引用本文： 武小煜, 李海波, 尹健健, 劉純, 吳思宇, 劉均, 馬佳義, 戴婷, 趙紅斌. 替米沙坦/膠原蛋白/聚己內酯神經導管的構建及其修復大鼠坐骨神經缺損效果的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(3): 352-361. doi: 10.7507/1002-1892.202108142 復制
自體神經移植是周圍神經損傷修復的金標準，但來源有限，無法滿足臨床需求[1]。隨著組織工程技術的發展，組織工程神經導管成為解決周圍神經損傷修復問題的重要手段之一[2]。高壓靜電紡絲技術具有易成型、操作簡單以及制備的材料具備納米纖維結構等優勢。已有研究采用該技術成功構建神經導管，其能引導缺損神經再生修復和功能重建[3-4]。植入材料引起宿主過度免疫反應是值得關注的問題，因過度免疫反應極易形成纖維化瘢痕組織，進而影響神經組織再生修復。針對該問題，有研究通過對神經導管材料進行表面改性和修飾，降低材料與宿主的免疫反應[5-7]。
替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑[8]，具有促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化作用[9-10]。而M2型巨噬細胞能分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，內源性抗炎因子不僅能降低免疫反應對組織的致炎作用，還能增加抗炎效應，抑制過度免疫反應導致的組織纖維化，通過內源性免疫調節促進組織再生修復和功能重建[11-12]。
基于上述相關研究，本實驗以替米沙坦作為免疫調節藥物，運用高壓靜電紡絲技術構建替米沙坦/膠原蛋白/聚己內酯（polycaprolactone，PCL）神經導管，通過動物實驗評價該神經導管修復坐骨神經缺損的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雌性成年Wistar大鼠40只，體質量為（200±10）g，由蘇州大學動物實驗中心提供。RAW264.7細胞購于上海細胞庫。PCL（相對分子質量80×103）、六氟異丙醇（Sigma公司，美國）；替米沙坦（Aladding上海分公司）；京尼平（和光純藥工業株式會社，日本）；膠原蛋白（本實驗室純化制備）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；小鼠CD86單克隆抗體、兔CD206多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）；兔髓磷脂堿基蛋白（myelin basic protein，MBP）多克隆抗體、小鼠髓磷脂蛋白0（myelin protein 0，P0）單克隆抗體、小鼠神經絲蛋白200 （neurofilament 200，NF-200）單克隆抗體、兔S-100β多克隆抗體、Cy5標記兔抗小鼠IgG、FITC標記羊抗兔IgG （Abcam公司，美國）；HRP標記羊抗小鼠、羊抗兔IgG二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程技術有限公司）；NucleoZol 試劑盒（Macherey-Nagel公司，德國）；Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒（南京諾唯贊生物公司）。高壓靜電紡絲機（天津云帆科技有限公司）；JSM-6701F掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 神經導管構建及表征
1.2.1 電紡溶液的制備
將6 g膠原蛋白、3 g PCL分別溶于100 mL六氟異丙醇（質量體積百分比為6%），以450 r/min攪拌12 h形成均勻的混合液。將膠原蛋白溶液（質量體積百分比為60%）和PCL溶液（質量體積百分比為40%）混合后，以450 r/min攪拌6 h形成均一的膠原蛋白/PCL混合液。根據前期藥物篩選實驗結果，確定本次研究負載替米沙坦濃度。取0、5、10、20 mg替米沙坦分別溶于10 mL膠原蛋白/PCL混合液中，制備替米沙坦/膠原蛋白/PCL電紡溶液。
1.2.2 神經導管的構建
基于課題組前期電紡實驗[13]，確立本次研究電紡參數。電紡參數：電壓16 kV，接收距離12 cm，針頭大小21G，推進速度0.5 mL/h，轉速150 r/min。將制備的替米沙坦/膠原蛋白/PCL電紡溶液置入10 mL醫用注射器中行高壓靜電紡絲。電紡完畢后，將獲得的神經導管置于37℃恒溫箱中揮發72 h，真空環境中48 h，以完全除去殘留的六氟異丙醇。待完全干燥后將神經導管剪成長15 mm 小段，4℃保存備用。
1.2.3 神經導管交聯及觀測
將神經導管置入1%京尼平溶液中，37℃交聯1 h，無水乙醇洗10 min，水洗3次×10 min，?40℃真空冷凍干燥后封裝，60Co輻照滅菌后備用。取交聯前后神經導管，常規程序噴金后，掃描電鏡觀察材料微觀結構。
1.2.4 藥物緩釋評價
將交聯后負載 20 mg 替米沙坦的神經導管（質量約30 mg）置入50 mL離心管中，加入50 mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4），置于37℃恒溫搖床上，分別于30 min及1、2、4、8、12、24、48、72、96 h直至700 h（96 h后間隔7 d取材1次），各取出 1 mL PBS，?20℃保存；同時回補等量PBS液。待實驗結束后，利用酶標儀于 270 nm處檢測不同時間點樣品的吸光度（A）值，繪制替米沙坦標準曲線，依據標準曲線計算不同時間點藥物濃度并計算累積釋放率。
1.3 替米沙坦體外免疫調節功能檢測
將RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔4×105個細胞，加入1 mL含10%FBS 的DMEM 完全培養基，置于37℃、5% CO2培養箱培養，每周更換2次培養液。待細胞達80%～90%融合后，更換含100 ng/mL脂多糖的DMEM完全培養基，刺激細胞6 h，以1%胰蛋白酶消化。取交聯后負載不同濃度替米沙坦的神經導管，分別與1.5×105個細胞共培養24 h。采用NucleoZol試劑盒分離細胞總RNA，Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒行逆轉錄PCR獲得cDNA，實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標志分子誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和M2 型巨噬細胞標志分子精氨酸酶1（Arginase 1，Arg-1）mRNA表達。采用2???方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 動物體內實驗
1.4.1 大鼠坐骨神經缺損及修復模型制備
將40只成年Wistar大鼠隨機分為A、B、C、D組，每組10只。各組大鼠首先經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，左后肢剃毛后依次切開皮膚和皮下組織，顯露股后肌群，沿肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經并充分游離。自梨狀肌下緣銳性切斷坐骨神經，并切除部分坐骨神經，自然回縮后形成長約15 mm 的缺損。A、B、C、D組分別以交聯后負載0、5、10、20 mg替米沙坦的神經導管橋接坐骨神經兩斷端，10-0無創可吸收縫合線縫合固定2針，縫合時始終保持神經導管與神經斷端無張力。各組大鼠術后均常規飼養。見圖1。
圖1
大鼠坐骨神經缺損修復模型制備
a. 神經缺損；b. 神經導管橋接
Figure1. Preparation of rat sciatic nerve defect repair modela. Defect model; b. After nerve conduit bridging
1.4.2 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組大鼠存活情況、切口愈合、有無感染及術側后肢活動恢復情況。
② 坐骨神經功能評估：術后1、3、6個月，各組取3只大鼠測量坐骨神經運動功能指數（sciatic functional index，SFI）。其中，SFI為0表示神經功能正常，?100表示神經功能完全喪失[14]。
③ 大體觀察：術后6個月時，每組取3只大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛（0.6 mL/100 g）處死后，按照原切口入路，觀察有無感染、神經導管兩端與坐骨神經橋接情況以及神經導管完整性。
④ 組織學觀察：術后1、3、6個月，每組取3只大鼠（術后6個月為大體觀察后），同上法處理后分離神經導管周圍組織，距神經導管兩端0.5 cm處切斷坐骨神經，置于10%甲醛固定72 h后，將每個樣品按照近、中、遠端切開。其中，中段樣品系列乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，片厚5 μm，常規HE染色后，光鏡下觀察神經組織再生及神經導管材料降解情況。
⑤ 免疫組織化學染色觀測：取各組術后1、6個月中段組織切片，依次以0.01%Triton X-100作用10 min，3%H2O2作用10 min，5% BSA室溫作用20 min。術后1個月切片加入CD86一抗（1∶200）、CD206一抗（1∶200），6個月切片加入P0一抗（1∶100）、MBP一抗（1∶100），4℃過夜；加入對應的二抗（1∶1 000），置于37℃溫箱中作用30 min，PBS沖洗；SABC 37℃溫箱中作用30 min，PBS沖洗；DAB避光顯色5～10 min，蘇木素復染，中性樹膠封片。光鏡下觀察CD86和CD206蛋白定位于巨噬細胞胞膜，MBP和P0蛋白定位于雪旺細胞胞膜，陽性染色均呈棕黃色。每組切片選取5個具有代表性的區域，利用Image Pro Plus圖像分析軟件測量陽性面積及總面積，計算陽性率（陽性面積/總面積×100%），取均值。
⑥ 免疫熒光染色觀察：取各組術后6個月近端及遠端組織切片，分別加入小鼠NF-200單克隆抗體和兔S-100β多克隆抗體，4℃孵育過夜；加入Cy5標記兔抗小鼠IgG（1∶1000）和FITC標記羊抗兔IgG（1∶1000）二抗置濕盒內，37℃溫箱中避光作用30 min； DAPI染色細胞核 10 min；磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NF-200和S-100β表達情況，其中NF-200（紅色）和S-100β（綠色）定位于細胞質。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準取α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管觀測
經高壓靜電紡絲技術可獲得內徑1.8 mm、外徑2.0 mm的神經導管，大體觀察導管呈白色、粗細均勻。掃描電鏡觀察示，交聯前神經導管納米纖維呈有序排列，纖維直徑為250～800 nm；交聯后納米纖維相互粘連，纖維變粗，直徑為350～1 200 nm，且結構致密。藥物緩釋評價顯示48 h內藥物釋放呈快速增加，累積釋放率達15.0%；48～100 h時藥物累積釋放率達22.5%；500 h時藥物累積釋放率達32.5%；500～700 h時藥物累積釋放率維持在32.5%。見圖2。
圖2
神經導管觀測
a. 大體觀察；b. 交聯前掃描電鏡觀察（× 3 000）；c. 交聯后掃描電鏡觀察（×3 000）；d. 藥物緩釋評價
Figure2. Observation of nerve conduita. Gross observation; b. SEM observation before crosslinking (× 3 000); c. SEM observation after crosslinking (×3 000); d. Drug release observation
2.2 替米沙坦體外免疫調節功能觀察
實時熒光定量PCR檢測顯示，隨著負載替米沙坦濃度增加，iNOS mRNA相對表達量下調，Arg-1 mRNA相對表達量上調，其中20 mg組與其他各組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
實時熒光定量PCR檢測神經導管體外免疫調節作用
a. iNOS；b. Arg-1
Figure3. In vivo immunomodulatory effect of nerve conduit by using real-time fluorescence quantitative PCRa. iNOS; b. Arg-1
2.3 動物體內實驗
2.3.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。A、B組大鼠左后肢逐步萎縮，失去運動功能；C、D組大鼠左后肢部分萎縮，存在一定運動功能，D組功能最好。
2.3.2 坐骨神經功能評估
術后各時間點，C、D 組SFI均高于A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；6個月時D組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。各組組內各時間點SFI比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
各組術后SFI比較（n=3，
）
Table2.
Comparison of SFI between groups after operation (n=3, 
)
2.3.3 大體觀察
術后6個月，A組神經/導管復合體明顯腫脹，神經端有結締組織附著；B組神經/導管復合體腫脹，但腫脹程度明顯低于A組；C、D組神經/導管復合體無腫脹，可見殘存的神經導管材料，導管兩端坐骨神經清晰可見。見圖4。
圖4
各組術后6個月大體觀察
從左至右分別為A、B、C、D組 a. 取材前；b. 取材后
Figure4. Gross observation of each group at 6 months after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Before taking materials; b. After taking materials
2.3.4 組織學觀察
HE染色示，術后1個月，各組神經導管中段未見新生組織生長。3個月，僅D組神經導管中段可見少量新生組織，其他各組中段未見新生組織生長。6個月，A組神經導管中段僅見極少量新生組織生長；B、C組可見少量新生組織生長；D組可見大量新生組織，明顯多于其他各組。見圖5。
圖5
術后各組HE染色觀察（×40）
紅箭頭示新生組織，黑箭頭示神經導管 從左至右依次為A、B、C、D組 a. 術后1個月；b. 術后3個月；c. 術后6個月
Figure5. HE staining observation of each group after operation (×40)Red arrow for new tissue, black arrow for nerve conduit From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. One month after operation; b. Three months after operation; c. Six months after operation
2.3.5 免疫組織化學染色觀測
術后1個月，各組CD86、CD206染色均呈陽性；A、B、C、D組CD86陽性率分別為36.15%±9.21%、19.94%±6.25%、17.39%±2.49%和14.92%±3.35%；CD206陽性率分別為4.22%±1.29%、12.52%±2.89%、30.48%±9.08%、60.89%±14.05%。其中，A組CD86陽性率高于其他各組，CD206陽性率低于其他各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C、D組間CD86陽性率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；CD206陽性率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
術后1個月各組CD86和CD206免疫組織化學染色觀察 （×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. CD86；b. CD206
Figure6. Immunohistochemical staining observation of CD86 and CD206 expressions in each group at 1 month after operation (×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. CD86; b. CD206
術后6個月，A 、B組MBP和P0染色均呈陰性，C、D組呈陽性。D組MBP和P0染色陽性率分別為76.21%±10.13%和69.16%±11.87%，明顯高于C組32.32%±8.79%和39.43%±12.14%，差異均有統計學意義（F=348.939，P<0.001；F=232.925，P<0.001）。見圖7。
圖7
術后6個月各組MBP和P0免疫組織化學染色觀察 （×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. MBP; b. P0
Figure7. Immunohistochemical staining observation of MBP and P0 expressions in each group at 6 months after operation (×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. MBP; b. P0
2.3.6 免疫熒光染色觀察
術后6個月，A 組NF-200蛋白表達為陰性；B、C、D組均為陽性，且D組明顯強于B、C組。A 組S-100β蛋白表達為陰性，B組為弱陽性，C、D組為強陽性。見圖8。
圖8
術后6個月各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. NF-200（白色箭頭）；b. S-100β（紅色箭頭）
Figure8. Immunofluorescence staining observation of each group at 6 months after operation (Fluorescence microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. NF-200 (white arrow); b. S-100β (red arrow)
3 討論
研究表明內植物材料不僅影響細胞黏附、生長和分化，還能調節宿主局部免疫反應，進而影響損傷組織再生和修復[15-16]。由于機體免疫反應極為復雜以及內植物材料理化特性不同，其植入體內后宿主的免疫反應也不完全相同[17-19]。如何通過材料改性和表面修飾制備具有免疫調節功能的免疫活性生物材料，加速損傷組織再生和修復，是目前組織工程研究熱點之一[20]。
本研究利用高壓靜電紡絲技術構建了替米沙坦/膠原蛋白/PCL神經導管，以期通過替米沙坦促進宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的作用，實現周圍神經缺損的再生和修復。藥物緩釋實驗顯示，制備的神經導管具有良好藥物緩釋效果，8 h時呈現藥物突釋，72 h時累積釋放達平臺期，而替米沙坦快速釋放有助于早期實現宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化。掃描電鏡觀察顯示，京尼平交聯后神經導管結構發生明顯改變，與交聯前相比納米纖維相互粘連，纖維直徑增加且結構致密，與課題組前期研究結果一致[21]。神經導管納米纖維致密具有兩方面優勢，一方面有利于阻止神經導管外部非神經組織的遷入和生長，影響神經組織再生；另一方面膠原蛋白交聯后降低了材料降解率，為神經組織在導管內部生長提供了充足空間[22]。
SFI是反映坐骨神經運動功能的重要指標，SFI值越高、坐骨神經運動功能越好[23]。動物體內實驗結果顯示，術后各時間點C、D 組SFI均高于A、B 組，6個月時D組高于C組，差異均有統計學意義，提示負載替米沙坦的神經導管能明顯提升大鼠坐骨神經運動功能。大體及HE染色觀察結果示，隨時間延長，采用負載替米沙坦神經導管修復的各組均有逐漸增加的新生組織，6個月時D組新生組織最多，且大部分神經導管材料已降解，與SFI檢測結果一致。
植入宿主體內的材料主要通過中性粒細胞、T細胞和巨噬細胞影響宿主免疫反應和組織再生[24-25]，其中材料對宿主巨噬細胞功能的影響是研究熱點[26-27]。大量研究已證明，通過對材料表面改性或負載免疫抑制因子，能促進宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，極化的M2型巨噬細胞通過釋放相關生長因子，促進損傷組織修復[28-29]。體外實驗結果顯示，神經導管能顯著抑制iNOS mRNA表達，上調Arg-1 mRNA表達，提示通過釋放替米沙坦能使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，進而抑制M1型巨噬細胞的致炎作用，增強M2型巨噬細胞的抗炎功能。動物體內實驗結果顯示，負載不同濃度替米沙坦的神經導管對宿主巨噬細胞影響也不同。CD86、CD206分別是M1、M2型巨噬細胞標志分子，通過檢測兩者變化能反映M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的程度。本研究發現，隨著神經導管中負載替米沙坦濃度的增加，神經新生組織中CD86表達明顯降低，相反CD206表達顯著增加，與體外實驗結果一致。
髓鞘是脊椎動物周圍神經系統中雪旺細胞胞質向其附近神經軸突延伸并包繞形成的膜結構，具有良好絕緣效果，在神經沖動傳導過程中發揮重要作用[30]。MBP和P0是神經髓鞘結構主要成分，其功能是維持周圍神經結構的完整性和神經沖動的傳導[31-32]。免疫組織化學染色觀測結果顯示，術后6個月時C、D組MBP和P0蛋白表達明顯增加，提示神經導管內的新生組織為神經纖維組織，而非結締組織或成纖維組織，同時也證明了再生的神經纖維具有髓鞘結構[33]。S-100β主要存在于神經膠質細胞和雪旺細胞，是雪旺細胞標志分子。NF-200與微管和微絲一起形成神經元細胞骨架，主要為軸突提供結構支持并調節軸突直徑，影響神經傳導速度[34-35]。免疫熒光染色結果顯示，隨著替米沙坦濃度增加，S-100β和NF-200表達程度逐漸增加，與MBP和P0蛋白表達結果一致。
綜上述，本研究利用高壓靜電紡絲技術構建了替米沙坦/膠原蛋白/PCL神經導管，利用替米沙坦緩釋作用能促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，通過M2型巨噬細胞的抗炎功能促進缺損周圍神經再生和修復。但替米沙坦促進神經組織再生的具體分子機制尚不清楚，有待進一步研究。后續還需要對該神經導管不斷優化，為其作為組織工程周圍神經修復材料用于臨床奠定實驗基礎。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京醫科大學附屬常州第二人民醫院倫理委員會批準；所有實驗大鼠符合國家一級動物標準；實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0009
作者貢獻聲明 武小煜負責研究實施、文章撰寫等所有工作；李海波、尹健健參與復制動物模型和神經導管橋接；劉純參與材料構建；吳思宇、劉均、馬佳義參與材料構建和材料性能評價；戴婷參與組織學染色和分析；趙紅斌參與研究設計、組織及其指導
自體神經移植是周圍神經損傷修復的金標準，但來源有限，無法滿足臨床需求[1]。隨著組織工程技術的發展，組織工程神經導管成為解決周圍神經損傷修復問題的重要手段之一[2]。高壓靜電紡絲技術具有易成型、操作簡單以及制備的材料具備納米纖維結構等優勢。已有研究采用該技術成功構建神經導管，其能引導缺損神經再生修復和功能重建[3-4]。植入材料引起宿主過度免疫反應是值得關注的問題，因過度免疫反應極易形成纖維化瘢痕組織，進而影響神經組織再生修復。針對該問題，有研究通過對神經導管材料進行表面改性和修飾，降低材料與宿主的免疫反應[5-7]。
替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑[8]，具有促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化作用[9-10]。而M2型巨噬細胞能分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，內源性抗炎因子不僅能降低免疫反應對組織的致炎作用，還能增加抗炎效應，抑制過度免疫反應導致的組織纖維化，通過內源性免疫調節促進組織再生修復和功能重建[11-12]。
基于上述相關研究，本實驗以替米沙坦作為免疫調節藥物，運用高壓靜電紡絲技術構建替米沙坦/膠原蛋白/聚己內酯（polycaprolactone，PCL）神經導管，通過動物實驗評價該神經導管修復坐骨神經缺損的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雌性成年Wistar大鼠40只，體質量為（200±10）g，由蘇州大學動物實驗中心提供。RAW264.7細胞購于上海細胞庫。PCL（相對分子質量80×103）、六氟異丙醇（Sigma公司，美國）；替米沙坦（Aladding上海分公司）；京尼平（和光純藥工業株式會社，日本）；膠原蛋白（本實驗室純化制備）；DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；小鼠CD86單克隆抗體、兔CD206多克隆抗體（Santa Cruz 公司，美國）；兔髓磷脂堿基蛋白（myelin basic protein，MBP）多克隆抗體、小鼠髓磷脂蛋白0（myelin protein 0，P0）單克隆抗體、小鼠神經絲蛋白200 （neurofilament 200，NF-200）單克隆抗體、兔S-100β多克隆抗體、Cy5標記兔抗小鼠IgG、FITC標記羊抗兔IgG （Abcam公司，美國）；HRP標記羊抗小鼠、羊抗兔IgG二抗（上海碧云天生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程技術有限公司）；NucleoZol 試劑盒（Macherey-Nagel公司，德國）；Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒（南京諾唯贊生物公司）。高壓靜電紡絲機（天津云帆科技有限公司）；JSM-6701F掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 神經導管構建及表征
1.2.1 電紡溶液的制備
將6 g膠原蛋白、3 g PCL分別溶于100 mL六氟異丙醇（質量體積百分比為6%），以450 r/min攪拌12 h形成均勻的混合液。將膠原蛋白溶液（質量體積百分比為60%）和PCL溶液（質量體積百分比為40%）混合后，以450 r/min攪拌6 h形成均一的膠原蛋白/PCL混合液。根據前期藥物篩選實驗結果，確定本次研究負載替米沙坦濃度。取0、5、10、20 mg替米沙坦分別溶于10 mL膠原蛋白/PCL混合液中，制備替米沙坦/膠原蛋白/PCL電紡溶液。
1.2.2 神經導管的構建
基于課題組前期電紡實驗[13]，確立本次研究電紡參數。電紡參數：電壓16 kV，接收距離12 cm，針頭大小21G，推進速度0.5 mL/h，轉速150 r/min。將制備的替米沙坦/膠原蛋白/PCL電紡溶液置入10 mL醫用注射器中行高壓靜電紡絲。電紡完畢后，將獲得的神經導管置于37℃恒溫箱中揮發72 h，真空環境中48 h，以完全除去殘留的六氟異丙醇。待完全干燥后將神經導管剪成長15 mm 小段，4℃保存備用。
1.2.3 神經導管交聯及觀測
將神經導管置入1%京尼平溶液中，37℃交聯1 h，無水乙醇洗10 min，水洗3次×10 min，?40℃真空冷凍干燥后封裝，60Co輻照滅菌后備用。取交聯前后神經導管，常規程序噴金后，掃描電鏡觀察材料微觀結構。
1.2.4 藥物緩釋評價
將交聯后負載 20 mg 替米沙坦的神經導管（質量約30 mg）置入50 mL離心管中，加入50 mL 0.01 mol/L PBS（pH7.4），置于37℃恒溫搖床上，分別于30 min及1、2、4、8、12、24、48、72、96 h直至700 h（96 h后間隔7 d取材1次），各取出 1 mL PBS，?20℃保存；同時回補等量PBS液。待實驗結束后，利用酶標儀于 270 nm處檢測不同時間點樣品的吸光度（A）值，繪制替米沙坦標準曲線，依據標準曲線計算不同時間點藥物濃度并計算累積釋放率。
1.3 替米沙坦體外免疫調節功能檢測
將RAW 264.7細胞接種于6孔板中，每孔4×105個細胞，加入1 mL含10%FBS 的DMEM 完全培養基，置于37℃、5% CO2培養箱培養，每周更換2次培養液。待細胞達80%～90%融合后，更換含100 ng/mL脂多糖的DMEM完全培養基，刺激細胞6 h，以1%胰蛋白酶消化。取交聯后負載不同濃度替米沙坦的神經導管，分別與1.5×105個細胞共培養24 h。采用NucleoZol試劑盒分離細胞總RNA，Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix試劑盒行逆轉錄PCR獲得cDNA，實時熒光定量PCR檢測M1型巨噬細胞標志分子誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和M2 型巨噬細胞標志分子精氨酸酶1（Arginase 1，Arg-1）mRNA表達。采用2???方法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。
表1
實時熒光定量PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR
1.4 動物體內實驗
1.4.1 大鼠坐骨神經缺損及修復模型制備
將40只成年Wistar大鼠隨機分為A、B、C、D組，每組10只。各組大鼠首先經腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，左后肢剃毛后依次切開皮膚和皮下組織，顯露股后肌群，沿肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經并充分游離。自梨狀肌下緣銳性切斷坐骨神經，并切除部分坐骨神經，自然回縮后形成長約15 mm 的缺損。A、B、C、D組分別以交聯后負載0、5、10、20 mg替米沙坦的神經導管橋接坐骨神經兩斷端，10-0無創可吸收縫合線縫合固定2針，縫合時始終保持神經導管與神經斷端無張力。各組大鼠術后均常規飼養。見圖1。
圖1
大鼠坐骨神經缺損修復模型制備
a. 神經缺損；b. 神經導管橋接
Figure1. Preparation of rat sciatic nerve defect repair modela. Defect model; b. After nerve conduit bridging
1.4.2 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組大鼠存活情況、切口愈合、有無感染及術側后肢活動恢復情況。
② 坐骨神經功能評估：術后1、3、6個月，各組取3只大鼠測量坐骨神經運動功能指數（sciatic functional index，SFI）。其中，SFI為0表示神經功能正常，?100表示神經功能完全喪失[14]。
③ 大體觀察：術后6個月時，每組取3只大鼠腹腔注射過量10%水合氯醛（0.6 mL/100 g）處死后，按照原切口入路，觀察有無感染、神經導管兩端與坐骨神經橋接情況以及神經導管完整性。
④ 組織學觀察：術后1、3、6個月，每組取3只大鼠（術后6個月為大體觀察后），同上法處理后分離神經導管周圍組織，距神經導管兩端0.5 cm處切斷坐骨神經，置于10%甲醛固定72 h后，將每個樣品按照近、中、遠端切開。其中，中段樣品系列乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，片厚5 μm，常規HE染色后，光鏡下觀察神經組織再生及神經導管材料降解情況。
⑤ 免疫組織化學染色觀測：取各組術后1、6個月中段組織切片，依次以0.01%Triton X-100作用10 min，3%H2O2作用10 min，5% BSA室溫作用20 min。術后1個月切片加入CD86一抗（1∶200）、CD206一抗（1∶200），6個月切片加入P0一抗（1∶100）、MBP一抗（1∶100），4℃過夜；加入對應的二抗（1∶1 000），置于37℃溫箱中作用30 min，PBS沖洗；SABC 37℃溫箱中作用30 min，PBS沖洗；DAB避光顯色5～10 min，蘇木素復染，中性樹膠封片。光鏡下觀察CD86和CD206蛋白定位于巨噬細胞胞膜，MBP和P0蛋白定位于雪旺細胞胞膜，陽性染色均呈棕黃色。每組切片選取5個具有代表性的區域，利用Image Pro Plus圖像分析軟件測量陽性面積及總面積，計算陽性率（陽性面積/總面積×100%），取均值。
⑥ 免疫熒光染色觀察：取各組術后6個月近端及遠端組織切片，分別加入小鼠NF-200單克隆抗體和兔S-100β多克隆抗體，4℃孵育過夜；加入Cy5標記兔抗小鼠IgG（1∶1000）和FITC標記羊抗兔IgG（1∶1000）二抗置濕盒內，37℃溫箱中避光作用30 min； DAPI染色細胞核 10 min；磷酸甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NF-200和S-100β表達情況，其中NF-200（紅色）和S-100β（綠色）定位于細胞質。
1.5 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。檢驗水準取α=0.05。
2 結果
2.1 神經導管觀測
經高壓靜電紡絲技術可獲得內徑1.8 mm、外徑2.0 mm的神經導管，大體觀察導管呈白色、粗細均勻。掃描電鏡觀察示，交聯前神經導管納米纖維呈有序排列，纖維直徑為250～800 nm；交聯后納米纖維相互粘連，纖維變粗，直徑為350～1 200 nm，且結構致密。藥物緩釋評價顯示48 h內藥物釋放呈快速增加，累積釋放率達15.0%；48～100 h時藥物累積釋放率達22.5%；500 h時藥物累積釋放率達32.5%；500～700 h時藥物累積釋放率維持在32.5%。見圖2。
圖2
神經導管觀測
a. 大體觀察；b. 交聯前掃描電鏡觀察（× 3 000）；c. 交聯后掃描電鏡觀察（×3 000）；d. 藥物緩釋評價
Figure2. Observation of nerve conduita. Gross observation; b. SEM observation before crosslinking (× 3 000); c. SEM observation after crosslinking (×3 000); d. Drug release observation
2.2 替米沙坦體外免疫調節功能觀察
實時熒光定量PCR檢測顯示，隨著負載替米沙坦濃度增加，iNOS mRNA相對表達量下調，Arg-1 mRNA相對表達量上調，其中20 mg組與其他各組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
實時熒光定量PCR檢測神經導管體外免疫調節作用
a. iNOS；b. Arg-1
Figure3. In vivo immunomodulatory effect of nerve conduit by using real-time fluorescence quantitative PCRa. iNOS; b. Arg-1
2.3 動物體內實驗
2.3.1 一般情況
術后各組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。A、B組大鼠左后肢逐步萎縮，失去運動功能；C、D組大鼠左后肢部分萎縮，存在一定運動功能，D組功能最好。
2.3.2 坐骨神經功能評估
術后各時間點，C、D 組SFI均高于A、B 組，差異有統計學意義（P<0.05）；6個月時D組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。各組組內各時間點SFI比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
各組術后SFI比較（n=3，）
Table2.
Comparison of SFI between groups after operation (n=3, )
2.3.3 大體觀察
術后6個月，A組神經/導管復合體明顯腫脹，神經端有結締組織附著；B組神經/導管復合體腫脹，但腫脹程度明顯低于A組；C、D組神經/導管復合體無腫脹，可見殘存的神經導管材料，導管兩端坐骨神經清晰可見。見圖4。
圖4
各組術后6個月大體觀察
從左至右分別為A、B、C、D組 a. 取材前；b. 取材后
Figure4. Gross observation of each group at 6 months after operationFrom left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. Before taking materials; b. After taking materials
2.3.4 組織學觀察
HE染色示，術后1個月，各組神經導管中段未見新生組織生長。3個月，僅D組神經導管中段可見少量新生組織，其他各組中段未見新生組織生長。6個月，A組神經導管中段僅見極少量新生組織生長；B、C組可見少量新生組織生長；D組可見大量新生組織，明顯多于其他各組。見圖5。
圖5
術后各組HE染色觀察（×40）
紅箭頭示新生組織，黑箭頭示神經導管 從左至右依次為A、B、C、D組 a. 術后1個月；b. 術后3個月；c. 術后6個月
Figure5. HE staining observation of each group after operation (×40)Red arrow for new tissue, black arrow for nerve conduit From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. One month after operation; b. Three months after operation; c. Six months after operation
2.3.5 免疫組織化學染色觀測
術后1個月，各組CD86、CD206染色均呈陽性；A、B、C、D組CD86陽性率分別為36.15%±9.21%、19.94%±6.25%、17.39%±2.49%和14.92%±3.35%；CD206陽性率分別為4.22%±1.29%、12.52%±2.89%、30.48%±9.08%、60.89%±14.05%。其中，A組CD86陽性率高于其他各組，CD206陽性率低于其他各組，差異均有統計學意義（P<0.05）。B、C、D組間CD86陽性率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；CD206陽性率比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
術后1個月各組CD86和CD206免疫組織化學染色觀察 （×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. CD86；b. CD206
Figure6. Immunohistochemical staining observation of CD86 and CD206 expressions in each group at 1 month after operation (×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. CD86; b. CD206
術后6個月，A 、B組MBP和P0染色均呈陰性，C、D組呈陽性。D組MBP和P0染色陽性率分別為76.21%±10.13%和69.16%±11.87%，明顯高于C組32.32%±8.79%和39.43%±12.14%，差異均有統計學意義（F=348.939，P<0.001；F=232.925，P<0.001）。見圖7。
圖7
術后6個月各組MBP和P0免疫組織化學染色觀察 （×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. MBP; b. P0
Figure7. Immunohistochemical staining observation of MBP and P0 expressions in each group at 6 months after operation (×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. MBP; b. P0
2.3.6 免疫熒光染色觀察
術后6個月，A 組NF-200蛋白表達為陰性；B、C、D組均為陽性，且D組明顯強于B、C組。A 組S-100β蛋白表達為陰性，B組為弱陽性，C、D組為強陽性。見圖8。
圖8
術后6個月各組免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×40）
從左至右依次為A、B、C、D組 a. NF-200（白色箭頭）；b. S-100β（紅色箭頭）
Figure8. Immunofluorescence staining observation of each group at 6 months after operation (Fluorescence microscope×40)From left to right for groups A, B, C, and D, respectively a. NF-200 (white arrow); b. S-100β (red arrow)
3 討論
研究表明內植物材料不僅影響細胞黏附、生長和分化，還能調節宿主局部免疫反應，進而影響損傷組織再生和修復[15-16]。由于機體免疫反應極為復雜以及內植物材料理化特性不同，其植入體內后宿主的免疫反應也不完全相同[17-19]。如何通過材料改性和表面修飾制備具有免疫調節功能的免疫活性生物材料，加速損傷組織再生和修復，是目前組織工程研究熱點之一[20]。
本研究利用高壓靜電紡絲技術構建了替米沙坦/膠原蛋白/PCL神經導管，以期通過替米沙坦促進宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的作用，實現周圍神經缺損的再生和修復。藥物緩釋實驗顯示，制備的神經導管具有良好藥物緩釋效果，8 h時呈現藥物突釋，72 h時累積釋放達平臺期，而替米沙坦快速釋放有助于早期實現宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化。掃描電鏡觀察顯示，京尼平交聯后神經導管結構發生明顯改變，與交聯前相比納米纖維相互粘連，纖維直徑增加且結構致密，與課題組前期研究結果一致[21]。神經導管納米纖維致密具有兩方面優勢，一方面有利于阻止神經導管外部非神經組織的遷入和生長，影響神經組織再生；另一方面膠原蛋白交聯后降低了材料降解率，為神經組織在導管內部生長提供了充足空間[22]。
SFI是反映坐骨神經運動功能的重要指標，SFI值越高、坐骨神經運動功能越好[23]。動物體內實驗結果顯示，術后各時間點C、D 組SFI均高于A、B 組，6個月時D組高于C組，差異均有統計學意義，提示負載替米沙坦的神經導管能明顯提升大鼠坐骨神經運動功能。大體及HE染色觀察結果示，隨時間延長，采用負載替米沙坦神經導管修復的各組均有逐漸增加的新生組織，6個月時D組新生組織最多，且大部分神經導管材料已降解，與SFI檢測結果一致。
植入宿主體內的材料主要通過中性粒細胞、T細胞和巨噬細胞影響宿主免疫反應和組織再生[24-25]，其中材料對宿主巨噬細胞功能的影響是研究熱點[26-27]。大量研究已證明，通過對材料表面改性或負載免疫抑制因子，能促進宿主M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，極化的M2型巨噬細胞通過釋放相關生長因子，促進損傷組織修復[28-29]。體外實驗結果顯示，神經導管能顯著抑制iNOS mRNA表達，上調Arg-1 mRNA表達，提示通過釋放替米沙坦能使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，進而抑制M1型巨噬細胞的致炎作用，增強M2型巨噬細胞的抗炎功能。動物體內實驗結果顯示，負載不同濃度替米沙坦的神經導管對宿主巨噬細胞影響也不同。CD86、CD206分別是M1、M2型巨噬細胞標志分子，通過檢測兩者變化能反映M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的程度。本研究發現，隨著神經導管中負載替米沙坦濃度的增加，神經新生組織中CD86表達明顯降低，相反CD206表達顯著增加，與體外實驗結果一致。
髓鞘是脊椎動物周圍神經系統中雪旺細胞胞質向其附近神經軸突延伸并包繞形成的膜結構，具有良好絕緣效果，在神經沖動傳導過程中發揮重要作用[30]。MBP和P0是神經髓鞘結構主要成分，其功能是維持周圍神經結構的完整性和神經沖動的傳導[31-32]。免疫組織化學染色觀測結果顯示，術后6個月時C、D組MBP和P0蛋白表達明顯增加，提示神經導管內的新生組織為神經纖維組織，而非結締組織或成纖維組織，同時也證明了再生的神經纖維具有髓鞘結構[33]。S-100β主要存在于神經膠質細胞和雪旺細胞，是雪旺細胞標志分子。NF-200與微管和微絲一起形成神經元細胞骨架，主要為軸突提供結構支持并調節軸突直徑，影響神經傳導速度[34-35]。免疫熒光染色結果顯示，隨著替米沙坦濃度增加，S-100β和NF-200表達程度逐漸增加，與MBP和P0蛋白表達結果一致。
綜上述，本研究利用高壓靜電紡絲技術構建了替米沙坦/膠原蛋白/PCL神經導管，利用替米沙坦緩釋作用能促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，通過M2型巨噬細胞的抗炎功能促進缺損周圍神經再生和修復。但替米沙坦促進神經組織再生的具體分子機制尚不清楚，有待進一步研究。后續還需要對該神經導管不斷優化，為其作為組織工程周圍神經修復材料用于臨床奠定實驗基礎。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京醫科大學附屬常州第二人民醫院倫理委員會批準；所有實驗大鼠符合國家一級動物標準；實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0009
作者貢獻聲明 武小煜負責研究實施、文章撰寫等所有工作；李海波、尹健健參與復制動物模型和神經導管橋接；劉純參與材料構建；吳思宇、劉均、馬佳義參與材料構建和材料性能評價；戴婷參與組織學染色和分析；趙紅斌參與研究設計、組織及其指導
