引用本文： 段克友, 官建中. 外泌體在骨質疏松癥治療中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(12): 1642-1649. doi: 10.7507/1002-1892.202105106 復制
骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是臨床常見慢性疾病，以骨量減少、骨脆性增加及骨微結構破壞為主要特征[1]。目前，OP 治療存在治療效果欠佳、副作用明顯、無法改善成骨細胞增殖分化、難以逆轉 OP 進程等問題[2]。有學者基于組織工程技術探索了干細胞移植治療 OP 的可行性，結果顯示干細胞移植雖能顯著增加 OP 小鼠成骨能力，但仍存在免疫排斥反應、細胞惡變風險增加、干細胞歸巢障礙等諸多難題[3]。因此，目前需要尋找一種在靶向促進骨組織再生同時，又能最大限度減少長期藥物暴露所帶來潛在危害的治療方法。
外泌體（exosomes，EXOs）是一種由細胞分泌到胞外的納米級囊泡微粒，具有與來源細胞相似的生物學活性，在細胞間通訊過程中扮演著重要角色[4]。研究發現多種細胞來源的 EXOs 參與了骨代謝過程中骨相關細胞增殖分化的調控，并具有穩定性高、無免疫原性及靶向能力強等優勢，彌補了傳統藥物及干細胞療法的不足[5-7]。隨著一些基于 EXOs 的臨床試驗在胰腺癌、腎移植等非成骨領域的開展，研究人員發現工程化改造后的成纖維樣 MSCs 來源的 EXOs 可直接靶向鼠肉瘤病毒致癌基因，抑制腫瘤細胞生長，并顯著提高胰腺癌小鼠生存率；濾泡輔助性 T 細胞來源的 EXOs 可以促進 B 細胞增殖分化，并在腎移植后抗體介導性排斥反應的發生中起重要作用[8-10]。基于此，研究人員開始關注 EXOs 能否成為治療 OP 的新型生物制劑。現對不同細胞來源 EXOs 在 OP 治療中的研究進展進行綜述，以期為后續研究提供參考。
1 EXOs 生物學特性
1.1 EXOs 結構及組成
EXOs 是一種與親代細胞具有相同拓撲結構的單膜囊泡，直徑為 40～100 nm，密度為 1.13～1.19 g/mL，呈球形或杯形[11]。EXOs 廣泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中，包含蛋白質、脂質、miRNA、mRNA、細胞因子等多種生物活性物質[4,12-13]。生理狀態下，EXOs 可通過協助生物分子的細胞間轉運改變受體細胞的生物學效應，并在細胞通訊中發揮重要作用，同時其獨特的脂質雙分子層結構可避免內部生物分子被胞外酶降解。
盡管 EXOs 中不包含細胞核、線粒體、內質網和高爾基體來源的蛋白質，但仍發現超過 4 400 種蛋白質，其中包括眾多跨膜蛋白（CD9、CD82、CD81、CD63 等）、膜轉運及融合蛋白，以及其他外圍相關膜蛋白和囊腔內的可溶性蛋白[14-15]。不同細胞來源的 EXOs 亦可攜帶特異性蛋白質，如抗原提呈細胞來源的 EXOs 富含 MHCⅡ類蛋白和共刺激蛋白、T 細胞來源的 EXOs 攜帶 CD3 分子，這類蛋白質在機體不同生理病理條件下的表達存在差異，具備作為生物學標志物的潛力，對疾病的早期診斷及干預有重要意義[16]。
EXOs 中還有 miRNA、mRNA 和 lncRNA 等多種形式的核酸，可通過傳遞遺傳信息影響受體細胞的生物學功能，如 mRNA 可在受體細胞內翻譯相應蛋白質；miRNA 可降解或抑制 mRNA 的表達，進而影響蛋白質的組成；lncRNA 則通過 RNA-RNA 或 RNA-DNA 間相互作用，調節 RNA 和蛋白質在受體細胞內的表達，參與骨重建過程[17-18]。
此外，EXOs 還含有磷脂酰膽堿、神經酰胺、膽固醇和鞘磷脂等多種脂質化合物，與眾多生物分子共同參與細胞間信號傳遞，并在免疫調節和抑制炎癥反應方面發揮重要作用[13]。
1.2 EXOs 的形成及其在骨重建中的作用
目前普遍認為 EXOs 是來源于胞內體途徑的納米級細胞外囊泡，是多泡體與質膜融合的結果。EXOs 的形成過程包括：① 液體及細胞外成分通過質膜內陷和內吞作用進入細胞，由此產生含有細胞表面蛋白和胞外可溶性蛋白的杯形或球形結構，促使早期核內體及晚期核內體的形成。② 晚期核內體再次內陷產生包含管腔內囊泡的細胞內多泡體，細胞質中多種成分在這一階段進入囊泡。③ 成熟后的多泡體一部分與自噬體融合，被溶酶體降解；另一部分通過細胞骨架和微管網絡轉運系統與質膜結合后釋放出 EXOs[12, 19]。
骨重建是持續終身的連續性過程。人體正常骨重建進程中，成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收始終處于動態平衡狀態，以維持骨代謝中的礦物質穩態[20]。但在絕經、衰老、制動等因素影響下，這種平衡狀態被打破，骨吸收大于骨形成，引起骨量減少、OP 等疾病[21-22]。骨重建進程的調控極其復雜，除需要 MSCs、成骨細胞、破骨細胞等細胞參與外，還需一系列細胞因子及分子的參與，其中 EXOs 在骨重建進程的調控中發揮重要作用。EXOs 通過胞吐作用被細胞釋放到胞外后，可經旁分泌及內分泌途徑與骨微環境中的靶細胞結合，激活胞內相關信號通路，進而逆轉 OP 中骨重建進程的動態失衡[23]。EXOs 與靶細胞結合的方式包括：① EXOs 表面配體與靶細胞表面受體特異性結合，產生信號復合體并激活細胞內信號通路；② EXOs 通過質膜融合或直接胞吞作用，將其攜帶的生物活性物質遞送至靶細胞內，激活胞內相關信號通路，從而改變受體細胞的生物學功能[24]。見圖1。
圖1
EXOs 的形成及其在骨重建中的作用
Figure1.
The formation of EXOs and its role in bone remodeling
2 不同細胞來源 EXOs 與OP
2.1 BMSCs
隨著年齡增長，人體內 BMSCs 成骨定向分化能力下降的同時，常伴隨著脂肪細胞分化傾向增強，這種轉換失衡可導致成骨能力下降及骨髓脂肪組織的蓄積，被認為是 OP 發生發展的重要原因[25]。研究顯示 BMSCs 來源 EXOs（BMSCs-EXOs）可以靶向內源性 MSCs，在促進成骨分化和血管化的同時抑制成脂分化，進而逆轉成骨-成脂間的轉換失衡，恢復 OP 小鼠丟失的骨量[6]。Zuo 等[4]在 BMSCs-EXOs 治療輻射誘導的 OP 研究中也發現了相似作用，此外 EXOs 處理后的 BMSCs 表現出了 DNA 損傷修復加速、增殖抑制減弱、氧化應激降低及細胞衰老相關蛋白表達降低等特點。Zuo 等指出 Wnt/β-catenin 途徑是抑制 BMSCs 成脂基因表達、恢復成骨細胞增殖分化的重要信號機制。除 Wnt 通路外，有研究將 BMSCs-EXOs 與成骨細胞共培養后發現，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路相關蛋白表達增加，且細胞周期 S 期比例顯著升高，表明 BMSCs-EXOs 可通過激活 MAPK 信號通路促進成骨細胞增殖，進而改善 OP癥狀[26]。
既往研究表明，BMSCs-EXOs 中 miRNA 的表達在骨代謝調節過程中存在差異，如 miR-218、let-7a、miR-135b、miR-148a、miR-299-5p、miR-219、miR-135b、miR-302b、miR-299-5p 在成骨細胞增殖分化過程中表達顯著上調，而 miR-155、miR-320c、miR-885-5p、miR-181a、miR-221 表達顯著下調，揭示了 miRNA 可能是 OP 治療的潛在靶點[27]。隨著研究的深入，近期發現 miR-935、miR-188、miR-27a-3p、miR-144、miR-187-5p、miR-214-3p、miR-1297等 miRNA，在靶向調解成骨細胞增殖分化及成骨相關轉錄因子表達方面同樣發揮重要作用。其中 miR-144 可通過 Wnt 信號通路下調分泌型卷曲相關蛋白 1 表達，進而促進 BMSCs 增殖及誘導成骨細胞分化[28]；miR-27a-3p 和 miR-935 分別通過靶向下調轉錄激活因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）、信號轉導與轉錄激活因子 1 表達促進骨形成，從而改善 OP 癥狀[29-30]；miR-1297 則可靶向阻斷 Wnt 信號通路，從而降低成骨相關轉錄因子 Runx2、Osterix 的表達，抑制成骨細胞分化，加速 OP 的進展[31]。另有研究闡明了 lncRNA 在 OP 中的作用，結果顯示肺腺癌轉移相關轉錄產物 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）可使 miR-34c 海綿化，并促進富含 AT 序列特異性結合蛋白 2（special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）的表達；同時，MALAT1、miR-34c 的成骨作用可分別被 miR-34c 和 SATB2 逆轉，表明 MALAT1 是通過調節 miR-34c/SATB2 軸增強 OP 小鼠的成骨細胞活性[32]。
綜上述，BMSCs-EXOs 參與調控骨相關細胞增殖分化、促進血管再生及免疫調節、抑制炎癥反應等過程，已成為骨再生醫學和免疫學中最主要的 EXOs 來源。以上研究均揭示了 BMSCs-EXOs 介導骨細胞微環境中各細胞間的交流模式及骨重建機制，其中以 miRNA 研究最為廣泛，而關于 lncRNA、siRNA 等在骨重建進程中扮演何種角色仍需進一步探索。
2.2 破骨細胞
破骨細胞來源 EXOs（EXOs derived from osteoclasts，OC-EXOs）調控成骨細胞-破骨細胞間通訊及骨重建過程的作用機制仍不明確。Huynh 等[33]研究發現，破骨細胞前體來源的 EXOs 具有促進破骨細胞成熟分化的作用；而富含 NK-κB 受體活化因子（receptor activator of NK-κB，RANK）的成熟 OC-EXOs 可競爭性抑制破骨細胞表面 RANK 與其配體 RANKL 的結合，進而阻斷破骨細胞中 RANK 信號通路，抑制破骨細胞形成，當 EXOs 中富含的 RANK 被消耗后，EXOs 介導的抑制破骨細胞形成作用隨之減弱，表明 OC-EXOs 是破骨細胞旁分泌的重要調解因子。Li 等[34]進一步闡明了 OC-EXOs 與成骨細胞間通訊的相關性，研究發現破骨細胞特異性 miR-214-3p 轉基因小鼠的血清 EXOs 中 的miR-214-3p 水平升高、成骨相關基因表達下調，小鼠骨密度及骨小梁數量明顯降低，提示 miR-214-3p 可能是參與成骨細胞-破骨細胞通訊的重要信使。后續研究對可能存在的分子機制進行了闡明，Zhao 等[35]發現 miR-214-3p 的促破骨細胞生成作用是通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物（Pten），進而激活 PI3K/Akt 信號通路實現的。而 miR-214-3p 的成骨抑制作用則依賴 EphrinA2/EphA2 介導的成骨細胞-破骨細胞相互作用；研究還指出，miR-214-3p 和 EphrinA2 水平在 OP 患者及 OP 小鼠模型血清中均顯著升高，可作為 OP 診斷及治療的潛在靶點[36]。
以上研究揭示了成骨細胞-破骨細胞間通訊的一種新機制，然而隨著越來越多的生物分子在 OC-EXOs 中被發現，成骨細胞-破骨細胞間是否存在其他信號通路及如何用于 OP 的治療仍需進一步探索。
2.3 成骨細胞
成骨細胞來源于具有多向分化潛力的 BMSCs，在骨基質合成、分泌和礦化過程中起關鍵作用。目前普遍認為成骨細胞來源 EXOs（EXOs derived from osteoblasts，OB-EXOs）在維持骨重建穩態及成骨細胞-破骨細胞通訊中發揮重要作用。Wei 等[37]發現成骨細胞在不同階段分泌的 EXOs 對 BMSCs 成骨分化作用存在差異性，其中中晚期分泌的 EXOs 可顯著促進 BMSCs 成骨分化作用，并顯示出了極高的骨靶向潛力。此過程中 BMSCs 內的 miRNA 表達譜發生改變，進一步分析這些 miRNA 的靶基因及信號通路，發現 OB-EXOs 的促成骨作用可能是軸抑制蛋白 1 下調和 β-catenin 上調，進而激活 Wnt 信號通路的結果；另外，包含 miR-431-5p、miR-221-5p、miR-710、miR-140-3p 和 let-7 在內的 43 種 miRNA 在 MC3T3-E1（一種成骨細胞系）源性 EXOs 中高度表達，參與了成骨細胞分化和骨重建的多種途徑，如 Wnt、胰島素、TGF-β 和鈣信號通路[38]。另有研究指出，富含 RANKL 的 OB-EXOs 可通過 RANKL-RANK 相互作用激活破骨細胞前體中 RANK 通路，促進破骨細胞形成；而應用骨保護素可抑制 RANK 與其配體結合，進一步驗證了 OB-EXOs 的促破骨細胞形成作用[39]。
2.4 骨細胞
骨細胞可通過感知全身或局部刺激、分泌各種細胞因子及信號分子調控成骨細胞和破骨細胞功能，其來源的細胞外囊泡中含有大量成骨因子，可顯著增強 BMSCs 定向募集及成骨作用，機械刺激可促進骨細胞細胞外囊泡的產生及釋放，而阻斷 Ca2+ 信號通路后，細胞外囊泡生成減少，骨組織再生能力下降，提示 Ca2+ 信號通路在細胞外囊泡的形成中發揮重要作用[40]。有研究在經肌肉生長抑制素處理的骨細胞所釋放的 EXOs 中，發現 miR-218 表達顯著下調，被成骨細胞內吞后，可通過 Wnt 信號通路下調 Runx2 表達，從而抑制成骨細胞分化，而破骨細胞內吞此類 EXOs 后其活性并無明顯變化[41]，表明 miR-218 可靶向促進成骨細胞活性，參與肌肉-骨骼間信號交流，或可作為 OP 的潛在治療靶點。除 miR-218 外，Sato 等[42]首次指出骨細胞減少的小鼠血漿 EXOs 中有 miR-3473a、miR-6244、miR-5621-5p 和 miR-6239 等 12 個 miRNA 水平顯著降低，提示血液循環可能是含有特異性 miRNA 的骨細胞源性 EXOs 發揮生物學作用的主要途徑。此外，攜帶 miR-124-3p 的骨細胞源性 EXOs 在高糖條件下可靶向抑制成骨細胞半乳糖凝集素 3 的表達，進而減少糖尿病性牙周炎小鼠牙周骨量[43]，而相關作用機制在糖尿病性 OP 的治療中是否同樣適用仍需進一步實驗驗證。
2.5 巨噬細胞
Xiong 等[44]的一項關于巨噬細胞源性 EXOs 研究指出，富含 miR-5106 的 M2 型巨噬細胞源性EXOs（EXOs derived from M2 macrophagy，M2-EXOs）可通過靶向鹽誘導激酶 2（salt-inducible kinase 2，SIK2）及 SIK3 基因促進 BMSCs 成骨分化，加速骨折愈合進程；與 M2-EXOs 相比，miR-5106 在 M1-EXOs 中的表達明顯降低，提示 M1-EXOs 可能具有更強成骨作用。矛盾的是，Xia 等[45]將 BMSCs 分別與 M0-EXOs、M1-EXOs 及 M2-EXOs 共培養后發現，M1-EXOs 反而具有更強的促進 BMSCs 增殖、成骨和成脂分化作用，表明巨噬細胞源性 EXOs 中存在 miR-5106 以外未知的骨代謝調控因子。進一步蛋白組學分析顯示，巨噬細胞源性 EXOs 中諸多內源性因子均可調控骨重建過程，如半乳糖凝集素可顯著增強 BMSCs 的成骨分化能力；膜聯蛋白 2 則可通過 MAPK 途徑刺激 RANKL 表達，從而加快破骨細胞介導的骨吸收進程[46-47]。巨噬細胞源性 EXOs 表現出了巨大的骨再生潛力，但目前相關研究報道較少，具體作用機制尚不清楚，明確此類 EXOs 中關鍵信號機制及調控因素，可能成為治療 OP 的一種新型策略。
2.6 內皮細胞
內皮細胞來源EXOs（EXOs derived from endothelial cells，EC-EXOs）及內皮祖細胞來源EXOs（EXOs derived from endothelial progenitor cells，EPC-EXOs）在調解骨重建進程、維持骨代謝平衡、改善 OP 癥狀中的作用已被證實。例如，EPC-EXOs 內的 miR-126 可通過下調 SPRED1 表達并激活 Raf/ERK 信號通路刺激血管及骨組織再生，縮短骨缺損修復時間[48]；EC-EXOs 內的 miR-155 可靶向抑制 Spi1、Mitf、Socs1 的表達，從而抑制骨髓巨噬細胞的激活及破骨細胞分化；進一步實驗證實尾靜脈注射 EC-EXOs 可治療 OP 小鼠模型，這種治療作用可被 miR-155 抑制劑逆轉，表明 EC-EXOs 可通過上調 miR-155 來抑制破骨細胞分化，影響 OP 進程[7]；值得注意的是，與 OB-EXOs 和 BMSCs-EXOs 相比，EC-EXOs 展現出了更強的骨靶向特性，獨特的骨靶向能力與其表面高表達的妊娠帶蛋白有關[7]。因此，依托內皮細胞獨特的骨靶向優勢，憑借 EXOs 自身優良的載藥特性，合成 EC-EXOs-成骨藥物獨特內源性復合體，直達疾病靶標，從而解決臨床給藥普遍存在的生物清除率高、半衰期短等問題，提高療效的同時減少不良反應，有望為 OP 治療提供新思路和方法。
2.7 人誘導多能干細胞
有研究將人誘導多能干細胞來源 MSCs 分泌的EXOs（EXOs secreted by MSCs derived from human induced pluripotent stem cells，hiPSC-MSC-EXOs）與 BMSCs 進行共培養后發現，BMSCs 的ALP 活性增強，成骨相關基因和蛋白表達上調，證明 hiPSC-MSC-EXOs 對 BMSCs增殖及成骨分化具有正向調控作用[49]。另有研究將 hiPSC-MSC-EXOs 與生物相容性好及具有骨傳導性的 β-磷酸三鈣制備復合支架，發現該支架在通過 PI3K/Akt 信號通路促進 BMSCs 成骨分化、加速骨缺損修復的同時，還能增加血管化區域，促進新生血管形成，且這種生物學效應隨 hiPSC-MSC-EXOs 濃度增加而增加[50]。
2.8 人臍帶 MSCs
近期研究表明，人臍帶 MSCs 來源EXOs（EXOs derived from human umbilical cord MSCs，hUMSC-EXOs）中的 C 型凝集素域家族 11A 可促進 BMSCs 成骨分化，抑制破骨細胞形成，從而減少 OP 小鼠骨吸收及骨髓脂肪累積，維持骨強度[51]。為進一步探索分子機制，Yang 等[52]對 OP 小鼠模型研究發現，hUMSC-EXOs 內的 miR-1263 可與 Mob1 的 3’ 非編碼區特異性結合，在下調 Mob1 表達的同時激活 YAP（Hipo 信號通路的關鍵調節劑）表達，從而抑制 Hipo 信號通路介導的 BMSCs 凋亡效應，逆轉 OP 進程；而敲除 miR-1263 后，BMSCs 凋亡增加，成骨作用隨之減弱，表明 hUMSC-EXOs 可通過 miR-1263/Mob1/Hipo 信號通路參與 BMSCs 凋亡的調解及 OP 的病理生理過程。
2.9 脂肪 MSCs
已有研究證實，脂肪 MSCs 來源EXOs（EXOs derived from adipose-derived MSCs，ADSCs-EXOs）可通過抑制破骨細胞中 NLRP3 炎癥小體的激活，逆轉破骨細胞介導的骨吸收進程，對糖尿病性 OP 小鼠具有良好的治療作用[53]。同時，此類 EXOs 還可上調 Bcl-2/Bax 表達，減少活性氧和細胞色素 c 的產生，在抑制骨細胞凋亡同時，降低 RANKL 在基因和蛋白水平的表達，導致骨細胞介導的破骨細胞生成受阻[54]。作為新興領域，目前研究主要涉及此類 EXOs 對破骨細胞生物學功能的調解，仍缺乏其對成骨細胞、BMSCs 等骨相關細胞作用的報道。
不同細胞來源 EXOs 在骨重建進程中的作用機制詳見表1。
表1
不同細胞來源 EXOs 在骨重建進程中的作用機制
Table1.
Mechanism of EXOs derived from different cells in bone remodeling
3 EXOs 作為 OP 治療靶點的優勢及可行性
EXOs 作為一種天然的內源性納米載體，可通過受體介導的內吞作用參與骨重建過程中各細胞間的信息交流[12]。與一般納米載體相比，EXOs 可將納米顆粒大小與無細胞毒性、低免疫原性、高靶向特異性及高載藥量等優勢相結合，為基因、抗OP藥物的轉運開辟了一條新途徑[55]。除自然分泌的 EXOs 外，一些基于基因工程技術將靶向肽或適配體定位到 EXOs 外膜的研究發現，工程化改造后的 EXOs 在減少藥物肝臟和肺部蓄積、提高生物利用度的同時，展現出了極高的細胞靶向特異性及跨膜傳遞效率[56]。同時，EXOs 可作用于 OP 發病機制中的多個環節及靶點，并已在 OP 動物模型中取得良好的治療效果，為 EXOs 的臨床轉化提供理論依據[4, 7, 28-29]；此外，相關 EXOs 均可通過微創方式從健康捐贈者骨髓及血清中分離獲取，低溫環境下保存方便，性質穩定，且不表達細胞表面的主要組織相容性復合體，不易發生免疫排斥反應，體內半衰期長，安全性更高[13, 57]。值得重視的是，EXOs 作為潛在的生物標志物在OP早期診斷、臨床干預和預后評估方面同樣具有良好應用前景[36, 58]。
4 總結與展望
不同細胞來源 EXOs 對于 OP 的作用機制主要涉及各種信號傳導通路的激活及基因表達的調控，從而調解免疫原性系統，影響骨重建進程中成骨細胞、破骨細胞及血管內皮細胞等的生物學功能，而具體哪種細胞來源的 EXOs 更適合作為 OP 治療的新型生物制劑，仍需要綜合 EXOs 產量、成骨能力等多方面因素予以分析。盡管一些基于 EXOs 的實驗研究在 OP 動物模型中取得了良好效果，但目前仍缺乏臨床應用的報道，其安全性及有效性仍需進一步評估。此外，EXOs 內諸多物質的功能尚不明確，且對已知信號通路背后的具體分子機制的研究仍處于初始階段。EXOs 的臨床轉化仍需注重改善提取方式、明確治療有效劑量、提高靶向性及安全性等。
作者貢獻：段克友負責查閱文獻、整理數據和論文撰寫；官建中對文章修改提出建設性意見，負責審閱并參與觀點形成。
利益沖突：所有作者聲明，在文章撰寫過程中不存在利益沖突。
骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是臨床常見慢性疾病，以骨量減少、骨脆性增加及骨微結構破壞為主要特征[1]。目前，OP 治療存在治療效果欠佳、副作用明顯、無法改善成骨細胞增殖分化、難以逆轉 OP 進程等問題[2]。有學者基于組織工程技術探索了干細胞移植治療 OP 的可行性，結果顯示干細胞移植雖能顯著增加 OP 小鼠成骨能力，但仍存在免疫排斥反應、細胞惡變風險增加、干細胞歸巢障礙等諸多難題[3]。因此，目前需要尋找一種在靶向促進骨組織再生同時，又能最大限度減少長期藥物暴露所帶來潛在危害的治療方法。
外泌體（exosomes，EXOs）是一種由細胞分泌到胞外的納米級囊泡微粒，具有與來源細胞相似的生物學活性，在細胞間通訊過程中扮演著重要角色[4]。研究發現多種細胞來源的 EXOs 參與了骨代謝過程中骨相關細胞增殖分化的調控，并具有穩定性高、無免疫原性及靶向能力強等優勢，彌補了傳統藥物及干細胞療法的不足[5-7]。隨著一些基于 EXOs 的臨床試驗在胰腺癌、腎移植等非成骨領域的開展，研究人員發現工程化改造后的成纖維樣 MSCs 來源的 EXOs 可直接靶向鼠肉瘤病毒致癌基因，抑制腫瘤細胞生長，并顯著提高胰腺癌小鼠生存率；濾泡輔助性 T 細胞來源的 EXOs 可以促進 B 細胞增殖分化，并在腎移植后抗體介導性排斥反應的發生中起重要作用[8-10]。基于此，研究人員開始關注 EXOs 能否成為治療 OP 的新型生物制劑。現對不同細胞來源 EXOs 在 OP 治療中的研究進展進行綜述，以期為后續研究提供參考。
1 EXOs 生物學特性
1.1 EXOs 結構及組成
EXOs 是一種與親代細胞具有相同拓撲結構的單膜囊泡，直徑為 40～100 nm，密度為 1.13～1.19 g/mL，呈球形或杯形[11]。EXOs 廣泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中，包含蛋白質、脂質、miRNA、mRNA、細胞因子等多種生物活性物質[4,12-13]。生理狀態下，EXOs 可通過協助生物分子的細胞間轉運改變受體細胞的生物學效應，并在細胞通訊中發揮重要作用，同時其獨特的脂質雙分子層結構可避免內部生物分子被胞外酶降解。
盡管 EXOs 中不包含細胞核、線粒體、內質網和高爾基體來源的蛋白質，但仍發現超過 4 400 種蛋白質，其中包括眾多跨膜蛋白（CD9、CD82、CD81、CD63 等）、膜轉運及融合蛋白，以及其他外圍相關膜蛋白和囊腔內的可溶性蛋白[14-15]。不同細胞來源的 EXOs 亦可攜帶特異性蛋白質，如抗原提呈細胞來源的 EXOs 富含 MHCⅡ類蛋白和共刺激蛋白、T 細胞來源的 EXOs 攜帶 CD3 分子，這類蛋白質在機體不同生理病理條件下的表達存在差異，具備作為生物學標志物的潛力，對疾病的早期診斷及干預有重要意義[16]。
EXOs 中還有 miRNA、mRNA 和 lncRNA 等多種形式的核酸，可通過傳遞遺傳信息影響受體細胞的生物學功能，如 mRNA 可在受體細胞內翻譯相應蛋白質；miRNA 可降解或抑制 mRNA 的表達，進而影響蛋白質的組成；lncRNA 則通過 RNA-RNA 或 RNA-DNA 間相互作用，調節 RNA 和蛋白質在受體細胞內的表達，參與骨重建過程[17-18]。
此外，EXOs 還含有磷脂酰膽堿、神經酰胺、膽固醇和鞘磷脂等多種脂質化合物，與眾多生物分子共同參與細胞間信號傳遞，并在免疫調節和抑制炎癥反應方面發揮重要作用[13]。
1.2 EXOs 的形成及其在骨重建中的作用
目前普遍認為 EXOs 是來源于胞內體途徑的納米級細胞外囊泡，是多泡體與質膜融合的結果。EXOs 的形成過程包括：① 液體及細胞外成分通過質膜內陷和內吞作用進入細胞，由此產生含有細胞表面蛋白和胞外可溶性蛋白的杯形或球形結構，促使早期核內體及晚期核內體的形成。② 晚期核內體再次內陷產生包含管腔內囊泡的細胞內多泡體，細胞質中多種成分在這一階段進入囊泡。③ 成熟后的多泡體一部分與自噬體融合，被溶酶體降解；另一部分通過細胞骨架和微管網絡轉運系統與質膜結合后釋放出 EXOs[12, 19]。
骨重建是持續終身的連續性過程。人體正常骨重建進程中，成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收始終處于動態平衡狀態，以維持骨代謝中的礦物質穩態[20]。但在絕經、衰老、制動等因素影響下，這種平衡狀態被打破，骨吸收大于骨形成，引起骨量減少、OP 等疾病[21-22]。骨重建進程的調控極其復雜，除需要 MSCs、成骨細胞、破骨細胞等細胞參與外，還需一系列細胞因子及分子的參與，其中 EXOs 在骨重建進程的調控中發揮重要作用。EXOs 通過胞吐作用被細胞釋放到胞外后，可經旁分泌及內分泌途徑與骨微環境中的靶細胞結合，激活胞內相關信號通路，進而逆轉 OP 中骨重建進程的動態失衡[23]。EXOs 與靶細胞結合的方式包括：① EXOs 表面配體與靶細胞表面受體特異性結合，產生信號復合體并激活細胞內信號通路；② EXOs 通過質膜融合或直接胞吞作用，將其攜帶的生物活性物質遞送至靶細胞內，激活胞內相關信號通路，從而改變受體細胞的生物學功能[24]。見圖1。
圖1
EXOs 的形成及其在骨重建中的作用
Figure1.
The formation of EXOs and its role in bone remodeling
2 不同細胞來源 EXOs 與OP
2.1 BMSCs
隨著年齡增長，人體內 BMSCs 成骨定向分化能力下降的同時，常伴隨著脂肪細胞分化傾向增強，這種轉換失衡可導致成骨能力下降及骨髓脂肪組織的蓄積，被認為是 OP 發生發展的重要原因[25]。研究顯示 BMSCs 來源 EXOs（BMSCs-EXOs）可以靶向內源性 MSCs，在促進成骨分化和血管化的同時抑制成脂分化，進而逆轉成骨-成脂間的轉換失衡，恢復 OP 小鼠丟失的骨量[6]。Zuo 等[4]在 BMSCs-EXOs 治療輻射誘導的 OP 研究中也發現了相似作用，此外 EXOs 處理后的 BMSCs 表現出了 DNA 損傷修復加速、增殖抑制減弱、氧化應激降低及細胞衰老相關蛋白表達降低等特點。Zuo 等指出 Wnt/β-catenin 途徑是抑制 BMSCs 成脂基因表達、恢復成骨細胞增殖分化的重要信號機制。除 Wnt 通路外，有研究將 BMSCs-EXOs 與成骨細胞共培養后發現，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路相關蛋白表達增加，且細胞周期 S 期比例顯著升高，表明 BMSCs-EXOs 可通過激活 MAPK 信號通路促進成骨細胞增殖，進而改善 OP癥狀[26]。
既往研究表明，BMSCs-EXOs 中 miRNA 的表達在骨代謝調節過程中存在差異，如 miR-218、let-7a、miR-135b、miR-148a、miR-299-5p、miR-219、miR-135b、miR-302b、miR-299-5p 在成骨細胞增殖分化過程中表達顯著上調，而 miR-155、miR-320c、miR-885-5p、miR-181a、miR-221 表達顯著下調，揭示了 miRNA 可能是 OP 治療的潛在靶點[27]。隨著研究的深入，近期發現 miR-935、miR-188、miR-27a-3p、miR-144、miR-187-5p、miR-214-3p、miR-1297等 miRNA，在靶向調解成骨細胞增殖分化及成骨相關轉錄因子表達方面同樣發揮重要作用。其中 miR-144 可通過 Wnt 信號通路下調分泌型卷曲相關蛋白 1 表達，進而促進 BMSCs 增殖及誘導成骨細胞分化[28]；miR-27a-3p 和 miR-935 分別通過靶向下調轉錄激活因子 3（activating transcription factor 3，ATF3）、信號轉導與轉錄激活因子 1 表達促進骨形成，從而改善 OP 癥狀[29-30]；miR-1297 則可靶向阻斷 Wnt 信號通路，從而降低成骨相關轉錄因子 Runx2、Osterix 的表達，抑制成骨細胞分化，加速 OP 的進展[31]。另有研究闡明了 lncRNA 在 OP 中的作用，結果顯示肺腺癌轉移相關轉錄產物 1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）可使 miR-34c 海綿化，并促進富含 AT 序列特異性結合蛋白 2（special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）的表達；同時，MALAT1、miR-34c 的成骨作用可分別被 miR-34c 和 SATB2 逆轉，表明 MALAT1 是通過調節 miR-34c/SATB2 軸增強 OP 小鼠的成骨細胞活性[32]。
綜上述，BMSCs-EXOs 參與調控骨相關細胞增殖分化、促進血管再生及免疫調節、抑制炎癥反應等過程，已成為骨再生醫學和免疫學中最主要的 EXOs 來源。以上研究均揭示了 BMSCs-EXOs 介導骨細胞微環境中各細胞間的交流模式及骨重建機制，其中以 miRNA 研究最為廣泛，而關于 lncRNA、siRNA 等在骨重建進程中扮演何種角色仍需進一步探索。
2.2 破骨細胞
破骨細胞來源 EXOs（EXOs derived from osteoclasts，OC-EXOs）調控成骨細胞-破骨細胞間通訊及骨重建過程的作用機制仍不明確。Huynh 等[33]研究發現，破骨細胞前體來源的 EXOs 具有促進破骨細胞成熟分化的作用；而富含 NK-κB 受體活化因子（receptor activator of NK-κB，RANK）的成熟 OC-EXOs 可競爭性抑制破骨細胞表面 RANK 與其配體 RANKL 的結合，進而阻斷破骨細胞中 RANK 信號通路，抑制破骨細胞形成，當 EXOs 中富含的 RANK 被消耗后，EXOs 介導的抑制破骨細胞形成作用隨之減弱，表明 OC-EXOs 是破骨細胞旁分泌的重要調解因子。Li 等[34]進一步闡明了 OC-EXOs 與成骨細胞間通訊的相關性，研究發現破骨細胞特異性 miR-214-3p 轉基因小鼠的血清 EXOs 中 的miR-214-3p 水平升高、成骨相關基因表達下調，小鼠骨密度及骨小梁數量明顯降低，提示 miR-214-3p 可能是參與成骨細胞-破骨細胞通訊的重要信使。后續研究對可能存在的分子機制進行了闡明，Zhao 等[35]發現 miR-214-3p 的促破骨細胞生成作用是通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物（Pten），進而激活 PI3K/Akt 信號通路實現的。而 miR-214-3p 的成骨抑制作用則依賴 EphrinA2/EphA2 介導的成骨細胞-破骨細胞相互作用；研究還指出，miR-214-3p 和 EphrinA2 水平在 OP 患者及 OP 小鼠模型血清中均顯著升高，可作為 OP 診斷及治療的潛在靶點[36]。
以上研究揭示了成骨細胞-破骨細胞間通訊的一種新機制，然而隨著越來越多的生物分子在 OC-EXOs 中被發現，成骨細胞-破骨細胞間是否存在其他信號通路及如何用于 OP 的治療仍需進一步探索。
2.3 成骨細胞
成骨細胞來源于具有多向分化潛力的 BMSCs，在骨基質合成、分泌和礦化過程中起關鍵作用。目前普遍認為成骨細胞來源 EXOs（EXOs derived from osteoblasts，OB-EXOs）在維持骨重建穩態及成骨細胞-破骨細胞通訊中發揮重要作用。Wei 等[37]發現成骨細胞在不同階段分泌的 EXOs 對 BMSCs 成骨分化作用存在差異性，其中中晚期分泌的 EXOs 可顯著促進 BMSCs 成骨分化作用，并顯示出了極高的骨靶向潛力。此過程中 BMSCs 內的 miRNA 表達譜發生改變，進一步分析這些 miRNA 的靶基因及信號通路，發現 OB-EXOs 的促成骨作用可能是軸抑制蛋白 1 下調和 β-catenin 上調，進而激活 Wnt 信號通路的結果；另外，包含 miR-431-5p、miR-221-5p、miR-710、miR-140-3p 和 let-7 在內的 43 種 miRNA 在 MC3T3-E1（一種成骨細胞系）源性 EXOs 中高度表達，參與了成骨細胞分化和骨重建的多種途徑，如 Wnt、胰島素、TGF-β 和鈣信號通路[38]。另有研究指出，富含 RANKL 的 OB-EXOs 可通過 RANKL-RANK 相互作用激活破骨細胞前體中 RANK 通路，促進破骨細胞形成；而應用骨保護素可抑制 RANK 與其配體結合，進一步驗證了 OB-EXOs 的促破骨細胞形成作用[39]。
2.4 骨細胞
骨細胞可通過感知全身或局部刺激、分泌各種細胞因子及信號分子調控成骨細胞和破骨細胞功能，其來源的細胞外囊泡中含有大量成骨因子，可顯著增強 BMSCs 定向募集及成骨作用，機械刺激可促進骨細胞細胞外囊泡的產生及釋放，而阻斷 Ca2+ 信號通路后，細胞外囊泡生成減少，骨組織再生能力下降，提示 Ca2+ 信號通路在細胞外囊泡的形成中發揮重要作用[40]。有研究在經肌肉生長抑制素處理的骨細胞所釋放的 EXOs 中，發現 miR-218 表達顯著下調，被成骨細胞內吞后，可通過 Wnt 信號通路下調 Runx2 表達，從而抑制成骨細胞分化，而破骨細胞內吞此類 EXOs 后其活性并無明顯變化[41]，表明 miR-218 可靶向促進成骨細胞活性，參與肌肉-骨骼間信號交流，或可作為 OP 的潛在治療靶點。除 miR-218 外，Sato 等[42]首次指出骨細胞減少的小鼠血漿 EXOs 中有 miR-3473a、miR-6244、miR-5621-5p 和 miR-6239 等 12 個 miRNA 水平顯著降低，提示血液循環可能是含有特異性 miRNA 的骨細胞源性 EXOs 發揮生物學作用的主要途徑。此外，攜帶 miR-124-3p 的骨細胞源性 EXOs 在高糖條件下可靶向抑制成骨細胞半乳糖凝集素 3 的表達，進而減少糖尿病性牙周炎小鼠牙周骨量[43]，而相關作用機制在糖尿病性 OP 的治療中是否同樣適用仍需進一步實驗驗證。
2.5 巨噬細胞
Xiong 等[44]的一項關于巨噬細胞源性 EXOs 研究指出，富含 miR-5106 的 M2 型巨噬細胞源性EXOs（EXOs derived from M2 macrophagy，M2-EXOs）可通過靶向鹽誘導激酶 2（salt-inducible kinase 2，SIK2）及 SIK3 基因促進 BMSCs 成骨分化，加速骨折愈合進程；與 M2-EXOs 相比，miR-5106 在 M1-EXOs 中的表達明顯降低，提示 M1-EXOs 可能具有更強成骨作用。矛盾的是，Xia 等[45]將 BMSCs 分別與 M0-EXOs、M1-EXOs 及 M2-EXOs 共培養后發現，M1-EXOs 反而具有更強的促進 BMSCs 增殖、成骨和成脂分化作用，表明巨噬細胞源性 EXOs 中存在 miR-5106 以外未知的骨代謝調控因子。進一步蛋白組學分析顯示，巨噬細胞源性 EXOs 中諸多內源性因子均可調控骨重建過程，如半乳糖凝集素可顯著增強 BMSCs 的成骨分化能力；膜聯蛋白 2 則可通過 MAPK 途徑刺激 RANKL 表達，從而加快破骨細胞介導的骨吸收進程[46-47]。巨噬細胞源性 EXOs 表現出了巨大的骨再生潛力，但目前相關研究報道較少，具體作用機制尚不清楚，明確此類 EXOs 中關鍵信號機制及調控因素，可能成為治療 OP 的一種新型策略。
2.6 內皮細胞
內皮細胞來源EXOs（EXOs derived from endothelial cells，EC-EXOs）及內皮祖細胞來源EXOs（EXOs derived from endothelial progenitor cells，EPC-EXOs）在調解骨重建進程、維持骨代謝平衡、改善 OP 癥狀中的作用已被證實。例如，EPC-EXOs 內的 miR-126 可通過下調 SPRED1 表達并激活 Raf/ERK 信號通路刺激血管及骨組織再生，縮短骨缺損修復時間[48]；EC-EXOs 內的 miR-155 可靶向抑制 Spi1、Mitf、Socs1 的表達，從而抑制骨髓巨噬細胞的激活及破骨細胞分化；進一步實驗證實尾靜脈注射 EC-EXOs 可治療 OP 小鼠模型，這種治療作用可被 miR-155 抑制劑逆轉，表明 EC-EXOs 可通過上調 miR-155 來抑制破骨細胞分化，影響 OP 進程[7]；值得注意的是，與 OB-EXOs 和 BMSCs-EXOs 相比，EC-EXOs 展現出了更強的骨靶向特性，獨特的骨靶向能力與其表面高表達的妊娠帶蛋白有關[7]。因此，依托內皮細胞獨特的骨靶向優勢，憑借 EXOs 自身優良的載藥特性，合成 EC-EXOs-成骨藥物獨特內源性復合體，直達疾病靶標，從而解決臨床給藥普遍存在的生物清除率高、半衰期短等問題，提高療效的同時減少不良反應，有望為 OP 治療提供新思路和方法。
2.7 人誘導多能干細胞
有研究將人誘導多能干細胞來源 MSCs 分泌的EXOs（EXOs secreted by MSCs derived from human induced pluripotent stem cells，hiPSC-MSC-EXOs）與 BMSCs 進行共培養后發現，BMSCs 的ALP 活性增強，成骨相關基因和蛋白表達上調，證明 hiPSC-MSC-EXOs 對 BMSCs增殖及成骨分化具有正向調控作用[49]。另有研究將 hiPSC-MSC-EXOs 與生物相容性好及具有骨傳導性的 β-磷酸三鈣制備復合支架，發現該支架在通過 PI3K/Akt 信號通路促進 BMSCs 成骨分化、加速骨缺損修復的同時，還能增加血管化區域，促進新生血管形成，且這種生物學效應隨 hiPSC-MSC-EXOs 濃度增加而增加[50]。
2.8 人臍帶 MSCs
近期研究表明，人臍帶 MSCs 來源EXOs（EXOs derived from human umbilical cord MSCs，hUMSC-EXOs）中的 C 型凝集素域家族 11A 可促進 BMSCs 成骨分化，抑制破骨細胞形成，從而減少 OP 小鼠骨吸收及骨髓脂肪累積，維持骨強度[51]。為進一步探索分子機制，Yang 等[52]對 OP 小鼠模型研究發現，hUMSC-EXOs 內的 miR-1263 可與 Mob1 的 3’ 非編碼區特異性結合，在下調 Mob1 表達的同時激活 YAP（Hipo 信號通路的關鍵調節劑）表達，從而抑制 Hipo 信號通路介導的 BMSCs 凋亡效應，逆轉 OP 進程；而敲除 miR-1263 后，BMSCs 凋亡增加，成骨作用隨之減弱，表明 hUMSC-EXOs 可通過 miR-1263/Mob1/Hipo 信號通路參與 BMSCs 凋亡的調解及 OP 的病理生理過程。
2.9 脂肪 MSCs
已有研究證實，脂肪 MSCs 來源EXOs（EXOs derived from adipose-derived MSCs，ADSCs-EXOs）可通過抑制破骨細胞中 NLRP3 炎癥小體的激活，逆轉破骨細胞介導的骨吸收進程，對糖尿病性 OP 小鼠具有良好的治療作用[53]。同時，此類 EXOs 還可上調 Bcl-2/Bax 表達，減少活性氧和細胞色素 c 的產生，在抑制骨細胞凋亡同時，降低 RANKL 在基因和蛋白水平的表達，導致骨細胞介導的破骨細胞生成受阻[54]。作為新興領域，目前研究主要涉及此類 EXOs 對破骨細胞生物學功能的調解，仍缺乏其對成骨細胞、BMSCs 等骨相關細胞作用的報道。
不同細胞來源 EXOs 在骨重建進程中的作用機制詳見表1。
表1
不同細胞來源 EXOs 在骨重建進程中的作用機制
Table1.
Mechanism of EXOs derived from different cells in bone remodeling
3 EXOs 作為 OP 治療靶點的優勢及可行性
EXOs 作為一種天然的內源性納米載體，可通過受體介導的內吞作用參與骨重建過程中各細胞間的信息交流[12]。與一般納米載體相比，EXOs 可將納米顆粒大小與無細胞毒性、低免疫原性、高靶向特異性及高載藥量等優勢相結合，為基因、抗OP藥物的轉運開辟了一條新途徑[55]。除自然分泌的 EXOs 外，一些基于基因工程技術將靶向肽或適配體定位到 EXOs 外膜的研究發現，工程化改造后的 EXOs 在減少藥物肝臟和肺部蓄積、提高生物利用度的同時，展現出了極高的細胞靶向特異性及跨膜傳遞效率[56]。同時，EXOs 可作用于 OP 發病機制中的多個環節及靶點，并已在 OP 動物模型中取得良好的治療效果，為 EXOs 的臨床轉化提供理論依據[4, 7, 28-29]；此外，相關 EXOs 均可通過微創方式從健康捐贈者骨髓及血清中分離獲取，低溫環境下保存方便，性質穩定，且不表達細胞表面的主要組織相容性復合體，不易發生免疫排斥反應，體內半衰期長，安全性更高[13, 57]。值得重視的是，EXOs 作為潛在的生物標志物在OP早期診斷、臨床干預和預后評估方面同樣具有良好應用前景[36, 58]。
4 總結與展望
不同細胞來源 EXOs 對于 OP 的作用機制主要涉及各種信號傳導通路的激活及基因表達的調控，從而調解免疫原性系統，影響骨重建進程中成骨細胞、破骨細胞及血管內皮細胞等的生物學功能，而具體哪種細胞來源的 EXOs 更適合作為 OP 治療的新型生物制劑，仍需要綜合 EXOs 產量、成骨能力等多方面因素予以分析。盡管一些基于 EXOs 的實驗研究在 OP 動物模型中取得了良好效果，但目前仍缺乏臨床應用的報道，其安全性及有效性仍需進一步評估。此外，EXOs 內諸多物質的功能尚不明確，且對已知信號通路背后的具體分子機制的研究仍處于初始階段。EXOs 的臨床轉化仍需注重改善提取方式、明確治療有效劑量、提高靶向性及安全性等。
作者貢獻：段克友負責查閱文獻、整理數據和論文撰寫；官建中對文章修改提出建設性意見，負責審閱并參與觀點形成。
利益沖突：所有作者聲明，在文章撰寫過程中不存在利益沖突。
