰島作為對照。
1.4 GelMA/HAMA/COS水凝膠對大鼠胰島活性和功能的影響
1.4.1 包封胰島的GelMA/HAMA/COS水凝膠制備
將200 μL含不同濃度COS的無菌GelMA/HAMA/COS混合液與200%±10%胰島當量混合，得到均勻的水凝膠和細胞混懸液，注入底部直徑8 mm的圓形模具，紫外線（365 nm，185 mW/cm2）照射20 s成膠，得到包封胰島的GelMA/HAMA/COS水凝膠，置入24孔板，加入完全培養基后于37℃細胞培養箱內培養。
1.4.2 水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響
將不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠中的胰島在常氧（20%O2）和低氧（1%O2）條件下培養48 h，通過活性氧試劑盒檢測細胞內積累的活性氧水平。按照1∶1 000用無血清培養液稀釋活性氧熒光探針（DCFH-DA），使其終濃度為10 μmol/L，加入胰島后37℃細胞培養箱內孵育20 min，通過熒光顯微鏡對細胞內DCFH-DA進行檢測和統計。以單純的GelMA/HAMA水凝膠作為對照組（n=3）。
1.4.3 水凝膠對低氧下胰島活性的影響
將大鼠胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h，使用Calcein-AM/PI進行活/死細胞染色檢測胰島活性（n=3）。
1.4.4 水凝膠對低氧下胰島功能的影響
實驗分為3組，單純胰島作為對照（A組），GelMA/HAMA水凝膠為B組，GelMA/HAMA/COS水凝膠為C組；其中C組COS濃度的選擇結合水凝膠表征以及活性氧和活/死細胞染色結果確定。① 免疫熒光染色：胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h，4%多聚甲醛固定和5%驢血清封閉，加入一抗兔抗胰島素抗體（1∶100）和小鼠抗胰高血糖素抗體（1∶400）4℃孵育過夜，二抗山羊抗小鼠IgG（AlexaFluor?488）（1∶500）和驢抗兔IgG（AlexaFluor?555）（1∶500）室溫孵育1 h，DAPI染核。檢測相關基因表達水平，并使用Image J軟件對相關基因的熒光強度進行量化。② GSIS實驗：胰島在各組水凝膠中低氧（1%O2）條件下培養48 h后，同1.3.2方法計算低糖和高糖條件下各組胰島素分泌量，檢測各組胰島對葡萄糖刺激的反應性。
1.5 統計學方法
應用GraphPad Prism 8統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 GelMA/HAMA/COS水凝膠相關觀測
① 掃描電鏡觀察：GelMA/HAMA/COS水凝膠內部呈現多孔結構，單純GelMA/HAMA水凝膠（0 mg/mL COS濃度組）孔徑較小，隨著COS濃度增加，水凝膠孔徑逐漸增大且凝膠纖維增粗，COS濃度為20 mg/mL時水凝膠孔徑顯著大于其余各濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。② 流變儀檢測：所有樣品給予紫外線照射后，G’和G’’均迅速升高，G’保持在1×104 Pa左右，G’’保持在1～100 Pa之間；G’大于G’’，提示成功形成水凝膠。③ 接觸角檢測：隨著COS濃度增加，水凝膠的接觸角稍有增加，親水性稍有下降，但各組接觸角均<90°。COS濃度為5、10、20 mg/mL的水凝膠接觸角大于COS濃度為0 mg/mL的水凝膠，差異有統計學意義（P<0.05）。④ 細胞毒性檢測：CCK-8檢測示，不同COS濃度的GelMA/HAMA/COS水凝膠A值差異均無統計學意義（P>0.05），均無明顯細胞毒性，能夠促進水凝膠表面生長的L929細胞黏附和增殖。見圖1。
圖1
GelMA/HAMA/COS水凝膠的表征和細胞毒性檢測
a. 掃描電鏡觀察（×300） 從左至右依次為0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組；b. 流變儀檢測 從左至右依次為0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組；c. 水凝膠孔徑；d. 接觸角檢測；e. 接觸角定量檢測；f. CCK-8法檢測細胞毒性
Figure1. Characterization and cytotoxicity detection of GelMA/HAMA/COS hydrogelsa. Scanning electron microscopy observation (×300) From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups; b. Rheological analysis From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups, respectively; c. Hydrogel pore size; d. Contact angle measurement; e. Quantitative detection of contact angle; f. CCK-8 assay for cytotoxicity
2.2 大鼠胰島相關觀測
① 胰島提取及鑒定：大鼠胰島在光鏡下呈類圓形，細胞質豐富，為黃褐色，半透明，邊緣清晰。雙硫腙染色示超過95%的胰島變為棕紅色，提示胰島有較高純度。見圖2。② GSIS實驗：胰島對低糖和高糖的刺激均具有較好響應，胰島素分泌量分別為（14.81±1.04）ng/mL和（28.01±2.07）ng/mL，差異有統計學意義（t=9.896，P<0.001）。③ 低氧對胰島活性的影響：隨著低氧培養時間延長，胰島活性逐漸降低，死細胞逐漸增多（圖3）。低氧處理24、48、72 h時，死細胞比例分別達17.00%±1.42%、29.39%±2.84%、43.70%±3.25%，與對照組0.89%±0.71%比較差異均有統計學意義（P<0.001）。
圖2
大鼠胰島形態及鑒定（×10）
a. 胰島形態；b. 雙硫腙染色
Figure2. Morphology and identification of rat islets (×10)a. Islet morphology; b. Dithizone staining
圖3
活/死細胞染色觀察低氧對大鼠胰島活性的影響（熒光顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞及二者合并 a. 對照組；b. 低氧處理24 h；c. 低氧處理48 h；d. 低氧處理72 h
Figure3. Live/dead cell staining to detect the effect of hypoxia on rat islet viability (Fluorescence microscope×40)From top to bottom for live cells, dead cells, and merge, respectively a. Control group; b. Hypoxic treatment for 24 hours; c. Hypoxic treatment for 48 hours; d. Hypoxic treatment for 72 hours
2.3 GelMA/HAMA/COS水凝膠對大鼠胰島活性和功能的影響
2.3.1 水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響
胰島在常氧和低氧狀態下都會產生活性氧，其中低氧條件下活性氧更多。對照組單純的GelMA/HAMA水凝膠并不能降低細胞活性氧，而GelMA/HAMA/COS水凝膠降低細胞內活性氧具有COS濃度依賴性，隨著COS濃度的增高活性氧清除能力逐漸增強。COS濃度達到5 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠能降低常氧條件下胰島內的活性氧，COS濃度達到10 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠顯著降低了低氧條件下胰島內的活性氧水平。見圖4。
圖4
水凝膠對低氧下胰島內活性氧的影響（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為對照組及0、1、5、10、20 mg/mL COS濃度組a. 常氧條件；b. 低氧條件
Figure4. Effect of hydrogel on reactive oxygen species in islet under hypoxia (Fluorescence microscope×40)From left to right for 0, 1, 5, 10, and 20 mg/mL COS concentration groups, respectively a. Normoxic conditions; b. Hypoxic conditions
2.3.2 水凝膠對低氧下胰島活性的影響
GelMA/HAMA/COS水凝膠能提高胰島活性，且與COS濃度成正相關，隨著COS濃度增高胰島死細胞數量逐漸減少，當COS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時，未見明顯凋亡細胞。見圖5。因此，結合水凝膠表征以及活性氧和活死細胞染色結果，選擇COS濃度為10 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠進行后續功能實驗。
圖5
活/死細胞染色觀察低氧對各組水凝膠中大鼠胰島活性的影響（熒光顯微鏡×40）
從上至下依次為活細胞、死細胞及二者合并 a. 對照組；b. 0 mg/mL COS濃度組；c. 1 mg/mL COS濃度組；d. 5 mg/mL COS濃度組；e. 10 mg/mL COS濃度組；f. 20 mg/mL COS濃度組
Figure5. Live/dead cells staining to detect the effect of hypoxia on the activity of rat islet in hydrogel (Fluorescence microscope×40)From top to bottom for live cells, dead cells, and merge, respectively a. Control group; b. 0 mg/mL COS concentration group; c. 1 mg/mL COS concentration group; d. 5 mg/mL COS concentration group; e. 10 mg/mL COS concentration group; f. 20 mg/mL COS concentration group2.3.3 水凝膠對低氧下胰島功能的影響
① 免疫熒光染色：C組胰島素基因和胰高血糖素基因表達量明顯高于A、B組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B組胰高血糖素基因表達量明顯高于A組（P<0.05），但A、B組間胰島素基因表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6、7a。② GSIS實驗：低糖及高糖刺激下，C組胰島素分泌量均顯著高于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖7b。
圖6
免疫熒光染色觀察水凝膠對低氧下胰島功能的影響（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為胰島素、胰高血糖素、細胞核及三者合并 a. A組；b. B組；c. C組
Figure6. Effect of hydrogel on the function of islet under hypoxic condition by immunofluorescence staining (Fluorescence microscope×40)From left to right for insulin, glucagon, nucleus, and merge, respectively a. Group A; ? b. Group B; ? c. Group C
圖7
水凝膠對低氧下胰島功能的影響
a. 免疫熒光染色定量檢測；b. GSIS實驗檢測胰島素分泌量
Figure7. The effect of hydrogel on islet function under hypoxiaa. Quantitative detection by immunofluorescence staining; b. GSIS assay to detect insulin secretion
3 討論
1型糖尿病是一種選擇性破壞胰島β細胞的自身免疫性疾病[18]。皮下胰島素注射作為臨床治療最常用的方法，不能實現血糖的生理性調控和延緩長期糖尿病的并發癥，因此胰島移植作為內源性胰島素分泌系統是一種有效的β細胞替代療法[19]。然而，在胰島分離和移植過程中，細胞外基質的破壞會使胰島長期處于缺氧狀態，并且胰島缺乏抗氧化酶的表達，缺氧條件下極易受到活性氧的攻擊[20]。此外，胰島具有高度的代謝活性，胰島素的分泌需要大量氧供來維持[21]。因此，缺氧是導致胰島損傷和移植失敗的主要原因，改善缺氧引起的氧化應激損傷是提高胰島移植效率的關鍵[22]。
COS可以直接清除細胞內的羥自由基、超氧陰離子等反應性自由基，抑制DNA損傷，從而保護細胞免受氧化應激損傷[23-24]。COS的抗氧化能力可能和抑制絲裂原活化蛋白激酶的磷酸化，并激活Nrf2信號通路有關[25]。研究表明COS能顯著降低雙氧水誘導的細胞凋亡和細胞內活性氧的產生，同時提高細胞的抗氧化能力，通過調節Nrf2/ARE信號通路保護細胞免受氧化損傷和凋亡[11]。在COS改善阿霉素誘導的心臟毒性的研究中，COS可以通過降低細胞內活性氧，增加線粒體膜電位和降低凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達，從而逆轉阿霉素引起的細胞活力下降，保護心肌細胞免受阿霉素誘導的凋亡[26]。因此，我們實驗將COS和胰島相結合，利用COS的抗氧化能力改善缺氧誘導的胰島損傷。但是，COS作為單一成分不能完整重建胰島細胞外基質仿生微環境，因此需要水凝膠參與構建細胞外基質的結構部分。
GelMA和HAMA因其較低的細胞毒性和快速光固化成膠特性，目前廣泛應用于細胞移植載體[27]、3D生物打印[28]以及類器官的構建[29]等。結合GelMA的力學性能和HAMA親水性的優點，構建的GelMA/HAMA水凝膠同時具備良好的機械性能和優異親水性，有利于維持3D打印水凝膠的基本結構和形態，同時為細胞體內移植后提供適宜和濕潤的微環境。此外，GelMA/HAMA水凝膠的多孔結構利于細胞黏附和營養物質運輸。雖然GelMA和HAMA構建的復合水凝膠作為細胞外基質能夠為胰島移植提供力學支撐和細胞黏附位點，但并不能改善長期移植面臨的細胞凋亡和功能失活。因此，我們實驗創新性地將COS與GelMA/HAMA水凝膠相結合，發揮各自優勢，構建具有抗氧化功能的GelMA/HAMA/COS復合水凝膠，用于模擬胰島細胞外基質仿生微環境。
本研究中構建了模擬體內胰島仿生微環境的GelMA/HAMA/COS水凝膠。掃描電鏡結果顯示，與GelMA/HAMA相比，實驗組隨COS濃度增加，凝膠纖維增粗且孔徑增大，纖維增粗利于胰島附著，胰島的大小為50～200 μm，較小孔徑不利于胰島形態的維持，當COS濃度達到10 mg/mL和20 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠孔徑大小足以容納絕大多數胰島。接觸角實驗結果顯示，隨著COS濃度增加，水凝膠的親水性有所降低，雖然COS有很好的水溶性，但是其親水性弱于GelMA和HAMA。但即使是COS濃度為20 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠，其接觸角仍然<90°，具有很好的生物相容性。
我們將提取的胰島在低氧條件下培養，證明了低氧會持續誘導胰島凋亡。使用GelMA/HAMA/COS水凝膠進一步培養胰島，活性氧染色結果表明，COS下調了胰島在低氧條件下活性氧的生成，且活性氧的清除能力與COS濃度成正相關。活/死細胞染色結果表明，細胞內活性氧的積累是導致胰島細胞凋亡的重要原因，且活性氧水平和細胞凋亡數量具有正相關性，而COS能降低活性氧引起的細胞凋亡。其中，COS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時，GelMA/HAMA/COS水凝膠在常氧和低氧下均能有效清除細胞內的活性氧，從而改善胰島活性。結合水凝膠表征的實驗結果，COS濃度為10 mg/mL的GelMA/HAMA/COS水凝膠是模擬胰島仿生微環境的最佳濃度。通過胰島免疫熒光染色和GSIS實驗進一步提示該COS濃度水凝膠對胰島功能具有積極影響。
綜上述，GelMA/HAMA/COS水凝膠具有良好的生物相容性和活性氧清除能力，在低氧和常氧條件下均能通過減輕活性氧提高胰島的存活和功能。因此，該復合水凝膠可用于胰島仿生微環境構建，提高胰島功能和移植效果。本研究不僅為開發抗氧化的COS生物材料提供了新的線索，而且為提高功能性移植物的存活率和擴大臨床胰島移植的可用性提供了理論依據。后續將進一步通過3D打印構建胰島類器官，并通過轉錄組測序、分子生物學功能實驗闡明其可能的作用機制。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南通大學動物實驗倫理委員會批準（S20210201-907），研究過程遵循國際通行的動物福利和倫理準則；實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2019-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0046
作者貢獻聲明 王東芝、郭益冰：實驗操作、論文撰寫；朱必文、潘浩鵬：數據整理、統計學分析；黃?、王志偉：課題設計、研究指導、論文修改、經費支持
