引用本文： 涂鵬程, 馬勇, 潘婭嵐, 汪志芳, 孫杰, 陳凱, 楊光露, 王禮寧, 劉孟敏, 郭楊. 負載威靈仙總皂苷絲素蛋白微載體復合軟骨細胞促進兔膝關節軟骨缺損修復的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(3): 343-351. doi: 10.7507/1002-1892.202107061 復制
膝關節軟骨是透明的無血管組織，一旦損傷難以自行修復[1]。目前膝關節軟骨損傷治療方式較多，但療效均不理想[2]。以非甾體類抗炎藥物為主的對癥治療，遠期療效不佳；以微骨折術等手術治療后，修復組織以瘢痕組織、纖維軟骨為主，失去了原生軟骨特性且易發生退行性改變[3-4]。組織工程技術是一種具有應用潛力的軟骨缺損修復方法[5]。設計并控制構建組織工程軟骨的生物支架、生長因子等關鍵要素，以保持軟骨細胞活性、增強支架軟骨再生效率，是組織工程技術用于軟骨修復的關鍵。
威靈仙為毛莨科植物威靈仙、棉團鐵線蓮或東北鐵線蓮的干燥根和根莖，能治療骨關節炎[6]。威靈仙總皂苷（clematis total saponins，CTS）為威靈仙提取物，能促進軟骨組織損傷修復，改善膝關節骨關節炎癥狀，發揮類生長因子作用[7-8]。絲素蛋白是從蠶繭中提取的天然蛋白，具有良好生物相容性，可作為軟骨組織工程支架材料[9]。研究顯示通過自交聯方法，可以將絲素蛋白中不穩定的α-螺旋結構轉化為β-折疊結構，使其具有不溶于水以及較高機械性能的優勢，近年來已被廣泛應用于構建藥物緩釋系統，而且低溫條件下絲素蛋白的自組裝對自身給藥活性和生物相容性影響較小[10-12]。此外，絲素蛋白降解產物為多種氨基酸，可以作為細胞生長營養物質[13]。我們前期研究制備了負載CTS絲素蛋白微球，并在體外實驗中搭載軟骨細胞培養，結果顯示其能維持軟骨細胞表型[14]。本次研究在制備負載CTS絲素蛋白微載體基礎上，于體外微重力條件下搭載軟骨細胞進行擴增培養，而后植入兔膝關節軟骨缺損處，探討負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞修復軟骨缺損的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡雄性新西蘭大白兔6只，體質量為（500±50） g；3月齡新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質量（3.0±0.5）kg。實驗動物均由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。
FBS、L-DMEM培養基（BioInd公司，以色列）；絲素蛋白溶液（Sigma-Aldrich公司，德國）；Ⅱ型膠原酶（大連美侖生物技術有限公司）；CTS提取物（西安奧晶科技發展有限公司）；HE、甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；GAPDH、TGF-β、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13, MMP-13）抗體、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Ⅱ型膠原抗體（Novus公司，美國）；蛋白聚糖抗體（Thermo公司，美國）；兔抗小鼠二抗（Affinity公司，美國）；MMP-9、MMP-13、MMP組織抑制因子1（tissue inhibitor of MMP 1，TIMP-1）ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。
液動力聚焦細胞培養系統（Celltech公司，美國）；微量注射泵（浙江史密斯醫學儀器有限公司）；冷凍干燥機（Labconco公司，美國）；化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）；多功能酶標儀（PerkinElmer公司，美國）；掃描電鏡 （Hitachi公司，日本）。
1.2 負載CTS絲素蛋白微載體的制備及觀察
1.2.1 微載體制備方法
參照本課題組既往采用方法，以高壓靜電場結合冷凍干燥方法制備負載CTS絲素蛋白微載體[14]。取5%絲素蛋白溶液，加入等體積10 mg/mL CTS溶液、甘油（絲素蛋白質量的30%）混勻后，轉入微量注射泵中。將高壓電發生器正、負極分別連接微量注射泵的注射器針頭和液氮收集池。打開高壓電發生器、微量注射泵，使混合液在靜電場作用下逐滴滴入液氮收集池；制備參數：電壓12～15 kV，注射針頭直徑0.45 mm，滴速1 mL/h。收集固化液滴并冷凍干燥，即獲得不溶于水的負載CTS絲素蛋白微載體[15]。取5%絲素蛋白溶液、甘油（絲素蛋白質量的30%）制備混合液，同上法制備單純絲素蛋白微載體。
1.2.2 微載體形態觀察
取負載CTS絲素蛋白微載體樣本，體式顯微鏡觀察后，噴金處理并掃描電鏡觀察微載體形態、大小及微觀形貌。利用Image J軟件計算微載體表面孔隙率。
1.2.3 藥物緩釋測定
將負載CTS絲素蛋白微載體樣本置于pH7.4 PBS中，密封置于37℃恒溫震蕩箱中緩慢搖動，分別于1、2、4、6、8、12、14、16、18 h及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 收集上清液0.1 mL，利用香草醛-高氯酸顯色方法[16]檢測CTS緩釋濃度，計算累積釋放量。
1.3 微重力條件下負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞培養及觀測
1.3.1 軟骨細胞培養及傳代
取6只4周齡新西蘭大白兔，空氣栓塞法處死后無菌條件下分離膝關節，取關節透明軟骨，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm；置于0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化6 h，200 μm濾網過濾后，以300×g離心5 min，獲得軟骨細胞。將細胞接種至培養皿，以含10%FBS以及1%青霉素、鏈霉素混合液的L-DMEM培養基培養，隔2 d換液1次，待細胞長滿瓶底70%～80%后傳代，取第3代細胞用于實驗。
1.3.2 微重力條件下微載體復合軟骨細胞培養及觀測
① 培養方法：將5×106個軟骨細胞分別與50 mg絲素蛋白微載體、負載CTS絲素蛋白微載體，置于液動力聚焦細胞培養系統培養倉中，調整轉速為12 r/min，使培養倉內微載體既不接觸培養倉壁，又在旋轉過程中呈自由落體狀態[17]。
② 觀測指標：培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察兩種微載體表面軟骨細胞黏附情況；7 d時于掃描電鏡下觀察細胞黏附情況，然后收集兩種微載體-軟骨細胞復合物，經0.25%胰蛋白酶消化后收集軟骨細胞；將細胞按1×105個/孔接種至96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養24 h后，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，以吸光度（A）值表示。以在培養皿中正常培養的軟骨細胞作為對照。實驗重復3次。
1.4 負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞修復軟骨缺損觀測
1.4.1 兔膝關節軟骨缺損模型制備及分組
參照1.3方法于體外微重力條件下培養兩種微載體-軟骨細胞復合物，待培養12 d觀察到軟骨細胞貼滿微載體表面時用于動物體內實驗。
取30只3月齡新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，在雙后肢膝關節滑車表面用眼科環鉆鉆取直徑3 mm、深3～4 mm圓孔，制備膝關節軟骨缺損模型。將模型隨機分為3組（n=20），分別為空白對照組（A組）、絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物組（B組）、負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物組（C組）。A組：膝關節軟骨缺損不作任何處理；B組：采用絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物填充關節軟骨缺損；C組：采用負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物填充關節軟骨缺損。B、C組植入量以填滿缺損處為標準。
術后兔單籠飼養，膝關節不固定。12周時采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死全部動物，按照原切口入路獲取膝關節樣本進行以下觀測。
1.4.2 觀測指標
① 關節液ELISA檢測及大體觀察：首先，在不打開膝關節腔條件下注入0.5 mL生理鹽水，充分屈伸活動關節后，抽吸關節液，以300×g離心10 min，去除殘留細胞；按照ELISA試劑盒說明書檢測MMP-9、MMP-13、TIMP-1含量。然后打開關節腔，觀察樣本軟骨缺損修復情況，根據國際軟骨修復評分準則（ICRS）從膝關節軟骨缺損填充度、表面光滑度、再生組織質地、完整性等方面進行評分[18]。
② 軟骨組織學觀察：將膝關節股骨遠端部分置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，然后置于10% EDTA中脫鈣至少2周；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切取6 μm厚切片。常規HE及甲苯胺藍染色，光鏡下觀察軟骨缺損修復情況。
③ 軟骨 Western blot檢測：利用環鉆按軟骨缺損痕跡鉆取樣本軟骨缺損處新生組織，加入RIPA裂解液球磨裂解，提取細胞總蛋白，經BCA法定量后，取等量蛋白稀釋為同體積，加入上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，再經電轉印，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗后二抗室溫孵育2 h，滴加ECL化學發光液，利用凝膠成像系統檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達，利用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH比值作為其相對表達量。
④ 關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察：將膝關節滑膜置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。部分切片行HE染色觀察組織炎癥細胞浸潤、血管增生等滑膜炎病理改變。其余部分切片經過水化、0.5%Triton X-100透化、3%H2O2滅活內源性過氧化物酶、10%BSA室溫封閉 2 h；iNOS抗體（1∶100）4℃孵育過夜，二抗孵育后，按照DAB顯色試劑盒說明進行顯色，蘇木素復染后封片，于光鏡下觀察并利用Image J軟件計算積分吸光度（IA）值，作為iNOS表達水平。
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 負載CTS絲素蛋白微載體表征觀察
負載CTS絲素蛋白微載體呈類球形，直徑主要在300～500 μm之間，占77.4%，形態較穩定、均一；微載體表面呈多孔結構，測量其孔隙率達35.63%±3.51%（圖1a、b）。藥物緩釋檢測顯示CTS在 24 h內釋放較快，24 h后釋放速度減緩且穩定，10 d內每天釋放量平均為0.307 mg，累積釋放量見圖1c。
圖1
負載CTS絲素蛋白微載體表征觀察
a. 體式顯微鏡觀察（×10）；b. 掃描電鏡觀察（×1 000）；c. CTS累積釋放量
Figure1. Characterization of CTS-silk fibroin microcarriera. Stereomicroscope observation (×10); b. Scanning electron microscope observation (×1 000); c. Cumulative release amount of CTS from CTS-silk fibroin microcarrier
2.2 微重力條件下微載體復合軟骨細胞培養觀察
隨培養時間延長，兩種微載體表面黏附的軟骨細胞逐漸增多，且軟骨細胞相互接觸生長（圖2）。CCK-8法檢測微重力條件下培養24 h 后，絲素蛋白微載體及負載CTS絲素蛋白微載體上的軟骨細胞增殖活性A值分別為2.06±0.13、2.09±0.13，較正常培養細胞（1.84±0.16）提高，差異有統計學意義（P<0.05）；兩種微載體間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
微重力條件下軟骨細胞在負載CTS絲素蛋白微載體上黏附情況觀察
a、b. 共培養3、7 d倒置相差顯微鏡觀察（×100）； c. 共培養7 d掃描電鏡觀察（×400）
Figure2. Observation of adhesion of chondrocytes to CTS-silk fibroin microcarrier under microgravitya, b. Observation under inverted phase contrast microscope after 3 and 7 days of co-culture, respectively (×100); c. Observation under scanning electron microscopy (×400)
2.3 動物體內實驗
2.3.1 大體觀察及關節液ELISA檢測
與A、B組相比，C組MMP-9、MMP-13含量均降低，TIMP-1含量上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。
表1
各組膝關節液MMP-9、MMP-13及TIMP-1含量比較（n=20，
）
Table1.
Comparison of MMP-9, MMP-13, and TIMP-1 contents between groups (n=20, 
)
術后12周，A組膝關節軟骨缺損未修復；B組軟骨缺損有組織填充，但未完全修復，且修復表面不平整；C組軟骨缺損修復表面更平整、與周圍正常軟骨組織界限模糊、結合緊密。見圖3。A、B、C組ICRS評分分別為（2.0±0.7）、（8.0±0.6）、（10.4±1.1）分，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
術后12周各組軟骨缺損大體觀察
a. A組；b. B組；c. C組
Figure3. Gross observation of cartilage defect in each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.2 軟骨組織學觀察
A組軟骨缺損區域僅有少量疏松組織填充，幾乎未形成新生軟骨。B組可見明顯組織填充軟骨缺損區域，但軟骨基質生成有限。C組可見軟骨缺損中的新生組織含有大量軟骨細胞，但細胞排列較紊亂；軟骨基質沉積明顯，與周邊組織較一致。見圖4。
圖4
各組軟骨組織學觀察（×100）
從左至右分別為A、B、C組 a. HE染色；b. 甲苯胺藍染色
Figure4. Histological observation of cartilage tissue in each group (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. HE staining; b. Toluidine blue staining
2.3.3 軟骨Western blot檢測
A、B、C組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量分別為0.521±0.081、0.833±0.099、1.139±0.136，蛋白聚糖分別為0.437±0.055、0.705±0.021、1.027±0.157。B、C組兩種蛋白相對表達量均高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
Western blot檢測各組目的蛋白表達
1～3分別為A～C組
Figure5. Target protein expressions detected by Western blot assay1-3 for groups A-C, respectively
2.3.4 關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察
HE染色示A組滑膜炎癥細胞浸潤及小血管增生明顯；與A組比較，B、C 組滑膜炎癥細胞浸潤與小血管增生均減輕，其中C組減輕程度更顯著。iNOS免疫組織化學染色示A、B、C組iNOS表達水平分別為0.22±0.015、0.20±0.021、0.15±0.013，C組低于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
各組關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為A、B、C 組 a. HE染色；b. iNOS免疫組織化學染色
Figure6. Histological and iNOS immunohistochemical staining observations of synovial tissue in each group (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. HE staining; b. iNOS immunohistochemical staining
3 討論
在構建組織工程軟骨過程中，理想的生物支架除了能為軟骨細胞提供黏附、生長、交互作用的三維結構環境外，還需要提供適當的生長因子來維持軟骨細胞活性，這是軟骨再生的關鍵[19]。
中藥威靈仙具有“祛風濕，通經絡”的作用，臨床廣泛用于膝關節骨關節炎治療中。CTS為威靈仙主要活性成分，可以通過多種途徑影響軟骨細胞活性，多方面改善軟骨修復微環境，包括降低氧化應激損傷防止關節軟骨退化，靶向線粒體凋亡途徑抑制軟骨細胞凋亡等[20-22]。我們前期研究結果也顯示威靈仙能夠上調TGF-β表達，發揮類生長因子作用，促進軟骨細胞基質分泌，提高細胞增殖活性[23]。本研究中，我們通過制備負載CTS絲素蛋白微載體，在微重力條件下搭載軟骨細胞擴增培養，再將此復合物植入兔膝關節軟骨缺損處，以實現CTS持續緩慢釋放，提高組織工程軟骨修復效率。
絲素蛋白已被證明是一種適用于軟骨組織工程的生物材料，具備優良的生物安全性、可降解性，同時也可以用來遞送脂溶性藥物[24-26]。既往研究中絲素蛋白藥物遞送載體的制備多采用乳化法、脫溶法，制備過程中多種化學試劑的處理可能會造成藥效活性的改變，且藥物包封率很低[27-28]。本研究中，我們利用凍干技術結合絲素蛋白自交聯方法制備載藥微載體。該方法無需過多使用有機溶劑，避免了化學試劑毒性殘留，能夠更大程度保持CTS藥效活性。同時為了給軟骨細胞黏附生長提供三維結構，制備更加穩定、均一的絲素蛋白微載體，我們參照Drachuk等[11]的方法，利用微量注射泵在高壓靜電場作用下將包封有CTS的絲素蛋白溶液逐滴滴入液氮收集池固化。由此制備的負載CTS絲素蛋白微載體呈規則類球形，直徑主要在300～500 μm范圍，表面多孔隙，能夠在至少10 d內緩慢釋放CTS，提示其植入體內后能對軟骨細胞產生長期影響。
相關研究顯示軟骨細胞在微重力環境下會進入懸浮狀態并聚集成細胞簇，在微載體存在情況下會促進細胞自發黏附于微載體表面增殖[29]。利用此特點，我們將軟骨細胞與制備的微載體在微重力條件下共培養。與平面皿培養方式相比，兩種微載體不僅無細胞毒性，還能顯著提高軟骨細胞增殖活性，在體外成功構建了負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物。
最后，本研究通過兔膝關節軟骨缺損模型來驗證負載CTS絲素蛋白微載體促進軟骨缺損修復的作用。結果顯示植入12周后，B組軟骨缺損獲得一定程度修復，但修復表面不完整，軟骨基質沉積有限，這可能與體外培養的軟骨細胞移植入體內后表型退變相關。而C組軟骨缺損區均形成致密有序的軟骨樣組織，并與周圍組織融合較好，表面也較完整，提示CTS長期緩慢釋放能夠持續促進移植軟骨細胞的表型維持，發揮了類生長因子作用，增強了支架-軟骨細胞復合物體內軟骨構建效率。
軟骨損傷后原生軟骨內穩態被打破，其中MMP與TIMP之間的動態平衡破壞是導致膝關節骨關節炎發生、發展的重要原因。MMP是一種能夠降解細胞外基質的內肽酶，在軟骨基質降解中發揮重要作用，而TIMP是阻斷細胞外基質降解、抑制 MMP活性的分泌糖蛋白，它參與組織結構的建立與維持[30-31]。本研究結果顯示與A、B組相比，C組MMP-9、MMP-13含量明顯降低、TIMP-1含量提高，表明CTS有助于調節MMP與TIMP-1平衡，促進軟骨損傷修復。此外，兔膝關節滑膜組織觀測結果顯示，植入12周后A、B組滑膜仍有明顯炎癥細胞浸潤和血管增生，C組滑膜炎癥細胞浸潤減少，但仍有微血管增生；iNOS免疫組織化學染色顯示，與A、B組相比，C組iNOS表達水平顯著降低。這些結果均表明緩慢釋放的CTS能夠降低關節軟骨損傷后滑膜炎癥狀態，改善軟骨修復微環境，促進軟骨損傷修復。
綜上述，本研究成功制備了負載CTS絲素蛋白微載體，其具有良好的CTS緩釋效果及生物相容性，在微重力條件下復合軟骨細胞構建的復合物，能夠改善關節損傷后炎癥微環境，顯著增強兔軟骨修復效率。但是本研究構建的組織工程軟骨失去了原生軟骨結構，下一步將對支架進行優化；同時在膝關節復雜力學、化學信號作用下，CTS能否長期有效維持組織工程軟骨修復質量也需進一步關注。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（201910A052）；實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0004，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0048
作者貢獻聲明 馬勇、郭楊負責研究設計、數據整理；劉孟敏、汪志芳指導實驗操作；涂鵬程負責支架載體構建及分析、數據收集、論文撰寫；楊光露、孫杰、陳凱負責部分實驗內容及數據分析；王禮寧、潘婭嵐負責對文章涉及相關研究進展進行校閱
膝關節軟骨是透明的無血管組織，一旦損傷難以自行修復[1]。目前膝關節軟骨損傷治療方式較多，但療效均不理想[2]。以非甾體類抗炎藥物為主的對癥治療，遠期療效不佳；以微骨折術等手術治療后，修復組織以瘢痕組織、纖維軟骨為主，失去了原生軟骨特性且易發生退行性改變[3-4]。組織工程技術是一種具有應用潛力的軟骨缺損修復方法[5]。設計并控制構建組織工程軟骨的生物支架、生長因子等關鍵要素，以保持軟骨細胞活性、增強支架軟骨再生效率，是組織工程技術用于軟骨修復的關鍵。
威靈仙為毛莨科植物威靈仙、棉團鐵線蓮或東北鐵線蓮的干燥根和根莖，能治療骨關節炎[6]。威靈仙總皂苷（clematis total saponins，CTS）為威靈仙提取物，能促進軟骨組織損傷修復，改善膝關節骨關節炎癥狀，發揮類生長因子作用[7-8]。絲素蛋白是從蠶繭中提取的天然蛋白，具有良好生物相容性，可作為軟骨組織工程支架材料[9]。研究顯示通過自交聯方法，可以將絲素蛋白中不穩定的α-螺旋結構轉化為β-折疊結構，使其具有不溶于水以及較高機械性能的優勢，近年來已被廣泛應用于構建藥物緩釋系統，而且低溫條件下絲素蛋白的自組裝對自身給藥活性和生物相容性影響較小[10-12]。此外，絲素蛋白降解產物為多種氨基酸，可以作為細胞生長營養物質[13]。我們前期研究制備了負載CTS絲素蛋白微球，并在體外實驗中搭載軟骨細胞培養，結果顯示其能維持軟骨細胞表型[14]。本次研究在制備負載CTS絲素蛋白微載體基礎上，于體外微重力條件下搭載軟骨細胞進行擴增培養，而后植入兔膝關節軟骨缺損處，探討負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞修復軟骨缺損的效果。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡雄性新西蘭大白兔6只，體質量為（500±50） g；3月齡新西蘭大白兔30只，雌雄各半，體質量（3.0±0.5）kg。實驗動物均由南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。
FBS、L-DMEM培養基（BioInd公司，以色列）；絲素蛋白溶液（Sigma-Aldrich公司，德國）；Ⅱ型膠原酶（大連美侖生物技術有限公司）；CTS提取物（西安奧晶科技發展有限公司）；HE、甲苯胺藍染色液（北京索萊寶科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；GAPDH、TGF-β、基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13, MMP-13）抗體、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；Ⅱ型膠原抗體（Novus公司，美國）；蛋白聚糖抗體（Thermo公司，美國）；兔抗小鼠二抗（Affinity公司，美國）；MMP-9、MMP-13、MMP組織抑制因子1（tissue inhibitor of MMP 1，TIMP-1）ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。
液動力聚焦細胞培養系統（Celltech公司，美國）；微量注射泵（浙江史密斯醫學儀器有限公司）；冷凍干燥機（Labconco公司，美國）；化學發光成像儀（上海天能科技有限公司）；多功能酶標儀（PerkinElmer公司，美國）；掃描電鏡 （Hitachi公司，日本）。
1.2 負載CTS絲素蛋白微載體的制備及觀察
1.2.1 微載體制備方法
參照本課題組既往采用方法，以高壓靜電場結合冷凍干燥方法制備負載CTS絲素蛋白微載體[14]。取5%絲素蛋白溶液，加入等體積10 mg/mL CTS溶液、甘油（絲素蛋白質量的30%）混勻后，轉入微量注射泵中。將高壓電發生器正、負極分別連接微量注射泵的注射器針頭和液氮收集池。打開高壓電發生器、微量注射泵，使混合液在靜電場作用下逐滴滴入液氮收集池；制備參數：電壓12～15 kV，注射針頭直徑0.45 mm，滴速1 mL/h。收集固化液滴并冷凍干燥，即獲得不溶于水的負載CTS絲素蛋白微載體[15]。取5%絲素蛋白溶液、甘油（絲素蛋白質量的30%）制備混合液，同上法制備單純絲素蛋白微載體。
1.2.2 微載體形態觀察
取負載CTS絲素蛋白微載體樣本，體式顯微鏡觀察后，噴金處理并掃描電鏡觀察微載體形態、大小及微觀形貌。利用Image J軟件計算微載體表面孔隙率。
1.2.3 藥物緩釋測定
將負載CTS絲素蛋白微載體樣本置于pH7.4 PBS中，密封置于37℃恒溫震蕩箱中緩慢搖動，分別于1、2、4、6、8、12、14、16、18 h及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d 收集上清液0.1 mL，利用香草醛-高氯酸顯色方法[16]檢測CTS緩釋濃度，計算累積釋放量。
1.3 微重力條件下負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞培養及觀測
1.3.1 軟骨細胞培養及傳代
取6只4周齡新西蘭大白兔，空氣栓塞法處死后無菌條件下分離膝關節，取關節透明軟骨，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm；置于0.2%Ⅱ型膠原酶37℃消化6 h，200 μm濾網過濾后，以300×g離心5 min，獲得軟骨細胞。將細胞接種至培養皿，以含10%FBS以及1%青霉素、鏈霉素混合液的L-DMEM培養基培養，隔2 d換液1次，待細胞長滿瓶底70%～80%后傳代，取第3代細胞用于實驗。
1.3.2 微重力條件下微載體復合軟骨細胞培養及觀測
① 培養方法：將5×106個軟骨細胞分別與50 mg絲素蛋白微載體、負載CTS絲素蛋白微載體，置于液動力聚焦細胞培養系統培養倉中，調整轉速為12 r/min，使培養倉內微載體既不接觸培養倉壁，又在旋轉過程中呈自由落體狀態[17]。
② 觀測指標：培養期間于倒置相差顯微鏡下觀察兩種微載體表面軟骨細胞黏附情況；7 d時于掃描電鏡下觀察細胞黏附情況，然后收集兩種微載體-軟骨細胞復合物，經0.25%胰蛋白酶消化后收集軟骨細胞；將細胞按1×105個/孔接種至96孔板，于37℃、5%CO2條件下培養24 h后，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性，以吸光度（A）值表示。以在培養皿中正常培養的軟骨細胞作為對照。實驗重復3次。
1.4 負載CTS絲素蛋白微載體復合軟骨細胞修復軟骨缺損觀測
1.4.1 兔膝關節軟骨缺損模型制備及分組
參照1.3方法于體外微重力條件下培養兩種微載體-軟骨細胞復合物，待培養12 d觀察到軟骨細胞貼滿微載體表面時用于動物體內實驗。
取30只3月齡新西蘭大白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后，在雙后肢膝關節滑車表面用眼科環鉆鉆取直徑3 mm、深3～4 mm圓孔，制備膝關節軟骨缺損模型。將模型隨機分為3組（n=20），分別為空白對照組（A組）、絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物組（B組）、負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物組（C組）。A組：膝關節軟骨缺損不作任何處理；B組：采用絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物填充關節軟骨缺損；C組：采用負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物填充關節軟骨缺損。B、C組植入量以填滿缺損處為標準。
術后兔單籠飼養，膝關節不固定。12周時采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死全部動物，按照原切口入路獲取膝關節樣本進行以下觀測。
1.4.2 觀測指標
① 關節液ELISA檢測及大體觀察：首先，在不打開膝關節腔條件下注入0.5 mL生理鹽水，充分屈伸活動關節后，抽吸關節液，以300×g離心10 min，去除殘留細胞；按照ELISA試劑盒說明書檢測MMP-9、MMP-13、TIMP-1含量。然后打開關節腔，觀察樣本軟骨缺損修復情況，根據國際軟骨修復評分準則（ICRS）從膝關節軟骨缺損填充度、表面光滑度、再生組織質地、完整性等方面進行評分[18]。
② 軟骨組織學觀察：將膝關節股骨遠端部分置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，然后置于10% EDTA中脫鈣至少2周；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切取6 μm厚切片。常規HE及甲苯胺藍染色，光鏡下觀察軟骨缺損修復情況。
③ 軟骨 Western blot檢測：利用環鉆按軟骨缺損痕跡鉆取樣本軟骨缺損處新生組織，加入RIPA裂解液球磨裂解，提取細胞總蛋白，經BCA法定量后，取等量蛋白稀釋為同體積，加入上樣緩沖液，混勻，沸水浴10 min，進行SDS-PAGE凝膠電泳，再經電轉印，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗后二抗室溫孵育2 h，滴加ECL化學發光液，利用凝膠成像系統檢測Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達，利用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白與GAPDH比值作為其相對表達量。
④ 關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察：將膝關節滑膜置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。部分切片行HE染色觀察組織炎癥細胞浸潤、血管增生等滑膜炎病理改變。其余部分切片經過水化、0.5%Triton X-100透化、3%H2O2滅活內源性過氧化物酶、10%BSA室溫封閉 2 h；iNOS抗體（1∶100）4℃孵育過夜，二抗孵育后，按照DAB顯色試劑盒說明進行顯色，蘇木素復染后封片，于光鏡下觀察并利用Image J軟件計算積分吸光度（IA）值，作為iNOS表達水平。
1.5 統計學方法
采用SPSS20.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 負載CTS絲素蛋白微載體表征觀察
負載CTS絲素蛋白微載體呈類球形，直徑主要在300～500 μm之間，占77.4%，形態較穩定、均一；微載體表面呈多孔結構，測量其孔隙率達35.63%±3.51%（圖1a、b）。藥物緩釋檢測顯示CTS在 24 h內釋放較快，24 h后釋放速度減緩且穩定，10 d內每天釋放量平均為0.307 mg，累積釋放量見圖1c。
圖1
負載CTS絲素蛋白微載體表征觀察
a. 體式顯微鏡觀察（×10）；b. 掃描電鏡觀察（×1 000）；c. CTS累積釋放量
Figure1. Characterization of CTS-silk fibroin microcarriera. Stereomicroscope observation (×10); b. Scanning electron microscope observation (×1 000); c. Cumulative release amount of CTS from CTS-silk fibroin microcarrier
2.2 微重力條件下微載體復合軟骨細胞培養觀察
隨培養時間延長，兩種微載體表面黏附的軟骨細胞逐漸增多，且軟骨細胞相互接觸生長（圖2）。CCK-8法檢測微重力條件下培養24 h 后，絲素蛋白微載體及負載CTS絲素蛋白微載體上的軟骨細胞增殖活性A值分別為2.06±0.13、2.09±0.13，較正常培養細胞（1.84±0.16）提高，差異有統計學意義（P<0.05）；兩種微載體間差異無統計學意義（P>0.05）。
圖2
微重力條件下軟骨細胞在負載CTS絲素蛋白微載體上黏附情況觀察
a、b. 共培養3、7 d倒置相差顯微鏡觀察（×100）； c. 共培養7 d掃描電鏡觀察（×400）
Figure2. Observation of adhesion of chondrocytes to CTS-silk fibroin microcarrier under microgravitya, b. Observation under inverted phase contrast microscope after 3 and 7 days of co-culture, respectively (×100); c. Observation under scanning electron microscopy (×400)
2.3 動物體內實驗
2.3.1 大體觀察及關節液ELISA檢測
與A、B組相比，C組MMP-9、MMP-13含量均降低，TIMP-1含量上調，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。
表1
各組膝關節液MMP-9、MMP-13及TIMP-1含量比較（n=20，）
Table1.
Comparison of MMP-9, MMP-13, and TIMP-1 contents between groups (n=20, )
術后12周，A組膝關節軟骨缺損未修復；B組軟骨缺損有組織填充，但未完全修復，且修復表面不平整；C組軟骨缺損修復表面更平整、與周圍正常軟骨組織界限模糊、結合緊密。見圖3。A、B、C組ICRS評分分別為（2.0±0.7）、（8.0±0.6）、（10.4±1.1）分，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖3
術后12周各組軟骨缺損大體觀察
a. A組；b. B組；c. C組
Figure3. Gross observation of cartilage defect in each group at 12 weeks after operationa. Group A; b. Group B; c. Group C
2.3.2 軟骨組織學觀察
A組軟骨缺損區域僅有少量疏松組織填充，幾乎未形成新生軟骨。B組可見明顯組織填充軟骨缺損區域，但軟骨基質生成有限。C組可見軟骨缺損中的新生組織含有大量軟骨細胞，但細胞排列較紊亂；軟骨基質沉積明顯，與周邊組織較一致。見圖4。
圖4
各組軟骨組織學觀察（×100）
從左至右分別為A、B、C組 a. HE染色；b. 甲苯胺藍染色
Figure4. Histological observation of cartilage tissue in each group (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. HE staining; b. Toluidine blue staining
2.3.3 軟骨Western blot檢測
A、B、C組Ⅱ型膠原蛋白相對表達量分別為0.521±0.081、0.833±0.099、1.139±0.136，蛋白聚糖分別為0.437±0.055、0.705±0.021、1.027±0.157。B、C組兩種蛋白相對表達量均高于A組，C組高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。
圖5
Western blot檢測各組目的蛋白表達
1～3分別為A～C組
Figure5. Target protein expressions detected by Western blot assay1-3 for groups A-C, respectively
2.3.4 關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察
HE染色示A組滑膜炎癥細胞浸潤及小血管增生明顯；與A組比較，B、C 組滑膜炎癥細胞浸潤與小血管增生均減輕，其中C組減輕程度更顯著。iNOS免疫組織化學染色示A、B、C組iNOS表達水平分別為0.22±0.015、0.20±0.021、0.15±0.013，C組低于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
各組關節滑膜組織學及iNOS免疫組織化學染色觀察（×100）
從左至右分別為A、B、C 組 a. HE染色；b. iNOS免疫組織化學染色
Figure6. Histological and iNOS immunohistochemical staining observations of synovial tissue in each group (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. HE staining; b. iNOS immunohistochemical staining
3 討論
在構建組織工程軟骨過程中，理想的生物支架除了能為軟骨細胞提供黏附、生長、交互作用的三維結構環境外，還需要提供適當的生長因子來維持軟骨細胞活性，這是軟骨再生的關鍵[19]。
中藥威靈仙具有“祛風濕，通經絡”的作用，臨床廣泛用于膝關節骨關節炎治療中。CTS為威靈仙主要活性成分，可以通過多種途徑影響軟骨細胞活性，多方面改善軟骨修復微環境，包括降低氧化應激損傷防止關節軟骨退化，靶向線粒體凋亡途徑抑制軟骨細胞凋亡等[20-22]。我們前期研究結果也顯示威靈仙能夠上調TGF-β表達，發揮類生長因子作用，促進軟骨細胞基質分泌，提高細胞增殖活性[23]。本研究中，我們通過制備負載CTS絲素蛋白微載體，在微重力條件下搭載軟骨細胞擴增培養，再將此復合物植入兔膝關節軟骨缺損處，以實現CTS持續緩慢釋放，提高組織工程軟骨修復效率。
絲素蛋白已被證明是一種適用于軟骨組織工程的生物材料，具備優良的生物安全性、可降解性，同時也可以用來遞送脂溶性藥物[24-26]。既往研究中絲素蛋白藥物遞送載體的制備多采用乳化法、脫溶法，制備過程中多種化學試劑的處理可能會造成藥效活性的改變，且藥物包封率很低[27-28]。本研究中，我們利用凍干技術結合絲素蛋白自交聯方法制備載藥微載體。該方法無需過多使用有機溶劑，避免了化學試劑毒性殘留，能夠更大程度保持CTS藥效活性。同時為了給軟骨細胞黏附生長提供三維結構，制備更加穩定、均一的絲素蛋白微載體，我們參照Drachuk等[11]的方法，利用微量注射泵在高壓靜電場作用下將包封有CTS的絲素蛋白溶液逐滴滴入液氮收集池固化。由此制備的負載CTS絲素蛋白微載體呈規則類球形，直徑主要在300～500 μm范圍，表面多孔隙，能夠在至少10 d內緩慢釋放CTS，提示其植入體內后能對軟骨細胞產生長期影響。
相關研究顯示軟骨細胞在微重力環境下會進入懸浮狀態并聚集成細胞簇，在微載體存在情況下會促進細胞自發黏附于微載體表面增殖[29]。利用此特點，我們將軟骨細胞與制備的微載體在微重力條件下共培養。與平面皿培養方式相比，兩種微載體不僅無細胞毒性，還能顯著提高軟骨細胞增殖活性，在體外成功構建了負載CTS絲素蛋白微載體-軟骨細胞復合物。
最后，本研究通過兔膝關節軟骨缺損模型來驗證負載CTS絲素蛋白微載體促進軟骨缺損修復的作用。結果顯示植入12周后，B組軟骨缺損獲得一定程度修復，但修復表面不完整，軟骨基質沉積有限，這可能與體外培養的軟骨細胞移植入體內后表型退變相關。而C組軟骨缺損區均形成致密有序的軟骨樣組織，并與周圍組織融合較好，表面也較完整，提示CTS長期緩慢釋放能夠持續促進移植軟骨細胞的表型維持，發揮了類生長因子作用，增強了支架-軟骨細胞復合物體內軟骨構建效率。
軟骨損傷后原生軟骨內穩態被打破，其中MMP與TIMP之間的動態平衡破壞是導致膝關節骨關節炎發生、發展的重要原因。MMP是一種能夠降解細胞外基質的內肽酶，在軟骨基質降解中發揮重要作用，而TIMP是阻斷細胞外基質降解、抑制 MMP活性的分泌糖蛋白，它參與組織結構的建立與維持[30-31]。本研究結果顯示與A、B組相比，C組MMP-9、MMP-13含量明顯降低、TIMP-1含量提高，表明CTS有助于調節MMP與TIMP-1平衡，促進軟骨損傷修復。此外，兔膝關節滑膜組織觀測結果顯示，植入12周后A、B組滑膜仍有明顯炎癥細胞浸潤和血管增生，C組滑膜炎癥細胞浸潤減少，但仍有微血管增生；iNOS免疫組織化學染色顯示，與A、B組相比，C組iNOS表達水平顯著降低。這些結果均表明緩慢釋放的CTS能夠降低關節軟骨損傷后滑膜炎癥狀態，改善軟骨修復微環境，促進軟骨損傷修復。
綜上述，本研究成功制備了負載CTS絲素蛋白微載體，其具有良好的CTS緩釋效果及生物相容性，在微重力條件下復合軟骨細胞構建的復合物，能夠改善關節損傷后炎癥微環境，顯著增強兔軟骨修復效率。但是本研究構建的組織工程軟骨失去了原生軟骨結構，下一步將對支架進行優化；同時在膝關節復雜力學、化學信號作用下，CTS能否長期有效維持組織工程軟骨修復質量也需進一步關注。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（201910A052）；實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0004，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2018-0048
作者貢獻聲明 馬勇、郭楊負責研究設計、數據整理；劉孟敏、汪志芳指導實驗操作；涂鵬程負責支架載體構建及分析、數據收集、論文撰寫；楊光露、孫杰、陳凱負責部分實驗內容及數據分析；王禮寧、潘婭嵐負責對文章涉及相關研究進展進行校閱
