引用本文： 張馳, 王遠賀, 孫康, 田少奇. 基于免疫級聯反應的蠶蛹漿比色法在關節假體周圍感染精準診斷中的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(2): 203-208. doi: 10.7507/1002-1892.202109046 復制
在人工關節置換術并發癥中，最嚴重的是假體周圍感染（periprosthetic joint infection，PJI）[1]。早期準確診斷PJI是及時、有效治療并取得良好預后的前提條件[2]。早期（術后3個月內發生）PJI主要由強毒力致病菌引起[3]，癥狀較為明顯，診斷難度相對較小；而遲發型（術后3～12個月）與晚期（術后12個月以后）PJI主要由低毒力致病菌（如表皮葡萄球菌）引起[4]，在假體表面形成生物膜后PJI更加難以診斷。為了解決PJI診斷困難的問題，多個醫學協會及團體提出了各自的共識或定義[5-6]，其中2018年PJI費城國際共識被學界公認為目前PJI診斷的“金標準”[7]。但是綜合分析各標準均存在一些問題，給臨床使用帶來諸多不便。
蠶蛹漿（silkworm larvae plasma，SLP）試劑是從蠶蛹血漿中提純的生物試劑，它可特異性識別細菌及真菌細胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan，PG）及β-葡聚糖（β-glucan，BG），并啟動免疫級聯反應，使反應底物變黑[8]，故SLP比色法理論上可能成為檢測PJI的全新檢測手段。本研究擬通過新西蘭大白兔PJI動物模型，檢驗SLP比色法在PJI精準診斷方面的效能。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、假體、菌株及主要試劑、儀器
12～16周齡健康雄性新西蘭大白兔90只，體質量2.5～2.7 kg，購自青島康大生物科技有限公司。實驗動物膝關節置換假體選用Swanson假體（Wright Medical Group公司，美國）。金黃色葡萄球菌（CICC 10145）、表皮葡萄球菌（CICC 10398）及大腸埃希菌（CICC 20658）均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。SLP試劑盒 ［日本Wako（和光純藥）株式會社］；兔C反應蛋白（C reactive protein，CRP）ELISA96T試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）。全自動血沉儀（Stago公司，法國）；全自動血液體液分析儀（Sysmex株式會社，日本）；比濁儀（GRANT公司，英國）。
1.2 PJI動物模型制備
1.2.1 動物麻醉
所有實驗動物以1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉[9]。由于兔對戊巴比妥鈉的耐受劑量較窄且存在個體差異，易引起呼吸衰竭致死，所以將兔固定于固定箱后，先給予總麻醉劑量的2/3，觀察實驗動物反應10～15 min，15 min后如果兔角膜反射依然存在，再給予剩余1/3麻醉劑量。由于給予的麻醉劑量較少，本研究術前及手術結束后均采用利多卡因行膝關節周圍浸潤性麻醉以減少實驗動物痛苦。
1.2.2 兔膝關節置換手術
麻醉效果滿意后，取右側膝關節正中切口入路，逐層切開分離皮下組織至髕韌帶處并電凝止血；經髕旁內側入路切開關節囊，屈曲膝關節并外翻髕骨以顯露膝關節內部結構。切除前、后交叉韌帶及半月板，使股骨和脛骨分離。先行股骨截骨，截骨時需注意勿損傷膝關節后方血管和神經，再向前牽拉脛骨使其脫位行脛骨截骨。截骨后擴髓，植入Swanson5-0假體，檢查假體松緊情況和膝關節屈伸活動度。將髕骨復位后再次檢查膝關節屈伸活動情況，確保無軟組織嵌入、股骨和脛骨處摩擦，并檢查假體穩定性。充分電凝止血后，按聚維酮碘溶液、生理鹽水、雙氧水、生理鹽水的順序沖洗關節2次。以連續鎖邊縫合方式縫合關節囊，單純間斷縫合手術切口。見圖1。
圖1
兔膝關節置換手術過程
a. 膝關節正中切口；b. 髕旁內側入路打開關節囊；c. 截骨后安裝假體；d. 逐層閉合切口
Figure1. Procedure of knee arthroplasty in experimental rabbitsa. Median incision of knee joint; b. Medial paraknee approach to open joint capsule; c. Installation of prosthesis after osteotomy; d. Closed the incision
1.2.3 實驗分組及方法
膝關節置換術后將實驗動物隨機分為3組：A組（金黃色葡萄球菌組）、B組（表皮葡萄球菌組）及C組（大腸埃希菌組），每組30只。A、B、C組動物周齡分別為（14.5±1.1）、（14.5±1.1）、（14.4±1.1）周，體質量分別為（2.597±0.465）、（2.599±0.475）、（2.601±0.474）kg，組間比較差異均無統計學意義（F=0.857，P=0.664；F=0.628，P=0.872）。
術后當日及第1、2天肌肉注射青霉素鈉（3×104 U/kg）預防感染，術后第3天取金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大腸埃希菌菌液以比濁儀分別稀釋至1×105、1×107、1×105 CFU/mL[10]；各取1 mL菌液注射入各組實驗動物關節腔進行PJI造模。
1.3 實驗動物造模成功率判定
各組分別于接種菌液前及接種后7、14、21 d經耳緣靜脈采血、關節腔穿刺采集關節液。取血清樣本，采用兔CRP ELISA96T試劑盒檢測CRP蛋白表達，采用全自動血沉儀檢測紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）；取關節液樣本，采用全自動血液體液分析儀進行白細胞計數和多形核粒細胞百分比檢測。接種菌液后21 d處死實驗動物，取置換側膝關節，切片后行HE染色觀察。依據2018年PJI費城國際共識的診斷標準（表1）判定3組實驗動物造模是否成功，并計算成功率。2018年PJI費城國際共識中的診斷閾值為人用，故我們做了預實驗，確定了新西蘭大白兔接種菌液后21 d時相應的診斷閾值。A、B、C組的血清CRP診斷閾值分別為18.64、9.22、10.62 mg/L，ESR診斷閾值分別為9.45、6.00、5.65 mm/1 h；關節液白細胞計數診斷閾值分別為71.5×106/L、75.5×106/L及66.0×106/L，多形核粒細胞百分比診斷閾值分別為71.5%、58.5%及55.0%。
表1
2018年PJI費城國際共識診斷標準
Table1.
2018 PJI Philadelphia International Consensus diagnostic criteria
1.4 SLP試劑診斷PJI
將無菌水、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大腸埃希菌菌液以及接種前、接種后7、14、21 d的血清和關節液各500 μL分別加入96孔板中，迅速在每孔中加入500 μL SLP檢測溶液后加蓋；30℃恒溫水浴60 min，采用微孔板目測比色法，樣本變為黑色為陽性，否則為陰性。其中無菌水為陰性對照，3種菌液為標準陽性對照；關節液及血液樣本中有1項為陽性，即為陽性。通過以下公式計算SLP試劑診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和診斷效率。敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異性=真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；陽性預測值=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%；陰性預測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%；診斷效率=（真陽性+真陰性）/（真陽性+假陽性+真陰性+假陰性）×100%。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差表示，3組間周齡及體質量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物造模成功判定
3組實驗動物在接種菌液前均無感染，提示此后感染為細菌接種所致而非手術后感染。21 d時，A、B、C組分別有26、18、23只實驗動物診斷為感染，造模成功率分別為86.7%、60.0%、76.7%，3組間比較差異無統計學意義（χ2=5.724，P=0.073）。
2.2 SLP試劑診斷PJI
A組在7 d時出現1只假陽性動物，導致特異性較低，僅為75.0%，7 d后隨著細菌在動物體內被免疫系統清除，SLP特異性升至100.0%；14 d及21 d時另外1只實驗動物出現了假陰性結果，導致SLP的敏感性降低至96.2%。B組在7 d時出現1只假陽性動物，導致其特異性為91.7%，與A組相同，14 d及21 d時SLP的特異性回升至100.0%；在14、21 d時分別出現1只和4只假陰性動物（敏感性分別為94.4%及83.3%）。C組在7 d時有2只假陽性動物，導致其特異性僅為71.4%，隨著時間推移特異性回升至100.0%。A、C組高毒力致病菌在21 d時診斷效率分別為96.7%和100.0%，效能極好；B組細菌的致病力較低且容易形成生物膜，故診斷效率隨著時間推移逐漸降低（由96.7%降至90.0%），但結果依然很好。見表2。
表2
各組接種菌液后各時間點SLP比色法結果比較（%）
Table2.
Comparison of SLP colorimetric results at each time point after inoculation of bacterial solution between groups (%)
3 討論
3.1 動物模型造模及檢測時間點選擇
近2年大部分以兔作為PJI造模動物的國內外實驗研究均采用21 d作為造模期限[11-12]，我們的預實驗中超過21 d后高毒力致病菌組動物死亡數量明顯增加，故本次造模選用21 d作為造模期限。因為B組為表皮葡萄球菌，其致病力較低且容易形成生物膜，從而在常規檢測方法中呈現假陰性，所以我們在實驗中設置了菌液接種后7 d和14 d作為檢測點，以利于觀察感染率的動態變化，體現SLP比色法的優勢。
3.2 PJI診斷的難點
目前PJI的診治是關節外科醫師面臨的重大難題之一，主要難點體現在早期診斷困難以及該并發癥造成的嚴重后果[13]。目前2018年PJI費城國際共識是學術界公認的PJI診斷“金標準”[7]，但其也存在一些問題：首先，診斷標準中存在很多主觀評價標準（諸如膿苔等），在一些特殊情況（如金屬碎屑及結晶沉積引起的關節炎）下也會產生類似于膿苔的產物，從而導致誤判；其次，很多診斷指標的反饋周期較長（細菌培養），最終診斷延遲性很高，不適用于一些特殊情況（如術前診斷為假體無菌性松動，如何確定不是低毒力致病菌導致的PJI）；再次，該診斷指標中存在主要指標、次要指標甚至是術后指標等復雜的評分系統，診斷較復雜，且部分患者如果不通過再次手術無法進行診斷，會給患者帶來極大痛苦；最后，次要診斷指標只能間接反映感染或炎癥的存在，無法直接檢測病原微生物且受機體自身免疫水平影響較大。目前大多數國內學者在臨床實踐中遇到疑似PJI的患者，會首先進行關節液細菌培養，得到培養結果后再手術。但根據2018年PJI費城國際共識，細菌培養陽性僅為諸多診斷指標之一，診斷PJI不能僅依靠細菌培養結果。根據國內外近期文獻報道，PJI大多數是由高毒力致病菌引起的[14-15]。但表皮葡萄球菌這種低毒力致病菌導致的PJI占總PJI患者的12.4%，其中難以治療的PJI中表皮葡萄球菌占14.5%[16]。由表皮葡萄球菌導致的PJI患者中肯定存在細菌培養陰性者，或者存在培養出表皮葡萄球菌后難以與人體皮膚定植菌相鑒別的情況。對于這種懷疑為PJI但又無細菌學證據支持的患者，手術時如何處理則成為一大難題。因此出現了很多新型檢測方法，如PCR及二代基因測序等基因水平檢測。新型檢測方法敏感性和特異性較好，但其缺點是結果回報時間太長，對于術中懷疑為PJI的患者無法做出快速、準確的診斷。如果對于這類患者進行翻修手術，病理學及微生物學結果回報后支持PJI的診斷，其災難性后果是患者難以承受的。
3.3 SLP比色法的原理
Ashida于1981年發現了一種可以從家蠶蠶蛹體內提取完整血漿的方法[17]。隨后人們發現存在于昆蟲血漿及角質層中的前酚氧化酶（prophenoloxidase，proPO）在昆蟲的防御機制中起著重要作用[18]，在微生物（細菌和/或真菌）感染昆蟲后會導致局部黑化。1986年Yoshida等[8]發現proPO級聯反應由PG及BG啟動，并由（1-3）-β-D-BG識別蛋白、PG識別蛋白、絲氨酸蛋白酶原、proPO以及一些未知成分組成。革蘭陰性菌細胞壁中PG約占70%，革蘭陽性菌為20%左右，BG則為真菌細胞壁的主要組成成分之一；故SLP檢驗理論上可以檢測出細菌及真菌感染。目前商業化的SLP檢測試劑是由蠶蛹體液中血漿部分制備，包含proPO級聯反應所需的所有物質，可以與很少量PG和/或BG結合，通過級聯反應不斷擴大反應規模[19]。試劑中添加有左旋多巴作為酚氧化酶的反應底物，當級聯反應被激活后，就可以觀察到試劑變為黑色或深藍色。
革蘭陽性菌細胞壁中的PG裸露，而革蘭陰性菌細胞壁中的PG被一層外膜包被，這在一定程度上會影響SLP的檢測結果。從本研究中也可看出，隨著時間推移，B組的診斷效率逐漸下降，主要原因是表皮葡萄球菌表面形成生物膜后，游離的細菌細胞壁明顯減少；但本研究結果也顯示，在表皮葡萄球菌形成生物膜后依然有著較高的診斷效率（90.0%）。超聲裂解法可以破壞生物膜，使隱藏其中的細菌得以暴露，故理論上超聲裂解法結合SLP檢測可以提高細菌及真菌的檢出率，我們已在進行相關研究。
3.4 SLP比色法的優勢
本研究結果顯示，SLP比色法對于PJI的總體診斷效能較好（95.6%～97.8%）。其中，A組在7 d時出現1只假陽性動物（特異性75.0%），我們認為這可能是由于SLP試劑對于PG敏感性極高，殘留于關節腔中已死亡或低于致病濃度的金黃色葡萄球菌細胞壁與試劑反應導致的。而14、21 d，另1只實驗動物出現了假陰性結果（敏感性96.2%），經培養發現其為金黃色葡萄球菌的小菌株變異，該變異菌株典型特征是生長代謝緩慢、菌落細小、毒力基因表達下調，以及與生物膜形成和黏附相關的主要基因表達增加[20]；我們考慮產生假陰性的結果可能與其成生物膜特性有關。B組在7 d時出現1只假陽性動物（特異性91.7%），分析可能原因與A組相同；在14、21 d時分別出現1只和4只假陰性動物（敏感性分別為94.4%及83.3%），我們分析原因可能是隨著時間推移，低毒力的表皮葡萄球菌開始在假體表面形成生物膜，產生假陰性結果。C組除7 d時有2只假陽性動物（特異性71.4%）外，14、21 d時敏感性、特異性以及診斷效率均極好（100%）。
目前關于SLP檢測的文獻較少，其中大多數是應用于微生物和工業領域[21]，應用于醫學方面的僅有3篇：① Kobayashi等[22]于2000年應用SLP檢測患者是否存在細菌感染，發現其敏感性為86.2%、特異性為90.6%，而陽性預測值為89.3%、診斷效率為88.5%。② 2003年Inada等[23]以SLP檢測腦脊液并與普通及內毒素特異性鱟實驗相結合，確定患者是否患有細菌或真菌性腦膜炎，并判斷致病菌種類（真菌、革蘭陰性菌或革蘭陽性菌）。③ 2005年Shimizu等[24]利用SLP檢測胃腸道手術后患者是否存在感染，并通過其變化預測患者發生感染性并發癥的可能性。他們發現以術后第1天SLP預測感染并發癥的效果最好，敏感性為66.7%、特異性為90.4%，曲線下面積為0.813±0.046。目前尚無將SLP比色法應用于關節外科，特別是PJI診斷方面的研究報道。
SLP檢測有諸多優點：① 方法簡單，結果回報時間短，可以于術中使用；② 價格相對較低，比白細胞酯酶和二代基因測序具有更高的效益-費用比；③ 直接檢測病原微生物，敏感性及特異性高；④ 樣本通用性強；⑤ 既可以檢測細菌感染，也可以針對目前逐漸增多的真菌感染進行檢測。
3.5 SLP比色法的局限性
本研究結果充分顯示SLP比色法在診斷PJI方面具有較高的敏感性、特異性以及診斷效率。但本研究也存在一些局限性：動物模型的全身情況較為簡單，與臨床上發生PJI患者的全身狀況（如糖尿病、風濕等其他基礎疾病）有差異；SLP比色法對于細菌細胞壁中的PG敏感程度極高，這會導致假陽性的出現。SLP比色法能否在臨床取得較為優異的診斷效率及良好的敏感性、特異性，尚需臨床實踐檢驗。
作者貢獻：張馳負責實驗構思、操作、資料總結分析及文章撰寫；王遠賀負責文獻查閱及篩選、部分資料收集及實驗動物的飼養，參與文章修改；孫康負責手術及麻醉相關指導，文章邏輯性修改及大體框架形成；田少奇負責實驗設計、文章審閱、修改，硬件設施提供及基金支持。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗經青島大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20190003。
在人工關節置換術并發癥中，最嚴重的是假體周圍感染（periprosthetic joint infection，PJI）[1]。早期準確診斷PJI是及時、有效治療并取得良好預后的前提條件[2]。早期（術后3個月內發生）PJI主要由強毒力致病菌引起[3]，癥狀較為明顯，診斷難度相對較小；而遲發型（術后3～12個月）與晚期（術后12個月以后）PJI主要由低毒力致病菌（如表皮葡萄球菌）引起[4]，在假體表面形成生物膜后PJI更加難以診斷。為了解決PJI診斷困難的問題，多個醫學協會及團體提出了各自的共識或定義[5-6]，其中2018年PJI費城國際共識被學界公認為目前PJI診斷的“金標準”[7]。但是綜合分析各標準均存在一些問題，給臨床使用帶來諸多不便。
蠶蛹漿（silkworm larvae plasma，SLP）試劑是從蠶蛹血漿中提純的生物試劑，它可特異性識別細菌及真菌細胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan，PG）及β-葡聚糖（β-glucan，BG），并啟動免疫級聯反應，使反應底物變黑[8]，故SLP比色法理論上可能成為檢測PJI的全新檢測手段。本研究擬通過新西蘭大白兔PJI動物模型，檢驗SLP比色法在PJI精準診斷方面的效能。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、假體、菌株及主要試劑、儀器
12～16周齡健康雄性新西蘭大白兔90只，體質量2.5～2.7 kg，購自青島康大生物科技有限公司。實驗動物膝關節置換假體選用Swanson假體（Wright Medical Group公司，美國）。金黃色葡萄球菌（CICC 10145）、表皮葡萄球菌（CICC 10398）及大腸埃希菌（CICC 20658）均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。SLP試劑盒 ［日本Wako（和光純藥）株式會社］；兔C反應蛋白（C reactive protein，CRP）ELISA96T試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）。全自動血沉儀（Stago公司，法國）；全自動血液體液分析儀（Sysmex株式會社，日本）；比濁儀（GRANT公司，英國）。
1.2 PJI動物模型制備
1.2.1 動物麻醉
所有實驗動物以1%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉[9]。由于兔對戊巴比妥鈉的耐受劑量較窄且存在個體差異，易引起呼吸衰竭致死，所以將兔固定于固定箱后，先給予總麻醉劑量的2/3，觀察實驗動物反應10～15 min，15 min后如果兔角膜反射依然存在，再給予剩余1/3麻醉劑量。由于給予的麻醉劑量較少，本研究術前及手術結束后均采用利多卡因行膝關節周圍浸潤性麻醉以減少實驗動物痛苦。
1.2.2 兔膝關節置換手術
麻醉效果滿意后，取右側膝關節正中切口入路，逐層切開分離皮下組織至髕韌帶處并電凝止血；經髕旁內側入路切開關節囊，屈曲膝關節并外翻髕骨以顯露膝關節內部結構。切除前、后交叉韌帶及半月板，使股骨和脛骨分離。先行股骨截骨，截骨時需注意勿損傷膝關節后方血管和神經，再向前牽拉脛骨使其脫位行脛骨截骨。截骨后擴髓，植入Swanson5-0假體，檢查假體松緊情況和膝關節屈伸活動度。將髕骨復位后再次檢查膝關節屈伸活動情況，確保無軟組織嵌入、股骨和脛骨處摩擦，并檢查假體穩定性。充分電凝止血后，按聚維酮碘溶液、生理鹽水、雙氧水、生理鹽水的順序沖洗關節2次。以連續鎖邊縫合方式縫合關節囊，單純間斷縫合手術切口。見圖1。
圖1
兔膝關節置換手術過程
a. 膝關節正中切口；b. 髕旁內側入路打開關節囊；c. 截骨后安裝假體；d. 逐層閉合切口
Figure1. Procedure of knee arthroplasty in experimental rabbitsa. Median incision of knee joint; b. Medial paraknee approach to open joint capsule; c. Installation of prosthesis after osteotomy; d. Closed the incision
1.2.3 實驗分組及方法
膝關節置換術后將實驗動物隨機分為3組：A組（金黃色葡萄球菌組）、B組（表皮葡萄球菌組）及C組（大腸埃希菌組），每組30只。A、B、C組動物周齡分別為（14.5±1.1）、（14.5±1.1）、（14.4±1.1）周，體質量分別為（2.597±0.465）、（2.599±0.475）、（2.601±0.474）kg，組間比較差異均無統計學意義（F=0.857，P=0.664；F=0.628，P=0.872）。
術后當日及第1、2天肌肉注射青霉素鈉（3×104 U/kg）預防感染，術后第3天取金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大腸埃希菌菌液以比濁儀分別稀釋至1×105、1×107、1×105 CFU/mL[10]；各取1 mL菌液注射入各組實驗動物關節腔進行PJI造模。
1.3 實驗動物造模成功率判定
各組分別于接種菌液前及接種后7、14、21 d經耳緣靜脈采血、關節腔穿刺采集關節液。取血清樣本，采用兔CRP ELISA96T試劑盒檢測CRP蛋白表達，采用全自動血沉儀檢測紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）；取關節液樣本，采用全自動血液體液分析儀進行白細胞計數和多形核粒細胞百分比檢測。接種菌液后21 d處死實驗動物，取置換側膝關節，切片后行HE染色觀察。依據2018年PJI費城國際共識的診斷標準（表1）判定3組實驗動物造模是否成功，并計算成功率。2018年PJI費城國際共識中的診斷閾值為人用，故我們做了預實驗，確定了新西蘭大白兔接種菌液后21 d時相應的診斷閾值。A、B、C組的血清CRP診斷閾值分別為18.64、9.22、10.62 mg/L，ESR診斷閾值分別為9.45、6.00、5.65 mm/1 h；關節液白細胞計數診斷閾值分別為71.5×106/L、75.5×106/L及66.0×106/L，多形核粒細胞百分比診斷閾值分別為71.5%、58.5%及55.0%。
表1
2018年PJI費城國際共識診斷標準
Table1.
2018 PJI Philadelphia International Consensus diagnostic criteria
1.4 SLP試劑診斷PJI
將無菌水、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大腸埃希菌菌液以及接種前、接種后7、14、21 d的血清和關節液各500 μL分別加入96孔板中，迅速在每孔中加入500 μL SLP檢測溶液后加蓋；30℃恒溫水浴60 min，采用微孔板目測比色法，樣本變為黑色為陽性，否則為陰性。其中無菌水為陰性對照，3種菌液為標準陽性對照；關節液及血液樣本中有1項為陽性，即為陽性。通過以下公式計算SLP試劑診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值和診斷效率。敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%；特異性=真陰性/（假陽性+真陰性）×100%；陽性預測值=真陽性/（真陽性+假陽性）×100%；陰性預測值=真陰性/（真陰性+假陰性）×100%；診斷效率=（真陽性+真陰性）/（真陽性+假陽性+真陰性+假陰性）×100%。
1.5 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，以均數±標準差表示，3組間周齡及體質量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物造模成功判定
3組實驗動物在接種菌液前均無感染，提示此后感染為細菌接種所致而非手術后感染。21 d時，A、B、C組分別有26、18、23只實驗動物診斷為感染，造模成功率分別為86.7%、60.0%、76.7%，3組間比較差異無統計學意義（χ2=5.724，P=0.073）。
2.2 SLP試劑診斷PJI
A組在7 d時出現1只假陽性動物，導致特異性較低，僅為75.0%，7 d后隨著細菌在動物體內被免疫系統清除，SLP特異性升至100.0%；14 d及21 d時另外1只實驗動物出現了假陰性結果，導致SLP的敏感性降低至96.2%。B組在7 d時出現1只假陽性動物，導致其特異性為91.7%，與A組相同，14 d及21 d時SLP的特異性回升至100.0%；在14、21 d時分別出現1只和4只假陰性動物（敏感性分別為94.4%及83.3%）。C組在7 d時有2只假陽性動物，導致其特異性僅為71.4%，隨著時間推移特異性回升至100.0%。A、C組高毒力致病菌在21 d時診斷效率分別為96.7%和100.0%，效能極好；B組細菌的致病力較低且容易形成生物膜，故診斷效率隨著時間推移逐漸降低（由96.7%降至90.0%），但結果依然很好。見表2。
表2
各組接種菌液后各時間點SLP比色法結果比較（%）
Table2.
Comparison of SLP colorimetric results at each time point after inoculation of bacterial solution between groups (%)
3 討論
3.1 動物模型造模及檢測時間點選擇
近2年大部分以兔作為PJI造模動物的國內外實驗研究均采用21 d作為造模期限[11-12]，我們的預實驗中超過21 d后高毒力致病菌組動物死亡數量明顯增加，故本次造模選用21 d作為造模期限。因為B組為表皮葡萄球菌，其致病力較低且容易形成生物膜，從而在常規檢測方法中呈現假陰性，所以我們在實驗中設置了菌液接種后7 d和14 d作為檢測點，以利于觀察感染率的動態變化，體現SLP比色法的優勢。
3.2 PJI診斷的難點
目前PJI的診治是關節外科醫師面臨的重大難題之一，主要難點體現在早期診斷困難以及該并發癥造成的嚴重后果[13]。目前2018年PJI費城國際共識是學術界公認的PJI診斷“金標準”[7]，但其也存在一些問題：首先，診斷標準中存在很多主觀評價標準（諸如膿苔等），在一些特殊情況（如金屬碎屑及結晶沉積引起的關節炎）下也會產生類似于膿苔的產物，從而導致誤判；其次，很多診斷指標的反饋周期較長（細菌培養），最終診斷延遲性很高，不適用于一些特殊情況（如術前診斷為假體無菌性松動，如何確定不是低毒力致病菌導致的PJI）；再次，該診斷指標中存在主要指標、次要指標甚至是術后指標等復雜的評分系統，診斷較復雜，且部分患者如果不通過再次手術無法進行診斷，會給患者帶來極大痛苦；最后，次要診斷指標只能間接反映感染或炎癥的存在，無法直接檢測病原微生物且受機體自身免疫水平影響較大。目前大多數國內學者在臨床實踐中遇到疑似PJI的患者，會首先進行關節液細菌培養，得到培養結果后再手術。但根據2018年PJI費城國際共識，細菌培養陽性僅為諸多診斷指標之一，診斷PJI不能僅依靠細菌培養結果。根據國內外近期文獻報道，PJI大多數是由高毒力致病菌引起的[14-15]。但表皮葡萄球菌這種低毒力致病菌導致的PJI占總PJI患者的12.4%，其中難以治療的PJI中表皮葡萄球菌占14.5%[16]。由表皮葡萄球菌導致的PJI患者中肯定存在細菌培養陰性者，或者存在培養出表皮葡萄球菌后難以與人體皮膚定植菌相鑒別的情況。對于這種懷疑為PJI但又無細菌學證據支持的患者，手術時如何處理則成為一大難題。因此出現了很多新型檢測方法，如PCR及二代基因測序等基因水平檢測。新型檢測方法敏感性和特異性較好，但其缺點是結果回報時間太長，對于術中懷疑為PJI的患者無法做出快速、準確的診斷。如果對于這類患者進行翻修手術，病理學及微生物學結果回報后支持PJI的診斷，其災難性后果是患者難以承受的。
3.3 SLP比色法的原理
Ashida于1981年發現了一種可以從家蠶蠶蛹體內提取完整血漿的方法[17]。隨后人們發現存在于昆蟲血漿及角質層中的前酚氧化酶（prophenoloxidase，proPO）在昆蟲的防御機制中起著重要作用[18]，在微生物（細菌和/或真菌）感染昆蟲后會導致局部黑化。1986年Yoshida等[8]發現proPO級聯反應由PG及BG啟動，并由（1-3）-β-D-BG識別蛋白、PG識別蛋白、絲氨酸蛋白酶原、proPO以及一些未知成分組成。革蘭陰性菌細胞壁中PG約占70%，革蘭陽性菌為20%左右，BG則為真菌細胞壁的主要組成成分之一；故SLP檢驗理論上可以檢測出細菌及真菌感染。目前商業化的SLP檢測試劑是由蠶蛹體液中血漿部分制備，包含proPO級聯反應所需的所有物質，可以與很少量PG和/或BG結合，通過級聯反應不斷擴大反應規模[19]。試劑中添加有左旋多巴作為酚氧化酶的反應底物，當級聯反應被激活后，就可以觀察到試劑變為黑色或深藍色。
革蘭陽性菌細胞壁中的PG裸露，而革蘭陰性菌細胞壁中的PG被一層外膜包被，這在一定程度上會影響SLP的檢測結果。從本研究中也可看出，隨著時間推移，B組的診斷效率逐漸下降，主要原因是表皮葡萄球菌表面形成生物膜后，游離的細菌細胞壁明顯減少；但本研究結果也顯示，在表皮葡萄球菌形成生物膜后依然有著較高的診斷效率（90.0%）。超聲裂解法可以破壞生物膜，使隱藏其中的細菌得以暴露，故理論上超聲裂解法結合SLP檢測可以提高細菌及真菌的檢出率，我們已在進行相關研究。
3.4 SLP比色法的優勢
本研究結果顯示，SLP比色法對于PJI的總體診斷效能較好（95.6%～97.8%）。其中，A組在7 d時出現1只假陽性動物（特異性75.0%），我們認為這可能是由于SLP試劑對于PG敏感性極高，殘留于關節腔中已死亡或低于致病濃度的金黃色葡萄球菌細胞壁與試劑反應導致的。而14、21 d，另1只實驗動物出現了假陰性結果（敏感性96.2%），經培養發現其為金黃色葡萄球菌的小菌株變異，該變異菌株典型特征是生長代謝緩慢、菌落細小、毒力基因表達下調，以及與生物膜形成和黏附相關的主要基因表達增加[20]；我們考慮產生假陰性的結果可能與其成生物膜特性有關。B組在7 d時出現1只假陽性動物（特異性91.7%），分析可能原因與A組相同；在14、21 d時分別出現1只和4只假陰性動物（敏感性分別為94.4%及83.3%），我們分析原因可能是隨著時間推移，低毒力的表皮葡萄球菌開始在假體表面形成生物膜，產生假陰性結果。C組除7 d時有2只假陽性動物（特異性71.4%）外，14、21 d時敏感性、特異性以及診斷效率均極好（100%）。
目前關于SLP檢測的文獻較少，其中大多數是應用于微生物和工業領域[21]，應用于醫學方面的僅有3篇：① Kobayashi等[22]于2000年應用SLP檢測患者是否存在細菌感染，發現其敏感性為86.2%、特異性為90.6%，而陽性預測值為89.3%、診斷效率為88.5%。② 2003年Inada等[23]以SLP檢測腦脊液并與普通及內毒素特異性鱟實驗相結合，確定患者是否患有細菌或真菌性腦膜炎，并判斷致病菌種類（真菌、革蘭陰性菌或革蘭陽性菌）。③ 2005年Shimizu等[24]利用SLP檢測胃腸道手術后患者是否存在感染，并通過其變化預測患者發生感染性并發癥的可能性。他們發現以術后第1天SLP預測感染并發癥的效果最好，敏感性為66.7%、特異性為90.4%，曲線下面積為0.813±0.046。目前尚無將SLP比色法應用于關節外科，特別是PJI診斷方面的研究報道。
SLP檢測有諸多優點：① 方法簡單，結果回報時間短，可以于術中使用；② 價格相對較低，比白細胞酯酶和二代基因測序具有更高的效益-費用比；③ 直接檢測病原微生物，敏感性及特異性高；④ 樣本通用性強；⑤ 既可以檢測細菌感染，也可以針對目前逐漸增多的真菌感染進行檢測。
3.5 SLP比色法的局限性
本研究結果充分顯示SLP比色法在診斷PJI方面具有較高的敏感性、特異性以及診斷效率。但本研究也存在一些局限性：動物模型的全身情況較為簡單，與臨床上發生PJI患者的全身狀況（如糖尿病、風濕等其他基礎疾病）有差異；SLP比色法對于細菌細胞壁中的PG敏感程度極高，這會導致假陽性的出現。SLP比色法能否在臨床取得較為優異的診斷效率及良好的敏感性、特異性，尚需臨床實踐檢驗。
作者貢獻：張馳負責實驗構思、操作、資料總結分析及文章撰寫；王遠賀負責文獻查閱及篩選、部分資料收集及實驗動物的飼養，參與文章修改；孫康負責手術及麻醉相關指導，文章邏輯性修改及大體框架形成；田少奇負責實驗設計、文章審閱、修改，硬件設施提供及基金支持。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：所有動物實驗經青島大學附屬醫院醫學倫理委員會批準。實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）20190003。
