引用本文： 邸運濤, 王存陽, 朱惠學, 于素香, 任義行, 李曉明. BMP-2 多肽/功能化碳納米管復合材料修復兔顱骨缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(3): 286-294. doi: 10.7507/1002-1892.202009014 復制
面對臨床患者對骨移植和骨再生方面的迫切需要，開發具有高成骨活性的骨修復材料迫在眉睫[1-2]。目前研究表明，與成骨相關多肽和活性蛋白等活性因子相結合，是提高材料成骨活性的有效途徑之一[3]。而且，與氨基酸序列較長的活性蛋白相比，成骨相關多肽合成成本低，穩定性高，更適合骨修復[4-6]。成骨相關多肽可通過共價結合或非共價結合方式附著于生物材料上。相比于非共價結合，共價結合能更有效地增加多肽與材料的相互作用，延長植入后相互作用時間，控制分子的取向，使多肽在體內緩慢釋放，有助于維持其功能[7-9]。然而，對于多肽通過非共價與共價作用，以及通過不同官能團與材料結合對材料骨修復性能影響的報道均較少。我們既往研究發現，多肽通過共價結合比非共價結合作用時間更長，且體外實驗結果表明，碳納米管表面的氨基（-NH2）比羧基（-COOH）更有利于提高材料骨修復性能[10]。但該研究結論需要體內實驗進行驗證。
為此，我們在前期研究基礎上，進行了本次體內實驗。顱骨缺損模型具有空間充足、硬腦膜和皮膚可以為植入材料提供支撐，以及無需額外固定等優勢[11]；此外骨缺損應超過動物不能自發愈合的尺寸，即臨界骨缺損直徑 8 mm[12]。故本研究通過建立兔 12 mm 顱骨缺損模型，利用 CT 掃描及三維重建、組織學染色等方法，觀察并比較等量 BMP-2 多肽通過非共價和共價作用，以及多肽分別通過 -COOH 和 -NH2 這兩種官能團與碳納米管結合，對兔顱骨缺損修復的效果，探討結合方式和官能團對多肽活性的影響規律以及改善骨修復效果的最佳組合。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
3 月齡雄性普通級新西蘭白兔 21 只，體質量 1.7～2.0 kg，平均 1.8 kg，由望都縣彤輝養殖公司提供。
多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT；外徑 40～60 nm，長度<2 μm，純度≥97%；深圳市納米港有限公司）；左旋聚乳酸［poly（L-lactide），PLLA；相對分子質量 2.5×105；山東濟南岱罡生物科技有限公司）］；BMP-2 多肽（序列 KTPKASSVPTELSAISTLYL，相對分子質量 2.1×103，純度 98.28%；合肥國肽生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；改良 HE 染色試劑盒、改良 Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。FREEZONE 12 冷凍干燥機（LABCONCO 公司，美國）；GE Lightspeed VCT CT 機（GE 公司，美國）；Olympus F100 顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 骨修復材料制備方法
參照文獻［10］方法制備骨修復材料。首先，將 MWCNT 經過純化處理，并通過功能化改性分別制備成羧基化碳納米管（MWCNT-COOH）和氨基化碳納米管（MWCNT-NH2）；然后，將二者分別浸泡于 BMP-2 溶液中，室溫下于無菌操作臺放置 24 h，制備 BMP-2 非共價結合的 MWCNT-COOH 和 MWCNT-NH2 復合材料；再通過 EDC/NHS 法制備 BMP-2 共價結合的 MWCNT-COOH 和 MWCNT-NH2 復合材料；最后，將以上 4 種復合材料（MWCNT 含量均為 0.2 wt.%）與 PLLA 共混，利用冷凍干燥法制備成 4 種復合支架，分別為 BMP-2 非共價結合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 1）、BMP-2 非共價結合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料 2）、BMP-2 共價結合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 3）、BMP-2 共價結合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料 4）。
1.3 實驗分組及方法
將 21 只新西蘭白兔左右兩側頂骨編號 1～42 號，采用隨機數字表法分為 5 組，對照組（A 組，6 側）及材料 1、2、3、4 組（分別為 B、C、D、E 組，每組 9 側）。各組動物適應環境飼養 l 周后，耳緣靜脈注射 2% 戊巴比妥鈉（30.0 mg/kg）全麻，備皮后沿顱中縫作 4 cm 切口，分層剝離皮下組織暴露兩側平坦的頂骨骨面，用取骨環鉆在兩側頂骨制備直徑 12 mm 雙層皮質骨貫通骨缺損，保留下方完整硬腦膜。分別將材料 1～4 植入 B～E 組缺損區，拉攏縫合骨膜以固定材料，縫合皮膚；A 組直接縫合皮膚。術后視動物狀態酌情給予蘇醒藥物，并肌肉注射 60 萬 U 青霉素，普食喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察動物進食、飲水、活動、體質量變化以及切口愈合情況。
1.4.2 CT 圖像處理和三維重建
CT 圖像處理：術后 4、8、12 周分別處死 7 只動物（每個時間點 A 組 2 個樣本，B～E 組各 3 個樣本），迅速完整取下眶部以上的顱骨進行 CT 掃描，掃描條件：電壓 80 kV，電流 500 mA，曝光時間 200 ms，旋轉角度 220°，層厚 1 mm，圖像數量 120 張。隨后，利用 Mimics20.0 軟件對兔顱骨進行 CT 三維重建，通過以下公式計算骨組織再生體積與總體積比值：（V2?V1）/V0，其中 V1 是指對缺損位置進行選區后測量的體積，V2 是指對缺損選區位置進行擬合修補處理后的體積，V0 為骨缺損初始體積。同時測量骨密度。
1.4.3 組織學觀察
CT 觀察后將顱骨標本置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，再用甲酸脫鈣 1 周。然后行常規石蠟包埋、切片（片厚 4 μm），進行 HE 染色和 Masson 三色染色，封片觀察，用 Image J 軟件計算新生骨組織體積比。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有實驗動物術中無死亡，術后均可正常進食、飲水、活動，體質量均正常增加。術后僅 2 只兔切口附近有炎性改變和皮脂腺瘤樣改變，考慮可能為操作時植入皮脂腺或毛發等異物所致；其余動物切口附近未出現不良反應。
2.2 CT 掃描和三維重建
CT 觀察示，術后 4、8 周，各組顱骨缺損均有不同程度修復，其中 B、C 組缺損被少許填充，D、E 組缺損修復效果更好。術后 12 周，B、C、D 組缺損被進一步填充，但仍可觀察到孔洞，D 組與 B、C 組相比填充程度更完整；E 組缺損已被完全填充，無孔洞。見圖 1～3。
圖1
術后各時間點各組 CT 掃描觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure1. CT scanning observation of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖2
術后各時間點各組 CT 三維重建觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure2. CT three-dimensional reconstruction observation of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖3
術后各時間點各組 CT 三維重建局部選區觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure3. Local selection observation of CT three-dimensional reconstruction of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
定量分析顯示，術后 4、8、12 周，各組骨組織再生體積與總體積比值和骨密度值隨時間增加均呈逐漸增加趨勢；且各時間點從 A～E 組也呈逐漸增加趨勢，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4、5。
圖4
術后各時間點各組骨組織再生體積與總體積比值比較
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure4. Comparison of the ratio of bone tissue regeneration volume to total volume at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖5
術后各時間點各組骨密度值比較
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12周
Figure5. Comparison of bone mineral density of each group at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
2.3 組織學觀察
HE 染色示，術后 4 周，A 組有大量纖維結締組織，無明顯骨生成；其余各組可觀察到成骨細胞核，有少量新生骨組織，B～E 組新生骨組織體積逐漸增大。術后 8 周，各組均有新生骨組織，B～E 組新生骨組織體積較 4 周時有所增大，B～E 組新生骨組織體積也呈逐漸增大趨勢。術后 12 周，A 組有少量新生骨組織生成；B～E 組新生骨組織體積較 8 周時進一步增大，B～E 組新生骨組織仍呈逐漸增大趨勢，其中 D、E 組產生了骨陷窩。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察（×100）
黑箭頭示纖維結締組織，黃箭頭示再生骨組織 從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure6. HE staining of each group at each time point after operation (×100)Black arrow showed fibrous connective tissue, yellow arrow showed regenerated bone tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
Masson 三色染色示，術后 4 周，A 組無再生骨組織；B～E 組均有再生的未成熟骨組織且組間呈逐漸增多趨勢。術后 8 周，A 組仍無再生骨組織，B～E 組再生的未成熟骨組織較 4 周時有所增多且組間也呈逐漸增多趨勢。術后 12 周，A 組有少量再生的未成熟骨組織；B～E 組再生骨組織較 8 周時進一步增多且組間仍呈逐漸增多趨勢，其中 D、E 組產生了再生成熟骨組織。見圖 7。
圖7
術后各時間點各組 Masson 三色染色觀察（×100）
綠箭頭示再生的未成熟骨組織，藍箭頭示再生的成熟骨組織 從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure7. Masson trichrome staining of each group at each time point after operationGreen arrow showed regenerated immature bone tissue, blue arrow showed regenerated mature bone tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
定量分析顯示，術后 4、8、12 周，各組新生骨組織體積比隨時間增加均呈逐漸增加趨勢；且各時間點從 A～E 組也呈逐漸增加趨勢，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 8、9。
圖8
術后各時間點各組 HE 染色定量分析新生骨組織體積比
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure8. Quantitative analysis of the volume ratio of new bone tissue by HE staining at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖9
術后各時間點各組 Masson 三色染色定量分析新生骨組織體積比
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure9. Quantitative analysis of the volume ratio of new bone tissue by Masson trichrome staining at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
3 討論
成骨相關多肽與材料通過非共價與共價兩種方式結合，具有不同特點。其中，非共價結合主要通過離子鍵、氫鍵和范德華力等作用，實驗方法以共混-多肽吸附為主，作用力較弱；而且，成骨相關多肽往往與材料不能有效結合，會在初始階段引發爆釋[13]。多肽共價結合主要通過酰胺鍵作用，作用力較強，從而可有效提高多肽與材料間的作用力，延長其植入體內后的作用時間，還可控制分子取向，使功能化表面具有較高穩定性，進而更有利于多肽等活性物質在體內緩慢釋放，促進多肽作用的發揮[14]。目前，已有很多研究通過共價結合引入成骨相關多肽來提高人工材料的骨修復能力[15]。
關于多肽與材料通過不同官能團結合對其成骨活性的影響，我們之前已進行了相關研究[10]。首先在 MWCNT 表面分別引入等量 -COOH 和 -NH2 官能團，然后將細胞黏附肽 RGD 和 BMP-2 多肽分別與 MWCNT 共價結合，最后將這些材料與聚乳酸共混后利用冷凍干燥法制備孔徑 10～200 μm 的多孔復合支架，通過體外實驗對支架的細胞成骨活性進行研究。掃描電鏡觀察顯示，在含有多肽/功能化 MWCNT 的支架中清楚觀察到 MWCNT 均勻分布，且各組復合支架微觀結構無顯著差異，表明官能團及多肽種類對復合支架的形貌結構無顯著影響。
已有研究表明基體材料中 MWCNT 的引入量達 1 wt.% 以上，會對復合支架的力學性能造成顯著影響[16-17]；達 0.5 wt.% 以上，會對復合材料的降解性能造成顯著影響[18-19]。本研究中，各組復合支架引入的多肽/功能化 MWCNT 含量較少（僅為 0.2 wt.%），因此官能團及多肽種類對支架的力學性質無顯著影響；術后 12 周，植入動物模型的材料均完全降解，表明官能團及多肽種類對支架的降解性能無顯著影響。此外，我們既往研究的 BMP-2 多肽釋放曲線表明，以不同官能團共價結合不影響 BMP-2 多肽釋放（P>0.05），BMP-2 多肽在 21 d 內穩定釋放；與非共價結合相比，BMP-2 多肽可通過與不同官能團的共價結合發揮更持久作用[10]。
因此，以上研究排除了一些因素對體外實驗結果可能的影響，如材料的微觀結構、材料共價結合多肽的量、多肽釋放速率和反應過程中溶液 pH 值。體外實驗結果表明，材料通過 -NH2 與多肽共價結合，小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 的黏附、增殖、分化和礦化能力明顯高于通過 -COOH 結合，這可能是由于官能團所帶的不同電荷導致了肽構象、蛋白吸附和肽鏈靶向作用差異，最終影響了細胞行為[10]。本研究通過體內實驗表明，利用不同官能團將多肽與材料共價結合，-NH2 的骨修復效果優于 -COOH，也可能是由于官能團所帶的不同電荷導致。
已有研究表明，肽鏈上帶正電荷的未反應 -NH2 可以吸附更多特異性蛋白。例如，Curran 等[20]報道了 -NH2 表面可以維持干細胞的活性細胞黏附和成骨分化，這可能與玻璃連接蛋白在表面吸附增加有關。Kikuchi 等[21]發現，-NH2 衍生的底物有利于細胞培養，并進一步證明胺衍生物吸附血清中的牛血漿纖維連接蛋白和玻璃連接蛋白，可能促進細胞黏附和生長行為。此外，纖維連接蛋白是一種重要的細胞黏附蛋白，已被證明對帶正電荷的材料表面具有親和力[22]。生物材料表面性質對細胞響應的影響，一般是由于表面化學可以調節被吸附特定蛋白質的結構和活性[23]。這些研究均通過體外實驗表明，通過 -NH2 結合多肽的復合材料骨修復效果可能優于通過 -COOH 結合多肽的復合材料，然而這些結果需要通過體內實驗進一步驗證。
本研究通過建立兔臨界顱骨缺損模型，觀察并比較等量 BMP-2 多肽通過非共價和共價作用，以及多肽分別與 -COOH 和 -NH2 這兩種官能團與碳納米管結合，對兔顱骨缺損修復的效果，探討結合方式和官能團對多肽活性的影響規律以及改善骨修復的最佳組合。在材料方面選擇了 MWCNT，一方面，MWCNT 被證明適合用于骨修復。文獻報道 MWCNT 不僅可促進細胞黏附和增殖，還可通過濃縮大量蛋白質（包括骨誘導蛋白形成誘導骨），將可誘導細胞分化為成骨細胞[24]。Pahlevanzadeh 等[25]合成并表征了一種新型含有 MWCNT 和鈣礬石的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，結果表明 MWCNT 的加入提高了聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的力學性能和生物活性。此外，MWCNT 比單壁碳納米管更適合用作骨修復材料，這可能是由于 MWCNT 對骨鈣素的長期作用強于單壁碳納米管，能更明顯地誘導新骨形成，進一步促進與新骨的結合，從而更早完成骨重建[26]。另一方面，MWCNT 很容易與不同官能團如 -COOH、-NH2、羥基、鄰苯二酚等結合，從而實現其功能性和在各個領域的應用。例如 Shrestha 等[27]通過混酸（濃硫酸和濃硝酸）制備 MWCNT-COOH 用于制備骨修復材料。Rahimi 等[28]采用酸氯化法制備 MWCNT-NH2，開發抗菌生物膜，利用二乙烯三胺和順丁烯二酸酐通過自由基聚合法制備 MWCNT-NH2 用于智能藥物輸送。然而，目前碳納米管作為納米材料，因為細胞毒性問題阻礙了其在骨修復領域的應用[29]。結合以往 MWCNT 含量對細胞毒性的影響，證實<50 μg/mL 的含量是安全范圍，所以制備復合支架時采用 0.2 wt.% 的含量在安全范圍以內[30]。本研究組織學觀察結果表明，術后并未發生因材料植入導致的炎癥反應，說明通過提純及官能化處理，可以避免納米材料因團聚或吸附雜質等原因引起的細胞毒性。而且，碳納米管與聚乳酸混合后制備成復合支架材料，使碳納米管結合的多肽在修復過程中穩定釋放，又有利于碳納米管隨聚乳酸的降解而緩慢排出。與一些其他未引入活性物質的骨修復材料體系相比，在術后相同時間實現了更好的修復效果[31-32]。而相比于近期研究使用膠原或負載基因作為活性物質的骨修復材料體系，本研究制備的材料修復時間相對稍長，但本研究使用的多肽與之相比具有低成本的優勢[33]。
綜上述，本研究一方面驗證了共價結合對 BMP-2 多肽的活性影響較小，修復效果優于非共價結合，而且通過不同官能團共價結合受不同電荷影響；另一方面，在今后多肽復合材料應用過程中，應對不同種類多肽如 P-15 多肽或 OGP 肽等，或各類官能團如羥基、巰基、鄰苯二酚基等因素進行更深入和系統地討論，從材料選擇和制備等方面提供一定參考，以期制備出更高性能的骨修復材料。
作者貢獻：邸運濤負責制作骨缺損模型和數據收集；王存陽負責骨修復材料的制備，數據分析和文章撰寫；朱惠學負責指導動物模型制作；于素香負責制作組織切片；任義行負責協助制作骨缺損模型；李曉明負責整體實驗設計和指導，觀點補充及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突，且經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經保定市第四中心醫院倫理委員會批準（2020028）。實驗動物使用許可證批準號 SYXK（冀）2017-002。
面對臨床患者對骨移植和骨再生方面的迫切需要，開發具有高成骨活性的骨修復材料迫在眉睫[1-2]。目前研究表明，與成骨相關多肽和活性蛋白等活性因子相結合，是提高材料成骨活性的有效途徑之一[3]。而且，與氨基酸序列較長的活性蛋白相比，成骨相關多肽合成成本低，穩定性高，更適合骨修復[4-6]。成骨相關多肽可通過共價結合或非共價結合方式附著于生物材料上。相比于非共價結合，共價結合能更有效地增加多肽與材料的相互作用，延長植入后相互作用時間，控制分子的取向，使多肽在體內緩慢釋放，有助于維持其功能[7-9]。然而，對于多肽通過非共價與共價作用，以及通過不同官能團與材料結合對材料骨修復性能影響的報道均較少。我們既往研究發現，多肽通過共價結合比非共價結合作用時間更長，且體外實驗結果表明，碳納米管表面的氨基（-NH2）比羧基（-COOH）更有利于提高材料骨修復性能[10]。但該研究結論需要體內實驗進行驗證。
為此，我們在前期研究基礎上，進行了本次體內實驗。顱骨缺損模型具有空間充足、硬腦膜和皮膚可以為植入材料提供支撐，以及無需額外固定等優勢[11]；此外骨缺損應超過動物不能自發愈合的尺寸，即臨界骨缺損直徑 8 mm[12]。故本研究通過建立兔 12 mm 顱骨缺損模型，利用 CT 掃描及三維重建、組織學染色等方法，觀察并比較等量 BMP-2 多肽通過非共價和共價作用，以及多肽分別通過 -COOH 和 -NH2 這兩種官能團與碳納米管結合，對兔顱骨缺損修復的效果，探討結合方式和官能團對多肽活性的影響規律以及改善骨修復效果的最佳組合。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
3 月齡雄性普通級新西蘭白兔 21 只，體質量 1.7～2.0 kg，平均 1.8 kg，由望都縣彤輝養殖公司提供。
多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNT；外徑 40～60 nm，長度<2 μm，純度≥97%；深圳市納米港有限公司）；左旋聚乳酸［poly（L-lactide），PLLA；相對分子質量 2.5×105；山東濟南岱罡生物科技有限公司）］；BMP-2 多肽（序列 KTPKASSVPTELSAISTLYL，相對分子質量 2.1×103，純度 98.28%；合肥國肽生物科技有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC］、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；改良 HE 染色試劑盒、改良 Masson 三色染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。FREEZONE 12 冷凍干燥機（LABCONCO 公司，美國）；GE Lightspeed VCT CT 機（GE 公司，美國）；Olympus F100 顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 骨修復材料制備方法
參照文獻［10］方法制備骨修復材料。首先，將 MWCNT 經過純化處理，并通過功能化改性分別制備成羧基化碳納米管（MWCNT-COOH）和氨基化碳納米管（MWCNT-NH2）；然后，將二者分別浸泡于 BMP-2 溶液中，室溫下于無菌操作臺放置 24 h，制備 BMP-2 非共價結合的 MWCNT-COOH 和 MWCNT-NH2 復合材料；再通過 EDC/NHS 法制備 BMP-2 共價結合的 MWCNT-COOH 和 MWCNT-NH2 復合材料；最后，將以上 4 種復合材料（MWCNT 含量均為 0.2 wt.%）與 PLLA 共混，利用冷凍干燥法制備成 4 種復合支架，分別為 BMP-2 非共價結合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 1）、BMP-2 非共價結合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料 2）、BMP-2 共價結合的 MWCNT-COOH+PLLA（材料 3）、BMP-2 共價結合的 MWCNT-NH2+PLLA（材料 4）。
1.3 實驗分組及方法
將 21 只新西蘭白兔左右兩側頂骨編號 1～42 號，采用隨機數字表法分為 5 組，對照組（A 組，6 側）及材料 1、2、3、4 組（分別為 B、C、D、E 組，每組 9 側）。各組動物適應環境飼養 l 周后，耳緣靜脈注射 2% 戊巴比妥鈉（30.0 mg/kg）全麻，備皮后沿顱中縫作 4 cm 切口，分層剝離皮下組織暴露兩側平坦的頂骨骨面，用取骨環鉆在兩側頂骨制備直徑 12 mm 雙層皮質骨貫通骨缺損，保留下方完整硬腦膜。分別將材料 1～4 植入 B～E 組缺損區，拉攏縫合骨膜以固定材料，縫合皮膚；A 組直接縫合皮膚。術后視動物狀態酌情給予蘇醒藥物，并肌肉注射 60 萬 U 青霉素，普食喂養。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體觀察
術后觀察動物進食、飲水、活動、體質量變化以及切口愈合情況。
1.4.2 CT 圖像處理和三維重建
CT 圖像處理：術后 4、8、12 周分別處死 7 只動物（每個時間點 A 組 2 個樣本，B～E 組各 3 個樣本），迅速完整取下眶部以上的顱骨進行 CT 掃描，掃描條件：電壓 80 kV，電流 500 mA，曝光時間 200 ms，旋轉角度 220°，層厚 1 mm，圖像數量 120 張。隨后，利用 Mimics20.0 軟件對兔顱骨進行 CT 三維重建，通過以下公式計算骨組織再生體積與總體積比值：（V2?V1）/V0，其中 V1 是指對缺損位置進行選區后測量的體積，V2 是指對缺損選區位置進行擬合修補處理后的體積，V0 為骨缺損初始體積。同時測量骨密度。
1.4.3 組織學觀察
CT 觀察后將顱骨標本置于 4% 多聚甲醛中固定 24 h，再用甲酸脫鈣 1 周。然后行常規石蠟包埋、切片（片厚 4 μm），進行 HE 染色和 Masson 三色染色，封片觀察，用 Image J 軟件計算新生骨組織體積比。
1.5 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
所有實驗動物術中無死亡，術后均可正常進食、飲水、活動，體質量均正常增加。術后僅 2 只兔切口附近有炎性改變和皮脂腺瘤樣改變，考慮可能為操作時植入皮脂腺或毛發等異物所致；其余動物切口附近未出現不良反應。
2.2 CT 掃描和三維重建
CT 觀察示，術后 4、8 周，各組顱骨缺損均有不同程度修復，其中 B、C 組缺損被少許填充，D、E 組缺損修復效果更好。術后 12 周，B、C、D 組缺損被進一步填充，但仍可觀察到孔洞，D 組與 B、C 組相比填充程度更完整；E 組缺損已被完全填充，無孔洞。見圖 1～3。
圖1
術后各時間點各組 CT 掃描觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure1. CT scanning observation of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖2
術后各時間點各組 CT 三維重建觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure2. CT three-dimensional reconstruction observation of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖3
術后各時間點各組 CT 三維重建局部選區觀察（方框示缺損區）
從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure3. Local selection observation of CT three-dimensional reconstruction of each group at each time point after operation (the box showed the defect)From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
定量分析顯示，術后 4、8、12 周，各組骨組織再生體積與總體積比值和骨密度值隨時間增加均呈逐漸增加趨勢；且各時間點從 A～E 組也呈逐漸增加趨勢，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4、5。
圖4
術后各時間點各組骨組織再生體積與總體積比值比較
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure4. Comparison of the ratio of bone tissue regeneration volume to total volume at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖5
術后各時間點各組骨密度值比較
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12周
Figure5. Comparison of bone mineral density of each group at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
2.3 組織學觀察
HE 染色示，術后 4 周，A 組有大量纖維結締組織，無明顯骨生成；其余各組可觀察到成骨細胞核，有少量新生骨組織，B～E 組新生骨組織體積逐漸增大。術后 8 周，各組均有新生骨組織，B～E 組新生骨組織體積較 4 周時有所增大，B～E 組新生骨組織體積也呈逐漸增大趨勢。術后 12 周，A 組有少量新生骨組織生成；B～E 組新生骨組織體積較 8 周時進一步增大，B～E 組新生骨組織仍呈逐漸增大趨勢，其中 D、E 組產生了骨陷窩。見圖 6。
圖6
術后各時間點各組 HE 染色觀察（×100）
黑箭頭示纖維結締組織，黃箭頭示再生骨組織 從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure6. HE staining of each group at each time point after operation (×100)Black arrow showed fibrous connective tissue, yellow arrow showed regenerated bone tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
Masson 三色染色示，術后 4 周，A 組無再生骨組織；B～E 組均有再生的未成熟骨組織且組間呈逐漸增多趨勢。術后 8 周，A 組仍無再生骨組織，B～E 組再生的未成熟骨組織較 4 周時有所增多且組間也呈逐漸增多趨勢。術后 12 周，A 組有少量再生的未成熟骨組織；B～E 組再生骨組織較 8 周時進一步增多且組間仍呈逐漸增多趨勢，其中 D、E 組產生了再生成熟骨組織。見圖 7。
圖7
術后各時間點各組 Masson 三色染色觀察（×100）
綠箭頭示再生的未成熟骨組織，藍箭頭示再生的成熟骨組織 從左至右依次為 A、B、C、D、E 組 a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure7. Masson trichrome staining of each group at each time point after operationGreen arrow showed regenerated immature bone tissue, blue arrow showed regenerated mature bone tissue From left to right for groups A, B, C, D, and E, respectively a. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
定量分析顯示，術后 4、8、12 周，各組新生骨組織體積比隨時間增加均呈逐漸增加趨勢；且各時間點從 A～E 組也呈逐漸增加趨勢，組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 8、9。
圖8
術后各時間點各組 HE 染色定量分析新生骨組織體積比
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure8. Quantitative analysis of the volume ratio of new bone tissue by HE staining at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
圖9
術后各時間點各組 Masson 三色染色定量分析新生骨組織體積比
a. 術后 4 周；b. 術后 8 周；c. 術后 12 周
Figure9. Quantitative analysis of the volume ratio of new bone tissue by Masson trichrome staining at each time point after operationa. At 4 weeks after operation; b. At 8 weeks after operation; c. At 12 weeks after operation
3 討論
成骨相關多肽與材料通過非共價與共價兩種方式結合，具有不同特點。其中，非共價結合主要通過離子鍵、氫鍵和范德華力等作用，實驗方法以共混-多肽吸附為主，作用力較弱；而且，成骨相關多肽往往與材料不能有效結合，會在初始階段引發爆釋[13]。多肽共價結合主要通過酰胺鍵作用，作用力較強，從而可有效提高多肽與材料間的作用力，延長其植入體內后的作用時間，還可控制分子取向，使功能化表面具有較高穩定性，進而更有利于多肽等活性物質在體內緩慢釋放，促進多肽作用的發揮[14]。目前，已有很多研究通過共價結合引入成骨相關多肽來提高人工材料的骨修復能力[15]。
關于多肽與材料通過不同官能團結合對其成骨活性的影響，我們之前已進行了相關研究[10]。首先在 MWCNT 表面分別引入等量 -COOH 和 -NH2 官能團，然后將細胞黏附肽 RGD 和 BMP-2 多肽分別與 MWCNT 共價結合，最后將這些材料與聚乳酸共混后利用冷凍干燥法制備孔徑 10～200 μm 的多孔復合支架，通過體外實驗對支架的細胞成骨活性進行研究。掃描電鏡觀察顯示，在含有多肽/功能化 MWCNT 的支架中清楚觀察到 MWCNT 均勻分布，且各組復合支架微觀結構無顯著差異，表明官能團及多肽種類對復合支架的形貌結構無顯著影響。
已有研究表明基體材料中 MWCNT 的引入量達 1 wt.% 以上，會對復合支架的力學性能造成顯著影響[16-17]；達 0.5 wt.% 以上，會對復合材料的降解性能造成顯著影響[18-19]。本研究中，各組復合支架引入的多肽/功能化 MWCNT 含量較少（僅為 0.2 wt.%），因此官能團及多肽種類對支架的力學性質無顯著影響；術后 12 周，植入動物模型的材料均完全降解，表明官能團及多肽種類對支架的降解性能無顯著影響。此外，我們既往研究的 BMP-2 多肽釋放曲線表明，以不同官能團共價結合不影響 BMP-2 多肽釋放（P>0.05），BMP-2 多肽在 21 d 內穩定釋放；與非共價結合相比，BMP-2 多肽可通過與不同官能團的共價結合發揮更持久作用[10]。
因此，以上研究排除了一些因素對體外實驗結果可能的影響，如材料的微觀結構、材料共價結合多肽的量、多肽釋放速率和反應過程中溶液 pH 值。體外實驗結果表明，材料通過 -NH2 與多肽共價結合，小鼠成骨細胞 MC3T3-E1 的黏附、增殖、分化和礦化能力明顯高于通過 -COOH 結合，這可能是由于官能團所帶的不同電荷導致了肽構象、蛋白吸附和肽鏈靶向作用差異，最終影響了細胞行為[10]。本研究通過體內實驗表明，利用不同官能團將多肽與材料共價結合，-NH2 的骨修復效果優于 -COOH，也可能是由于官能團所帶的不同電荷導致。
已有研究表明，肽鏈上帶正電荷的未反應 -NH2 可以吸附更多特異性蛋白。例如，Curran 等[20]報道了 -NH2 表面可以維持干細胞的活性細胞黏附和成骨分化，這可能與玻璃連接蛋白在表面吸附增加有關。Kikuchi 等[21]發現，-NH2 衍生的底物有利于細胞培養，并進一步證明胺衍生物吸附血清中的牛血漿纖維連接蛋白和玻璃連接蛋白，可能促進細胞黏附和生長行為。此外，纖維連接蛋白是一種重要的細胞黏附蛋白，已被證明對帶正電荷的材料表面具有親和力[22]。生物材料表面性質對細胞響應的影響，一般是由于表面化學可以調節被吸附特定蛋白質的結構和活性[23]。這些研究均通過體外實驗表明，通過 -NH2 結合多肽的復合材料骨修復效果可能優于通過 -COOH 結合多肽的復合材料，然而這些結果需要通過體內實驗進一步驗證。
本研究通過建立兔臨界顱骨缺損模型，觀察并比較等量 BMP-2 多肽通過非共價和共價作用，以及多肽分別與 -COOH 和 -NH2 這兩種官能團與碳納米管結合，對兔顱骨缺損修復的效果，探討結合方式和官能團對多肽活性的影響規律以及改善骨修復的最佳組合。在材料方面選擇了 MWCNT，一方面，MWCNT 被證明適合用于骨修復。文獻報道 MWCNT 不僅可促進細胞黏附和增殖，還可通過濃縮大量蛋白質（包括骨誘導蛋白形成誘導骨），將可誘導細胞分化為成骨細胞[24]。Pahlevanzadeh 等[25]合成并表征了一種新型含有 MWCNT 和鈣礬石的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，結果表明 MWCNT 的加入提高了聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥的力學性能和生物活性。此外，MWCNT 比單壁碳納米管更適合用作骨修復材料，這可能是由于 MWCNT 對骨鈣素的長期作用強于單壁碳納米管，能更明顯地誘導新骨形成，進一步促進與新骨的結合，從而更早完成骨重建[26]。另一方面，MWCNT 很容易與不同官能團如 -COOH、-NH2、羥基、鄰苯二酚等結合，從而實現其功能性和在各個領域的應用。例如 Shrestha 等[27]通過混酸（濃硫酸和濃硝酸）制備 MWCNT-COOH 用于制備骨修復材料。Rahimi 等[28]采用酸氯化法制備 MWCNT-NH2，開發抗菌生物膜，利用二乙烯三胺和順丁烯二酸酐通過自由基聚合法制備 MWCNT-NH2 用于智能藥物輸送。然而，目前碳納米管作為納米材料，因為細胞毒性問題阻礙了其在骨修復領域的應用[29]。結合以往 MWCNT 含量對細胞毒性的影響，證實<50 μg/mL 的含量是安全范圍，所以制備復合支架時采用 0.2 wt.% 的含量在安全范圍以內[30]。本研究組織學觀察結果表明，術后并未發生因材料植入導致的炎癥反應，說明通過提純及官能化處理，可以避免納米材料因團聚或吸附雜質等原因引起的細胞毒性。而且，碳納米管與聚乳酸混合后制備成復合支架材料，使碳納米管結合的多肽在修復過程中穩定釋放，又有利于碳納米管隨聚乳酸的降解而緩慢排出。與一些其他未引入活性物質的骨修復材料體系相比，在術后相同時間實現了更好的修復效果[31-32]。而相比于近期研究使用膠原或負載基因作為活性物質的骨修復材料體系，本研究制備的材料修復時間相對稍長，但本研究使用的多肽與之相比具有低成本的優勢[33]。
綜上述，本研究一方面驗證了共價結合對 BMP-2 多肽的活性影響較小，修復效果優于非共價結合，而且通過不同官能團共價結合受不同電荷影響；另一方面，在今后多肽復合材料應用過程中，應對不同種類多肽如 P-15 多肽或 OGP 肽等，或各類官能團如羥基、巰基、鄰苯二酚基等因素進行更深入和系統地討論，從材料選擇和制備等方面提供一定參考，以期制備出更高性能的骨修復材料。
作者貢獻：邸運濤負責制作骨缺損模型和數據收集；王存陽負責骨修復材料的制備，數據分析和文章撰寫；朱惠學負責指導動物模型制作；于素香負責制作組織切片；任義行負責協助制作骨缺損模型；李曉明負責整體實驗設計和指導，觀點補充及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突，且經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經保定市第四中心醫院倫理委員會批準（2020028）。實驗動物使用許可證批準號 SYXK（冀）2017-002。
