引用本文： 謝慧鋒, 周偉, 白波, 張姝江. 軟骨組織工程中種子細胞接種密度和比例的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(4): 470-478. doi: 10.7507/1002-1892.202110091 復制
關節軟骨缺少血管、神經，營養主要來源于關節液，損傷后難以自我修復，從而導致骨關節炎的發生[1]。自然條件下損傷軟骨由纖維瘢痕組織修復[2]，不能達到天然軟骨力學特性。目前，骨關節炎的治療一般采用關節腔內注射、微骨折、軟骨移植等方法，但均存在很大局限性，且效果不佳，患者最終仍不可避免需要接受關節置換手術[3-7]。
軟骨組織工程技術是目前針對軟骨缺損的一項有前景的治療技術[8]，其核心包括支架、種子細胞、生長因子三要素。其中，支架需要具備一定機械力學特性、生物相容性和可降解性，以及一定的孔徑和孔隙率，為細胞生長及營養物質運輸提供足夠空間[8-9]。關節軟骨細胞（articular chondrocytes，ACHs）是軟骨組織工程中應用最早與研究最多的種子細胞。1999年Brittberg等[10]就報道了運用局部注射自體ACHs的方法，成功修復了膝關節骨關節炎患者的軟骨缺損。但ACHs面臨著細胞來源少、獲取時會造成供區軟骨缺損[11-13]、在體外單層擴增后容易出現去分化的問題[14-17]。軟骨組織工程中另一種常用的種子細胞是BMSCs。BMSCs具有來源廣、擴增快，并且多次傳代后仍具有多向分化能力的優點，在ACHs來源緊缺的情況下，上述優勢更為突出[12，18]。
軟骨組織工程中，確定種子細胞種類后還需選擇適宜的細胞接種密度。如種子細胞接種密度過高，可能由于營養不足使單個細胞分泌基質的能力下降[19-21]，同時會延長細胞體外培養擴增周期，導致細胞發生去分化[14，19-21]；而細胞接種密度過低，則會減少細胞間聯系，不利于細胞分化及軟骨特異性細胞外基質的合成分泌[22-27]。此外，即使種子細胞的接種密度相同，種子細胞的比例不同或支架材料不同，最終細胞外基質的分泌情況也有差異[28]。本文將從種子細胞的接種密度和比例兩方面對ACHs和BMSCs在三維支架中培養的研究作一綜述，以期為構建組織工程軟骨提供參考。
1 正常軟骨的分層結構
宏觀上看似質地均勻的軟骨組織實際上呈分層結構，每層結構的細胞形態和纖維排列方向都不相同。ACHs是軟骨中唯一存在的細胞，呈密度梯度分布，其密度為（7.1±2.1）×106～（24.0±7.5）×106個/cm3，越接近軟骨表面細胞密度越大[29]。關節軟骨表層ACHs占細胞總數的10%～20%，其呈扁平狀，平行于關節面排列；細胞外基質含大量Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，ColⅡ），其排列方向與ACHs相似，平行于關節面有利于抵抗摩擦力和剪切力。中間層占40%～60%，ACHs呈球形，Col Ⅱ無定向網狀交織，纖維直徑和蛋白多糖含量逐漸增加。深層占30%～40%，ACHs呈柱狀，蛋白多糖含量最高而ColⅡ含量少，膠原纖維方向與關節面垂直，有利于抵抗機械壓力。鈣化層約占5%，分布稀疏的ACHs肥大化分泌Ⅹ型膠原（collagen type Ⅹ，ColⅩ）[1，30-32]。鈣化層的膠原纖維把軟骨固定于軟骨下骨。
2 不同接種密度ACHs在三維結構中的研究
為了改進ACHs修復軟骨缺損的方法，許多學者開始探究包括接種細胞密度、支架材料、培養條件等因素的影響（表1）。Mauck等[33]將ACHs以接近或大于天然軟骨中細胞的密度接種于瓊脂糖凝膠中培養9周，并加以動態力學刺激。結果表明相對于天然ACHs密度，更高的細胞接種密度可產生更多膠原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。加以力學刺激后的新生軟骨組織雖然更薄，但具有更強的機械特性。
表1
不同接種密度的ACHs在三維結構中的研究
Table1.
Researches of different seeding densities of ACHs in three-dimensional scaffolds
隨后Saini等[34]研究發現，在左旋聚乳酸 ［poly（L-lactic acid），PLLA］ 支架上的GAG和膠原沉積量也受ACHs接種密度的影響；另外，隨著受到的剪切應力增加，膠原合成增多而GAG沉積減少。對于更低密度的研究，Iwasa等[35]將兔ACHs以0.2×106、2×106、20×106個/mL密度接種于去端膠原蛋白凝膠中培養4周，結果顯示低密度接種的ACHs雖然增殖能力強，但分泌的硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）總量較少，新生軟骨結構的硬度也不如高密度接種組。Moretti等[36]探索了在三維結構中培養的ACHs在體內成軟骨能力，將人ACHs于體外擴增后，以13×106個/mL和76×106個/mL密度接種于透明質酸支架上，最后植入小鼠背部皮下。結果顯示，無論是體內或體外，高密度ACHs都能合成總量更多的GAG和ColⅡ及更少的ColⅠ，同時新生軟骨結構具有更好的生物力學特性。Williams等[37]、Mahmoudifar等[38]分別將ACHs接種于海藻酸鹽與聚乙醇酸支架中培養，得到了類似結論。另外有學者發現，即使是種子細胞接種密度在（30～60）×106個/mL之間，軟骨的機械特性也有顯著差異，高密度組總體表現出更好的機械特性[44，47]。然而，也有學者研究表明，ACHs的接種密度并非越高越好。Cui等[45]首次報道了ACHs加以TGF-β1和FGF-2刺激后，單個細胞成軟骨能力的GAG/DNA比值與ColⅡ/DNA比值在低密度接種組更高。Mesallati等[19]的研究將ACHs接種密度從30×106個/mL增加至136×106個/mL后，單個細胞合成GAG和ColⅡ的能力反而下降，ACHs接種密度過高不利于單個細胞合成細胞外基質。因此推測ACHs的最佳接種密度可能在較低水平。
除了對細胞外基質的檢測，不同接種密度ACHs的基因表達水平也逐漸成為學者們關注的焦點。Wang等[39]報道將ACHs以2×106個/mL與20×106個/mL兩種密度接種于絲素蛋白支架上培養，3周后高密度組的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、ColⅡ、Y染色體性別決定區相關高遷移率族框9 ［SRY（sex-determining region Y）-related high-mobility group box，SOX9］ 基因的轉錄水平及ColⅡ/ ColⅠ基因轉錄水平的比值均顯著高于低密度組，且與ACHs肥大化相關的ColⅩ基因轉錄水平更低。組織染色與ColⅡ免疫組織化學染色結果與ColⅡ基因轉錄水平相一致，表明細胞高密度接種有利于軟骨形成。Cao等[14]通過對比不同接種密度和不同代次的ACHs基因表達水平和在體內成軟骨情況，發現高密度接種與三維結構培養均有利于軟骨特異性基因的表達及軟骨形成。
近年來，生物打印技術成為軟骨組織工程熱點。Ren等[46]利用生物打印技術構建了具有仿生細胞密度梯度的ColⅡ水凝膠復合結構，結果顯示，細胞分布模式和總細胞密度會影響細胞外基質的合成；在第2～3周，中細胞密度組的GAG含量接近高密度組，但單個細胞合成GAG的效率更高。Lam等[48]發現了甲基丙烯酸化明膠（methacrylated gelatin，GelMA）與甲基丙烯酸化透明質酸（methacrylated hyaluronic acid，HAMA）構建的水凝膠在種子細胞密度為5×106 個/mL時幾乎不分泌ColⅡ；但種子細胞密度提高至25×106個/mL時情況改善，同時Ⅱ型膠原α1鏈基因（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和Aggrecan基因的表達水平也得到提高。此外，ACHs在GelMA中ColⅠ基因的表達水平始終較高，說明GelMA可能不是最適合軟骨組織工程的支架材料。
3 不同接種密度BMSCs在三維結構中的研究
BMSCs具有很強的體外擴增能力和多向分化能力，且來源廣泛，可多次反復從骨髓中獲取而不造成供區組織缺損[12，18]。但目前還未能實現完全控制BMSCs在體內、外的分化，即分化后的BMSCs未完全具備成熟ACHs分泌基質的能力，導致形成的軟骨結構力學性能不理想[18，49]。考慮到由BMSCs接種密度不同所造成的影響，20多年來學者們設計了BMSCs的不同細胞密度分組實驗，以探究最終的成軟骨效果（表2）。Ponticiello等[20]將BMSCs以（3～48）×106個/mL密度接種于明膠海綿支架上，并在添加有TGF-β3的培養基中培養21 d，結果顯示，當細胞初始密度達12×106個/mL后，支架上GAG的含量不再隨細胞密度增加而增加，GAG/DNA比值反而減小。表明在支架上過高的細胞密度會抑制細胞分泌基質的功能，這點與ACHs情況類似。然而，該實驗并未對比不同細胞密度間的膠原成分，尚不能推斷12×106個/mL就是BMSCs的最優接種密度。Kavalkovich等[21]發現在細胞接種密度為25×106 個/mL時GAG合成總量及GAG/DNA比值最大；即使增加培養基體積，更高接種密度的BMSCs也會出現合成GAG的能力下降。考慮到支架孔徑影響細胞增殖及營養物質滲透，Bean等[56]對比了不同接種密度的BMSCs在不同直徑大小聚己內酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］ 纖維支架上分泌合成的表現，發現纖維直徑較大的支架具有更大孔徑，更適合細胞增殖與分泌細胞外基質；第6周時最高細胞接種密度組（4×106個/mL）的ColⅠ基因表達水平較低，而ColⅡ基因表達水平最高，相應的ColⅡ分泌總量也最多；Aggrecan基因的表達量雖然稍低于中等細胞接種密度組，但仍能產生最多的GAG總量。除了營養限制以外，還有其他重要因素影響高密度BMSCs分泌基質的能力。Buxton等[53]認為導致高密度BMSCs出現單個細胞分泌基質減少，是營養不足和細胞旁分泌、自分泌反饋調節的結果。該研究結果與Kavalkovich等[21]的報道結論一致，當聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 ［poly（ethylene glycol）dimethacrylate，PEGDA］ 水凝膠中的細胞密度為25×106個/mL時，每個細胞和每個整體結構之間的基質產量達到最優平衡，這個密度也接近天然膝關節軟骨中的細胞密度。相比ACHs，BMSCs的擴增能力強，而且不容易出現去分化。有學者認為BMSCs不需要較高的接種密度，也能得到較好的成軟骨效果。Hui等[51]的研究結果顯示，細胞接種密度達5×106 個/mL時，GAG的含量和GAG/DNA比值均與細胞接種密度成正相關。Pustlauk等[57]認為在H-DMEM和0.125%BSA培養條件下，接種密度為2.4×106個/mL的BMSCs在水母膠原支架中的成軟骨標志物水平最高，細胞外基質沉積效果最好。此密度足以讓BMSCs在支架中成軟骨分化。
表2
不同接種密度BMSCs在三維結構中的研究
Table2.
Researches of different seeding densities of BMSCs in three-dimensional scaffolds
BMSCs的基因表達水平反映了自身分化情況，同樣值得關注。Huang等[50]比較了接種密度為3×106、6×106、9×106個/mL的BMSCs在瓊脂糖中培養3周后的結果，發現在存在TGF-β3的條件下，隨著細胞接種密度增加，ColⅡ基因表達水平逐漸增高；只有達到9×106個/mL接種密度的細胞才表達Aggrecan基因；TGF-β3在上述基因的表達水平對相關基質的合成起促進作用。2009年Li等[52]發現ColⅠ微球中，細胞接種密度達1×106個/mL組的ColⅡ和Aggrecan基因表達水平最高，GAG含量最多，但此細胞密度組已經出現GAG/DNA值下降。
由于BMSCs形成軟骨需要向ACHs分化，大部分學者傾向于在培養基中添加外源性細胞因子，以促進這個過程。然而，Zhang等[54]發現即使不添加外源性細胞因子，ColⅠ支架也可誘導BMSCs向ACHs分化。提高細胞的接種密度可提高BMSCs的SOX9、ColⅡ與Aggrecan基因表達水平和成軟骨能力。Li等[58]的研究結果與Zhang等[54]的報道一致，在支架中加入ColⅠ也可促進BMSCs成軟骨分化。因此高密度接種的BMSCs具有更明顯的軟骨表型和成軟骨能力。
已有文獻報道，組織工程軟骨的生物力學特性尚未能達到研究者預期的標準[61]，仍需繼續探索改進方法。Sun等[59]的研究表明在聚D，L-乳酸/聚乙二醇/聚D，L-乳酸水凝膠中，20×106個/mL組和50×106個/mL組的新生軟骨機械強度在培養第8周后比培養第4周時稍減弱，但總GAG和羥脯氨酸沉積量顯著高于4×106個/mL組和8×106個/mL組，而20×106個/mL組單個細胞分泌基質的效率更高。Kim等[60]發現增加HAMA水凝膠中BMSCs的接種密度，會使新生軟骨力學特性增強，軟骨細胞外基質的含量增多，但會使水凝膠體積收縮，可能是細胞黏附并牽拉材料所致，最終構建的組織工程軟骨大小與預期有一定差距。
4 BMSCs和ACHs在三維結構中共培養
BMSCs和ACHs共培養的目的在于減少所需ACHs的數量與探索兩種細胞間是否有協同形成軟骨的作用。既往學者們猜測ACHs可誘導BMSCs向ACHs分化。雖然成軟骨培養基可誘導BMSCs表達軟骨特異性基因，但Wu等[62-63]通過熒光蛋白標記的方法，證實了在共培養中BMSCs促進軟骨形成的機制并非通過向ACHs分化，而是通過營養作用刺激ACHs增殖和分泌基質。其作用機制是BMSCs可合成多種細胞因子，通過旁分泌、形成細胞外囊泡與膜納米管作用于周圍細胞[64]。Levorson等[23]把牛ACHs與兔BMSCs以1∶0、1∶1、1∶3、1∶5與0∶1的比例混合，并調節成1.75×106個/mL和3.5×106個/mL兩種密度接種于PCL支架上，共培養3周后，1∶1比例組共培養產生的膠原總量少于純ACHs組（1∶0組），但顯著多于其他比例組；此外，按照1∶1比例共培養，低接種密度與高接種密度結果無顯著差異。但此研究中細胞密度分組少，事實上可能存在更優的細胞接種密度范圍。遺憾的是，設計有多個細胞接種密度的ACHs和BMSCs三維共培養的研究寥寥無幾，至今學者們探索更多的是這兩種細胞按照不同比例共培養的成軟骨作用（表3）。Mo等[24]將兔ACHs和人BMSCs以1∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶1比例混合接種于海藻酸鹽水凝膠中培養，結果發現隨培養時間延長和BMSCs比例增大，合成GAG和ColⅡ的量相應增多；直至第28天，1∶2組合成GAG和ColⅡ的量顯著多余其他比例組，且與純ACHs組（1∶0組）相當，而純BMSC組（0∶1組）最少。ColⅡ/ColⅠ基因表達水平比值與之類似，不同的是純ACHs組（1∶0組）的ColⅡ基因表達水平顯著高于其他各組。還值得注意的是，檢測發現共培養中的人BMSCs不表達人特異性ColⅡ基因，因此推測共培養中的BMSCs未直接參與軟骨形成。Meretoja等[25]的研究結果表明，原代ACHs的成軟骨能力強于傳代后的ACHs。此外相比純ACHs組（1∶0），共培養組（ACHs∶BMSCs為1∶1和1∶3）能產生接近甚至更好的成軟骨效果，從而減少原代ACHs的需求量。Ko等[26]發現ACHs與BMSCs比例為1∶4時，Aggrecan和ColⅡ基因表達水平更高。Sabatino等[27]將含有不同細胞比例的共培養結構進行了體內外實驗，體外實驗顯示ACHs與BMSCs比例為25∶75組的成軟骨能力強，且較接近純ACHs組（1∶0 組）；而相對于直接植入裸鼠皮下培養8周，預先在體外培養2周后再植入體內培養6周的成軟骨能力更強，其中以5∶95組最為顯著。上述研究結果顯示，目前在三維支架中BMSCs單獨應用時重建軟骨的能力尚不如ACHs，但將BMSCs與ACHs共培養可在一定程度上減少所需ACHs的需求量，同時達到接近甚至優于單獨應用 ACHs 時的效果。此外BMSCs來源廣，易獲取，并隨著對誘導和培養條件的探索和改進，BMSCs仍是一種很有前景的種子細胞。但兩種細胞共培養的最優比例與接種密度仍需更進一步探索。
表3
BMSCs和ACHs在三維結構中共培養相關研究
Table3.
Researches of co-culture of BMSC and ACHs in three-dimensional scaffolds
5 小結與展望
目前關于三維結構中構建組織工程軟骨的實驗研究中，所設計的細胞接種密度分組較少，密度范圍窄，可能沒有包含實際最合適的細胞接種密度。此外，構建組織工程軟骨的最終效果還受到支架材料特性、種子細胞狀態、生長因子等諸多因素的影響，目前很難得出一個普遍適用的細胞密度標準，但這并不代表我們可以不用關注種子細胞的接種密度，選擇適宜的種子細胞接種密度對構建組織工程軟骨仍具有重大意義。種子細胞接種密度過低會導致細胞外基質總量少，形成的軟骨生物力學特性差，并且會減少細胞間的聯系，不利于BMSCs的分化；密度過高會延長細胞體外擴增時間，對ACHs而言還會導致去分化、合成軟骨特異性基質的能力減弱；因此需要考慮如何取得平衡。在共培養中選擇適宜的種子細胞比例，可減少所需ACHs的數量及傳代次數，從而保持ACHs表型，最終提高構建組織工程軟骨的效率。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 張姝江、白波：綜述構思及設計、論文審校；謝慧鋒：觀點形成、資料收集及文章撰寫；周偉：文獻收集
關節軟骨缺少血管、神經，營養主要來源于關節液，損傷后難以自我修復，從而導致骨關節炎的發生[1]。自然條件下損傷軟骨由纖維瘢痕組織修復[2]，不能達到天然軟骨力學特性。目前，骨關節炎的治療一般采用關節腔內注射、微骨折、軟骨移植等方法，但均存在很大局限性，且效果不佳，患者最終仍不可避免需要接受關節置換手術[3-7]。
軟骨組織工程技術是目前針對軟骨缺損的一項有前景的治療技術[8]，其核心包括支架、種子細胞、生長因子三要素。其中，支架需要具備一定機械力學特性、生物相容性和可降解性，以及一定的孔徑和孔隙率，為細胞生長及營養物質運輸提供足夠空間[8-9]。關節軟骨細胞（articular chondrocytes，ACHs）是軟骨組織工程中應用最早與研究最多的種子細胞。1999年Brittberg等[10]就報道了運用局部注射自體ACHs的方法，成功修復了膝關節骨關節炎患者的軟骨缺損。但ACHs面臨著細胞來源少、獲取時會造成供區軟骨缺損[11-13]、在體外單層擴增后容易出現去分化的問題[14-17]。軟骨組織工程中另一種常用的種子細胞是BMSCs。BMSCs具有來源廣、擴增快，并且多次傳代后仍具有多向分化能力的優點，在ACHs來源緊缺的情況下，上述優勢更為突出[12，18]。
軟骨組織工程中，確定種子細胞種類后還需選擇適宜的細胞接種密度。如種子細胞接種密度過高，可能由于營養不足使單個細胞分泌基質的能力下降[19-21]，同時會延長細胞體外培養擴增周期，導致細胞發生去分化[14，19-21]；而細胞接種密度過低，則會減少細胞間聯系，不利于細胞分化及軟骨特異性細胞外基質的合成分泌[22-27]。此外，即使種子細胞的接種密度相同，種子細胞的比例不同或支架材料不同，最終細胞外基質的分泌情況也有差異[28]。本文將從種子細胞的接種密度和比例兩方面對ACHs和BMSCs在三維支架中培養的研究作一綜述，以期為構建組織工程軟骨提供參考。
1 正常軟骨的分層結構
宏觀上看似質地均勻的軟骨組織實際上呈分層結構，每層結構的細胞形態和纖維排列方向都不相同。ACHs是軟骨中唯一存在的細胞，呈密度梯度分布，其密度為（7.1±2.1）×106～（24.0±7.5）×106個/cm3，越接近軟骨表面細胞密度越大[29]。關節軟骨表層ACHs占細胞總數的10%～20%，其呈扁平狀，平行于關節面排列；細胞外基質含大量Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，ColⅡ），其排列方向與ACHs相似，平行于關節面有利于抵抗摩擦力和剪切力。中間層占40%～60%，ACHs呈球形，Col Ⅱ無定向網狀交織，纖維直徑和蛋白多糖含量逐漸增加。深層占30%～40%，ACHs呈柱狀，蛋白多糖含量最高而ColⅡ含量少，膠原纖維方向與關節面垂直，有利于抵抗機械壓力。鈣化層約占5%，分布稀疏的ACHs肥大化分泌Ⅹ型膠原（collagen type Ⅹ，ColⅩ）[1，30-32]。鈣化層的膠原纖維把軟骨固定于軟骨下骨。
2 不同接種密度ACHs在三維結構中的研究
為了改進ACHs修復軟骨缺損的方法，許多學者開始探究包括接種細胞密度、支架材料、培養條件等因素的影響（表1）。Mauck等[33]將ACHs以接近或大于天然軟骨中細胞的密度接種于瓊脂糖凝膠中培養9周，并加以動態力學刺激。結果表明相對于天然ACHs密度，更高的細胞接種密度可產生更多膠原和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。加以力學刺激后的新生軟骨組織雖然更薄，但具有更強的機械特性。
表1
不同接種密度的ACHs在三維結構中的研究
Table1.
Researches of different seeding densities of ACHs in three-dimensional scaffolds
隨后Saini等[34]研究發現，在左旋聚乳酸 ［poly（L-lactic acid），PLLA］ 支架上的GAG和膠原沉積量也受ACHs接種密度的影響；另外，隨著受到的剪切應力增加，膠原合成增多而GAG沉積減少。對于更低密度的研究，Iwasa等[35]將兔ACHs以0.2×106、2×106、20×106個/mL密度接種于去端膠原蛋白凝膠中培養4周，結果顯示低密度接種的ACHs雖然增殖能力強，但分泌的硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）總量較少，新生軟骨結構的硬度也不如高密度接種組。Moretti等[36]探索了在三維結構中培養的ACHs在體內成軟骨能力，將人ACHs于體外擴增后，以13×106個/mL和76×106個/mL密度接種于透明質酸支架上，最后植入小鼠背部皮下。結果顯示，無論是體內或體外，高密度ACHs都能合成總量更多的GAG和ColⅡ及更少的ColⅠ，同時新生軟骨結構具有更好的生物力學特性。Williams等[37]、Mahmoudifar等[38]分別將ACHs接種于海藻酸鹽與聚乙醇酸支架中培養，得到了類似結論。另外有學者發現，即使是種子細胞接種密度在（30～60）×106個/mL之間，軟骨的機械特性也有顯著差異，高密度組總體表現出更好的機械特性[44，47]。然而，也有學者研究表明，ACHs的接種密度并非越高越好。Cui等[45]首次報道了ACHs加以TGF-β1和FGF-2刺激后，單個細胞成軟骨能力的GAG/DNA比值與ColⅡ/DNA比值在低密度接種組更高。Mesallati等[19]的研究將ACHs接種密度從30×106個/mL增加至136×106個/mL后，單個細胞合成GAG和ColⅡ的能力反而下降，ACHs接種密度過高不利于單個細胞合成細胞外基質。因此推測ACHs的最佳接種密度可能在較低水平。
除了對細胞外基質的檢測，不同接種密度ACHs的基因表達水平也逐漸成為學者們關注的焦點。Wang等[39]報道將ACHs以2×106個/mL與20×106個/mL兩種密度接種于絲素蛋白支架上培養，3周后高密度組的聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、ColⅡ、Y染色體性別決定區相關高遷移率族框9 ［SRY（sex-determining region Y）-related high-mobility group box，SOX9］ 基因的轉錄水平及ColⅡ/ ColⅠ基因轉錄水平的比值均顯著高于低密度組，且與ACHs肥大化相關的ColⅩ基因轉錄水平更低。組織染色與ColⅡ免疫組織化學染色結果與ColⅡ基因轉錄水平相一致，表明細胞高密度接種有利于軟骨形成。Cao等[14]通過對比不同接種密度和不同代次的ACHs基因表達水平和在體內成軟骨情況，發現高密度接種與三維結構培養均有利于軟骨特異性基因的表達及軟骨形成。
近年來，生物打印技術成為軟骨組織工程熱點。Ren等[46]利用生物打印技術構建了具有仿生細胞密度梯度的ColⅡ水凝膠復合結構，結果顯示，細胞分布模式和總細胞密度會影響細胞外基質的合成；在第2～3周，中細胞密度組的GAG含量接近高密度組，但單個細胞合成GAG的效率更高。Lam等[48]發現了甲基丙烯酸化明膠（methacrylated gelatin，GelMA）與甲基丙烯酸化透明質酸（methacrylated hyaluronic acid，HAMA）構建的水凝膠在種子細胞密度為5×106 個/mL時幾乎不分泌ColⅡ；但種子細胞密度提高至25×106個/mL時情況改善，同時Ⅱ型膠原α1鏈基因（collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1）和Aggrecan基因的表達水平也得到提高。此外，ACHs在GelMA中ColⅠ基因的表達水平始終較高，說明GelMA可能不是最適合軟骨組織工程的支架材料。
3 不同接種密度BMSCs在三維結構中的研究
BMSCs具有很強的體外擴增能力和多向分化能力，且來源廣泛，可多次反復從骨髓中獲取而不造成供區組織缺損[12，18]。但目前還未能實現完全控制BMSCs在體內、外的分化，即分化后的BMSCs未完全具備成熟ACHs分泌基質的能力，導致形成的軟骨結構力學性能不理想[18，49]。考慮到由BMSCs接種密度不同所造成的影響，20多年來學者們設計了BMSCs的不同細胞密度分組實驗，以探究最終的成軟骨效果（表2）。Ponticiello等[20]將BMSCs以（3～48）×106個/mL密度接種于明膠海綿支架上，并在添加有TGF-β3的培養基中培養21 d，結果顯示，當細胞初始密度達12×106個/mL后，支架上GAG的含量不再隨細胞密度增加而增加，GAG/DNA比值反而減小。表明在支架上過高的細胞密度會抑制細胞分泌基質的功能，這點與ACHs情況類似。然而，該實驗并未對比不同細胞密度間的膠原成分，尚不能推斷12×106個/mL就是BMSCs的最優接種密度。Kavalkovich等[21]發現在細胞接種密度為25×106 個/mL時GAG合成總量及GAG/DNA比值最大；即使增加培養基體積，更高接種密度的BMSCs也會出現合成GAG的能力下降。考慮到支架孔徑影響細胞增殖及營養物質滲透，Bean等[56]對比了不同接種密度的BMSCs在不同直徑大小聚己內酯 ［poly（ε-caprolactone），PCL］ 纖維支架上分泌合成的表現，發現纖維直徑較大的支架具有更大孔徑，更適合細胞增殖與分泌細胞外基質；第6周時最高細胞接種密度組（4×106個/mL）的ColⅠ基因表達水平較低，而ColⅡ基因表達水平最高，相應的ColⅡ分泌總量也最多；Aggrecan基因的表達量雖然稍低于中等細胞接種密度組，但仍能產生最多的GAG總量。除了營養限制以外，還有其他重要因素影響高密度BMSCs分泌基質的能力。Buxton等[53]認為導致高密度BMSCs出現單個細胞分泌基質減少，是營養不足和細胞旁分泌、自分泌反饋調節的結果。該研究結果與Kavalkovich等[21]的報道結論一致，當聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 ［poly（ethylene glycol）dimethacrylate，PEGDA］ 水凝膠中的細胞密度為25×106個/mL時，每個細胞和每個整體結構之間的基質產量達到最優平衡，這個密度也接近天然膝關節軟骨中的細胞密度。相比ACHs，BMSCs的擴增能力強，而且不容易出現去分化。有學者認為BMSCs不需要較高的接種密度，也能得到較好的成軟骨效果。Hui等[51]的研究結果顯示，細胞接種密度達5×106 個/mL時，GAG的含量和GAG/DNA比值均與細胞接種密度成正相關。Pustlauk等[57]認為在H-DMEM和0.125%BSA培養條件下，接種密度為2.4×106個/mL的BMSCs在水母膠原支架中的成軟骨標志物水平最高，細胞外基質沉積效果最好。此密度足以讓BMSCs在支架中成軟骨分化。
表2
不同接種密度BMSCs在三維結構中的研究
Table2.
Researches of different seeding densities of BMSCs in three-dimensional scaffolds
BMSCs的基因表達水平反映了自身分化情況，同樣值得關注。Huang等[50]比較了接種密度為3×106、6×106、9×106個/mL的BMSCs在瓊脂糖中培養3周后的結果，發現在存在TGF-β3的條件下，隨著細胞接種密度增加，ColⅡ基因表達水平逐漸增高；只有達到9×106個/mL接種密度的細胞才表達Aggrecan基因；TGF-β3在上述基因的表達水平對相關基質的合成起促進作用。2009年Li等[52]發現ColⅠ微球中，細胞接種密度達1×106個/mL組的ColⅡ和Aggrecan基因表達水平最高，GAG含量最多，但此細胞密度組已經出現GAG/DNA值下降。
由于BMSCs形成軟骨需要向ACHs分化，大部分學者傾向于在培養基中添加外源性細胞因子，以促進這個過程。然而，Zhang等[54]發現即使不添加外源性細胞因子，ColⅠ支架也可誘導BMSCs向ACHs分化。提高細胞的接種密度可提高BMSCs的SOX9、ColⅡ與Aggrecan基因表達水平和成軟骨能力。Li等[58]的研究結果與Zhang等[54]的報道一致，在支架中加入ColⅠ也可促進BMSCs成軟骨分化。因此高密度接種的BMSCs具有更明顯的軟骨表型和成軟骨能力。
已有文獻報道，組織工程軟骨的生物力學特性尚未能達到研究者預期的標準[61]，仍需繼續探索改進方法。Sun等[59]的研究表明在聚D，L-乳酸/聚乙二醇/聚D，L-乳酸水凝膠中，20×106個/mL組和50×106個/mL組的新生軟骨機械強度在培養第8周后比培養第4周時稍減弱，但總GAG和羥脯氨酸沉積量顯著高于4×106個/mL組和8×106個/mL組，而20×106個/mL組單個細胞分泌基質的效率更高。Kim等[60]發現增加HAMA水凝膠中BMSCs的接種密度，會使新生軟骨力學特性增強，軟骨細胞外基質的含量增多，但會使水凝膠體積收縮，可能是細胞黏附并牽拉材料所致，最終構建的組織工程軟骨大小與預期有一定差距。
4 BMSCs和ACHs在三維結構中共培養
BMSCs和ACHs共培養的目的在于減少所需ACHs的數量與探索兩種細胞間是否有協同形成軟骨的作用。既往學者們猜測ACHs可誘導BMSCs向ACHs分化。雖然成軟骨培養基可誘導BMSCs表達軟骨特異性基因，但Wu等[62-63]通過熒光蛋白標記的方法，證實了在共培養中BMSCs促進軟骨形成的機制并非通過向ACHs分化，而是通過營養作用刺激ACHs增殖和分泌基質。其作用機制是BMSCs可合成多種細胞因子，通過旁分泌、形成細胞外囊泡與膜納米管作用于周圍細胞[64]。Levorson等[23]把牛ACHs與兔BMSCs以1∶0、1∶1、1∶3、1∶5與0∶1的比例混合，并調節成1.75×106個/mL和3.5×106個/mL兩種密度接種于PCL支架上，共培養3周后，1∶1比例組共培養產生的膠原總量少于純ACHs組（1∶0組），但顯著多于其他比例組；此外，按照1∶1比例共培養，低接種密度與高接種密度結果無顯著差異。但此研究中細胞密度分組少，事實上可能存在更優的細胞接種密度范圍。遺憾的是，設計有多個細胞接種密度的ACHs和BMSCs三維共培養的研究寥寥無幾，至今學者們探索更多的是這兩種細胞按照不同比例共培養的成軟骨作用（表3）。Mo等[24]將兔ACHs和人BMSCs以1∶0、2∶1、1∶1、1∶2和0∶1比例混合接種于海藻酸鹽水凝膠中培養，結果發現隨培養時間延長和BMSCs比例增大，合成GAG和ColⅡ的量相應增多；直至第28天，1∶2組合成GAG和ColⅡ的量顯著多余其他比例組，且與純ACHs組（1∶0組）相當，而純BMSC組（0∶1組）最少。ColⅡ/ColⅠ基因表達水平比值與之類似，不同的是純ACHs組（1∶0組）的ColⅡ基因表達水平顯著高于其他各組。還值得注意的是，檢測發現共培養中的人BMSCs不表達人特異性ColⅡ基因，因此推測共培養中的BMSCs未直接參與軟骨形成。Meretoja等[25]的研究結果表明，原代ACHs的成軟骨能力強于傳代后的ACHs。此外相比純ACHs組（1∶0），共培養組（ACHs∶BMSCs為1∶1和1∶3）能產生接近甚至更好的成軟骨效果，從而減少原代ACHs的需求量。Ko等[26]發現ACHs與BMSCs比例為1∶4時，Aggrecan和ColⅡ基因表達水平更高。Sabatino等[27]將含有不同細胞比例的共培養結構進行了體內外實驗，體外實驗顯示ACHs與BMSCs比例為25∶75組的成軟骨能力強，且較接近純ACHs組（1∶0 組）；而相對于直接植入裸鼠皮下培養8周，預先在體外培養2周后再植入體內培養6周的成軟骨能力更強，其中以5∶95組最為顯著。上述研究結果顯示，目前在三維支架中BMSCs單獨應用時重建軟骨的能力尚不如ACHs，但將BMSCs與ACHs共培養可在一定程度上減少所需ACHs的需求量，同時達到接近甚至優于單獨應用 ACHs 時的效果。此外BMSCs來源廣，易獲取，并隨著對誘導和培養條件的探索和改進，BMSCs仍是一種很有前景的種子細胞。但兩種細胞共培養的最優比例與接種密度仍需更進一步探索。
表3
BMSCs和ACHs在三維結構中共培養相關研究
Table3.
Researches of co-culture of BMSC and ACHs in three-dimensional scaffolds
5 小結與展望
目前關于三維結構中構建組織工程軟骨的實驗研究中，所設計的細胞接種密度分組較少，密度范圍窄，可能沒有包含實際最合適的細胞接種密度。此外，構建組織工程軟骨的最終效果還受到支架材料特性、種子細胞狀態、生長因子等諸多因素的影響，目前很難得出一個普遍適用的細胞密度標準，但這并不代表我們可以不用關注種子細胞的接種密度，選擇適宜的種子細胞接種密度對構建組織工程軟骨仍具有重大意義。種子細胞接種密度過低會導致細胞外基質總量少，形成的軟骨生物力學特性差，并且會減少細胞間的聯系，不利于BMSCs的分化；密度過高會延長細胞體外擴增時間，對ACHs而言還會導致去分化、合成軟骨特異性基質的能力減弱；因此需要考慮如何取得平衡。在共培養中選擇適宜的種子細胞比例，可減少所需ACHs的數量及傳代次數，從而保持ACHs表型，最終提高構建組織工程軟骨的效率。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 張姝江、白波：綜述構思及設計、論文審校；謝慧鋒：觀點形成、資料收集及文章撰寫；周偉：文獻收集
