引用本文： 黃騰立, 沈君劼, 林俊卿, 鄭憲友. M2型巨噬細胞/小膠質細胞來源線粒體移植治療小鼠脊髓損傷的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(6): 751-759. doi: 10.7507/1002-1892.202201040 復制
各類高能暴力導致脊髓損傷后，會出現受損節段及以下肢體產生完全/不完全感覺、運動、自主神經等一系列功能障礙。脊髓損傷后，局部病灶首先經歷神經軸索斷裂、局部血管破裂出血、血脊髓屏障破裂等一系列病理改變；然后會出現繼發性損傷，包括炎癥細胞募集及炎癥因子風暴、局部微循環障礙、巨噬細胞極化障礙、氧化應急損傷、線粒體功能障礙等[1]。線粒體是細胞能量代謝的核心與中樞，也是細胞內氧自由基的主要來源，脊髓損傷后一旦發生線粒體功能障礙，將極大影響局部能量代謝，產生大量氧自由基，造成脊髓損傷局部氧化應激損傷，從而導致局部損傷加重，并抑制損傷處自我修復[2]。此外，脊髓損傷后損傷區域會出現細胞凋亡、細胞焦亡等一系列細胞程序性死亡[3]，調控線粒體功能對于這類細胞程序性死亡具有潛在抑制作用[4]，有利于脊髓損傷后自我修復。
目前，脊髓損傷研究中多采用藥物對線粒體功能障礙進行調節，包括5-HT1F受體激動劑[5]、紅景天苷[6]、β2-腎上腺素能受體激動劑（福莫特羅）[7]等。有研究顯示線粒體移植可促進損傷脊髓功能恢復，作用機制可能是移植的線粒體維持脊髓損傷區域線粒體能量代謝功能，從而促進運動及感覺功能恢復[8-9]。M2型巨噬細胞/小膠質細胞是脊髓損傷后損傷局部的主要吞噬細胞，相較于干細胞，來源更豐富、提取相對容易。因此，本研究采用M2型巨噬細胞/小膠質細胞來源線粒體移植治療小鼠脊髓損傷，觀察治療效果并初步探究作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠36只，體質量30～35 g，由上海交通大學附屬第六人民醫院提供。小鼠巨噬細胞（小膠質細胞）細胞系BV2細胞（中國科學院上海細胞庫），–80℃冰箱保存。
抗精氨酸酶 1（Arginase 1，Arg-1）一抗、抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗、FITC標記抗小鼠/兔二抗、氧化磷酸酶鏈（oxidative phosphorylation，OXPHOS）、VEGFA ELISA檢測試劑盒（Abcam公司，英國）；流式抗體iNOS、Arg-1以及FITC標記番茄凝集素（LEA-FITC）、MitoSox Red 線粒體超氧化物指示劑、重組小鼠IL-4（ThermoFisher公司，美國）；活性氧熒光探針DCFH-DA、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、細胞線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）。
微量注射器（Hamilton公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；超速離心管、超速離心器（Beckman公司，美國）；Western電泳系統（Bio-Rad公司，美國）；流式檢測儀（BD 公司，美國）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）；顯微血管夾（夾力10～30 g，上海豪沃生物科技有限公司）。
1.2 BV2細胞極化誘導及鑒定
1.2.1 BV2細胞培養
將BV2細胞置于37℃恒溫水浴鍋中解凍；吸取細胞懸液至15 mL離心管，加入10 mL預熱培養基，使用移液槍吹打混勻；以250×g 離心5 min，棄上清，加入1 mL培養基吹打混勻重懸；將細胞以（2.5～4.0）×104個/孔接種于培養皿中，加入含10%FBS、1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM培養基（完全培養基），置于37℃、5%CO2及適當濕度恒溫細胞培養箱中培養，每隔2 d更換培養基。待細胞生長至約80%融合后進行后續操作。
1.2.2 BV2細胞極化誘導
根據不同干預措施，實驗分為未干預組（M0組）、M1型極化組（M1組）、M2型極化組（M2組）。將BV2細胞接種于6孔板中，每孔6×105個。M0組：不作任何干預；M1組：每孔加入含100 ng/mL LPS的完全培養基，誘導細胞向M1型極化；M2組：每孔加入含20 ng/mL IL-4的完全培養基，誘導細胞向M2型極化。每組至少3個復孔。極化誘導48 h后取各組細胞進行以下觀測。
1.2.3 BV2細胞極化誘導后鑒定
① 細胞形態：倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。 ② 免疫熒光染色：各組細胞經胰蛋白酶消化后，重新種植于預置細胞爬片的24孔板，每孔2.5×105個細胞，待細胞完全貼壁后，將細胞爬片置于4%多聚甲醛固定10 min；洗滌后使用0.01% Triton破膜，FBS封閉，加入一抗Arg-1（1∶200）4℃孵育過夜，滴加FITC標記二抗孵育1 h，洗滌后加入DAPI顯色。倒置熒光顯微鏡下觀察，M2型巨噬細胞標志物Arg-1陽性染色呈綠光熒光。每組隨機選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。③ 流式細胞術檢測：各組細胞以500×g離心5 min，吸棄上清液，加入PBS重懸，經固定及破膜后，分別加入M1型巨噬細胞標志物iNOS、M2型巨噬細胞標志物Arg-1一抗（1∶100），避光孵育1 h，流式檢測儀檢測。
1.2.4 BV2細胞線粒體功能檢測
① MitoSox Red染色：各組細胞經胰蛋白酶消化后重新種植于12孔板中，每孔5×105個細胞，待細胞完全貼壁后，加入 MitoSox Red染料，置于37℃細胞培養箱內孵育15 min，預熱緩沖液沖洗細胞3次。倒置熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為陽性染色。每組隨機選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。② DCFH-DA 染色：除加入DCFH-DA染料不同外，細胞處理以及觀測方法與MitoSox Red染色一致。綠色熒光為陽性染色。
1.3 M2型BV2細胞來源線粒體的提取與鑒定
取M2組細胞用胰蛋白酶消化后，以200×g離心5 min，取細胞沉淀以預冷PBS重懸。取少量細胞用以細胞計數。其余細胞以4℃、600×g 離心5 min，棄上清，根據細胞計數結果，于細胞沉淀中加入線粒體分離試劑（1.5 mL∶3×107個細胞），冰浴放置15 min。使用勻漿器將細胞懸液勻漿操作10～30次；以4℃、1 000×g 離心10 min，吸取上清液轉移至另一離心管中；以4℃、11 000×g 離心10 min，去除上清液，使用線粒體儲存液重懸沉淀，獲得M2型BV2細胞來源線粒體。采用Western blot法檢測M2型BV2細胞及其來源線粒體內OXPHOS各相關復合物（復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與Ⅴ）的表達水平，使用Image J軟件檢測條帶灰度值，計算復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ與復合物Ⅳ灰度值比值，評估所提取線粒體呼吸功能及純度后用于后續動物實驗。
1.4 動物實驗
1.4.1 實驗分組及方法
取36只小鼠隨機分為3組，分別為假手術組、脊髓損傷組及線粒體移植組，每組12只。各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，以T10節段脊髓水平為中心作背部正中切口，逐層分離至充分暴露脊柱后，使用咬骨鉗咬除T10節段脊柱棘突與椎板（操作過程中注意保證硬脊膜完整性），充分暴露脊髓。假手術組不進行任何脊髓損傷手術，直接縫合切口。脊髓損傷組及線粒體移植組使用顯微血管夾，完全夾閉（最大夾力30 g）T10節段水平脊髓1 min，制備脊髓損傷模型；然后分別使用微量注射器于損傷節段正中注射10 μL無菌線粒體儲存液、10 μL線粒體（100 μg），逐層縫合切口。脊髓損傷小鼠術后每天人工按摩膀胱2次，促進排尿、排便，直至自主膀胱反射重新建立。各組小鼠術后每天肌肉注射青霉素2萬U，持續1周。
1.4.2 觀測指標
① 運動功能評價：觀察術后各組小鼠存活情況。于造模后即刻（0 d）以及7、14、21、28 d，每組取5只小鼠，采用BMS（Basso Mouse Scale）評分評價后肢運動功能恢復情況。
② 免疫熒光染色觀察：術后14 d，每組取3只小鼠使用過量麻醉法處死，于原手術切口入路，切取損傷節段脊髓中心組織制備冰凍橫切片，片厚25 μm。取部分切片，置于4%多聚甲醛固定、0.01%Triton破膜、FBS封閉后，加入一抗iNOS（1∶200）4℃過夜孵育，次日洗滌后，滴加FITC標記二抗室溫孵育1 h，DAPI顯色，封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，iNOS陽性細胞呈綠色熒光。每組選擇3個視野，使用Image J軟件進行陽性細胞計數。
③ LEA-FITC染色觀察：取各組部分切片同上法固定、破膜及封閉后，加入LEA-FITC染色工作液，避光室溫孵育2 h，DAPI顯色5 min，封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，LEA陽性細胞呈綠色熒光。每組選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。
④ ELISA檢測： 取各組損傷節段脊髓組織，使用ELISA試劑盒檢測VEGFA表達。
1.5 統計學方法
采用Prism8.0統計軟件進行分析。計量資料符合正態分布，數據以均數±標準差表示，BMS評分組間比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用Greenhouse-Geisser法進行校正，同一組別不同時間點間比較采用 Bonferroni 法，同一時間點不同組間比較采用多因素方差分析；熒光染色測量結果組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 極化誘導后BV2細胞及其線粒體功能檢測
2.1.1 細胞形態觀察
M0組：細胞以圓形為主，未見明顯不規則改變及偽足產生。M1組：細胞形態大多不規則，以長梭形為主且出現少量偽足。M2組：細胞仍以圓形為主，有少量不規則形態細胞并出現少量偽足。見圖1a。
圖1
BV2細胞極化誘導后觀察
a. 細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100） 從左至右分別為M0組、M1組、M2組； b. 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100） 從上至下分別為M0組、M1組、M2組 從左至右分別為Arg-1染色、DAPI染色、兩者重疊； c. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為M0組、M1組、M2組
Figure1. The M2-like BV2 cells observation after polarization inductiona. Cell morphology observation (Inverted microscope×100) From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively; b. Immunofluorescence staining observation (Inverted fluorescence microscope×100) From top to bottom for M0, M1, and M2 groups, respectively From left to right for Arg-1 staining, DAPI staining, and merge, respectively; c. Flow cytometry detection From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively
2.1.2 免疫熒光染色觀測
M0組、M1組及M2組Arg-1熒光強度分別為0.917±0.092、0.962±0.136、1.378±0.116。M2組較M0組、M1組增加，差異有統計學意義（P<0.05）；M0組、M1組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1b。
2.1.3 流式細胞術檢測
M0組、M1組、M2組iNOS 表達分別為0.09%±0.01%、32.23%±5.93%、0.16%±0.18%，Arg-1分別為0.89%±0.18%、0.13%±0.12%、18.92%±5.02%。M1組iNOS表達高于M0組及M2組，M2組Arg-1表達高于M0組及M1組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1c。
2.1.4 MitoSox Red及DCFH-DA染色檢測
各組Mitosox Red染色及DCFH-DA染色結果一致。M0組未見明顯陽性熒光，M1組可見較明顯熒光，M2組可見微量熒光。其中M1組熒光強度高于M0組及M2組（P<0.05），M0組與M2組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
BV2細胞極化誘導后線粒體功能觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為M0組、M1組、M2組 a. MitoSox Red染色；b. DCFH-DA染色；c. 熒光強度組間比較 *P<0.05
Figure2. Mitochondrial function of BV2 cells after polarization induction (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively a. MitoSox Red staining; b. DCFH-DA staining; c. Comparison of fluorescence intensity between groups *P<0.05
2.2 M2型BV2細胞來源線粒體鑒定
Western blot法檢測示線粒體內OXPHOS各相關復合物（復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與Ⅴ）條帶表達均較M2型BV2細胞更清晰，各復合物灰度值比值升高（P<0.05），提示成功提取細胞線粒體。見圖3。
圖3
Western blot法檢測M2型BV2細胞及其來源線粒體內OXPHOS表達
1：M2型BV2細胞 2：M2型BV2細胞來源線粒體 a. 電泳圖； b. 定量分析結果 *P<0.05
Figure3. Detection of OXPHOS expression in M2-like BV2 cells and their mitochondria by Western blot1: M2-like BV2 cells 2: M2-like BV2 cells-derived mitochondria a. Electropherogram; b. Quantitative analysis results *P<0.05
2.3 動物實驗
2.3.1 運動功能評價
脊髓損傷組2只小鼠因術中出血過多死亡，線粒體移植組1只小鼠術后3 d因感染死亡，均對應補充。其余小鼠均存活至實驗完成。
術后隨時間延長，脊髓損傷組及線粒體移植組小鼠后肢功能逐漸恢復，但各時間點BMS評分均低于假手術組（P<0.05）。術后0 、7、14 d脊髓損傷組及線粒體移植組BMS評分差異無統計學意義（P>0.05）；術后21、28 d時，線粒體移植組評分高于脊髓損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1及圖4。
表1
各時間點各組BMS評分比較（n=5，
）
Table1.
Comparison of the BMS score between groups at different time points (n=5, 
)
圖4
術后各組小鼠BMS評分變化趨勢
Figure4.
Change trend of BMS score of mice in each group after operation
2.3.2 免疫熒光染色觀察
假手術組：未見明顯iNOS陽性細胞；脊髓損傷組：可見大量iNOS陽性細胞；線粒體移植組：可見少量iNOS陽性細胞。見圖5。假手術組、脊髓損傷組、線粒體移植組陽性細胞數分別為（0.33±0.58）、（52.67±10.69）、（24.33±10.69）個，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖5
術后14 d各組小鼠iNOS免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為iNOS染色、DAPI染色、兩者重疊 a. 假手術組；b. 脊髓損傷組；c. 線粒體移植組
Figure5. iNOS immunofluorescence staining of each group at 14 days after operation (Inverted fluorescence microscope×200)From left to right for iNOS staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Sham group; b. SCI group; c. MT group
2.3.3 LEA-FITC染色觀察
假手術組：未見明顯陽性細胞。脊髓損傷組：DAPI染色示注射區域有細胞，但未見LEA陽性細胞。線粒體移植組：線粒體移植區域可見明顯細胞聚集，可見LEA陽性細胞。見圖6。
圖6
術后14 d各組LEA-FITC染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為LEA-FITC染色、DAPI染色、兩者重疊 a：假手術組；b. 脊髓損傷組；c. 線粒體移植組
Figure6. LEA-FITC immunofluorescence staining of each group at 14 days after operation (Inverted fluorescence microscope×200)From left to right for LEA-FITC staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Sham group; b. SCI group; c. MT group
2.3.4 ELISA檢測
假手術組、脊髓損傷組及線粒體移植組VEGFA表達量分別為（63.38±4.09）、（58.79±6.28）、（205.22±6.42）pg/mL。線粒體移植組脊髓損傷節段VEGFA表達量高于假手術組及脊髓損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
小膠質細胞是組織定居的巨噬細胞，在機體固有免疫中起到重要作用。研究表明，不同極化狀態下巨噬細胞的線粒體功能具有較大差異，M1型巨噬細胞具有明顯的線粒體功能障礙，并且會產生大量氧自由基引起氧化應激損傷；而M2型巨噬細胞線粒體功能較佳[10]。BV2細胞作為小膠質細胞的永生細胞系，是體外模擬巨噬細胞/小膠質細胞功能的重要工具。本研究中我們使用IL-4刺激誘導BV2細胞極化，并成功獲得了M2型BV2細胞。
本研究MitoSox Red及DCFH-DA染色提示，M1型BV2細胞線粒體的特異性氧自由基及細胞整體氧自由基水平顯著上升，存在明顯氧化應激損傷；而M2型BV2細胞未見明顯氧自由基水平異常提高，提示M2型BV2細胞內線粒體功能好于M1型BV2細胞，是較好的線粒體來源細胞。OXPHOS是線粒體正常代謝重要途徑，其表達與細胞線粒體功能及其介導的病理機制息息相關[11-13]。本研究通過Western blot法檢測了細胞來源及線粒體來源的OXPHOS各復合體表達，結果顯示成功獲得了代謝功能較佳且純度較高的線粒體。上述檢測結果提示M2型巨噬細胞/小膠質細胞作為線粒體來源細胞可行性較高。
有研究報道使用線粒體治療創傷性腦部損傷并起到了積極作用[14]。脊髓損傷作為中樞神經系統損傷中的重要組成部分，其相關研究較少。近期研究發現，紅景天苷能夠改善脊髓損傷后的線粒體功能，從而抑制神經元凋亡[15]，提示線粒體在脊髓損傷治療中具有極大潛能[2, 16]。本研究采用M2型BV2細胞來源線粒體治療小鼠脊髓損傷，發現移植治療后脊髓損傷小鼠BMS評分顯著提高，提示該方法能促進小鼠運動功能恢復。本研究選擇脊髓損傷后的巨噬細胞極化障礙及成血管方向作為線粒體移植后的檢測靶點，結果發現M2型BV2細胞來源線粒體能夠促進脊髓損傷后局部血管新生，并且抑制損傷區域炎癥性M1型巨噬細胞極化，從而抑制脊髓損傷后神經炎癥程度，有利于損傷脊髓恢復。既往研究發現M1型巨噬細胞來源的外泌體能夠抑制脊髓損傷后的線粒體功能，并加重脊髓損傷癥狀[17]。因此，通過抑制脊髓損傷后損傷節段M1型巨噬細胞極化具有促進脊髓損傷修復的作用。本研究同樣表明了巨噬細胞/小膠質細胞的免疫代謝在中樞神經損傷中的重要作用。線粒體功能與血管生成息息相關，研究已證實來源于線粒體的氧自由基能夠通過刺激VEGF信號通路促進血管生成[18]。本研究通過ELISA檢測發現移植線粒體能夠促進損傷局部VEGFA表達升高，間接提示了脊髓損傷后線粒體功能與血管新生的重要關聯。
綜上述，M2型巨噬細胞/小膠質細胞來源線粒體移植能夠促進脊髓損傷局部血管生成，抑制損傷局部炎癥性M1型巨噬細胞極化，達到促進脊髓損傷修復的作用，為線粒體移植治療創傷性中樞神經損傷的機制研究提供了新線索，并且為線粒體移植治療脊髓損傷提供了理論依據。但本研究仍有一定局限性，雖然已通過體內外實驗檢測了M2型BV2細胞移植治療對脊髓損傷后巨噬細胞極化障礙及成血管方面的影響，尚未從分子角度闡述其相關機制，仍需進一步實驗研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經上海交通大學附屬第六人民醫院醫學倫理委員會批準（DWSY2020-0605）；動物實驗程序及開展方案符合動物使用及管理委員會規定；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0020
作者貢獻聲明 黃騰立：研究設計與實施；沈君劼：研究實施及數據收集；林俊卿：參與文章撰寫并作批評性審閱；鄭憲友：研究設計及對文章知識性內容作批評性審閱
各類高能暴力導致脊髓損傷后，會出現受損節段及以下肢體產生完全/不完全感覺、運動、自主神經等一系列功能障礙。脊髓損傷后，局部病灶首先經歷神經軸索斷裂、局部血管破裂出血、血脊髓屏障破裂等一系列病理改變；然后會出現繼發性損傷，包括炎癥細胞募集及炎癥因子風暴、局部微循環障礙、巨噬細胞極化障礙、氧化應急損傷、線粒體功能障礙等[1]。線粒體是細胞能量代謝的核心與中樞，也是細胞內氧自由基的主要來源，脊髓損傷后一旦發生線粒體功能障礙，將極大影響局部能量代謝，產生大量氧自由基，造成脊髓損傷局部氧化應激損傷，從而導致局部損傷加重，并抑制損傷處自我修復[2]。此外，脊髓損傷后損傷區域會出現細胞凋亡、細胞焦亡等一系列細胞程序性死亡[3]，調控線粒體功能對于這類細胞程序性死亡具有潛在抑制作用[4]，有利于脊髓損傷后自我修復。
目前，脊髓損傷研究中多采用藥物對線粒體功能障礙進行調節，包括5-HT1F受體激動劑[5]、紅景天苷[6]、β2-腎上腺素能受體激動劑（福莫特羅）[7]等。有研究顯示線粒體移植可促進損傷脊髓功能恢復，作用機制可能是移植的線粒體維持脊髓損傷區域線粒體能量代謝功能，從而促進運動及感覺功能恢復[8-9]。M2型巨噬細胞/小膠質細胞是脊髓損傷后損傷局部的主要吞噬細胞，相較于干細胞，來源更豐富、提取相對容易。因此，本研究采用M2型巨噬細胞/小膠質細胞來源線粒體移植治療小鼠脊髓損傷，觀察治療效果并初步探究作用機制。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠36只，體質量30～35 g，由上海交通大學附屬第六人民醫院提供。小鼠巨噬細胞（小膠質細胞）細胞系BV2細胞（中國科學院上海細胞庫），–80℃冰箱保存。
抗精氨酸酶 1（Arginase 1，Arg-1）一抗、抗誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗、FITC標記抗小鼠/兔二抗、氧化磷酸酶鏈（oxidative phosphorylation，OXPHOS）、VEGFA ELISA檢測試劑盒（Abcam公司，英國）；流式抗體iNOS、Arg-1以及FITC標記番茄凝集素（LEA-FITC）、MitoSox Red 線粒體超氧化物指示劑、重組小鼠IL-4（ThermoFisher公司，美國）；活性氧熒光探針DCFH-DA、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、細胞線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）。
微量注射器（Hamilton公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；超速離心管、超速離心器（Beckman公司，美國）；Western電泳系統（Bio-Rad公司，美國）；流式檢測儀（BD 公司，美國）；Image J軟件（美國國立衛生研究院）；顯微血管夾（夾力10～30 g，上海豪沃生物科技有限公司）。
1.2 BV2細胞極化誘導及鑒定
1.2.1 BV2細胞培養
將BV2細胞置于37℃恒溫水浴鍋中解凍；吸取細胞懸液至15 mL離心管，加入10 mL預熱培養基，使用移液槍吹打混勻；以250×g 離心5 min，棄上清，加入1 mL培養基吹打混勻重懸；將細胞以（2.5～4.0）×104個/孔接種于培養皿中，加入含10%FBS、1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM培養基（完全培養基），置于37℃、5%CO2及適當濕度恒溫細胞培養箱中培養，每隔2 d更換培養基。待細胞生長至約80%融合后進行后續操作。
1.2.2 BV2細胞極化誘導
根據不同干預措施，實驗分為未干預組（M0組）、M1型極化組（M1組）、M2型極化組（M2組）。將BV2細胞接種于6孔板中，每孔6×105個。M0組：不作任何干預；M1組：每孔加入含100 ng/mL LPS的完全培養基，誘導細胞向M1型極化；M2組：每孔加入含20 ng/mL IL-4的完全培養基，誘導細胞向M2型極化。每組至少3個復孔。極化誘導48 h后取各組細胞進行以下觀測。
1.2.3 BV2細胞極化誘導后鑒定
① 細胞形態：倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長情況。 ② 免疫熒光染色：各組細胞經胰蛋白酶消化后，重新種植于預置細胞爬片的24孔板，每孔2.5×105個細胞，待細胞完全貼壁后，將細胞爬片置于4%多聚甲醛固定10 min；洗滌后使用0.01% Triton破膜，FBS封閉，加入一抗Arg-1（1∶200）4℃孵育過夜，滴加FITC標記二抗孵育1 h，洗滌后加入DAPI顯色。倒置熒光顯微鏡下觀察，M2型巨噬細胞標志物Arg-1陽性染色呈綠光熒光。每組隨機選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。③ 流式細胞術檢測：各組細胞以500×g離心5 min，吸棄上清液，加入PBS重懸，經固定及破膜后，分別加入M1型巨噬細胞標志物iNOS、M2型巨噬細胞標志物Arg-1一抗（1∶100），避光孵育1 h，流式檢測儀檢測。
1.2.4 BV2細胞線粒體功能檢測
① MitoSox Red染色：各組細胞經胰蛋白酶消化后重新種植于12孔板中，每孔5×105個細胞，待細胞完全貼壁后，加入 MitoSox Red染料，置于37℃細胞培養箱內孵育15 min，預熱緩沖液沖洗細胞3次。倒置熒光顯微鏡下觀察，紅色熒光為陽性染色。每組隨機選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。② DCFH-DA 染色：除加入DCFH-DA染料不同外，細胞處理以及觀測方法與MitoSox Red染色一致。綠色熒光為陽性染色。
1.3 M2型BV2細胞來源線粒體的提取與鑒定
取M2組細胞用胰蛋白酶消化后，以200×g離心5 min，取細胞沉淀以預冷PBS重懸。取少量細胞用以細胞計數。其余細胞以4℃、600×g 離心5 min，棄上清，根據細胞計數結果，于細胞沉淀中加入線粒體分離試劑（1.5 mL∶3×107個細胞），冰浴放置15 min。使用勻漿器將細胞懸液勻漿操作10～30次；以4℃、1 000×g 離心10 min，吸取上清液轉移至另一離心管中；以4℃、11 000×g 離心10 min，去除上清液，使用線粒體儲存液重懸沉淀，獲得M2型BV2細胞來源線粒體。采用Western blot法檢測M2型BV2細胞及其來源線粒體內OXPHOS各相關復合物（復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與Ⅴ）的表達水平，使用Image J軟件檢測條帶灰度值，計算復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ與復合物Ⅳ灰度值比值，評估所提取線粒體呼吸功能及純度后用于后續動物實驗。
1.4 動物實驗
1.4.1 實驗分組及方法
取36只小鼠隨機分為3組，分別為假手術組、脊髓損傷組及線粒體移植組，每組12只。各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，以T10節段脊髓水平為中心作背部正中切口，逐層分離至充分暴露脊柱后，使用咬骨鉗咬除T10節段脊柱棘突與椎板（操作過程中注意保證硬脊膜完整性），充分暴露脊髓。假手術組不進行任何脊髓損傷手術，直接縫合切口。脊髓損傷組及線粒體移植組使用顯微血管夾，完全夾閉（最大夾力30 g）T10節段水平脊髓1 min，制備脊髓損傷模型；然后分別使用微量注射器于損傷節段正中注射10 μL無菌線粒體儲存液、10 μL線粒體（100 μg），逐層縫合切口。脊髓損傷小鼠術后每天人工按摩膀胱2次，促進排尿、排便，直至自主膀胱反射重新建立。各組小鼠術后每天肌肉注射青霉素2萬U，持續1周。
1.4.2 觀測指標
① 運動功能評價：觀察術后各組小鼠存活情況。于造模后即刻（0 d）以及7、14、21、28 d，每組取5只小鼠，采用BMS（Basso Mouse Scale）評分評價后肢運動功能恢復情況。
② 免疫熒光染色觀察：術后14 d，每組取3只小鼠使用過量麻醉法處死，于原手術切口入路，切取損傷節段脊髓中心組織制備冰凍橫切片，片厚25 μm。取部分切片，置于4%多聚甲醛固定、0.01%Triton破膜、FBS封閉后，加入一抗iNOS（1∶200）4℃過夜孵育，次日洗滌后，滴加FITC標記二抗室溫孵育1 h，DAPI顯色，封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，iNOS陽性細胞呈綠色熒光。每組選擇3個視野，使用Image J軟件進行陽性細胞計數。
③ LEA-FITC染色觀察：取各組部分切片同上法固定、破膜及封閉后，加入LEA-FITC染色工作液，避光室溫孵育2 h，DAPI顯色5 min，封片。倒置熒光顯微鏡下觀察，LEA陽性細胞呈綠色熒光。每組選擇3個視野，使用Image J軟件進行熒光強度半定量分析。
④ ELISA檢測： 取各組損傷節段脊髓組織，使用ELISA試劑盒檢測VEGFA表達。
1.5 統計學方法
采用Prism8.0統計軟件進行分析。計量資料符合正態分布，數據以均數±標準差表示，BMS評分組間比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用Greenhouse-Geisser法進行校正，同一組別不同時間點間比較采用 Bonferroni 法，同一時間點不同組間比較采用多因素方差分析；熒光染色測量結果組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 極化誘導后BV2細胞及其線粒體功能檢測
2.1.1 細胞形態觀察
M0組：細胞以圓形為主，未見明顯不規則改變及偽足產生。M1組：細胞形態大多不規則，以長梭形為主且出現少量偽足。M2組：細胞仍以圓形為主，有少量不規則形態細胞并出現少量偽足。見圖1a。
圖1
BV2細胞極化誘導后觀察
a. 細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100） 從左至右分別為M0組、M1組、M2組； b. 免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×100） 從上至下分別為M0組、M1組、M2組 從左至右分別為Arg-1染色、DAPI染色、兩者重疊； c. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為M0組、M1組、M2組
Figure1. The M2-like BV2 cells observation after polarization inductiona. Cell morphology observation (Inverted microscope×100) From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively; b. Immunofluorescence staining observation (Inverted fluorescence microscope×100) From top to bottom for M0, M1, and M2 groups, respectively From left to right for Arg-1 staining, DAPI staining, and merge, respectively; c. Flow cytometry detection From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively
2.1.2 免疫熒光染色觀測
M0組、M1組及M2組Arg-1熒光強度分別為0.917±0.092、0.962±0.136、1.378±0.116。M2組較M0組、M1組增加，差異有統計學意義（P<0.05）；M0組、M1組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1b。
2.1.3 流式細胞術檢測
M0組、M1組、M2組iNOS 表達分別為0.09%±0.01%、32.23%±5.93%、0.16%±0.18%，Arg-1分別為0.89%±0.18%、0.13%±0.12%、18.92%±5.02%。M1組iNOS表達高于M0組及M2組，M2組Arg-1表達高于M0組及M1組，差異均有統計學意義（P<0.05）；其余組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1c。
2.1.4 MitoSox Red及DCFH-DA染色檢測
各組Mitosox Red染色及DCFH-DA染色結果一致。M0組未見明顯陽性熒光，M1組可見較明顯熒光，M2組可見微量熒光。其中M1組熒光強度高于M0組及M2組（P<0.05），M0組與M2組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
BV2細胞極化誘導后線粒體功能觀察（倒置熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為M0組、M1組、M2組 a. MitoSox Red染色；b. DCFH-DA染色；c. 熒光強度組間比較 *P<0.05
Figure2. Mitochondrial function of BV2 cells after polarization induction (Inverted fluorescence microscope×100)From left to right for M0, M1, and M2 groups, respectively a. MitoSox Red staining; b. DCFH-DA staining; c. Comparison of fluorescence intensity between groups *P<0.05
2.2 M2型BV2細胞來源線粒體鑒定
Western blot法檢測示線粒體內OXPHOS各相關復合物（復合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ與Ⅴ）條帶表達均較M2型BV2細胞更清晰，各復合物灰度值比值升高（P<0.05），提示成功提取細胞線粒體。見圖3。
圖3
Western blot法檢測M2型BV2細胞及其來源線粒體內OXPHOS表達
1：M2型BV2細胞 2：M2型BV2細胞來源線粒體 a. 電泳圖； b. 定量分析結果 *P<0.05
Figure3. Detection of OXPHOS expression in M2-like BV2 cells and their mitochondria by Western blot1: M2-like BV2 cells 2: M2-like BV2 cells-derived mitochondria a. Electropherogram; b. Quantitative analysis results *P<0.05
2.3 動物實驗
2.3.1 運動功能評價
脊髓損傷組2只小鼠因術中出血過多死亡，線粒體移植組1只小鼠術后3 d因感染死亡，均對應補充。其余小鼠均存活至實驗完成。
術后隨時間延長，脊髓損傷組及線粒體移植組小鼠后肢功能逐漸恢復，但各時間點BMS評分均低于假手術組（P<0.05）。術后0 、7、14 d脊髓損傷組及線粒體移植組BMS評分差異無統計學意義（P>0.05）；術后21、28 d時，線粒體移植組評分高于脊髓損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1及圖4。
表1
各時間點各組BMS評分比較（n=5，）
Table1.
Comparison of the BMS score between groups at different time points (n=5, )
圖4
術后各組小鼠BMS評分變化趨勢
Figure4.
Change trend of BMS score of mice in each group after operation
2.3.2 免疫熒光染色觀察
假手術組：未見明顯iNOS陽性細胞；脊髓損傷組：可見大量iNOS陽性細胞；線粒體移植組：可見少量iNOS陽性細胞。見圖5。假手術組、脊髓損傷組、線粒體移植組陽性細胞數分別為（0.33±0.58）、（52.67±10.69）、（24.33±10.69）個，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖5
術后14 d各組小鼠iNOS免疫熒光染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為iNOS染色、DAPI染色、兩者重疊 a. 假手術組；b. 脊髓損傷組；c. 線粒體移植組
Figure5. iNOS immunofluorescence staining of each group at 14 days after operation (Inverted fluorescence microscope×200)From left to right for iNOS staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Sham group; b. SCI group; c. MT group
2.3.3 LEA-FITC染色觀察
假手術組：未見明顯陽性細胞。脊髓損傷組：DAPI染色示注射區域有細胞，但未見LEA陽性細胞。線粒體移植組：線粒體移植區域可見明顯細胞聚集，可見LEA陽性細胞。見圖6。
圖6
術后14 d各組LEA-FITC染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
從左至右分別為LEA-FITC染色、DAPI染色、兩者重疊 a：假手術組；b. 脊髓損傷組；c. 線粒體移植組
Figure6. LEA-FITC immunofluorescence staining of each group at 14 days after operation (Inverted fluorescence microscope×200)From left to right for LEA-FITC staining, DAPI staining, and merge, respectively a. Sham group; b. SCI group; c. MT group
2.3.4 ELISA檢測
假手術組、脊髓損傷組及線粒體移植組VEGFA表達量分別為（63.38±4.09）、（58.79±6.28）、（205.22±6.42）pg/mL。線粒體移植組脊髓損傷節段VEGFA表達量高于假手術組及脊髓損傷組，差異有統計學意義（P<0.05）。
3 討論
小膠質細胞是組織定居的巨噬細胞，在機體固有免疫中起到重要作用。研究表明，不同極化狀態下巨噬細胞的線粒體功能具有較大差異，M1型巨噬細胞具有明顯的線粒體功能障礙，并且會產生大量氧自由基引起氧化應激損傷；而M2型巨噬細胞線粒體功能較佳[10]。BV2細胞作為小膠質細胞的永生細胞系，是體外模擬巨噬細胞/小膠質細胞功能的重要工具。本研究中我們使用IL-4刺激誘導BV2細胞極化，并成功獲得了M2型BV2細胞。
本研究MitoSox Red及DCFH-DA染色提示，M1型BV2細胞線粒體的特異性氧自由基及細胞整體氧自由基水平顯著上升，存在明顯氧化應激損傷；而M2型BV2細胞未見明顯氧自由基水平異常提高，提示M2型BV2細胞內線粒體功能好于M1型BV2細胞，是較好的線粒體來源細胞。OXPHOS是線粒體正常代謝重要途徑，其表達與細胞線粒體功能及其介導的病理機制息息相關[11-13]。本研究通過Western blot法檢測了細胞來源及線粒體來源的OXPHOS各復合體表達，結果顯示成功獲得了代謝功能較佳且純度較高的線粒體。上述檢測結果提示M2型巨噬細胞/小膠質細胞作為線粒體來源細胞可行性較高。
有研究報道使用線粒體治療創傷性腦部損傷并起到了積極作用[14]。脊髓損傷作為中樞神經系統損傷中的重要組成部分，其相關研究較少。近期研究發現，紅景天苷能夠改善脊髓損傷后的線粒體功能，從而抑制神經元凋亡[15]，提示線粒體在脊髓損傷治療中具有極大潛能[2, 16]。本研究采用M2型BV2細胞來源線粒體治療小鼠脊髓損傷，發現移植治療后脊髓損傷小鼠BMS評分顯著提高，提示該方法能促進小鼠運動功能恢復。本研究選擇脊髓損傷后的巨噬細胞極化障礙及成血管方向作為線粒體移植后的檢測靶點，結果發現M2型BV2細胞來源線粒體能夠促進脊髓損傷后局部血管新生，并且抑制損傷區域炎癥性M1型巨噬細胞極化，從而抑制脊髓損傷后神經炎癥程度，有利于損傷脊髓恢復。既往研究發現M1型巨噬細胞來源的外泌體能夠抑制脊髓損傷后的線粒體功能，并加重脊髓損傷癥狀[17]。因此，通過抑制脊髓損傷后損傷節段M1型巨噬細胞極化具有促進脊髓損傷修復的作用。本研究同樣表明了巨噬細胞/小膠質細胞的免疫代謝在中樞神經損傷中的重要作用。線粒體功能與血管生成息息相關，研究已證實來源于線粒體的氧自由基能夠通過刺激VEGF信號通路促進血管生成[18]。本研究通過ELISA檢測發現移植線粒體能夠促進損傷局部VEGFA表達升高，間接提示了脊髓損傷后線粒體功能與血管新生的重要關聯。
綜上述，M2型巨噬細胞/小膠質細胞來源線粒體移植能夠促進脊髓損傷局部血管生成，抑制損傷局部炎癥性M1型巨噬細胞極化，達到促進脊髓損傷修復的作用，為線粒體移植治療創傷性中樞神經損傷的機制研究提供了新線索，并且為線粒體移植治療脊髓損傷提供了理論依據。但本研究仍有一定局限性，雖然已通過體內外實驗檢測了M2型BV2細胞移植治療對脊髓損傷后巨噬細胞極化障礙及成血管方面的影響，尚未從分子角度闡述其相關機制，仍需進一步實驗研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經上海交通大學附屬第六人民醫院醫學倫理委員會批準（DWSY2020-0605）；動物實驗程序及開展方案符合動物使用及管理委員會規定；實驗動物使用許可證號：SYXK（滬）2016-0020
作者貢獻聲明 黃騰立：研究設計與實施；沈君劼：研究實施及數據收集；林俊卿：參與文章撰寫并作批評性審閱；鄭憲友：研究設計及對文章知識性內容作批評性審閱
