引用本文： 胡華, 李連泰, 劉艷偉, 王書君, 謝雙喜, 孫建君. 白藜蘆醇對炎癥所致椎間軟骨終板退變中高遷移率蛋白1信號的影響. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(4): 461-469. doi: 10.7507/1002-1892.202110084 復制
隨著我國居民日常生活狀態的改變，椎間盤退行性疾病發生率逐年升高，呈現年輕化趨勢，嚴重影響人們生活質量。此類疾病發展過程中，患者的椎間盤組織水分含量下降，膠原蛋白膜通透性隨之改變，纖維環膠原受損，細胞排列紊亂，椎間軟骨終板（cartilage endplate，CEP）細胞的結構隨之改變，甚至形成骨化[1]。因此，深入揭示椎間CEP細胞退變的分子機制，尋找維系其活性的可靠作用靶點，對于疾病治療具有重大意義。
椎間CEP細胞在炎癥性應激下進行性退變發生異常凋亡，進而導致椎間盤組織功能障礙，這是腰椎、頸椎等發生病變的始動因素[2]。當患者椎間CEP出現退變后，嚴重影響椎間盤組織營養物質、氧氣的傳輸以及代謝廢棄物的清除，如不能及時有效控制其進展，會導致椎間盤內乳酸含量升高，有機氧含量明顯下降，刺激椎間盤內TNF-α等促炎介質釋放，以及相關基質金屬蛋白酶的轉錄與翻譯，誘導更為激烈的炎癥性應激，推動椎間CEP細胞大范圍凋亡，同時更進一步降低Ⅱ型膠原蛋白等骨架蛋白以及相關代謝因子的合成[3]。因此抑制椎間盤組織中炎癥性應激，緩解椎間CEP退變進程，減輕椎間盤組織的病理損傷，為椎間盤退行性疾病的臨床治療提供了新途徑。
高遷移率蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種在真核生物的組織和細胞中廣泛分布的小分子蛋白。研究顯示[4]HMGB1在骨關節炎、類風濕關節炎等多種炎癥性疾病中表達升高，參與調控疾病的進展。Shen等[5]研究顯示在膠原誘導的小鼠關節炎模型中，HMGB1通過調控細胞外信號調節激酶（extracellular singal-regulated protein kinase，ERK）的活性，參與軟骨細胞的分化與凋亡。但是有關HMGB1-ERK信號在椎間盤病變中作用的報道較少。 白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種具有生物活性的多酚類天然產物，具有良好的免疫調節及抗炎、抗癌、抗氧化等作用。Fan等[6]研究發現在痛風性關節炎小鼠模型中，RES能明顯抑制炎癥因子釋放，緩解軟骨細胞損傷。本研究基于HMGB1-ERK信號，探討RES對椎間盤退行性病變中椎間CEP的作用，以期為疾病的臨床治療提供更多研究基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3周齡健康雄性SD大鼠1只，體質量80 g；7～8周齡健康雄性SD大鼠50只，體質量80～100 g；購自廣州銳格生物科技有限公司，于我院動物房中以標準飼料、自由飲水適應性喂養1周后用于實驗。
pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）、陰性對照無義序列pcDNA3.1-scramble均由上海Sangon Biotech公司設計完成。磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、 B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia 2 gene，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；Western blot試劑盒、HE染色試劑盒、ELISA試劑盒、TUNEL染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（HyClone公司，美國）。
組織包埋機、切片機（Leica公司，德國）；BX43光學顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；臺式離心機（上海精宏實驗設備有限公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Promega公司，美國）。
1.2 椎間CEP細胞分離、培養及鑒定
取3周齡SD大鼠1只，以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠背部向上固定于手術臺上，備皮，作縱切口暴露大鼠椎間盤；取椎間軟骨組織，PBS清洗3次后剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，離心半徑12 cm、1 000 r/min離心10 min；棄上清，收集沉淀物，轉移至DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，每2天更換培養基，待細胞完全貼壁后進行傳代，光鏡下觀察細胞形態。取對數生長期的第3代椎間CEP細胞用于后續實驗。
將第3代椎間CEP細胞置于DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，待90%細胞完成爬片后，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗，分別采用甲苯胺藍染色、兔抗大鼠Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色進行鑒定[7]。
1.3 CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
參照文獻 ［8］ 方法進行檢測。取椎間CEP細胞并調整至1×104個/孔接種于96孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h后，分別以0、10、20、30、40 μmol/L RES預處理24 h；之后加入10 ng/mL IL-1β，繼續于37℃、5%CO2條件下培養24、48、72 h，PBS清洗后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃避光孵育2 h，酶標儀檢測各組在波長450 nm處的吸光度（A）值，篩選最佳RES濃度。
1.4 基因芯片分析RES對椎間CEP細胞的作用靶點
參照文獻 ［9］ 方法進行檢測。取椎間CEP細胞并調整至1×104個/孔接種于96孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h后以最佳濃度RES預處理24 h作為實驗組，不添加RES繼續培養24 h為對照組；之后加入10 ng/mL IL-1β繼續于37℃、5%CO2條件下培養24 h。PBS清洗后，TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，再體外合成cDNA，純化，雜交，Affymix基因芯片分析，將數據通過Feature Extraction軟件分析；滿足P<0.05、Fold Change≥2的基因為差異表達基因，并繪制基因火山圖和熱圖。
同時行qRT-PCR檢測進行驗證。常規提取樣本中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測定完整性，分光光度計檢測其濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，嚴格按照各試劑盒說明書，上機進行PCR擴增。反應體系：預變性，2 min，95℃；變性，30 s，95℃；退火，35 s，60℃；40個循環。以GAPDH作為參照物，相關基因的相對表達以2?ΔΔCt進行計算。引物序列見表1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of each gene in qRT-PCR detection
1.5 RES對椎間CEP細胞的影響
參照文獻 ［10］ 方法，調整椎間CEP細胞濃度，以1×106個/孔接種于24孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h。取正常椎間CEP細胞不作任何處理作為對照（A組）；另外分別以10 ng/mL IL-1β（B組）、10 ng/mL IL-1β+pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）（C組）、10 ng/mL IL-1β+30 μmol/L RES（D組）、10 ng/mL IL-1β+30 μmol/L RES+pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）（E組）處理細胞，于37℃、5%CO2條件下培養24 h，光鏡下觀察各組細胞形態變化。然后以預冷PBS緩沖液洗滌細胞，離心半徑12 cm、1 000 r/min離心5 min，留取細胞沉淀。重懸細胞后，依次加入200 mL Annexin-V-FITC、10 μL碘化丙啶，避光靜置15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；同時使用ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α含量。取適量各組細胞，參照文獻 ［11］ 方法行Western blot檢測目的蛋白HMGB1、ERK、p-ERK、Bcl-2和Bax相對表達量。
1.6 動物實驗
將RES超細粉以DMSO配制成20 mg/mL溶液，參照Jiang等[12]報道的人與動物劑量的換算關系，計算大鼠的使用劑量為50 mg/kg。將50只7～8周齡SD大鼠隨機分為A1～E1組，每組10只。大鼠術前禁食不禁水12 h，B1～E1組大鼠參照Kim等[13]方法制備椎間CEP退行性病變模型，以50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，備皮，于無菌操作臺上充分暴露L5、6，通過30 G穿刺針穿刺注射[14]IL-1β（400 ng/kg、100 μL）；A1組注射等量生理鹽水。造模后D1組大鼠每日腹腔注射50 mg/kg RES，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-scramble；E1組每日腹腔注射50 mg/kg RES，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）；C1組每日腹腔注射50 mg/kg DMSO，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）；A1、B1組每日腹腔注射50 mg/kg DMSO，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-scramble。
連續處理14 d后，進行以下觀測：① ELISA檢測：每只大鼠取靜脈血5 mL，使用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中IL-10和TNF-α的含量。② HE染色：斷頭處死大鼠，剝離其L5、6椎間盤組織，生理鹽水清洗3次，多聚甲醛固定，石蠟包埋，50 nm厚切片。取部分切片行HE染色，光鏡下觀察大鼠椎間盤組織的病理損傷情況[12]。③ TUNEL染色：取部分切片行TUNEL染色，光鏡下觀察大鼠椎間CEP細胞的凋亡情況，按文獻 ［15］ 方法定量檢測大鼠椎間CEP細胞凋亡率。④ Western blot檢測：取適量各組大鼠椎間盤組織，參照文獻 ［11］方法行Western blot檢測目的蛋白HMGB1、ERK、p-ERK、Bcl-2和Bax相對表達量。
1.7 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料若符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素分析，兩兩比較采用LSD檢驗；若不符合正態分布，數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠椎間CEP細胞鑒定
光鏡下觀察示，細胞培養24 h后逐漸開始貼壁，呈梭形生長；7 d后出現細胞間突起，周圍出現基質樣物質沉淀；第3代細胞生長旺盛，呈鵝卵石狀。甲苯胺藍染色示細胞質被染成紫紅色，Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色呈陽性，提示所培養細胞為大鼠椎間CEP細胞。見圖1。
圖1
大鼠椎間CEP細胞鑒定
a. 第3代細胞形態觀察（×400）；b. 甲苯胺藍染色（倒置顯微鏡×200）；c. Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）
Figure1. The identification of rat intervertebral CEP cellsa. The morphological observation of cells at third passage (×400); b. Toluidine blue staining (Inverted microscope×200); c. The immunofluorescence staining of collagen type Ⅱ (Fluorescence microscope×200)
2.2 CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
CCK-8法檢測示，24 h時各組A值均降至最低，隨培養時間延長逐漸增高。各時間點30 μmol/L RES組A值顯著高于其余各濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。因此，后續實驗以30 μmol/L作為RES處理濃度。
圖2
CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
Figure2.
The effect of RES on the activity of intervertebral CEP cells detected by CCK-8 assay
2.3 基因芯片分析RES對椎間CEP細胞的作用靶點
將基因芯片分析結果繪制火山圖顯示，與對照組細胞比較，實驗組細胞中有40個基因表達上調，52個基因表達下調；將表達差異較為明顯的基因繪制成熱圖，顯示HMGB1、ERK基因表達差異較其他基因更明顯。采用qRT-PCR進行驗證顯示，實驗組HMGB1、ERK、Bax、TNF-α的mRNA相對表達量較對照組明顯降低，IL-10、Bcl-2的mRNA相對表達量較對照組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。因此推測RES對大鼠椎間CEP細胞的作用靶點為HMGB1-ERK信號。
圖3
RES對大鼠椎間CEP細胞的作用靶點檢測
a. 差異表達基因的火山圖；b：差異表達基因的熱圖；c. qRT-PCR檢測
Figure3. The detection of targets of RES on rat intervertebral CEP cellsa. The volcano plot of differentially expressed genes; b. The heat map of differentially expressed genes; c. qRT-PCR detection
2.4 RES對椎間CEP細胞的影響
2.4.1 細胞形態觀察
光鏡觀察示，A組椎間CEP細胞的細胞核呈圓形，較大，在細胞質中性狀穩定，細胞貼壁生長較快，形狀規則；B組細胞染色質出現明顯聚集，細胞生長緩慢，出現較多漂浮細胞；C組培養基中出現的漂浮細胞數量明顯多于B組，細胞核固縮更嚴重，細胞形狀不規則；D組貼壁生長的細胞數量較B組明顯增多，細胞核性狀趨于正常，幾乎不見漂浮細胞；E組貼壁生長的細胞數量較D組明顯減少，但較B組增多，可見少量漂浮細胞。見圖4。
圖4
各組細胞形態觀察（×200）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組；e. E組
Figure4. The observation of cell morphology in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.4.2 流式細胞儀檢測
A～E組細胞凋亡率分別為2.01%±0.35%、61.03%±1.28%、65.47%±2.76%、20.67%±0.77%、32.18%±0.45%。B～E組細胞凋亡率明顯高于A組，C組明顯高于B組，D、E組明顯低于B組，E組明顯高于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組；e. E組
Figure5. The cell apoptosis detected by flow cytometry in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.4.3 ELISA檢測
與A組比較，B～E組細胞上清液中IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；與B組比較，C組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高，D、E組IL-10含量明顯升高、TNF-α含量明顯降低；與D組比較，E組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；上述差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
ELISA法檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-10含量
a. TNF-α；b. IL-10
Figure6. The contents of TNF-α and IL-10 in the supernatant of cells of each group detected by ELISA methoda. TNF-α; b. IL-10
2.4.4 Western blot檢測
ERK蛋白相對表達量各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與A組比較，B～E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；與B組比較，C組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，D、E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯降低，Bcl-2蛋白相對表達量明顯升高；與D組比較，E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低。以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
Western blot檢測各組細胞中蛋白表達
a. 電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組；b. 各蛋白相對表達量
Figure7. The protein expressions in cells of each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E; b. The relative expression of each protein
2.5 動物實驗
2.5.1 ELISA檢測
與A1組比較，B1～E1組大鼠血清中IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；與B1組比較，C1組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高，D1、E1組IL-10含量明顯升高、TNF-α含量明顯降低；與D1組比較，E1組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-10含量
a. TNF-α；b. IL-10
Figure8. The contents of TNF-α and IL-10 in serum of rats in each group detected by ELISAa. TNF-α; b. IL-10
2.5.2 HE染色
A1組大鼠椎間CEP細胞數量豐富，膠原清晰可辨，排列整齊，未見炎癥浸潤或鈣化等現象；B1組大鼠椎間CEP細胞數量明顯減少，密度隨之減小，膠原或斷裂或缺失，失去規則形狀，炎癥細胞大量浸潤，多處出現鈣化點；C1組大鼠椎間CEP細胞減少更為明顯，炎癥浸潤及鈣化點數量較A1組嚴重；D1組大鼠椎間CEP細胞數量明顯回升，炎癥浸潤明顯緩解，偶見鈣化點；E1組大鼠椎間CEP細胞損傷較B1組輕，但比D1組嚴重。見圖9。
圖9
各組大鼠椎間盤組織HE染色觀察（×400）
a. A1組；b. B1組；c. C1組；d. D1組；e. E1組
Figure9. HE staining observation of rat intervertebral disc tissue in each group (×400)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1; e. Group E1
2.5.3 TUNEL染色
A1～E1組大鼠椎間CEP細胞的凋亡率分別為8.35%±0.79%、33.14%±1.31%、37.48%±0.89%、18.24%±1.36%、23.67%±2.25%。與A1組比較，B1～E1組細胞凋亡率明顯升高；與B1組比較，C1組細胞凋亡率明顯升高，D1、E1組細胞凋亡率明顯降低；與D1組比較，E1組細胞凋亡率明顯升高；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10。
圖10
各組大鼠椎間盤組織TUNEL染色觀察（×400）
a. A1組；b. B1組；c. C1組；d. D1組；e. E1組
Figure10. TUNEL staining observation of rat intervertebral disc tissue in each group (×400)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1; e. Group E1
2.5.4 Western blot檢測
ERK蛋白相對表達量各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與A1組比較，B1～E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；與B1組比較，C1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，D1、E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯降低，Bcl-2蛋白相對表達量明顯升高；與D1組比較，E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低。以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11。
圖11
Western blot檢測各組大鼠椎間盤組織中蛋白表達
a. 電泳圖 1：A1組 2：B1組 3：C1組 4：D1組 5：E1組；b. 各蛋白相對表達量
Figure11. The protein expressions of rat intervertebral disc tissue in each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1 5: Group E1; b. The relative expression of each protein
3 討論
椎間盤退行性病變過程中發生的椎間盤組織結構性損傷、中樞性椎間盤內營養物質供應失衡、細胞代謝終產物逐漸集聚，以及細胞外基質日益降解等情況，均與處于椎間盤內炎癥性微環境中的椎間CEP細胞退變密切相關[16-17]。Gorth等[18]研究指出IL-1β在椎間盤退行性病變中發揮關鍵作用，并且細胞和動物模型顯示IL-1β含量的變化直接影響椎間CEP細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達。眾所周知，IL-1β是一種細胞進行炎癥性應激的早期介質，炎癥性應激的進展以及炎癥后期介質將如何影響椎間CEP細胞的退變[19]，相關報道較少。炎癥性應激的晚期介質HMGB1在關節炎、強直性脊柱炎等炎癥性疾病的進展中發揮重要作用[20]，但在椎間盤退行性病變中作用的報道較少。研究顯示[21]在椎間盤退行性病變過程中，椎間CEP細胞因椎間盤內環境pH值的改變以及酸性有害物質的積累等，CEP中促炎因子如TNF-α大量合成、表達、釋放，相關抗炎因子如IL-10表達受限，HMGB1表達被激活（HMGB1的激活能促進更為廣泛的炎癥相關信號轉錄與翻譯[22]），這些炎癥信號的正反饋推動了更大范圍的HMGB1釋放，促進其下游分子ERK磷酸化，將炎癥信號傳導至細胞核，甚至周圍細胞、組織中，將炎癥性應激的反應級聯放大[23]，誘導椎間CEP細胞的異常凋亡。本研究采用IL-1β制備椎間CEP細胞的炎癥環境，體外實驗結果顯示，RES能明顯增強炎癥環境中椎間CEP細胞的生長活性，降低其凋亡率，降低促炎因子TNF-α的釋放，升高抗炎因子IL-10的含量，并且抑制HMGB1的表達，抑制椎間CEP細胞的體外炎癥性應激。上述結果提示HMGB1作為CEP退行性病變治療的靶點具有十分廣闊的前景。
已有研究證實[24-25]抗HMGB1治療可減輕骨性類風濕關節炎、脊髓缺血再灌注損傷等炎癥性疾病中組織的病理損傷，緩解骨相關組織的功能障礙。賀亞軍等[26]研究報道在大鼠脊髓損傷模型中，抑制HMGB1信號傳導，能明顯減少實驗動物膠質瘢痕形成，降低炎癥因子釋放，促進其后肢運動功能恢復。Kawakubo等[27]研究顯示在脂多糖誘導的小鼠椎間盤損傷模型中，進行抗HMGB1治療能明顯抑制椎間盤內椎間CEP細胞凋亡，改善小鼠椎間盤組織的功能。本研究中動物實驗結果顯示，在SD大鼠椎間盤CEP退行性病變模型中，D1組大鼠椎間盤組織損傷明顯緩解，椎間CEP細胞凋亡率明顯下降，血清中的TNF-α含量降低、IL-10含量升高，組織中HMGB1的表達以及p-ERK水平明顯下降，提示了RES對HMGB1信號存在一定抑制作用，提示該信號可能為RES的作用靶點。并以pcDNA3.1-HMGB1在體外與體內進行了功能挽救實驗，細胞及動物實驗觀測指標顯示，E組及E1組均明顯差于D組及D1組，提示RES+pcDNA3.1能部分逆轉RES對HMGB1信號的抑制作用，也印證了RES在疾病中的作用位點。
綜上述，RES能明顯抑制炎癥誘導的椎間CEP細胞凋亡，這與抑制HMGB1的表達有關。但是如何將這一作用應用到臨床治療中，尚需較大臨床樣本量和更為系統的研究進一步明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經承德醫學院附屬醫院動物倫理委員會審核批準（20210126-A）；動物使用許可證號：SYXK（冀）2021-004，動物生產許可證號SCXK（粵）2021-0059
作者貢獻聲明 胡華：設計細胞實驗和數據整理、統計分析；李連泰：設計動物實驗和數據整理、統計分析；劉艷偉、王書君：動物飼養和試劑采購；謝雙喜、孫建君：儀器操作及設備維護
隨著我國居民日常生活狀態的改變，椎間盤退行性疾病發生率逐年升高，呈現年輕化趨勢，嚴重影響人們生活質量。此類疾病發展過程中，患者的椎間盤組織水分含量下降，膠原蛋白膜通透性隨之改變，纖維環膠原受損，細胞排列紊亂，椎間軟骨終板（cartilage endplate，CEP）細胞的結構隨之改變，甚至形成骨化[1]。因此，深入揭示椎間CEP細胞退變的分子機制，尋找維系其活性的可靠作用靶點，對于疾病治療具有重大意義。
椎間CEP細胞在炎癥性應激下進行性退變發生異常凋亡，進而導致椎間盤組織功能障礙，這是腰椎、頸椎等發生病變的始動因素[2]。當患者椎間CEP出現退變后，嚴重影響椎間盤組織營養物質、氧氣的傳輸以及代謝廢棄物的清除，如不能及時有效控制其進展，會導致椎間盤內乳酸含量升高，有機氧含量明顯下降，刺激椎間盤內TNF-α等促炎介質釋放，以及相關基質金屬蛋白酶的轉錄與翻譯，誘導更為激烈的炎癥性應激，推動椎間CEP細胞大范圍凋亡，同時更進一步降低Ⅱ型膠原蛋白等骨架蛋白以及相關代謝因子的合成[3]。因此抑制椎間盤組織中炎癥性應激，緩解椎間CEP退變進程，減輕椎間盤組織的病理損傷，為椎間盤退行性疾病的臨床治療提供了新途徑。
高遷移率蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種在真核生物的組織和細胞中廣泛分布的小分子蛋白。研究顯示[4]HMGB1在骨關節炎、類風濕關節炎等多種炎癥性疾病中表達升高，參與調控疾病的進展。Shen等[5]研究顯示在膠原誘導的小鼠關節炎模型中，HMGB1通過調控細胞外信號調節激酶（extracellular singal-regulated protein kinase，ERK）的活性，參與軟骨細胞的分化與凋亡。但是有關HMGB1-ERK信號在椎間盤病變中作用的報道較少。 白藜蘆醇（resveratrol，RES）是一種具有生物活性的多酚類天然產物，具有良好的免疫調節及抗炎、抗癌、抗氧化等作用。Fan等[6]研究發現在痛風性關節炎小鼠模型中，RES能明顯抑制炎癥因子釋放，緩解軟骨細胞損傷。本研究基于HMGB1-ERK信號，探討RES對椎間盤退行性病變中椎間CEP的作用，以期為疾病的臨床治療提供更多研究基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3周齡健康雄性SD大鼠1只，體質量80 g；7～8周齡健康雄性SD大鼠50只，體質量80～100 g；購自廣州銳格生物科技有限公司，于我院動物房中以標準飼料、自由飲水適應性喂養1周后用于實驗。
pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）、陰性對照無義序列pcDNA3.1-scramble均由上海Sangon Biotech公司設計完成。磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、 B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia 2 gene，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；Western blot試劑盒、HE染色試劑盒、ELISA試劑盒、TUNEL染色試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒（HyClone公司，美國）。
組織包埋機、切片機（Leica公司，德國）；BX43光學顯微鏡、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；臺式離心機（上海精宏實驗設備有限公司）；超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Promega公司，美國）。
1.2 椎間CEP細胞分離、培養及鑒定
取3周齡SD大鼠1只，以40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，將大鼠背部向上固定于手術臺上，備皮，作縱切口暴露大鼠椎間盤；取椎間軟骨組織，PBS清洗3次后剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，離心半徑12 cm、1 000 r/min離心10 min；棄上清，收集沉淀物，轉移至DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，每2天更換培養基，待細胞完全貼壁后進行傳代，光鏡下觀察細胞形態。取對數生長期的第3代椎間CEP細胞用于后續實驗。
將第3代椎間CEP細胞置于DMEM培養基中，37℃、5%CO2條件下培養，待90%細胞完成爬片后，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗，分別采用甲苯胺藍染色、兔抗大鼠Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色進行鑒定[7]。
1.3 CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
參照文獻 ［8］ 方法進行檢測。取椎間CEP細胞并調整至1×104個/孔接種于96孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h后，分別以0、10、20、30、40 μmol/L RES預處理24 h；之后加入10 ng/mL IL-1β，繼續于37℃、5%CO2條件下培養24、48、72 h，PBS清洗后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃避光孵育2 h，酶標儀檢測各組在波長450 nm處的吸光度（A）值，篩選最佳RES濃度。
1.4 基因芯片分析RES對椎間CEP細胞的作用靶點
參照文獻 ［9］ 方法進行檢測。取椎間CEP細胞并調整至1×104個/孔接種于96孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h后以最佳濃度RES預處理24 h作為實驗組，不添加RES繼續培養24 h為對照組；之后加入10 ng/mL IL-1β繼續于37℃、5%CO2條件下培養24 h。PBS清洗后，TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，再體外合成cDNA，純化，雜交，Affymix基因芯片分析，將數據通過Feature Extraction軟件分析；滿足P<0.05、Fold Change≥2的基因為差異表達基因，并繪制基因火山圖和熱圖。
同時行qRT-PCR檢測進行驗證。常規提取樣本中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測定完整性，分光光度計檢測其濃度和純度，逆轉錄合成cDNA，嚴格按照各試劑盒說明書，上機進行PCR擴增。反應體系：預變性，2 min，95℃；變性，30 s，95℃；退火，35 s，60℃；40個循環。以GAPDH作為參照物，相關基因的相對表達以2?ΔΔCt進行計算。引物序列見表1。
表1
qRT-PCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of each gene in qRT-PCR detection
1.5 RES對椎間CEP細胞的影響
參照文獻 ［10］ 方法，調整椎間CEP細胞濃度，以1×106個/孔接種于24孔培養板，37℃、5%CO2條件下培養24 h。取正常椎間CEP細胞不作任何處理作為對照（A組）；另外分別以10 ng/mL IL-1β（B組）、10 ng/mL IL-1β+pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）（C組）、10 ng/mL IL-1β+30 μmol/L RES（D組）、10 ng/mL IL-1β+30 μmol/L RES+pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）（E組）處理細胞，于37℃、5%CO2條件下培養24 h，光鏡下觀察各組細胞形態變化。然后以預冷PBS緩沖液洗滌細胞，離心半徑12 cm、1 000 r/min離心5 min，留取細胞沉淀。重懸細胞后，依次加入200 mL Annexin-V-FITC、10 μL碘化丙啶，避光靜置15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率；同時使用ELISA試劑盒檢測各組細胞上清液中抗炎因子IL-10和促炎因子TNF-α含量。取適量各組細胞，參照文獻 ［11］ 方法行Western blot檢測目的蛋白HMGB1、ERK、p-ERK、Bcl-2和Bax相對表達量。
1.6 動物實驗
將RES超細粉以DMSO配制成20 mg/mL溶液，參照Jiang等[12]報道的人與動物劑量的換算關系，計算大鼠的使用劑量為50 mg/kg。將50只7～8周齡SD大鼠隨機分為A1～E1組，每組10只。大鼠術前禁食不禁水12 h，B1～E1組大鼠參照Kim等[13]方法制備椎間CEP退行性病變模型，以50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，備皮，于無菌操作臺上充分暴露L5、6，通過30 G穿刺針穿刺注射[14]IL-1β（400 ng/kg、100 μL）；A1組注射等量生理鹽水。造模后D1組大鼠每日腹腔注射50 mg/kg RES，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-scramble；E1組每日腹腔注射50 mg/kg RES，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）；C1組每日腹腔注射50 mg/kg DMSO，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-HMGB1（pcDNA3.1）；A1、B1組每日腹腔注射50 mg/kg DMSO，同時椎間盤組織注射pcDNA3.1-scramble。
連續處理14 d后，進行以下觀測：① ELISA檢測：每只大鼠取靜脈血5 mL，使用ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清中IL-10和TNF-α的含量。② HE染色：斷頭處死大鼠，剝離其L5、6椎間盤組織，生理鹽水清洗3次，多聚甲醛固定，石蠟包埋，50 nm厚切片。取部分切片行HE染色，光鏡下觀察大鼠椎間盤組織的病理損傷情況[12]。③ TUNEL染色：取部分切片行TUNEL染色，光鏡下觀察大鼠椎間CEP細胞的凋亡情況，按文獻 ［15］ 方法定量檢測大鼠椎間CEP細胞凋亡率。④ Western blot檢測：取適量各組大鼠椎間盤組織，參照文獻 ［11］方法行Western blot檢測目的蛋白HMGB1、ERK、p-ERK、Bcl-2和Bax相對表達量。
1.7 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料若符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素分析，兩兩比較采用LSD檢驗；若不符合正態分布，數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠椎間CEP細胞鑒定
光鏡下觀察示，細胞培養24 h后逐漸開始貼壁，呈梭形生長；7 d后出現細胞間突起，周圍出現基質樣物質沉淀；第3代細胞生長旺盛，呈鵝卵石狀。甲苯胺藍染色示細胞質被染成紫紅色，Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色呈陽性，提示所培養細胞為大鼠椎間CEP細胞。見圖1。
圖1
大鼠椎間CEP細胞鑒定
a. 第3代細胞形態觀察（×400）；b. 甲苯胺藍染色（倒置顯微鏡×200）；c. Ⅱ型膠原蛋白細胞免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）
Figure1. The identification of rat intervertebral CEP cellsa. The morphological observation of cells at third passage (×400); b. Toluidine blue staining (Inverted microscope×200); c. The immunofluorescence staining of collagen type Ⅱ (Fluorescence microscope×200)
2.2 CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
CCK-8法檢測示，24 h時各組A值均降至最低，隨培養時間延長逐漸增高。各時間點30 μmol/L RES組A值顯著高于其余各濃度組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。因此，后續實驗以30 μmol/L作為RES處理濃度。
圖2
CCK-8法檢測RES對椎間CEP細胞活性的影響
Figure2.
The effect of RES on the activity of intervertebral CEP cells detected by CCK-8 assay
2.3 基因芯片分析RES對椎間CEP細胞的作用靶點
將基因芯片分析結果繪制火山圖顯示，與對照組細胞比較，實驗組細胞中有40個基因表達上調，52個基因表達下調；將表達差異較為明顯的基因繪制成熱圖，顯示HMGB1、ERK基因表達差異較其他基因更明顯。采用qRT-PCR進行驗證顯示，實驗組HMGB1、ERK、Bax、TNF-α的mRNA相對表達量較對照組明顯降低，IL-10、Bcl-2的mRNA相對表達量較對照組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。因此推測RES對大鼠椎間CEP細胞的作用靶點為HMGB1-ERK信號。
圖3
RES對大鼠椎間CEP細胞的作用靶點檢測
a. 差異表達基因的火山圖；b：差異表達基因的熱圖；c. qRT-PCR檢測
Figure3. The detection of targets of RES on rat intervertebral CEP cellsa. The volcano plot of differentially expressed genes; b. The heat map of differentially expressed genes; c. qRT-PCR detection
2.4 RES對椎間CEP細胞的影響
2.4.1 細胞形態觀察
光鏡觀察示，A組椎間CEP細胞的細胞核呈圓形，較大，在細胞質中性狀穩定，細胞貼壁生長較快，形狀規則；B組細胞染色質出現明顯聚集，細胞生長緩慢，出現較多漂浮細胞；C組培養基中出現的漂浮細胞數量明顯多于B組，細胞核固縮更嚴重，細胞形狀不規則；D組貼壁生長的細胞數量較B組明顯增多，細胞核性狀趨于正常，幾乎不見漂浮細胞；E組貼壁生長的細胞數量較D組明顯減少，但較B組增多，可見少量漂浮細胞。見圖4。
圖4
各組細胞形態觀察（×200）
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組；e. E組
Figure4. The observation of cell morphology in each group (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.4.2 流式細胞儀檢測
A～E組細胞凋亡率分別為2.01%±0.35%、61.03%±1.28%、65.47%±2.76%、20.67%±0.77%、32.18%±0.45%。B～E組細胞凋亡率明顯高于A組，C組明顯高于B組，D、E組明顯低于B組，E組明顯高于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況
a. A組；b. B組；c. C組；d. D組；e. E組
Figure5. The cell apoptosis detected by flow cytometry in each groupa. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.4.3 ELISA檢測
與A組比較，B～E組細胞上清液中IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；與B組比較，C組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高，D、E組IL-10含量明顯升高、TNF-α含量明顯降低；與D組比較，E組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；上述差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
ELISA法檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-10含量
a. TNF-α；b. IL-10
Figure6. The contents of TNF-α and IL-10 in the supernatant of cells of each group detected by ELISA methoda. TNF-α; b. IL-10
2.4.4 Western blot檢測
ERK蛋白相對表達量各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與A組比較，B～E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；與B組比較，C組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高、Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，D、E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯降低，Bcl-2蛋白相對表達量明顯升高；與D組比較，E組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低。以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
Western blot檢測各組細胞中蛋白表達
a. 電泳圖 1：A組 2：B組 3：C組 4：D組 5：E組；b. 各蛋白相對表達量
Figure7. The protein expressions in cells of each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram 1: Group A 2: Group B 3: Group C 4: Group D 5: Group E; b. The relative expression of each protein
2.5 動物實驗
2.5.1 ELISA檢測
與A1組比較，B1～E1組大鼠血清中IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；與B1組比較，C1組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高，D1、E1組IL-10含量明顯升高、TNF-α含量明顯降低；與D1組比較，E1組IL-10含量明顯降低、TNF-α含量明顯升高；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
ELISA法檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-10含量
a. TNF-α；b. IL-10
Figure8. The contents of TNF-α and IL-10 in serum of rats in each group detected by ELISAa. TNF-α; b. IL-10
2.5.2 HE染色
A1組大鼠椎間CEP細胞數量豐富，膠原清晰可辨，排列整齊，未見炎癥浸潤或鈣化等現象；B1組大鼠椎間CEP細胞數量明顯減少，密度隨之減小，膠原或斷裂或缺失，失去規則形狀，炎癥細胞大量浸潤，多處出現鈣化點；C1組大鼠椎間CEP細胞減少更為明顯，炎癥浸潤及鈣化點數量較A1組嚴重；D1組大鼠椎間CEP細胞數量明顯回升，炎癥浸潤明顯緩解，偶見鈣化點；E1組大鼠椎間CEP細胞損傷較B1組輕，但比D1組嚴重。見圖9。
圖9
各組大鼠椎間盤組織HE染色觀察（×400）
a. A1組；b. B1組；c. C1組；d. D1組；e. E1組
Figure9. HE staining observation of rat intervertebral disc tissue in each group (×400)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1; e. Group E1
2.5.3 TUNEL染色
A1～E1組大鼠椎間CEP細胞的凋亡率分別為8.35%±0.79%、33.14%±1.31%、37.48%±0.89%、18.24%±1.36%、23.67%±2.25%。與A1組比較，B1～E1組細胞凋亡率明顯升高；與B1組比較，C1組細胞凋亡率明顯升高，D1、E1組細胞凋亡率明顯降低；與D1組比較，E1組細胞凋亡率明顯升高；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10。
圖10
各組大鼠椎間盤組織TUNEL染色觀察（×400）
a. A1組；b. B1組；c. C1組；d. D1組；e. E1組
Figure10. TUNEL staining observation of rat intervertebral disc tissue in each group (×400)a. Group A1; b. Group B1; c. Group C1; d. Group D1; e. Group E1
2.5.4 Western blot檢測
ERK蛋白相對表達量各組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。與A1組比較，B1～E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低；與B1組比較，C1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低，D1、E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯降低，Bcl-2蛋白相對表達量明顯升高；與D1組比較，E1組HMGB1、p-ERK、Bax蛋白相對表達量明顯升高，Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低。以上差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖11。
圖11
Western blot檢測各組大鼠椎間盤組織中蛋白表達
a. 電泳圖 1：A1組 2：B1組 3：C1組 4：D1組 5：E1組；b. 各蛋白相對表達量
Figure11. The protein expressions of rat intervertebral disc tissue in each group detected by Western blota. Electrophoresis diagram 1: Group A1 2: Group B1 3: Group C1 4: Group D1 5: Group E1; b. The relative expression of each protein
3 討論
椎間盤退行性病變過程中發生的椎間盤組織結構性損傷、中樞性椎間盤內營養物質供應失衡、細胞代謝終產物逐漸集聚，以及細胞外基質日益降解等情況，均與處于椎間盤內炎癥性微環境中的椎間CEP細胞退變密切相關[16-17]。Gorth等[18]研究指出IL-1β在椎間盤退行性病變中發揮關鍵作用，并且細胞和動物模型顯示IL-1β含量的變化直接影響椎間CEP細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的表達。眾所周知，IL-1β是一種細胞進行炎癥性應激的早期介質，炎癥性應激的進展以及炎癥后期介質將如何影響椎間CEP細胞的退變[19]，相關報道較少。炎癥性應激的晚期介質HMGB1在關節炎、強直性脊柱炎等炎癥性疾病的進展中發揮重要作用[20]，但在椎間盤退行性病變中作用的報道較少。研究顯示[21]在椎間盤退行性病變過程中，椎間CEP細胞因椎間盤內環境pH值的改變以及酸性有害物質的積累等，CEP中促炎因子如TNF-α大量合成、表達、釋放，相關抗炎因子如IL-10表達受限，HMGB1表達被激活（HMGB1的激活能促進更為廣泛的炎癥相關信號轉錄與翻譯[22]），這些炎癥信號的正反饋推動了更大范圍的HMGB1釋放，促進其下游分子ERK磷酸化，將炎癥信號傳導至細胞核，甚至周圍細胞、組織中，將炎癥性應激的反應級聯放大[23]，誘導椎間CEP細胞的異常凋亡。本研究采用IL-1β制備椎間CEP細胞的炎癥環境，體外實驗結果顯示，RES能明顯增強炎癥環境中椎間CEP細胞的生長活性，降低其凋亡率，降低促炎因子TNF-α的釋放，升高抗炎因子IL-10的含量，并且抑制HMGB1的表達，抑制椎間CEP細胞的體外炎癥性應激。上述結果提示HMGB1作為CEP退行性病變治療的靶點具有十分廣闊的前景。
已有研究證實[24-25]抗HMGB1治療可減輕骨性類風濕關節炎、脊髓缺血再灌注損傷等炎癥性疾病中組織的病理損傷，緩解骨相關組織的功能障礙。賀亞軍等[26]研究報道在大鼠脊髓損傷模型中，抑制HMGB1信號傳導，能明顯減少實驗動物膠質瘢痕形成，降低炎癥因子釋放，促進其后肢運動功能恢復。Kawakubo等[27]研究顯示在脂多糖誘導的小鼠椎間盤損傷模型中，進行抗HMGB1治療能明顯抑制椎間盤內椎間CEP細胞凋亡，改善小鼠椎間盤組織的功能。本研究中動物實驗結果顯示，在SD大鼠椎間盤CEP退行性病變模型中，D1組大鼠椎間盤組織損傷明顯緩解，椎間CEP細胞凋亡率明顯下降，血清中的TNF-α含量降低、IL-10含量升高，組織中HMGB1的表達以及p-ERK水平明顯下降，提示了RES對HMGB1信號存在一定抑制作用，提示該信號可能為RES的作用靶點。并以pcDNA3.1-HMGB1在體外與體內進行了功能挽救實驗，細胞及動物實驗觀測指標顯示，E組及E1組均明顯差于D組及D1組，提示RES+pcDNA3.1能部分逆轉RES對HMGB1信號的抑制作用，也印證了RES在疾病中的作用位點。
綜上述，RES能明顯抑制炎癥誘導的椎間CEP細胞凋亡，這與抑制HMGB1的表達有關。但是如何將這一作用應用到臨床治療中，尚需較大臨床樣本量和更為系統的研究進一步明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經承德醫學院附屬醫院動物倫理委員會審核批準（20210126-A）；動物使用許可證號：SYXK（冀）2021-004，動物生產許可證號SCXK（粵）2021-0059
作者貢獻聲明 胡華：設計細胞實驗和數據整理、統計分析；李連泰：設計動物實驗和數據整理、統計分析；劉艷偉、王書君：動物飼養和試劑采購；謝雙喜、孫建君：儀器操作及設備維護
