引用本文： 丁思勰, 洪慧蕾, 徐凌寒, 王曉瑋, 張維波, 李向陽, 王銀龍, 陳佳龍. 酚胺交聯涂層接枝氯己定改善鈦表面抗菌性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(3): 335-342. doi: 10.7507/1002-1892.202108095 復制
鈦及其合金由于具有優異的力學性能和生物相容性，已廣泛應用于制備骨科植入物（如膝關節、髖關節置換假體等）[1]，但約有10%的骨科植入物因感染導致植入失敗[2-3]。感染主要由微生物定植于植入物表面并形成保護性生物膜所致[4]，生物膜一旦形成，可以保護內部細菌免受宿主免疫系統和抗菌藥物攻擊。傳統口服或靜脈注射抗生素方法由于抗生素的抗菌譜匹配問題、病灶富集藥物量不足、藥物無法有效滲透生物膜等原因，療效不理想[5]；另外，抗生素誘發的細菌耐藥性和全身臟器毒性不可忽視[6]。因此，優選廣譜抗菌且高效的藥物局部遞送策略亟待研發。
骨科植入物表面構建抗菌涂層，被認為是降低骨科植入物感染風險的有效方法，既保留了材料基本特性，又使抗菌藥物直接作用于病灶部位，提高藥效的同時避免了全身給藥導致的不良反應[7-8]。氯己定（chlorhexidine，CHX）作為雙胍類化合物，具有非常強的廣譜抑菌和殺菌能力，被廣泛用于防治感染[9]；其所帶正電荷與細菌膜發生靜電作用而破壞膜結構，導致細菌裂解，而無需進入細菌內部[10]，故將其固定于植入物表面可以賦予表面廣譜和高效抗菌能力，且不易引發細菌耐藥性。
兒茶酚的酚羥基具有高反應活性，不僅可以螯合金屬，也可以與胺基、巰基共價交聯，形成酚胺多功能表面[11]。受此啟發，本研究首先利用水相沉積，在鈦表面制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）與己二胺（hexamethylene diamine，HD）的酚胺交聯涂層，再利用涂層表面的酚羥基接枝CHX以賦予材料表面良好的抗菌性能，為防治鈦基骨植入物感染并發癥提供更好的解決策略。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
純鈦（山西寶雞有色金屬有限公司）；小鼠成骨樣細胞系（MC3T3‐E1）（中國科學院上海細胞庫）；金黃色葡萄球菌（上海保藏生物技術中心）。 EGCG、HD（Sigma公司，美國）；丙酮、Tris（上海阿拉丁試劑有限公司）；腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）固體粉末（青島高科園海博生物技術有限公司）；PBS（GIBCO公司，美國）；活/死細菌染色試劑盒（Invitrogen公司，美國）。GeminiSEM 300掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜儀（Thermo Scientific，美國）；JGW-360B接觸角測量儀（北京海富達科技有限公司）；DMI3000B熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；MQX200酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將直徑1 cm的純鈦片依次經 80、150、400、600、800、1 000、1 500、2 000目砂紙打磨，再依次經丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗；烘干后將樣品浸入2.5 mol/L NaOH 溶液中60℃處理24 h，再置于沸水中浸泡2 h。然后將樣品分為3份，其中1份烘干后設為對照組；另取1份樣品在對照組處理基礎上，浸入含1 mg/mL EGCG與5 mg/mL HD的Tris溶液（1.5 mg/mL）中，37℃恒溫下靜置24 h，去離子水超聲清洗3次，每次5 min，烘干后設為涂層組；最后1份樣品在涂層組處理基礎上，浸入1 mg/mL CHX去離子水溶液中，37℃恒溫下靜置24 h，去離子水超聲清洗3次，每次5 min，烘干后設為接枝組。
1.3 觀測指標
1.3.1 表面理化性能表征
每組取1個樣品，干燥后噴金30 s，利用掃描電鏡觀察表面形貌變化；每組取1個樣品，利用X射線光電子能譜儀分析表面元素組成，測量3次取均值；每組取6個樣品，室溫下利用接觸角測量儀測量表面水接觸角。
1.3.2 體外抗菌性能評價
將冷凍保存的菌種復蘇后，用接種環挑取1個合適大小的金黃色葡萄球菌菌落加入BHI培養基中培養24 h，稀釋菌液至細菌密度為1×107 CFU/mL。取60 μL菌液滴加到各組樣品正面，37℃培養4 h后，每組加入BHI培養基2 mL，37℃繼續共培養至設定時間后進行以下評價。① 活/死細菌染色評價：共培養24 h后每組取1個樣品，PBS漂洗，采用活/死細菌試劑盒染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察活/死細菌（綠色為活菌，紅色為死菌，黃色為凋亡中細菌），評價樣品表面活/死細菌黏附情況。② 抑菌環實驗：從共培養24 h的菌液中取100 μL稀釋1 000倍，加入瓊脂培養板并涂勻涂布，每組取1個樣品正面向下放置于瓊脂培養基上，37℃培養24 h，通過樣品周圍出現的抑菌環大小評價樣品釋放物質對周圍環境細菌的抑制能力。③ 濁度法評價：共培養24 h和48 h時每組取6個樣品，吸取150 μL培養液，采用酶標儀測量660 nm處的吸光度（A）值，利用A值與細菌密度的正比例關系[12]，評價培養體系中的細菌量。
1.3.3 體外細胞相容性評價
每組取6個樣品置于24孔板中，每組6個復孔，每孔加入1×105個/mL MC3T3-E1細胞懸液1 mL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養1、3、7 d后，用MTT法檢測細胞增殖情況。另外，培養1、3、7 d時每組各取1個樣品，1%戊二醛固定2 h，PBS清洗，加入羅丹明染色15 min，熒光顯微鏡下觀察細胞黏附量及形態。
1.3.4 細菌-細胞共培養評價
將60 μL密度為1×107 CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液滴加于樣品表面（每組各3個樣品），37℃孵育4 h后，加入1 mL密度為1× 105個/mL的MC3T3‐E1細胞，37℃、5%CO2培養3 d取出樣品，PBS漂洗后活/死細菌試劑盒染色20 min，熒光顯微鏡下觀察樣品表面細菌和黏附細胞情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，表面水接觸角各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；濁度法評價A值及MTT法檢測A值各組間比較采用析因設計方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 表面理化性能表征
掃描電鏡示對照組表面呈多孔結構；涂層組表面孔隙被填充、孔徑減小；接枝組表面孔隙被進一步填充，部分區域多孔結構被完全覆蓋。見圖1。
圖1
各組掃描電鏡觀察（×50 k）
a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure1. Scanning electron microscope observation of each group (×50 k)a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
X射線光電子能譜檢測示，相比對照組，涂層組和接枝組Ti和O元素比例逐漸下降，Ti2p和O1s峰隨之減弱，C元素比例增加，C1s峰增強；相比涂層組與對照組，接枝組N1s峰增強并出現Cl2p特征峰。見表1、圖2。
表1
X射線光電子能譜檢測各組樣品表面元素組成比例（%）
Table1.
The composition ratio of surface elements in each group detected by X-ray photoelectron spectroscopy (%)
圖2
各組X射線光電子能譜全譜圖
Figure2.
X-ray photoelectron spectroscopy full spectrum of each group
接觸角測量儀檢測示，對照組、涂層組和接枝組的表面水接觸角分別為（7.15±1.53）°、（13.31±1.74）°、（43.41±1.29）°，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 體外抗菌性能評價
2.2.1 活/死細菌染色評價
樣品與細菌共培養24 h后，活/死細菌染色示對照組與涂層組表面幾乎被細菌覆蓋，且大部分為活細菌（綠色）；接枝組表面細菌零星附著且死細菌（紅色）所占比例更高。見圖3。
圖3
活/死細菌染色觀察（熒光顯微鏡×100）
綠色為活細菌，紅色為死細菌，黃色為凋亡細菌 a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure3. Live/dead bacterial staining observation (Fluorescence microscope×100)Green for living bacteria, red for dead bacteria, and yellow for apoptotic bacteria a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
2.2.2 抑菌環實驗
樣品與細菌共培養24 h后，對照組、涂層組樣品周圍無抑菌環，接枝組樣品周圍有明顯的抑菌透明環。見圖4。
圖4
各組抑菌環評價結果
a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure4. Results of inhibition zone of each groupa. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
2.2.3 濁度法評價
樣品與細菌共培養24 h和48 h時，僅接枝組樣品A值無顯著變化，且數值極低，對照組和涂層組的A值均顯著高于接枝組，差異有統計學意義（P<0.05），且隨著共培養時間延長而增加。見圖5。
圖5
濁度法評價各組細菌增殖情況
Figure5.
Bacterial proliferation of each group detected by nephelo metery
2.3 體外細胞相容性評價
MTT法檢測示，各組A值均隨培養時間延長而逐漸增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。培養1、3、7 d，接枝組A值低于對照組和涂層組，但3組間兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
MTT法評價各組細胞增殖情況
Figure6.
Cell proliferation of each group detected by MTT
熒光顯微鏡觀察示，各組細胞黏附量均隨培養時間延長而增加，且均呈正常梭形；各時間點接枝組黏附細胞均少于對照組和涂層組。見圖7。
圖7
培養各時間點各組黏附細胞情況觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右分別為對照組、涂層組、接枝組 a. 1 d；b. 3 d；c. 7 d
Figure7. Observation of adhesion cells on the surface of samples of each group at different time points of culture (Fluorescence microscope×50)From left to right for control group, coating group, and grafting group, respectively a. One day; b. Three days; c. Seven days
2.4 細菌-細胞共培養評價
培養3 d后對照組與涂層組樣品表面均被細菌完全覆蓋，而接枝組表面黏附細胞形態良好，呈正常的長梭形或多角形，彌散偽足，伸展性良好并且相互連接，且未觀察到細菌。見圖8。
圖8
細菌-細胞共培養3 d觀察（熒光顯微鏡×100）
綠色為活細菌/活細胞，紅色為死細菌/死細胞，黃色為凋亡中細菌 a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure8. Observation of bacteria-cell after co-culture for 3 days (Fluorescence microscope×100)Green for living bacteria/living cells, red for dead bacteria/dead cells, and yellow for apoptotic bacteria a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
3 討論
理想的骨科植入物抗菌涂層需具備防止細菌黏附于植入物表面、抑制植入物周圍組織細菌增殖、無細胞毒性的特點。大量研究將抗菌劑裝載于植入物表面，利用表面的抗菌劑抑制或殺死植入物表面黏附細菌，或者通過釋放抗菌劑抑制或殺死植入物周圍的細菌[13]。目前抗菌劑主要包括抗生素、抗菌肽、金屬離子等[14-16]。其中金屬離子[17-18]由于具有強效、廣譜的抗菌性能而被廣泛研究，但受其細胞毒性所累，臨床應用被嚴格限制。低細胞毒性的抗菌肽被認為極具應用價值，但其抗菌效能低、體內易分解、合成成本高等問題亟待解決[19]。抗生素修飾賦予植入物表面抗菌性能[20-23]，但抗生素與細菌的匹配問題、細菌耐藥性等影響其治療效果。CHX作為一種抗菌物質被廣泛用于手術器械滅菌、皮膚或創面消毒和傷口沖洗等，其殺菌作用機制是基于其陽離子，通過靜電作用結合到微生物胞質膜中帶負電荷的區域，干擾代謝過程，使胞質膜失去滲透控制，進而導致胞內成分的裂解[24]。該機制誘發細菌耐藥突變風險低，且具有廣譜抗菌的優勢[25]。我們前期研究證明1 mg/mL CHX溶液所制備的鈦基表面不但具有良好的抗菌性能，而且對成骨細胞毒性小[26]，因此本研究采用1 mg/mL CHX溶液制備抗菌涂層。
CHX與材料表面通過物理吸附和化學共價兩種方式結合[27]，其中物理吸附以離子鍵、氫鍵和范德華力為主要結合力，吸附力較弱，植入初期常會突釋抗菌劑，使局部藥物濃度過高引起細胞毒性，后期藥物釋放量不足，甚至低于最低抑菌濃度而無法抑制細菌增殖。而化學共價結合主要以共價鍵結合，有效降低抗菌物質的釋放、提高涂層表面抗菌穩定性[28]。
鈦及其合金是生物惰性材料，堿熱處理使鈦表面形成富含羥基的TiO2-凝膠層，凝膠晶體收縮形成多孔結構[29]，模擬天然骨組織的特征，使得材料表面具有良好的生物相容性[30]；另外，其高比表面積也有效增加材料表面與骨組織的結合位點，有利于骨整合[31]。為了將CHX穩定結合于多孔表面，本研究利用富含兒茶酚基團的多酚化合物EGCG與HD交聯沉積在鈦多孔表面，構建酚胺涂層作為中間層，利用酚胺涂層表面的酚羥基/醌基等活性基團共價結合CHX的亞胺基團，實現CHX的共價固定，以長期維持抗菌性能。結果顯示，涂層組表面多孔結構被EGCG/HD交聯產物填充，孔徑減小，親水性降低；接枝組表面隨著CHX修飾，孔徑進一步減小，親水性進一步顯著下降，元素分析顯示N1s峰增強和出現Cl2p特征峰，提示酚胺交聯涂層和CHX成功接枝于鈦多孔表面。
骨科植入物感染并發癥始動因素主要是手術過程帶入細菌和周圍組織中細菌的侵入，細菌在植入物表面定植并形成生物膜導致感染發生，因此限制細菌在植入物表面黏附對預防感染至關重要[32]。體外抗菌實驗中，對照組與涂層組樣品表面黏附大量細菌且活細菌比例高、樣品周圍無抑菌環，而接枝組表面僅黏附少量死細菌、樣品周圍有透亮的抑菌環，說明酚胺涂層載CHX可防止細菌黏附于植入物表面、抑制植入物周圍組織細菌增殖，有效改善鈦基表面抗菌性能。然而，抗菌涂層的細胞毒性同樣不容忽視，體外細胞相容性實驗顯示，涂層組與接枝組相對對照組，初期黏附細胞減少且接枝組最少，分析與涂層組和接枝組表面多孔結構被填充，細胞黏附位點減少有關。另外，當細胞培養7 d時，涂層組與接枝組細胞增殖均略高于對照組，分析與含胺基表面有利于細胞增殖和成骨分化有關[33]，因此制備的涂層及接枝表面仍具有良好的細胞相容性。細菌-細胞共培養模擬植入物在細菌攻擊下的表現，結果顯示對照組與涂層組表面大量細菌黏附且無細胞，接枝組表面無細菌黏附并可見成骨細胞黏附，細胞呈長梭形或多角形，伸展性良好并相互連接，證明接枝組在細菌攻擊下保證了細胞黏附，提示能預防植入物失敗的發生。
綜上述，本研究利用堿性條件下酚羥基與胺基反應，成功在堿熱處理后鈦表面構建了EGCG/HD交聯涂層，并通過浸泡CHX水溶液實現CHX接枝，最終構建了抗菌表面。該表面不但抑制細菌在接枝CHX的酚胺涂層鈦基表面的黏附，而且抑制了材料周圍細菌的增殖，具有良好的成骨細胞相容性，提示其用于臨床可以避免植入過程帶入細菌或周圍細菌遷入所導致的感染，同時保證有菌環境中成骨細胞的黏附以促進鈦基植入物骨結合。另外，酚胺交聯涂層表面富含酚羥基、醌基、胺基，是有效的接枝反應平臺，其可以用于抗菌物質和生物活性分子共接枝，如BMP-2[34]、BMP-7[35]等活性因子。后期我們將嘗試多種功能分子共固定，以提升植入物的臨床應用價值。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經安徽醫科大學生物醫學倫理委員會批準（20160126）
作者貢獻聲明 王銀龍、陳佳龍負責實驗設計；丁思勰、洪慧蕾、王曉瑋負責實驗實施；徐凌寒、張維波、李向陽負責結果收集整理；丁思勰負責實驗結果統計分析及文章撰寫
鈦及其合金由于具有優異的力學性能和生物相容性，已廣泛應用于制備骨科植入物（如膝關節、髖關節置換假體等）[1]，但約有10%的骨科植入物因感染導致植入失敗[2-3]。感染主要由微生物定植于植入物表面并形成保護性生物膜所致[4]，生物膜一旦形成，可以保護內部細菌免受宿主免疫系統和抗菌藥物攻擊。傳統口服或靜脈注射抗生素方法由于抗生素的抗菌譜匹配問題、病灶富集藥物量不足、藥物無法有效滲透生物膜等原因，療效不理想[5]；另外，抗生素誘發的細菌耐藥性和全身臟器毒性不可忽視[6]。因此，優選廣譜抗菌且高效的藥物局部遞送策略亟待研發。
骨科植入物表面構建抗菌涂層，被認為是降低骨科植入物感染風險的有效方法，既保留了材料基本特性，又使抗菌藥物直接作用于病灶部位，提高藥效的同時避免了全身給藥導致的不良反應[7-8]。氯己定（chlorhexidine，CHX）作為雙胍類化合物，具有非常強的廣譜抑菌和殺菌能力，被廣泛用于防治感染[9]；其所帶正電荷與細菌膜發生靜電作用而破壞膜結構，導致細菌裂解，而無需進入細菌內部[10]，故將其固定于植入物表面可以賦予表面廣譜和高效抗菌能力，且不易引發細菌耐藥性。
兒茶酚的酚羥基具有高反應活性，不僅可以螯合金屬，也可以與胺基、巰基共價交聯，形成酚胺多功能表面[11]。受此啟發，本研究首先利用水相沉積，在鈦表面制備表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）與己二胺（hexamethylene diamine，HD）的酚胺交聯涂層，再利用涂層表面的酚羥基接枝CHX以賦予材料表面良好的抗菌性能，為防治鈦基骨植入物感染并發癥提供更好的解決策略。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑、儀器
純鈦（山西寶雞有色金屬有限公司）；小鼠成骨樣細胞系（MC3T3‐E1）（中國科學院上海細胞庫）；金黃色葡萄球菌（上海保藏生物技術中心）。 EGCG、HD（Sigma公司，美國）；丙酮、Tris（上海阿拉丁試劑有限公司）；腦心浸液肉湯（brain heart infusion，BHI）固體粉末（青島高科園海博生物技術有限公司）；PBS（GIBCO公司，美國）；活/死細菌染色試劑盒（Invitrogen公司，美國）。GeminiSEM 300掃描電鏡（ZEISS公司，德國）；ESCALAB 250Xi X 射線光電子能譜儀（Thermo Scientific，美國）；JGW-360B接觸角測量儀（北京海富達科技有限公司）；DMI3000B熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；MQX200酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將直徑1 cm的純鈦片依次經 80、150、400、600、800、1 000、1 500、2 000目砂紙打磨，再依次經丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗；烘干后將樣品浸入2.5 mol/L NaOH 溶液中60℃處理24 h，再置于沸水中浸泡2 h。然后將樣品分為3份，其中1份烘干后設為對照組；另取1份樣品在對照組處理基礎上，浸入含1 mg/mL EGCG與5 mg/mL HD的Tris溶液（1.5 mg/mL）中，37℃恒溫下靜置24 h，去離子水超聲清洗3次，每次5 min，烘干后設為涂層組；最后1份樣品在涂層組處理基礎上，浸入1 mg/mL CHX去離子水溶液中，37℃恒溫下靜置24 h，去離子水超聲清洗3次，每次5 min，烘干后設為接枝組。
1.3 觀測指標
1.3.1 表面理化性能表征
每組取1個樣品，干燥后噴金30 s，利用掃描電鏡觀察表面形貌變化；每組取1個樣品，利用X射線光電子能譜儀分析表面元素組成，測量3次取均值；每組取6個樣品，室溫下利用接觸角測量儀測量表面水接觸角。
1.3.2 體外抗菌性能評價
將冷凍保存的菌種復蘇后，用接種環挑取1個合適大小的金黃色葡萄球菌菌落加入BHI培養基中培養24 h，稀釋菌液至細菌密度為1×107 CFU/mL。取60 μL菌液滴加到各組樣品正面，37℃培養4 h后，每組加入BHI培養基2 mL，37℃繼續共培養至設定時間后進行以下評價。① 活/死細菌染色評價：共培養24 h后每組取1個樣品，PBS漂洗，采用活/死細菌試劑盒染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察活/死細菌（綠色為活菌，紅色為死菌，黃色為凋亡中細菌），評價樣品表面活/死細菌黏附情況。② 抑菌環實驗：從共培養24 h的菌液中取100 μL稀釋1 000倍，加入瓊脂培養板并涂勻涂布，每組取1個樣品正面向下放置于瓊脂培養基上，37℃培養24 h，通過樣品周圍出現的抑菌環大小評價樣品釋放物質對周圍環境細菌的抑制能力。③ 濁度法評價：共培養24 h和48 h時每組取6個樣品，吸取150 μL培養液，采用酶標儀測量660 nm處的吸光度（A）值，利用A值與細菌密度的正比例關系[12]，評價培養體系中的細菌量。
1.3.3 體外細胞相容性評價
每組取6個樣品置于24孔板中，每組6個復孔，每孔加入1×105個/mL MC3T3-E1細胞懸液1 mL，置于37℃、5%CO2培養箱中培養1、3、7 d后，用MTT法檢測細胞增殖情況。另外，培養1、3、7 d時每組各取1個樣品，1%戊二醛固定2 h，PBS清洗，加入羅丹明染色15 min，熒光顯微鏡下觀察細胞黏附量及形態。
1.3.4 細菌-細胞共培養評價
將60 μL密度為1×107 CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液滴加于樣品表面（每組各3個樣品），37℃孵育4 h后，加入1 mL密度為1× 105個/mL的MC3T3‐E1細胞，37℃、5%CO2培養3 d取出樣品，PBS漂洗后活/死細菌試劑盒染色20 min，熒光顯微鏡下觀察樣品表面細菌和黏附細胞情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，表面水接觸角各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；濁度法評價A值及MTT法檢測A值各組間比較采用析因設計方差分析；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 表面理化性能表征
掃描電鏡示對照組表面呈多孔結構；涂層組表面孔隙被填充、孔徑減小；接枝組表面孔隙被進一步填充，部分區域多孔結構被完全覆蓋。見圖1。
圖1
各組掃描電鏡觀察（×50 k）
a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure1. Scanning electron microscope observation of each group (×50 k)a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
X射線光電子能譜檢測示，相比對照組，涂層組和接枝組Ti和O元素比例逐漸下降，Ti2p和O1s峰隨之減弱，C元素比例增加，C1s峰增強；相比涂層組與對照組，接枝組N1s峰增強并出現Cl2p特征峰。見表1、圖2。
表1
X射線光電子能譜檢測各組樣品表面元素組成比例（%）
Table1.
The composition ratio of surface elements in each group detected by X-ray photoelectron spectroscopy (%)
圖2
各組X射線光電子能譜全譜圖
Figure2.
X-ray photoelectron spectroscopy full spectrum of each group
接觸角測量儀檢測示，對照組、涂層組和接枝組的表面水接觸角分別為（7.15±1.53）°、（13.31±1.74）°、（43.41±1.29）°，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2 體外抗菌性能評價
2.2.1 活/死細菌染色評價
樣品與細菌共培養24 h后，活/死細菌染色示對照組與涂層組表面幾乎被細菌覆蓋，且大部分為活細菌（綠色）；接枝組表面細菌零星附著且死細菌（紅色）所占比例更高。見圖3。
圖3
活/死細菌染色觀察（熒光顯微鏡×100）
綠色為活細菌，紅色為死細菌，黃色為凋亡細菌 a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure3. Live/dead bacterial staining observation (Fluorescence microscope×100)Green for living bacteria, red for dead bacteria, and yellow for apoptotic bacteria a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
2.2.2 抑菌環實驗
樣品與細菌共培養24 h后，對照組、涂層組樣品周圍無抑菌環，接枝組樣品周圍有明顯的抑菌透明環。見圖4。
圖4
各組抑菌環評價結果
a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure4. Results of inhibition zone of each groupa. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
2.2.3 濁度法評價
樣品與細菌共培養24 h和48 h時，僅接枝組樣品A值無顯著變化，且數值極低，對照組和涂層組的A值均顯著高于接枝組，差異有統計學意義（P<0.05），且隨著共培養時間延長而增加。見圖5。
圖5
濁度法評價各組細菌增殖情況
Figure5.
Bacterial proliferation of each group detected by nephelo metery
2.3 體外細胞相容性評價
MTT法檢測示，各組A值均隨培養時間延長而逐漸增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。培養1、3、7 d，接枝組A值低于對照組和涂層組，但3組間兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。
圖6
MTT法評價各組細胞增殖情況
Figure6.
Cell proliferation of each group detected by MTT
熒光顯微鏡觀察示，各組細胞黏附量均隨培養時間延長而增加，且均呈正常梭形；各時間點接枝組黏附細胞均少于對照組和涂層組。見圖7。
圖7
培養各時間點各組黏附細胞情況觀察（熒光顯微鏡×50）
從左至右分別為對照組、涂層組、接枝組 a. 1 d；b. 3 d；c. 7 d
Figure7. Observation of adhesion cells on the surface of samples of each group at different time points of culture (Fluorescence microscope×50)From left to right for control group, coating group, and grafting group, respectively a. One day; b. Three days; c. Seven days
2.4 細菌-細胞共培養評價
培養3 d后對照組與涂層組樣品表面均被細菌完全覆蓋，而接枝組表面黏附細胞形態良好，呈正常的長梭形或多角形，彌散偽足，伸展性良好并且相互連接，且未觀察到細菌。見圖8。
圖8
細菌-細胞共培養3 d觀察（熒光顯微鏡×100）
綠色為活細菌/活細胞，紅色為死細菌/死細胞，黃色為凋亡中細菌 a. 對照組；b. 涂層組；c. 接枝組
Figure8. Observation of bacteria-cell after co-culture for 3 days (Fluorescence microscope×100)Green for living bacteria/living cells, red for dead bacteria/dead cells, and yellow for apoptotic bacteria a. Control group; b. Coating group; c. Grafting group
3 討論
理想的骨科植入物抗菌涂層需具備防止細菌黏附于植入物表面、抑制植入物周圍組織細菌增殖、無細胞毒性的特點。大量研究將抗菌劑裝載于植入物表面，利用表面的抗菌劑抑制或殺死植入物表面黏附細菌，或者通過釋放抗菌劑抑制或殺死植入物周圍的細菌[13]。目前抗菌劑主要包括抗生素、抗菌肽、金屬離子等[14-16]。其中金屬離子[17-18]由于具有強效、廣譜的抗菌性能而被廣泛研究，但受其細胞毒性所累，臨床應用被嚴格限制。低細胞毒性的抗菌肽被認為極具應用價值，但其抗菌效能低、體內易分解、合成成本高等問題亟待解決[19]。抗生素修飾賦予植入物表面抗菌性能[20-23]，但抗生素與細菌的匹配問題、細菌耐藥性等影響其治療效果。CHX作為一種抗菌物質被廣泛用于手術器械滅菌、皮膚或創面消毒和傷口沖洗等，其殺菌作用機制是基于其陽離子，通過靜電作用結合到微生物胞質膜中帶負電荷的區域，干擾代謝過程，使胞質膜失去滲透控制，進而導致胞內成分的裂解[24]。該機制誘發細菌耐藥突變風險低，且具有廣譜抗菌的優勢[25]。我們前期研究證明1 mg/mL CHX溶液所制備的鈦基表面不但具有良好的抗菌性能，而且對成骨細胞毒性小[26]，因此本研究采用1 mg/mL CHX溶液制備抗菌涂層。
CHX與材料表面通過物理吸附和化學共價兩種方式結合[27]，其中物理吸附以離子鍵、氫鍵和范德華力為主要結合力，吸附力較弱，植入初期常會突釋抗菌劑，使局部藥物濃度過高引起細胞毒性，后期藥物釋放量不足，甚至低于最低抑菌濃度而無法抑制細菌增殖。而化學共價結合主要以共價鍵結合，有效降低抗菌物質的釋放、提高涂層表面抗菌穩定性[28]。
鈦及其合金是生物惰性材料，堿熱處理使鈦表面形成富含羥基的TiO2-凝膠層，凝膠晶體收縮形成多孔結構[29]，模擬天然骨組織的特征，使得材料表面具有良好的生物相容性[30]；另外，其高比表面積也有效增加材料表面與骨組織的結合位點，有利于骨整合[31]。為了將CHX穩定結合于多孔表面，本研究利用富含兒茶酚基團的多酚化合物EGCG與HD交聯沉積在鈦多孔表面，構建酚胺涂層作為中間層，利用酚胺涂層表面的酚羥基/醌基等活性基團共價結合CHX的亞胺基團，實現CHX的共價固定，以長期維持抗菌性能。結果顯示，涂層組表面多孔結構被EGCG/HD交聯產物填充，孔徑減小，親水性降低；接枝組表面隨著CHX修飾，孔徑進一步減小，親水性進一步顯著下降，元素分析顯示N1s峰增強和出現Cl2p特征峰，提示酚胺交聯涂層和CHX成功接枝于鈦多孔表面。
骨科植入物感染并發癥始動因素主要是手術過程帶入細菌和周圍組織中細菌的侵入，細菌在植入物表面定植并形成生物膜導致感染發生，因此限制細菌在植入物表面黏附對預防感染至關重要[32]。體外抗菌實驗中，對照組與涂層組樣品表面黏附大量細菌且活細菌比例高、樣品周圍無抑菌環，而接枝組表面僅黏附少量死細菌、樣品周圍有透亮的抑菌環，說明酚胺涂層載CHX可防止細菌黏附于植入物表面、抑制植入物周圍組織細菌增殖，有效改善鈦基表面抗菌性能。然而，抗菌涂層的細胞毒性同樣不容忽視，體外細胞相容性實驗顯示，涂層組與接枝組相對對照組，初期黏附細胞減少且接枝組最少，分析與涂層組和接枝組表面多孔結構被填充，細胞黏附位點減少有關。另外，當細胞培養7 d時，涂層組與接枝組細胞增殖均略高于對照組，分析與含胺基表面有利于細胞增殖和成骨分化有關[33]，因此制備的涂層及接枝表面仍具有良好的細胞相容性。細菌-細胞共培養模擬植入物在細菌攻擊下的表現，結果顯示對照組與涂層組表面大量細菌黏附且無細胞，接枝組表面無細菌黏附并可見成骨細胞黏附，細胞呈長梭形或多角形，伸展性良好并相互連接，證明接枝組在細菌攻擊下保證了細胞黏附，提示能預防植入物失敗的發生。
綜上述，本研究利用堿性條件下酚羥基與胺基反應，成功在堿熱處理后鈦表面構建了EGCG/HD交聯涂層，并通過浸泡CHX水溶液實現CHX接枝，最終構建了抗菌表面。該表面不但抑制細菌在接枝CHX的酚胺涂層鈦基表面的黏附，而且抑制了材料周圍細菌的增殖，具有良好的成骨細胞相容性，提示其用于臨床可以避免植入過程帶入細菌或周圍細菌遷入所導致的感染，同時保證有菌環境中成骨細胞的黏附以促進鈦基植入物骨結合。另外，酚胺交聯涂層表面富含酚羥基、醌基、胺基，是有效的接枝反應平臺，其可以用于抗菌物質和生物活性分子共接枝，如BMP-2[34]、BMP-7[35]等活性因子。后期我們將嘗試多種功能分子共固定，以提升植入物的臨床應用價值。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經安徽醫科大學生物醫學倫理委員會批準（20160126）
作者貢獻聲明 王銀龍、陳佳龍負責實驗設計；丁思勰、洪慧蕾、王曉瑋負責實驗實施；徐凌寒、張維波、李向陽負責結果收集整理；丁思勰負責實驗結果統計分析及文章撰寫
