引用本文： 曾秀安, 厲孟, 楊其兵, 汪其苑, 陳永新, 羅想利, 李繼東, 藍旭. 二甲基乙二酰基甘氨酸對跨區穿支皮瓣ChokeⅡ區血管生成的影響機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(2): 224-230. doi: 10.7507/1002-1892.202107103 復制
自Koshima等[1]提出“穿支皮瓣”概念以來，跨區穿支皮瓣因可切取面積大、修復效果好、供區損傷小等特點，常被用于皮膚軟組織缺損修復。Cormack等[2]將皮膚血管供區分為解剖區、血流動力學區和潛在區。跨區穿支皮瓣在解剖區和血流動力學區成活相對穩定，在潛在區易發生缺血壞死，限制了在臨床上廣泛應用[3-4]。因此，如何提高跨區穿支皮瓣移植后的成活率仍是需解決的問題。
相鄰血管體之間相互吻合的血管稱為“Choke血管”，該血管對跨區穿支皮瓣的成活極其重要[5]。Xu等[6]在多血管體穿支皮瓣研究中發現存在ChokeⅠ區和Ⅱ區，前者位于解剖區與血流動力學區之間，后者位于血流動力學區與潛在區之間；ChokeⅡ區血管生成減少和血液灌注不足是導致跨區穿支皮瓣壞死的主要原因之一。因此，促進Choke血管生成、改善血液供應等，對跨區穿支皮瓣成活至關重要[7]。
有學者提出通過手術延遲、藥物干預等方式來促進跨區穿支皮瓣血管生成、改善血供[8-9]。然而，手術延遲不僅增加了手術次數和感染風險，還給患者帶來較大創傷。藥物干預具有損傷小、相對安全等優點，逐漸成為研究熱點，并取得一定成果，但藥物作用機制及最佳給藥途徑需進一步研究[10-11]。二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）是一種非特異性脯氨酸羥化酶抑制劑，可有效抑制脯氨酸羥化酶活性，使缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）積聚，從而激活下游VEGF、紅細胞生成素等基因的表達，繼而促進血管生成[12-13]。研究發現DMOG可促進皮瓣血管生成、改善血供，提高皮瓣成活率[12, 14]。但目前有關DMOG對跨區穿支皮瓣ChokeⅡ區血管生成影響的相關研究較少。本研究以大鼠為模型，觀察腹腔注射DMOG對跨區穿支皮瓣ChokeⅡ區血管生成和皮瓣潛在區成活的影響，探索其作用機制，為臨床采用跨區穿支皮瓣修復大面積皮膚軟組織缺損、提高皮瓣成活率提供治療思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠126只，體質量240～300 g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。DMOG、HIF-1α抑制劑YC-1（Selleck公司，美國）；多克隆抗體HIF-1α、VEGF（Abcam公司，美國）；DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；300 Bloom明膠、水合氯醛（天津市光復精細化工研究所）；PBS緩沖液（蘭州總醫院骨科研究所）；紅色氧化鉛（天津市致遠化學試劑有限公司）；鼠HIF-1α ELISA試劑盒、鼠VEGF ELISA試劑盒（TSZ科技有限公司，美國）；聚偏氟乙烯膜、BCA蛋白定量試劑盒、高效RIPA組織細胞裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉、濾紙、脫敏發光液（北京索來寶科技有限公司）。
熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（伯騰儀器有限公司，美國）；H1650-W臺式微量高速離心機、臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Image J軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗分組及方法
采用隨機數字表法將126只大鼠分為DMOG組、YC-1組、空白對照組，每組42只。3組大鼠參照文獻 ［15］方法制備跨區穿支皮瓣模型。具體步驟：大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6 mg/kg）麻醉后，俯臥于操作臺并四肢固定，背部脫毛處理，記號筆標記跨區穿支皮瓣區域12 cm×3 cm。聚維酮碘溶液消毒，鋪無菌單，切開皮膚至深筋膜淺層，沿筋膜層向對側緩慢分離，逐層掀起分離皮瓣，充分暴露髂腰動脈、肋間后動脈、胸背動脈。結扎并切斷肋間后動脈和胸背動脈，保留髂腰動脈為皮瓣穿支血管，獲得以髂腰動脈為蒂的三血管體穿支皮瓣（圖1）。創面徹底結扎止血后，以4-0縫線原位間斷縫合皮緣。
圖1
跨區穿支皮瓣模型制備示意圖
a. 皮瓣設計；b. 島狀皮瓣；c. 切取的皮瓣；d. 皮瓣原位縫合
Figure1. Schematic diagram of flap model preparationa. Flap design; b. Island flap; c. The flap was dissected; d. The flap was sutured in situ
術前1 d、2 h以及術后1、2、3 d，DMOG組腹腔注射2 mL含DMOG（40 mg/kg）的生理鹽水[16]，YC-1組注射2 mL含YC-1（10 mg/kg）的生理鹽水[17-18]，空白對照組給予等量生理鹽水。術后大鼠均單獨飼養并自由覓食、飲水。于術后3、5、7 d 取大鼠同上法麻醉后行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察各組大鼠皮瓣成活情況，包括皮瓣顏色、質地及是否發生壞死。術后7 d各組取6只大鼠，切取整塊皮瓣組織并掀起展開，通過皮瓣透光試驗觀察血管生成情況；使用Image J軟件測量皮瓣成活面積，計算皮瓣成活率，公式為：成活面積/總面積×100%。
1.3.2 血管造影觀察
術后7 d各組取6只大鼠，采用血管造影觀察皮瓣ChokeⅡ區血管生成情況。大鼠仰臥位固定，分離一側頸總動脈以及對側頸內靜脈并用慕絲線標記。將硅膠管留置針置入頸總動脈，排盡大鼠體內血液后注入生理鹽水肝素，直至頸內靜脈流出清亮生理鹽水。然后，將大鼠置于40℃水浴鍋中，將明膠-氧化鉛混合物（50 mL/kg）注入頸總動脈，直至四肢末端出現點狀、斑塊狀顏色時停止灌注。將大鼠置于4℃冰箱，隔日剝離皮瓣，平鋪拍攝X線片，觀察血管生成情況。
1.3.3 組織學觀察
術后7 d各組取6只大鼠，取ChokeⅡ區皮瓣組織，面積2.0 cm×0.6 cm，置于甲醛固定，常規脫水包埋切片，片厚5 μm。每只大鼠取1張切片行HE染色，在低倍鏡下找到血管密集區，再在高倍鏡下選取5個視野，使用Image J軟件計數血管。
1.3.4 免疫組織化學染色觀測
取1.3.3中制作的切片（每只大鼠取1張），置于檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，用中火微波處理10 min后取出自然冷卻；蒸餾水清洗3次，PBS緩沖液清洗，加入0.01% Triton X-100，37℃孵育10 min；加入3%H2O2，37℃孵育10 min；加入5%牛血清白蛋白，37℃孵育20 min；加入HIF-1α、VEGF一抗（兔多克隆抗體稀釋比為1∶100），4℃冰箱中過夜；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30 min。取出濕盒加入SABC，37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，甲醛固定，中性樹脂封片。在40×10倍光鏡下觀察HIF-1α、VEGF分布，陽性染色呈棕黃色或黃褐色。
1.3.5 ELISA檢測
術后3、5、7 d，各組分別取6只大鼠ChokeⅡ區皮瓣組織250 mg，加入PBS緩沖液，冰浴下研磨，以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心30 min；取上清，參照BCA蛋白定量試劑盒檢測HIF-1α、VEGF蛋白總濃度。
1.3.6 Western blot檢測
術后7 d各組取6只大鼠ChokeⅡ區皮瓣組織蛋白，調節蛋白濃度，凝膠電泳、濕法轉膜，在50 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，加入小鼠抗大鼠VEGF、HIF-1α一抗（稀釋比1∶300），4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比1∶4 000），室溫孵育2 h。化學發光、顯影，圖像分析系統行灰度掃描分析，以與內參β-actin灰度值比值表示VEGF、HIF-1α蛋白相對表達量。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及血管造影觀察
術后7 d，DMOG組切口愈合良好，皮瓣遠端未見明顯壞死，皮瓣質地較軟、未出現發黑結痂；空白對照組和YC-1組切口愈合欠佳，皮瓣發生壞死且主要位于遠端，皮瓣質地較硬，可見黑色痂皮。見圖2。DMOG組大鼠皮瓣成活率為90.28%±1.37%，高于YC-1組84.28%±1.45%及空白對照組85.83%±1.60%，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。皮瓣透光試驗及血管造影觀察顯示DMOG組皮瓣ChokeⅡ區血管生成較多且結構清晰、完整；YC-1組及空白對照組Choke Ⅱ區血管較少，血管結構紊亂。見圖3、4。
圖2
術后7 d各組皮瓣大體觀察
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure2. Gross observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
圖3
術后7 d透光試驗觀察各組皮瓣血管生成情況
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure3. Flap angiogenesis observed by light transmission test at7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
圖4
術后7 d各組皮瓣血管造影觀察
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure4. Angiography observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后7 d，與YC-1組和空白對照組相比，DMOG組血管明顯增多且管腔形態結構較完整（圖5）。DMOG組、YC-1組、空白對照組血管數量分別為（25.56±1.29）、（7.38±0.54）、（14.48±0.91）條/視野。DMOG組高于其余兩組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖5
術后7 d 各組皮瓣HE染色觀察（×200）
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure5. HE staining of flaps in each group at 7 days after operation (×200)a. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
術后7 d，DMOG組皮瓣Choke Ⅱ區HIF-1α、VEGF表達顯著，染色明顯強于YC-1組、空白對照組（圖6）。
圖6
術后7 d各組免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為DMOG組、 YC-1組、空白對照組 a. HIF-1α；b. VEGF
Figure6. Immunohistochemical staining of flaps in each group at 7 days after operation (×400)From left to right for DMOG group, YC-1 group, and Control group a. HIF-1α; b. VEGF
2.3 ELISA檢測
術后3、5、7 d DMOG組皮瓣ChokeⅡ區HIF-1α、VEGF表達量均高于YC-1組、空白對照組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
術后各時間點各組ELISA法檢測HIF-1α及VEGF蛋白表達
a. HIF-1α；b. VEGF
Figure7. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by ELISA at each time point after operationa. HIF-1α; b. VEGF
2.4 Western blot檢測
術后7 d ，DMOG組HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量均高于空白對照組和YC-1組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
術后7 d Western blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達
a. 電泳圖 1～3： DMOG組 4～6：YC-1組 7～9：空白對照組； b. 蛋白相對表達量
Figure8. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by Western blot at 7 days after operationa. Electropherogram 1-3: DMOG group 4-6: YC-1 group 7-9: Control group; b. Relative protein expressions
3 討論
既往有研究采用不同干預方式促進皮瓣血管生成，提高皮瓣成活率。陶先耀等[12]通過腹腔注射DMOG預處理來影響大鼠跨區穿支皮瓣成活及閉塞區血管生成，發現DMOG可提高皮瓣VEGF表達，促進跨區穿支皮瓣閉塞區血管生成，進而改善皮瓣血供。習珊珊等[14]研究發現通過尾靜脈注射DMOG能改善大鼠跨區皮瓣血管體區微循環，減輕皮瓣缺血及缺氧程度，提高皮瓣成活率。上述研究僅探索了DMOG處理后對皮瓣血管生成的影響，未對跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區血管生成的作用機制進行深入研究，為此我們進行了本次研究。研究結果顯示DMOG組皮瓣成活面積明顯大于YC-1組和空白對照組；HE染色及明膠-氧化鉛血管造影觀察見DMOG組Choke Ⅱ區血管結構清晰完整，血管數量明顯多于其余兩組；ELISA檢測示DMOG組中HIF-1α和VEGF表達持續增加，且明顯高于其余兩組。
上述結果表明DMOG可增強跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區HIF-1α和VEGF表達，促進Choke Ⅱ區血管新生，改善皮瓣遠端血液供應，擴大了跨區穿支皮瓣可切取面積，提高了穿支皮瓣成活率。分析其作用機制主要包括以下三方面：第一，DMOG可提高跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α的表達。VEGF是促進血管生成的重要因子之一，可促進血管內皮細胞增殖、分化及遷移等，進而促進血管新生與再通[19-20]。而Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α表達增加為該區血管生成提供了有利條件，改善跨區穿支皮瓣潛在區血液供應，從而擴大跨區穿支皮瓣的可切取面積、提高成活率。第二，DMOG是一種非特異性脯氨酸羥化酶抑制劑，可抑制脯氨酸羥化酶活性，模擬一種相對缺氧環境，抑制HIF-1α的降解，使HIF-1α在細胞內聚集，從而激活下游基因的轉錄與表達，發揮其調節作用[16]。而HIF-1α是促血管生成的主要調控因子，隨細胞內氧濃度變化調控下位基因的表達與轉錄。在有氧條件下HIF-1α不穩定，可經脯氨酸羥化酶羥化啟動泛素-蛋白酶途徑將其水解；在缺氧情況下HIF-1α穩定，可轉移至細胞核內與HIF-1β結合組成異二聚體，再與細胞核內染色體上的順式作用元件相互作用，調控包括VEGF、促紅細胞生成素、血管生成素1等相關基因的轉錄與表達[7，21] ，使上述物質在細胞內積聚增加，更大程度地發揮其促血管生成作用，降低了跨區穿支皮瓣潛在區缺血缺氧損傷。第三，本研究給藥途徑為腹腔注射，相對于灌胃給藥，消除了藥物的首過效應，更有利于藥物吸收，最大限度地發揮藥物作用。
綜上述，DMOG能促進跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區血管生成，增加皮瓣血液供應和灌注，使皮瓣缺血、缺氧得到有效改善，提高了跨區穿支皮瓣的可切取面積和成活率。但本研究應用DMOG干預后僅檢測了皮瓣Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α表達。未來還需進一步研究DMOG可能通過其他相關因子促進血管生成的通路。此外，皮瓣成活是多因素共同作用的結果，本研究僅從促血管生成角度研究對皮瓣成活的影響，其他影響因素還需進一步探索。同時，還需深入研究DMOG的毒副作用，為臨床應用安全性提供實驗依據。
作者貢獻：曾秀安、楊其兵、汪其苑負責資料收集及實驗；曾秀安負責撰寫文章；楊其兵、羅想利、陳永新、李繼東負責數據、圖片收集整理和統計分析；厲孟、藍旭負責研究設計、內容構思、觀點形成、文章結構設計、文章修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經甘肅省人民醫院醫學倫理委員會批準（2021-222）。實驗動物生產許可證號：SCXK（甘）2015-0001；實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0029。
自Koshima等[1]提出“穿支皮瓣”概念以來，跨區穿支皮瓣因可切取面積大、修復效果好、供區損傷小等特點，常被用于皮膚軟組織缺損修復。Cormack等[2]將皮膚血管供區分為解剖區、血流動力學區和潛在區。跨區穿支皮瓣在解剖區和血流動力學區成活相對穩定，在潛在區易發生缺血壞死，限制了在臨床上廣泛應用[3-4]。因此，如何提高跨區穿支皮瓣移植后的成活率仍是需解決的問題。
相鄰血管體之間相互吻合的血管稱為“Choke血管”，該血管對跨區穿支皮瓣的成活極其重要[5]。Xu等[6]在多血管體穿支皮瓣研究中發現存在ChokeⅠ區和Ⅱ區，前者位于解剖區與血流動力學區之間，后者位于血流動力學區與潛在區之間；ChokeⅡ區血管生成減少和血液灌注不足是導致跨區穿支皮瓣壞死的主要原因之一。因此，促進Choke血管生成、改善血液供應等，對跨區穿支皮瓣成活至關重要[7]。
有學者提出通過手術延遲、藥物干預等方式來促進跨區穿支皮瓣血管生成、改善血供[8-9]。然而，手術延遲不僅增加了手術次數和感染風險，還給患者帶來較大創傷。藥物干預具有損傷小、相對安全等優點，逐漸成為研究熱點，并取得一定成果，但藥物作用機制及最佳給藥途徑需進一步研究[10-11]。二甲基乙二酰基甘氨酸（dimethyloxalylglycine，DMOG）是一種非特異性脯氨酸羥化酶抑制劑，可有效抑制脯氨酸羥化酶活性，使缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）積聚，從而激活下游VEGF、紅細胞生成素等基因的表達，繼而促進血管生成[12-13]。研究發現DMOG可促進皮瓣血管生成、改善血供，提高皮瓣成活率[12, 14]。但目前有關DMOG對跨區穿支皮瓣ChokeⅡ區血管生成影響的相關研究較少。本研究以大鼠為模型，觀察腹腔注射DMOG對跨區穿支皮瓣ChokeⅡ區血管生成和皮瓣潛在區成活的影響，探索其作用機制，為臨床采用跨區穿支皮瓣修復大面積皮膚軟組織缺損、提高皮瓣成活率提供治療思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠126只，體質量240～300 g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。DMOG、HIF-1α抑制劑YC-1（Selleck公司，美國）；多克隆抗體HIF-1α、VEGF（Abcam公司，美國）；DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；300 Bloom明膠、水合氯醛（天津市光復精細化工研究所）；PBS緩沖液（蘭州總醫院骨科研究所）；紅色氧化鉛（天津市致遠化學試劑有限公司）；鼠HIF-1α ELISA試劑盒、鼠VEGF ELISA試劑盒（TSZ科技有限公司，美國）；聚偏氟乙烯膜、BCA蛋白定量試劑盒、高效RIPA組織細胞裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉、濾紙、脫敏發光液（北京索來寶科技有限公司）。
熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（伯騰儀器有限公司，美國）；H1650-W臺式微量高速離心機、臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Image J軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 實驗分組及方法
采用隨機數字表法將126只大鼠分為DMOG組、YC-1組、空白對照組，每組42只。3組大鼠參照文獻 ［15］方法制備跨區穿支皮瓣模型。具體步驟：大鼠腹腔注射5%水合氯醛（6 mg/kg）麻醉后，俯臥于操作臺并四肢固定，背部脫毛處理，記號筆標記跨區穿支皮瓣區域12 cm×3 cm。聚維酮碘溶液消毒，鋪無菌單，切開皮膚至深筋膜淺層，沿筋膜層向對側緩慢分離，逐層掀起分離皮瓣，充分暴露髂腰動脈、肋間后動脈、胸背動脈。結扎并切斷肋間后動脈和胸背動脈，保留髂腰動脈為皮瓣穿支血管，獲得以髂腰動脈為蒂的三血管體穿支皮瓣（圖1）。創面徹底結扎止血后，以4-0縫線原位間斷縫合皮緣。
圖1
跨區穿支皮瓣模型制備示意圖
a. 皮瓣設計；b. 島狀皮瓣；c. 切取的皮瓣；d. 皮瓣原位縫合
Figure1. Schematic diagram of flap model preparationa. Flap design; b. Island flap; c. The flap was dissected; d. The flap was sutured in situ
術前1 d、2 h以及術后1、2、3 d，DMOG組腹腔注射2 mL含DMOG（40 mg/kg）的生理鹽水[16]，YC-1組注射2 mL含YC-1（10 mg/kg）的生理鹽水[17-18]，空白對照組給予等量生理鹽水。術后大鼠均單獨飼養并自由覓食、飲水。于術后3、5、7 d 取大鼠同上法麻醉后行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察各組大鼠皮瓣成活情況，包括皮瓣顏色、質地及是否發生壞死。術后7 d各組取6只大鼠，切取整塊皮瓣組織并掀起展開，通過皮瓣透光試驗觀察血管生成情況；使用Image J軟件測量皮瓣成活面積，計算皮瓣成活率，公式為：成活面積/總面積×100%。
1.3.2 血管造影觀察
術后7 d各組取6只大鼠，采用血管造影觀察皮瓣ChokeⅡ區血管生成情況。大鼠仰臥位固定，分離一側頸總動脈以及對側頸內靜脈并用慕絲線標記。將硅膠管留置針置入頸總動脈，排盡大鼠體內血液后注入生理鹽水肝素，直至頸內靜脈流出清亮生理鹽水。然后，將大鼠置于40℃水浴鍋中，將明膠-氧化鉛混合物（50 mL/kg）注入頸總動脈，直至四肢末端出現點狀、斑塊狀顏色時停止灌注。將大鼠置于4℃冰箱，隔日剝離皮瓣，平鋪拍攝X線片，觀察血管生成情況。
1.3.3 組織學觀察
術后7 d各組取6只大鼠，取ChokeⅡ區皮瓣組織，面積2.0 cm×0.6 cm，置于甲醛固定，常規脫水包埋切片，片厚5 μm。每只大鼠取1張切片行HE染色，在低倍鏡下找到血管密集區，再在高倍鏡下選取5個視野，使用Image J軟件計數血管。
1.3.4 免疫組織化學染色觀測
取1.3.3中制作的切片（每只大鼠取1張），置于檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中，用中火微波處理10 min后取出自然冷卻；蒸餾水清洗3次，PBS緩沖液清洗，加入0.01% Triton X-100，37℃孵育10 min；加入3%H2O2，37℃孵育10 min；加入5%牛血清白蛋白，37℃孵育20 min；加入HIF-1α、VEGF一抗（兔多克隆抗體稀釋比為1∶100），4℃冰箱中過夜；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育30 min。取出濕盒加入SABC，37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，甲醛固定，中性樹脂封片。在40×10倍光鏡下觀察HIF-1α、VEGF分布，陽性染色呈棕黃色或黃褐色。
1.3.5 ELISA檢測
術后3、5、7 d，各組分別取6只大鼠ChokeⅡ區皮瓣組織250 mg，加入PBS緩沖液，冰浴下研磨，以離心半徑10 cm，12 000 r/min離心30 min；取上清，參照BCA蛋白定量試劑盒檢測HIF-1α、VEGF蛋白總濃度。
1.3.6 Western blot檢測
術后7 d各組取6只大鼠ChokeⅡ區皮瓣組織蛋白，調節蛋白濃度，凝膠電泳、濕法轉膜，在50 g/L脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，加入小鼠抗大鼠VEGF、HIF-1α一抗（稀釋比1∶300），4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG二抗（稀釋比1∶4 000），室溫孵育2 h。化學發光、顯影，圖像分析系統行灰度掃描分析，以與內參β-actin灰度值比值表示VEGF、HIF-1α蛋白相對表達量。實驗重復3次。
1.4 統計學方法
采用SPSS23.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及血管造影觀察
術后7 d，DMOG組切口愈合良好，皮瓣遠端未見明顯壞死，皮瓣質地較軟、未出現發黑結痂；空白對照組和YC-1組切口愈合欠佳，皮瓣發生壞死且主要位于遠端，皮瓣質地較硬，可見黑色痂皮。見圖2。DMOG組大鼠皮瓣成活率為90.28%±1.37%，高于YC-1組84.28%±1.45%及空白對照組85.83%±1.60%，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。皮瓣透光試驗及血管造影觀察顯示DMOG組皮瓣ChokeⅡ區血管生成較多且結構清晰、完整；YC-1組及空白對照組Choke Ⅱ區血管較少，血管結構紊亂。見圖3、4。
圖2
術后7 d各組皮瓣大體觀察
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure2. Gross observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
圖3
術后7 d透光試驗觀察各組皮瓣血管生成情況
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure3. Flap angiogenesis observed by light transmission test at7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
圖4
術后7 d各組皮瓣血管造影觀察
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure4. Angiography observation of flaps in each group at 7 days after operationa. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
2.2 組織學及免疫組織化學染色觀察
術后7 d，與YC-1組和空白對照組相比，DMOG組血管明顯增多且管腔形態結構較完整（圖5）。DMOG組、YC-1組、空白對照組血管數量分別為（25.56±1.29）、（7.38±0.54）、（14.48±0.91）條/視野。DMOG組高于其余兩組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。
圖5
術后7 d 各組皮瓣HE染色觀察（×200）
a. DMOG組；b. YC-1組；c. 空白對照組
Figure5. HE staining of flaps in each group at 7 days after operation (×200)a. DMOG group; b. YC-1 group; c. Control group
術后7 d，DMOG組皮瓣Choke Ⅱ區HIF-1α、VEGF表達顯著，染色明顯強于YC-1組、空白對照組（圖6）。
圖6
術后7 d各組免疫組織化學染色觀察（×400）
從左至右分別為DMOG組、 YC-1組、空白對照組 a. HIF-1α；b. VEGF
Figure6. Immunohistochemical staining of flaps in each group at 7 days after operation (×400)From left to right for DMOG group, YC-1 group, and Control group a. HIF-1α; b. VEGF
2.3 ELISA檢測
術后3、5、7 d DMOG組皮瓣ChokeⅡ區HIF-1α、VEGF表達量均高于YC-1組、空白對照組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
術后各時間點各組ELISA法檢測HIF-1α及VEGF蛋白表達
a. HIF-1α；b. VEGF
Figure7. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by ELISA at each time point after operationa. HIF-1α; b. VEGF
2.4 Western blot檢測
術后7 d ，DMOG組HIF-1α、VEGF蛋白相對表達量均高于空白對照組和YC-1組，空白對照組高于YC-1組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
術后7 d Western blot檢測HIF-1α、VEGF蛋白表達
a. 電泳圖 1～3： DMOG組 4～6：YC-1組 7～9：空白對照組； b. 蛋白相對表達量
Figure8. HIF-1α and VEGF protein expressions detected by Western blot at 7 days after operationa. Electropherogram 1-3: DMOG group 4-6: YC-1 group 7-9: Control group; b. Relative protein expressions
3 討論
既往有研究采用不同干預方式促進皮瓣血管生成，提高皮瓣成活率。陶先耀等[12]通過腹腔注射DMOG預處理來影響大鼠跨區穿支皮瓣成活及閉塞區血管生成，發現DMOG可提高皮瓣VEGF表達，促進跨區穿支皮瓣閉塞區血管生成，進而改善皮瓣血供。習珊珊等[14]研究發現通過尾靜脈注射DMOG能改善大鼠跨區皮瓣血管體區微循環，減輕皮瓣缺血及缺氧程度，提高皮瓣成活率。上述研究僅探索了DMOG處理后對皮瓣血管生成的影響，未對跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區血管生成的作用機制進行深入研究，為此我們進行了本次研究。研究結果顯示DMOG組皮瓣成活面積明顯大于YC-1組和空白對照組；HE染色及明膠-氧化鉛血管造影觀察見DMOG組Choke Ⅱ區血管結構清晰完整，血管數量明顯多于其余兩組；ELISA檢測示DMOG組中HIF-1α和VEGF表達持續增加，且明顯高于其余兩組。
上述結果表明DMOG可增強跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區HIF-1α和VEGF表達，促進Choke Ⅱ區血管新生，改善皮瓣遠端血液供應，擴大了跨區穿支皮瓣可切取面積，提高了穿支皮瓣成活率。分析其作用機制主要包括以下三方面：第一，DMOG可提高跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α的表達。VEGF是促進血管生成的重要因子之一，可促進血管內皮細胞增殖、分化及遷移等，進而促進血管新生與再通[19-20]。而Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α表達增加為該區血管生成提供了有利條件，改善跨區穿支皮瓣潛在區血液供應，從而擴大跨區穿支皮瓣的可切取面積、提高成活率。第二，DMOG是一種非特異性脯氨酸羥化酶抑制劑，可抑制脯氨酸羥化酶活性，模擬一種相對缺氧環境，抑制HIF-1α的降解，使HIF-1α在細胞內聚集，從而激活下游基因的轉錄與表達，發揮其調節作用[16]。而HIF-1α是促血管生成的主要調控因子，隨細胞內氧濃度變化調控下位基因的表達與轉錄。在有氧條件下HIF-1α不穩定，可經脯氨酸羥化酶羥化啟動泛素-蛋白酶途徑將其水解；在缺氧情況下HIF-1α穩定，可轉移至細胞核內與HIF-1β結合組成異二聚體，再與細胞核內染色體上的順式作用元件相互作用，調控包括VEGF、促紅細胞生成素、血管生成素1等相關基因的轉錄與表達[7，21] ，使上述物質在細胞內積聚增加，更大程度地發揮其促血管生成作用，降低了跨區穿支皮瓣潛在區缺血缺氧損傷。第三，本研究給藥途徑為腹腔注射，相對于灌胃給藥，消除了藥物的首過效應，更有利于藥物吸收，最大限度地發揮藥物作用。
綜上述，DMOG能促進跨區穿支皮瓣Choke Ⅱ區血管生成，增加皮瓣血液供應和灌注，使皮瓣缺血、缺氧得到有效改善，提高了跨區穿支皮瓣的可切取面積和成活率。但本研究應用DMOG干預后僅檢測了皮瓣Choke Ⅱ區VEGF、HIF-1α表達。未來還需進一步研究DMOG可能通過其他相關因子促進血管生成的通路。此外，皮瓣成活是多因素共同作用的結果，本研究僅從促血管生成角度研究對皮瓣成活的影響，其他影響因素還需進一步探索。同時，還需深入研究DMOG的毒副作用，為臨床應用安全性提供實驗依據。
作者貢獻：曾秀安、楊其兵、汪其苑負責資料收集及實驗；曾秀安負責撰寫文章；楊其兵、羅想利、陳永新、李繼東負責數據、圖片收集整理和統計分析；厲孟、藍旭負責研究設計、內容構思、觀點形成、文章結構設計、文章修改，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經甘肅省人民醫院醫學倫理委員會批準（2021-222）。實驗動物生產許可證號：SCXK（甘）2015-0001；實驗動物使用許可證號：SYXK（軍）2012-0029。
