引用本文： 王川, 張飛, 彭吾訓, 王濤, 謝志鴻, 顏楊林, 邱汗柯. LOC103693069對BMSCs缺氧性凋亡的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(3): 362-369. doi: 10.7507/1002-1892.202103092 復制
近年來， BMSCs移植治療缺血缺氧性疾病的體外研究已較多，并取得一定進展，但體內移植療效尚不確切。有研究發現外源性BMSCs移植至體內后，在缺氧環境中會發生大量凋亡，嚴重影響了修復作用的發揮[1-2]。如何抑制BMSCs缺氧性凋亡成為亟待解決的問題，學者們提出了缺氧預處理、改善線粒體功能、清除活性氧等方法來抑制細胞凋亡，但效果均不理想[3-4]。
長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長度超過200個核苷酸的非編碼 RNA，研究表明其對BMSCs基因表達具有廣泛調控作用[5-6]，在缺血缺氧相關疾病中對細胞增殖、凋亡具有重要調控作用[7]。本研究以大鼠BMSCs為研究對象，篩選缺氧處理后下調最明顯基因，并構建慢病毒轉染BMSCs，觀察細胞活性，探討其對BMSCs缺氧性凋亡的影響，以期為調控BMSCs缺氧性凋亡提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1周齡SD大鼠30只，雌雄不限，體質量10～20 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。
L-DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；成軟骨、成脂、成骨誘導培養基（Cyagen 公司，美國）；AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國）；一步法逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；油紅O染液、阿利新藍染液、ALP染液（北京索萊寶科技有限公司）；低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、B細胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）抗體（Abcam公司，美國）；線粒體膜電位檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。
CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）；PCR儀（Eppendorf公司，德國）；LightCycler R 480Ⅱ型實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；多功能酶標儀（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
30只SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥溶液麻醉后，取雙側股骨及脛骨，采用L-DMEM 培養基沖洗骨髓至培養皿中；以離心半徑15 cm、1 000 r/min 離心5 min；棄上清液，取5 mL 含 10%FBS的L-DMEM完全培養基重懸后接種于25 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養，2～3 d后首次全量換液，以后每3天換液1次。待細胞長滿瓶底80%左右，予0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA進行傳代。取第3代細胞誘導分化2周后，經油紅O、阿利新藍和ALP染色鑒定具有成脂、成軟骨和成骨分化潛能，培養細胞為BMSCs。取第3代BMSCs進行后續實驗。
1.3 BMSCs缺氧模型制備及觀測
1.3.1 實驗分組及模型制備方法
將BMSCs隨機分為4組：對照組、5%O2組（5%CO2、90%N2和5%O2）、1%O2組（5%CO2、94%N2和1%O2）和無氧組（5%CO2、95%N2）。其中，對照組為正常培養細胞；各缺氧培養組采用細胞缺氧培養箱，通過氣體監測器設置對應CO2、N2、O2濃度培養，模擬體內缺氧條件[8]。
1.3.2 觀測指標
① CCK-8法檢測細胞活性：取BMSCs調整為濃度 1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。按上述方法分組（每組3個復孔）并培養48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態，按CCK-8試劑盒操作說明采用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度（A）值。
② 線粒體膜電位檢測：取BMSCs調整為濃度1×107個/mL的細胞懸液，接種于共聚焦培養皿，每孔1 mL。按上述方法分組（每組3個復孔）并培養48 h后，PBS洗滌3遍。取100 μL 10倍培養緩沖液加900 μL滅菌去離子水稀釋，預熱至37℃后吸取500 μL加入1 μL JC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液。取500 μL，JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃、5%CO2培養箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；激光共聚焦顯微鏡下采集熒光，凋亡細胞呈綠色熒光，正常細胞呈紅色熒光。Image J軟件計算紅/綠熒光比值，表示細胞凋亡情況。
③ 流式細胞儀檢測：取BMSCs調整為濃度5×104個/mL的細胞懸液，接種于T25培養瓶，待細胞長滿瓶底70%，按上述方法分組并培養48 h。以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞后，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，然后依次加入5 μL AnnexinⅤ、5 μL PI，室溫避光孵育5 min，輕輕渦旋細胞并室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
④ Western blot檢測：參照流式細胞儀檢測方法取細胞分組及培養48 h后，加入含1%蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，將蛋白與上樣緩沖液混勻、加熱，PAGE 凝膠電泳。用電轉移儀將蛋白轉移至PVDF膜，置于封閉液。加入一抗（HIF-1α、Caspase-3、Bcl-2）4℃孵育過夜，二抗孵育2 h；ECL 化學發光顯影。以β-actin作為內參，目的條帶與內參條帶的灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。
結合上述觀測結果，選擇細胞凋亡最明顯的濃度組進行后續實驗。
1.4 缺氧BMSCs目標基因篩選及分析
1.4.1 缺氧BMSCs基因差異分析
取經篩選濃度缺氧處理48 h的BMSCs，通過基因芯片進行基因篩選，由上海吉凱基因科技有限公司完成。然后檢索Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲得與BMSCs相關的微陣列。采用Limma 包分析BMSCs表達芯片，通過差異倍數（fold-change，FC）選擇差異表達基因，篩選標準為|log2 FC|>2和P<0.05。采用pheatmap構建差異基因熱圖。
1.4.2 qRT-PCR檢測
對篩選出的表達下調基因進行qRT-PCR分析，選擇下調程度最大基因。取BMSCs按1.3.1方法分組并培養48 h，分別提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA量。采用miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，65℃加熱5 min使逆轉錄酶失活。目的基因和GAPDH引物由上海生工生物科技有限公司合成。反應條件：95℃ 預變性3 min；95℃變性 3 s、60℃退火30 s，共45個循環。采用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.5 目的基因對BMSCs缺氧性凋亡的作用
1.5.1 目的基因慢病毒構建
篩選的目的基因慢病毒由上海吉凱基因科技有限公司構建，包括高表達、低表達以及陰性對照。
1.5.2 目的基因慢病毒轉染BMSCs觀測
實驗分為4組：正常對照組、陰性對照組、高表達組及低表達組。取第3代BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，重懸調整為細胞濃度為1×105個/mL的細胞懸液；接種于25 cm2培養瓶中，每瓶5 mL。正常對照組不作特殊處理。陰性對照組、高表達組、低表達組分別加入相應的慢病毒原液100 μL以及Polybrane稀釋液100 μL，混勻后于37℃、5%CO2培養條件下培養；10 h后根據細胞狀態更換L-DMEM 完全培養基，以后每2～3 天常規換液1次。
轉染4～5 d棄原培養基，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的L-DMEM完全培養基加壓篩選24 h；隨后，將嘌呤霉素濃度減至1 μg/mL維持篩選，傳3代得到穩定株。qRT-PCR檢測目的基因表達水平，觀察其是否轉染成功。
明確轉染成功后，將上述各組細胞按照篩選的缺氧條件培養48 h后，參照1.3.2方法觀測目的基因轉染對細胞活性及相關蛋白表達的影響。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 缺氧誘導BMSCs凋亡觀測
培養48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察對照組及5%O2組細胞呈長梭形，生長狀態良好；1%O2組、無氧組細胞部分老化、凋亡，邊緣毛糙，折光性差。CCK-8法檢測示，對照組、5%O2組、1%O2組、無氧組A值分別為2.00±0.02、1.92±0.02、1.39±0.03、0.64±0.03；線粒體膜電位檢測示，紅/綠熒光比值分別為1.00±0.01、0.85±0.02、0.70±0.02、0.40±0.03；流式細胞儀檢測示，細胞凋亡率分別為3.27%±0.03%、3.32%±0.02%、42.1%±0.56%、70.2%±1.02%；Western blot檢測示，隨O2濃度降低，HIF-1α和Caspase-3蛋白相對表達量逐漸上升，Bcl-2蛋白相對表達量下降。見圖1～4。
圖1
倒置熒光顯微鏡觀察不同缺氧條件下細胞形態（×100）
a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure1. Observation of cell morphology under different hypoxic conditions by inverted fluorescene microscope (×100)a. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖2
激光共聚焦顯微鏡下觀察不同缺氧條件下細胞熒光表達（×100）
從左至右分別為紅色熒光（正常細胞）、綠色熒光（凋亡細胞）、DAPI以及重疊圖片 a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure2. Observation of fluorescence expression under different hypoxic conditions by laser confocal microscope (×100)From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively a. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖3
流式細胞儀檢測不同缺氧條件下細胞凋亡情況
a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure3. Cell apoptosis under different hypoxic conditions by flow cytometrya. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖4
Western blot檢測不同缺氧條件下細胞HIF-1α、Caspase-3及Bcl-2蛋白表達情況
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：5%O2組 3：1%O2組 4：無氧組；b. 目的蛋白相對表達量
Figure4. HIF-1α, Caspase-3, and Bcl-2 protein expressions under different hypoxic conditions detected by Western blot assaya. Electrophoresis graph Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: 5%O2 group 3: 1%O2 group 4: Anaerobic condition group; b. Relative expressions of target proteins
無氧組上述指標與其他組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），故選擇以該濃度培養48 h的BMSCs進行后續實驗。
2.2 缺氧BMSCs目標基因篩選及分析
基因芯片分析示，缺氧處理后BMSCs中AC125847.1、LOC102547753、AABR07017208.2、LOC103693069明顯下調。qRT-PCR檢測示，LOC103693069表達下調最明顯，且隨著缺氧程度加重，其表達也呈持續下調趨勢（P<0.05），說明LOC103693069參與調控BMSCs缺氧性凋亡。見圖5。
圖5
目標基因篩選熱圖及qRT-PCR驗證
a. 差異基因表達熱圖；b. qRT-PCR結果
Figure5. Heat map analysis of target gene screening and qRT-PCR verificationa. Differential gene expression heat map; b. qRT-PCR results
2.3 目的基因對BMSCs缺氧性凋亡的作用
2.3.1 慢病毒轉染后qRT-PCR檢測
與正常對照組比較，慢病毒轉染后高表達組LOC103693069上調（14.23±1.21）倍，低表達組下調（9.22±1.14）倍，提示目的基因成功轉染至細胞。
2.3.2 缺氧處理觀測
倒置熒光顯微鏡下觀察見低表達組細胞大量凋亡，高表達組凋亡情況較之減少。正常對照組、陰性對照組、高表達組及低表達組CCK-8法檢測示A值分別為0.64±0.02、0.61±0.02、0.97±0.03、0.56±0.01；線粒體膜電位檢測紅/綠熒光比值分別為0.50±0.01、0.51±0.02、0.85±0.03、0.39±0.01；流式細胞儀檢測細胞凋亡率分別為60.30%±1.51%、64.00%±2.03%、41.00%±0.97%、72.60%±2.35%；Western blot檢測Caspase-3蛋白相對表達量分別為1.00±0.02、0.90±0.01、0.41±0.01、0.81±0.01，Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.19±0.01、0.15±0.01、0.78±0.02、0.36±0.01。上述檢測指標組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6、7。
圖6
LOC103693069基因慢病毒轉染BMSCs后Western blot檢測目的蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：正常對照組 2：陰性對照組 3：高表達組 4：低表達組
Figure6. Target protein expression of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirus by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Normal control group 2: Negative control group 3: High-expression group 4: Low-expression group
圖7
LOC103693069基因慢病毒轉染BMSCs觀測
a. 倒置熒光顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組；b. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組；c. 激光共聚焦顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為紅色熒光（正常細胞）、綠色熒光（凋亡細胞）、DAPI以及重疊圖片 從上至下分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組
Figure7. Observation of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirusa. Inverted fluorescence microscope observation (×100) From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; b. Flow cytometry detection From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; c. Laser confocal microscope observation (×100) From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively From top to bottom for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively
缺氧處理后，低表達組細胞凋亡率較陰性對照組增高，線粒體膜電位呈低紅、高綠熒光，HIF-1α和Caspase-3蛋白表達上調、Bcl-2蛋白表達下調；而高表達組逆轉了上述結果，細胞凋亡率低于其他組，促進了BMSCs在缺氧條件下的存活。
3 討論
本研究中通過體外模擬缺氧處理BMSCs，發現細胞大量凋亡，細胞活性明顯降低，線粒體膜電位下降，HIF-1α和Caspase-3蛋白相對表達量上調，Bcl-2蛋白相對表達量下調。與既往研究報道的體外缺氧處理后BMSCs大量凋亡、凋亡相關蛋白表達增加結論[7]一致。然而，目前尚無最佳的改善BMSCs缺氧性凋亡方法，主要有調控活性氧、改善線粒體膜電位、調控HIF-1α表達等，但具體效果尚不確切[8-9]。因此，尋找有效的抗BMSCs缺氧性凋亡方法具有重要意義。
近年來，隨著對LncRNA研究的深入，越來越多證據表明以往被認為是結構不完整、無功能的LncRNA，在機體多種生物學作用中發揮了強大調控作用，為改善BMSCs缺氧性凋亡提供了一種新思路和方法，也成為該領域的研究熱點。我們采用基因芯片檢測了缺氧凋亡BMSCs的相關基因表達，進一步行qRT-PCR驗證，最終確定LOC103693069在缺氧后表達下調最顯著，且隨著缺氧程度加重持續下調。有研究發現在缺氧狀態下LncRNA表達異常，且在細胞功能調節中起著重要作用[10-15]。結合上述研究結果提示LOC103693069與BMSCs缺氧性凋亡密切相關。
LncRNA屬于非編碼基因，其功能涉及細胞凋亡、增殖、分化、代謝等多個生物過程，特別是調控基因表達，越來越受到重視。研究顯示LncRNA H19通過抑制MAPK信號通路，促進肝癌細胞凋亡[12]；LncRNA CASC9通過穩定Nrf2的負調控因子miR-383-5P來減少Nrf2，從而在脊髓損傷神經元增殖中起關鍵調節作用[13]；LncRNA RN7SK通過抑制巨噬細胞形成基因的轉錄，來調控巨噬細胞極化和先天免疫反應[14]；LncRNA HOTTIP通過與多嘧啶束結合蛋白1相互作用，促進K-H型剪接調節蛋白水平，從而促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[15]。同樣，我們在BMSCs缺氧模型中通過LncRNA芯片分析篩選得到LOC103693069與BMSCs缺氧性凋亡密切相關，過表達LOC103693069并缺氧處理后，BMSCs凋亡率和凋亡相關蛋白表達明顯降低，當下調LOC103693069時BMSCs凋亡率增加，相關凋亡蛋白表達上調，表明了過表達LOC103693069可抑制BMSCs缺氧性凋亡。綜上述，本研究證實了LOC103693069可改善 BMSCs的缺氧性凋亡。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（2101122）；實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001
作者貢獻聲明 王川負責實驗設計、實施及文章撰寫；王濤參與實驗設計與實施；謝志鴻負責數據整理和統計分析；顏楊林、邱汗柯參與實驗細胞的提取和培養；彭吾訓、張飛負責實驗設計與評估以及文章審閱
近年來， BMSCs移植治療缺血缺氧性疾病的體外研究已較多，并取得一定進展，但體內移植療效尚不確切。有研究發現外源性BMSCs移植至體內后，在缺氧環境中會發生大量凋亡，嚴重影響了修復作用的發揮[1-2]。如何抑制BMSCs缺氧性凋亡成為亟待解決的問題，學者們提出了缺氧預處理、改善線粒體功能、清除活性氧等方法來抑制細胞凋亡，但效果均不理想[3-4]。
長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是長度超過200個核苷酸的非編碼 RNA，研究表明其對BMSCs基因表達具有廣泛調控作用[5-6]，在缺血缺氧相關疾病中對細胞增殖、凋亡具有重要調控作用[7]。本研究以大鼠BMSCs為研究對象，篩選缺氧處理后下調最明顯基因，并構建慢病毒轉染BMSCs，觀察細胞活性，探討其對BMSCs缺氧性凋亡的影響，以期為調控BMSCs缺氧性凋亡提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1周齡SD大鼠30只，雌雄不限，體質量10～20 g，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。
L-DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；成軟骨、成脂、成骨誘導培養基（Cyagen 公司，美國）；AnnexinⅤ/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測試劑盒（BD 公司，美國）；一步法逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；油紅O染液、阿利新藍染液、ALP染液（北京索萊寶科技有限公司）；低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、B細胞淋巴瘤/白血病基因2（B cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）抗體（Abcam公司，美國）；線粒體膜電位檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）。
CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國）；PCR儀（Eppendorf公司，德國）；LightCycler R 480Ⅱ型實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）儀（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；多功能酶標儀（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 BMSCs分離培養及鑒定
30只SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥溶液麻醉后，取雙側股骨及脛骨，采用L-DMEM 培養基沖洗骨髓至培養皿中；以離心半徑15 cm、1 000 r/min 離心5 min；棄上清液，取5 mL 含 10%FBS的L-DMEM完全培養基重懸后接種于25 cm2培養瓶中，于37℃、5%CO2條件下培養，2～3 d后首次全量換液，以后每3天換液1次。待細胞長滿瓶底80%左右，予0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA進行傳代。取第3代細胞誘導分化2周后，經油紅O、阿利新藍和ALP染色鑒定具有成脂、成軟骨和成骨分化潛能，培養細胞為BMSCs。取第3代BMSCs進行后續實驗。
1.3 BMSCs缺氧模型制備及觀測
1.3.1 實驗分組及模型制備方法
將BMSCs隨機分為4組：對照組、5%O2組（5%CO2、90%N2和5%O2）、1%O2組（5%CO2、94%N2和1%O2）和無氧組（5%CO2、95%N2）。其中，對照組為正常培養細胞；各缺氧培養組采用細胞缺氧培養箱，通過氣體監測器設置對應CO2、N2、O2濃度培養，模擬體內缺氧條件[8]。
1.3.2 觀測指標
① CCK-8法檢測細胞活性：取BMSCs調整為濃度 1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL。按上述方法分組（每組3個復孔）并培養48 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態，按CCK-8試劑盒操作說明采用酶標儀測定各孔450 nm處吸光度（A）值。
② 線粒體膜電位檢測：取BMSCs調整為濃度1×107個/mL的細胞懸液，接種于共聚焦培養皿，每孔1 mL。按上述方法分組（每組3個復孔）并培養48 h后，PBS洗滌3遍。取100 μL 10倍培養緩沖液加900 μL滅菌去離子水稀釋，預熱至37℃后吸取500 μL加入1 μL JC-1，渦旋混勻配成JC-1工作液。取500 μL，JC-1工作液將細胞均勻懸浮，37℃、5%CO2培養箱孵育30 min，PBS洗滌3遍；激光共聚焦顯微鏡下采集熒光，凋亡細胞呈綠色熒光，正常細胞呈紅色熒光。Image J軟件計算紅/綠熒光比值，表示細胞凋亡情況。
③ 流式細胞儀檢測：取BMSCs調整為濃度5×104個/mL的細胞懸液，接種于T25培養瓶，待細胞長滿瓶底70%，按上述方法分組并培養48 h。以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞后，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，然后依次加入5 μL AnnexinⅤ、5 μL PI，室溫避光孵育5 min，輕輕渦旋細胞并室溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
④ Western blot檢測：參照流式細胞儀檢測方法取細胞分組及培養48 h后，加入含1%蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，將蛋白與上樣緩沖液混勻、加熱，PAGE 凝膠電泳。用電轉移儀將蛋白轉移至PVDF膜，置于封閉液。加入一抗（HIF-1α、Caspase-3、Bcl-2）4℃孵育過夜，二抗孵育2 h；ECL 化學發光顯影。以β-actin作為內參，目的條帶與內參條帶的灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次。
結合上述觀測結果，選擇細胞凋亡最明顯的濃度組進行后續實驗。
1.4 缺氧BMSCs目標基因篩選及分析
1.4.1 缺氧BMSCs基因差異分析
取經篩選濃度缺氧處理48 h的BMSCs，通過基因芯片進行基因篩選，由上海吉凱基因科技有限公司完成。然后檢索Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲得與BMSCs相關的微陣列。采用Limma 包分析BMSCs表達芯片，通過差異倍數（fold-change，FC）選擇差異表達基因，篩選標準為|log2 FC|>2和P<0.05。采用pheatmap構建差異基因熱圖。
1.4.2 qRT-PCR檢測
對篩選出的表達下調基因進行qRT-PCR分析，選擇下調程度最大基因。取BMSCs按1.3.1方法分組并培養48 h，分別提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測定總RNA量。采用miRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA，65℃加熱5 min使逆轉錄酶失活。目的基因和GAPDH引物由上海生工生物科技有限公司合成。反應條件：95℃ 預變性3 min；95℃變性 3 s、60℃退火30 s，共45個循環。采用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。
1.5 目的基因對BMSCs缺氧性凋亡的作用
1.5.1 目的基因慢病毒構建
篩選的目的基因慢病毒由上海吉凱基因科技有限公司構建，包括高表達、低表達以及陰性對照。
1.5.2 目的基因慢病毒轉染BMSCs觀測
實驗分為4組：正常對照組、陰性對照組、高表達組及低表達組。取第3代BMSCs用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，以離心半徑15 cm、1 000 r/min離心5 min，重懸調整為細胞濃度為1×105個/mL的細胞懸液；接種于25 cm2培養瓶中，每瓶5 mL。正常對照組不作特殊處理。陰性對照組、高表達組、低表達組分別加入相應的慢病毒原液100 μL以及Polybrane稀釋液100 μL，混勻后于37℃、5%CO2培養條件下培養；10 h后根據細胞狀態更換L-DMEM 完全培養基，以后每2～3 天常規換液1次。
轉染4～5 d棄原培養基，加入含2 μg/mL嘌呤霉素的L-DMEM完全培養基加壓篩選24 h；隨后，將嘌呤霉素濃度減至1 μg/mL維持篩選，傳3代得到穩定株。qRT-PCR檢測目的基因表達水平，觀察其是否轉染成功。
明確轉染成功后，將上述各組細胞按照篩選的缺氧條件培養48 h后，參照1.3.2方法觀測目的基因轉染對細胞活性及相關蛋白表達的影響。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 缺氧誘導BMSCs凋亡觀測
培養48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察對照組及5%O2組細胞呈長梭形，生長狀態良好；1%O2組、無氧組細胞部分老化、凋亡，邊緣毛糙，折光性差。CCK-8法檢測示，對照組、5%O2組、1%O2組、無氧組A值分別為2.00±0.02、1.92±0.02、1.39±0.03、0.64±0.03；線粒體膜電位檢測示，紅/綠熒光比值分別為1.00±0.01、0.85±0.02、0.70±0.02、0.40±0.03；流式細胞儀檢測示，細胞凋亡率分別為3.27%±0.03%、3.32%±0.02%、42.1%±0.56%、70.2%±1.02%；Western blot檢測示，隨O2濃度降低，HIF-1α和Caspase-3蛋白相對表達量逐漸上升，Bcl-2蛋白相對表達量下降。見圖1～4。
圖1
倒置熒光顯微鏡觀察不同缺氧條件下細胞形態（×100）
a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure1. Observation of cell morphology under different hypoxic conditions by inverted fluorescene microscope (×100)a. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖2
激光共聚焦顯微鏡下觀察不同缺氧條件下細胞熒光表達（×100）
從左至右分別為紅色熒光（正常細胞）、綠色熒光（凋亡細胞）、DAPI以及重疊圖片 a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure2. Observation of fluorescence expression under different hypoxic conditions by laser confocal microscope (×100)From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively a. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖3
流式細胞儀檢測不同缺氧條件下細胞凋亡情況
a. 對照組；b. 5%O2組；c. 1%O2組；d. 無氧組
Figure3. Cell apoptosis under different hypoxic conditions by flow cytometrya. Control group; b. 5%O2 group; c. 1%O2 group; d. Anaerobic condition group
圖4
Western blot檢測不同缺氧條件下細胞HIF-1α、Caspase-3及Bcl-2蛋白表達情況
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：5%O2組 3：1%O2組 4：無氧組；b. 目的蛋白相對表達量
Figure4. HIF-1α, Caspase-3, and Bcl-2 protein expressions under different hypoxic conditions detected by Western blot assaya. Electrophoresis graph Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: 5%O2 group 3: 1%O2 group 4: Anaerobic condition group; b. Relative expressions of target proteins
無氧組上述指標與其他組比較，差異均有統計學意義（P<0.05），故選擇以該濃度培養48 h的BMSCs進行后續實驗。
2.2 缺氧BMSCs目標基因篩選及分析
基因芯片分析示，缺氧處理后BMSCs中AC125847.1、LOC102547753、AABR07017208.2、LOC103693069明顯下調。qRT-PCR檢測示，LOC103693069表達下調最明顯，且隨著缺氧程度加重，其表達也呈持續下調趨勢（P<0.05），說明LOC103693069參與調控BMSCs缺氧性凋亡。見圖5。
圖5
目標基因篩選熱圖及qRT-PCR驗證
a. 差異基因表達熱圖；b. qRT-PCR結果
Figure5. Heat map analysis of target gene screening and qRT-PCR verificationa. Differential gene expression heat map; b. qRT-PCR results
2.3 目的基因對BMSCs缺氧性凋亡的作用
2.3.1 慢病毒轉染后qRT-PCR檢測
與正常對照組比較，慢病毒轉染后高表達組LOC103693069上調（14.23±1.21）倍，低表達組下調（9.22±1.14）倍，提示目的基因成功轉染至細胞。
2.3.2 缺氧處理觀測
倒置熒光顯微鏡下觀察見低表達組細胞大量凋亡，高表達組凋亡情況較之減少。正常對照組、陰性對照組、高表達組及低表達組CCK-8法檢測示A值分別為0.64±0.02、0.61±0.02、0.97±0.03、0.56±0.01；線粒體膜電位檢測紅/綠熒光比值分別為0.50±0.01、0.51±0.02、0.85±0.03、0.39±0.01；流式細胞儀檢測細胞凋亡率分別為60.30%±1.51%、64.00%±2.03%、41.00%±0.97%、72.60%±2.35%；Western blot檢測Caspase-3蛋白相對表達量分別為1.00±0.02、0.90±0.01、0.41±0.01、0.81±0.01，Bcl-2蛋白相對表達量分別為0.19±0.01、0.15±0.01、0.78±0.02、0.36±0.01。上述檢測指標組間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6、7。
圖6
LOC103693069基因慢病毒轉染BMSCs后Western blot檢測目的蛋白表達
Mr：相對分子質量 1：正常對照組 2：陰性對照組 3：高表達組 4：低表達組
Figure6. Target protein expression of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirus by Western blotMr: Relative molecular mass 1: Normal control group 2: Negative control group 3: High-expression group 4: Low-expression group
圖7
LOC103693069基因慢病毒轉染BMSCs觀測
a. 倒置熒光顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組；b. 流式細胞儀檢測 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組；c. 激光共聚焦顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為紅色熒光（正常細胞）、綠色熒光（凋亡細胞）、DAPI以及重疊圖片 從上至下分別為正常對照組、陰性對照組、高表達組、低表達組
Figure7. Observation of BMSCs transfected with LOC103693069 lentivirusa. Inverted fluorescence microscope observation (×100) From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; b. Flow cytometry detection From left to right for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively; c. Laser confocal microscope observation (×100) From left to right for red fluorescence (normal cells), green fluorescence (apoptotic cells), DAPI, and overlapping images, respectively From top to bottom for normal control group, negative control group, high-expression group, and low-expression group, respectively
缺氧處理后，低表達組細胞凋亡率較陰性對照組增高，線粒體膜電位呈低紅、高綠熒光，HIF-1α和Caspase-3蛋白表達上調、Bcl-2蛋白表達下調；而高表達組逆轉了上述結果，細胞凋亡率低于其他組，促進了BMSCs在缺氧條件下的存活。
3 討論
本研究中通過體外模擬缺氧處理BMSCs，發現細胞大量凋亡，細胞活性明顯降低，線粒體膜電位下降，HIF-1α和Caspase-3蛋白相對表達量上調，Bcl-2蛋白相對表達量下調。與既往研究報道的體外缺氧處理后BMSCs大量凋亡、凋亡相關蛋白表達增加結論[7]一致。然而，目前尚無最佳的改善BMSCs缺氧性凋亡方法，主要有調控活性氧、改善線粒體膜電位、調控HIF-1α表達等，但具體效果尚不確切[8-9]。因此，尋找有效的抗BMSCs缺氧性凋亡方法具有重要意義。
近年來，隨著對LncRNA研究的深入，越來越多證據表明以往被認為是結構不完整、無功能的LncRNA，在機體多種生物學作用中發揮了強大調控作用，為改善BMSCs缺氧性凋亡提供了一種新思路和方法，也成為該領域的研究熱點。我們采用基因芯片檢測了缺氧凋亡BMSCs的相關基因表達，進一步行qRT-PCR驗證，最終確定LOC103693069在缺氧后表達下調最顯著，且隨著缺氧程度加重持續下調。有研究發現在缺氧狀態下LncRNA表達異常，且在細胞功能調節中起著重要作用[10-15]。結合上述研究結果提示LOC103693069與BMSCs缺氧性凋亡密切相關。
LncRNA屬于非編碼基因，其功能涉及細胞凋亡、增殖、分化、代謝等多個生物過程，特別是調控基因表達，越來越受到重視。研究顯示LncRNA H19通過抑制MAPK信號通路，促進肝癌細胞凋亡[12]；LncRNA CASC9通過穩定Nrf2的負調控因子miR-383-5P來減少Nrf2，從而在脊髓損傷神經元增殖中起關鍵調節作用[13]；LncRNA RN7SK通過抑制巨噬細胞形成基因的轉錄，來調控巨噬細胞極化和先天免疫反應[14]；LncRNA HOTTIP通過與多嘧啶束結合蛋白1相互作用，促進K-H型剪接調節蛋白水平，從而促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移[15]。同樣，我們在BMSCs缺氧模型中通過LncRNA芯片分析篩選得到LOC103693069與BMSCs缺氧性凋亡密切相關，過表達LOC103693069并缺氧處理后，BMSCs凋亡率和凋亡相關蛋白表達明顯降低，當下調LOC103693069時BMSCs凋亡率增加，相關凋亡蛋白表達上調，表明了過表達LOC103693069可抑制BMSCs缺氧性凋亡。綜上述，本研究證實了LOC103693069可改善 BMSCs的缺氧性凋亡。
利益沖突 所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（2101122）；實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001
作者貢獻聲明 王川負責實驗設計、實施及文章撰寫；王濤參與實驗設計與實施；謝志鴻負責數據整理和統計分析；顏楊林、邱汗柯參與實驗細胞的提取和培養；彭吾訓、張飛負責實驗設計與評估以及文章審閱
