引用本文： 張月, 劉克達, 閆明, 王蔚. 濃縮生長因子聯合礦化膠原材料對 BMSCs 黏附、增殖和成骨分化的影響及體內成骨效應. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(3): 295-302. doi: 10.7507/1002-1892.202009070 復制
腫瘤、骨髓炎、先天畸形和外傷等均可導致骨缺損，骨缺損的再生修復是近年臨床研究熱點[1]。隨著材料學和骨組織工程領域的發展，復合多種高分子的人工骨材料可以滿足多種臨床需求[2]。礦化膠原（mineralized collagen，MC）材料是一種優良的人工骨替代材料，通過仿生學技術在體外礦化制備而成，可以根據臨床需要制備不同規格和形狀[3-4]。MC 材料可廣泛應用于顱骨、頜骨及四肢骨等部位骨缺損修復、脊柱融合手術、牙周組織再生等方面。作為較理想的支架材料，MC 材料具有多孔結構和良好生物學特性，可為細胞黏附、生長和分化提供穩定支持，有利于新生骨組織形成[5]。
濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）是新一代血小板濃縮提取物，它通過變速離心，最大程度激活血小板，富集到高濃度生長因子（包括 PDGF、TGF-β、IGF、VEGF、EGF、BMPs 等）并將它們緩慢釋放出來，從而起到促進組織再生等作用[6-7]。將 CGF 單獨或與植骨材料聯合應用于美容、燒傷治療以及骨增量或骨缺損修復（如口腔種植手術）、慢性骨髓炎等外科手術中，已得到臨床廣泛認可[8-13]。
為了更好修復骨缺損，提高細胞在 MC 材料上的黏附、增殖活性，加快新生骨組織沉積速度，本研究擬將 CGF 與 MC 材料聯合應用于骨組織工程中，但兩者以何種比例混合可達最佳效果尚不明確。因此，本研究制取 CGF 提取液（CGF extracts，CGFe），通過相關檢測探究不同濃度 CGFe 對 MC 材料上人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）黏附、增殖及成骨分化的影響，并將兩者復合物植入兔下頜骨缺損模型觀察新骨形成情況，以期為 CGF 和 MC 材料在骨缺損修復再生中的聯合應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、動物及主要試劑、儀器
hBMSCs（北京裕恒豐有限公司）；MC 材料（北京奧精科技有限公司）。健康 7～12 月齡新西蘭大耳兔 18 只，體質量（3.5±0.5）kg，雌雄不限，由青島康大生物科技有限公司提供。
α-MEM 培養液（HyClone 公司，美國）；FBS（Serapro 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ALP 活性試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠抗人骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、Alexa Fluor 564 標記山羊抗小鼠二抗（Abcam 公司，美國）；β-tubulin 抗體（Affinity 公司，美國）；5×蛋白上樣緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。MultiskanMS-352 酶標定量測試儀（Tecan 公司，瑞士）；IX50 倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）；Forma steri-cycle 371 培養箱（Thermo 公司，美國）；S4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CGF 血纖維蛋白離心機（Medifuge 公司，意大利）；Tanon SDS-PAGE 蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）。Microview 軟件（GE Healthcare BioSciences 公司，美國）。
1.2 MC 材料表面形貌觀察
采用掃描電鏡觀察 MC 材料表面多孔形貌，并測量材料孔徑和計算孔隙率。
1.3 CGF 的獲取
篩選 10 名志愿者，年齡 20～30 歲，心、肝、腎功能正常，血常規正常，無乙肝表面抗原陽性、丙肝、梅毒、免疫系統疾病、代謝性疾病等，近期無感冒。提前設定好 CGF 制備程序[14]，抽取志愿者靜脈血 9 mL，立即放入離心機轉筒中，對側配平保證轉子平衡，變速離心（2 400～3 000 r/min）12 min，得到 CGF 凝膠。
1.4 體外實驗
1.4.1 CGFe 的制備
在超凈工作臺內，用鑷子去掉 CGF 凝膠上的紅細胞，然后放入無菌離心管中，用研磨棒研磨凝膠，擠出 CGF 滲出液；再用剪刀剪碎組織塊，置于?80℃ 冰凍 1 h，4℃ 冰箱解凍后用高速攪拌器攪拌，室溫下以 3 000×g 離心 8 min，取上清，即為 CGFe。超凈臺內用 0.22 μm 濾器過濾后分裝于?20℃ 冰箱保存，避免反復凍融[13]。
1.4.2 實驗分組
取 hBMSCs 分為 4 組，A、B、C 組分別用含 2%、5%、10%CGFe 的 α-MEM 培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗）培養；D 組用不含 CGFe 的 α-MEM 培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗）培養。各組所用含 CGFe 的培養基均為在含 10%FBS 培養基基礎上再加 CGFe。
1.4.3 CGFe 對細胞黏附的影響
將各組細胞懸液按照 2×104 個/孔密度接種于 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組設 3 個復孔。培養 24 h 后吸去培養液，4℃ 以 2.5% 戊二醛固定 3 h，梯度乙醇脫水，空氣中干燥，噴金，掃描電鏡觀察。
1.4.4 CGFe 對細胞增殖的影響
將各組細胞懸液按照 4×104 個/孔密度接種至 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組每個時間點設 3 個復孔。培養 1、2、3、5、7 d 后，每孔添加 100 μL CCK-8 試劑，繼續培養 1 h，每孔吸取 110 μL 反應液于 96 孔板中。根據 CCK-8 試劑盒說明書操作，于 450 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值。
1.4.5 ALP 活性檢測
將各組細胞懸液按照 4×104 個/孔密度接種至 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組每個時間點設 3 個復孔，每 3 天換液。每組細胞分別采用成骨誘導培養液（含 50 mg/L 維生素 C、10 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10%FBS 的 α-MEM 培養基）誘導培養，5、7、14 d 后吸去培養液，PBS 輕柔清洗 3 次，加入 500 μL 0.1%Triton X-100，4℃、12 000 r/min 離心 5 min。收集上清液，用 BCA 法測定蛋白濃度，根據 ALP 檢測試劑盒說明書操作并計算各組 ALP 活性。
1.4.6 Western blot 檢測 OPN 蛋白表達
各組細胞同 1.4.5 方法成骨誘導培養 14 d 后，用 RIPA 提取細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。取 35 μg 細胞總蛋白溶液與 5×SDS 加樣緩沖液混勻，100℃ 加熱 5 min 使蛋白變性，加樣于 10%SDS-PAGE 凝膠中，電泳 80 V、30 min，100 V、1 h，再將蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上；硝酸纖維素膜用 5% 脫脂牛奶室溫下封閉 1 h，PBST 洗膜 5 min×1 次；用小鼠抗人 OPN 抗體（1∶1 000）孵育過夜，PBST 洗膜 5 min×3 次；用山羊抗小鼠抗體（1∶10 000）孵育 1 h，PBST 洗膜 10 min×3 次。掃描成像，用 Image master VDS 成像分析系統進行灰度值檢測，以 OPN 蛋白和內參蛋白 β-tubulin 的灰度值比值作為 OPN 蛋白相對表達量。
1.5 體內實驗
取 18 只新西蘭大耳兔，耳緣靜脈注射 20% 烏拉坦（5 mL/kg）麻醉后，抽取 9 mL 靜脈血同前法離心得到 CGF 凝膠。于雙側下頜骨體部下緣 5 mm 作一長 2～3 cm 平行切口，暴露骨面；左、右側下頜骨使用中空取骨鉆分別制備一直徑 8 mm、深 4 mm 的圓形骨缺損區；左、右側骨缺損區分別植入 0.1 mL CGF 凝膠+0.05 g MC 材料（體積比 1∶1，實驗組）和 0.1 g 單純 MC 材料（對照組）。
術后 4、8、12 周分別取 6 只兔，采用空氣栓塞法處死，取材，行 Micro-CT 掃描觀察體內新骨形成及材料降解情況。通過 Microview 軟件對 Micro-CT 觀察結果進行三維重建分析，計算新生骨體積（new bone volume，BV）、新生骨體積百分比（new bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁數（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離（trabecular separation，Tb.Sp）及材料剩余體積（residual material volume，MV）、材料剩余體積百分比（residual material volume fraction，MV/TV）。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 MC 材料表面形貌觀察
MC 材料表面粗糙，疏松有孔。掃描電鏡觀察示材料呈三維立體多孔網狀分層結構，含有大量孔徑大小不一（50～500 μm）的孔隙，孔隙之間相互廣泛交通，孔隙率>70%。見圖 1。
圖1
MC 材料掃描電鏡觀察
a. ×500；b. ×1 000
Figure1. Scanning electron microscopy observation of MC materiala. ×500; b. ×1 000
2.2 體外實驗
2.2.1 CGFe 對細胞黏附的影響
培養 24 h 掃描電鏡觀察示，各組材料表面均有基質樣物質黏附，材料表面及孔隙內均有細胞長入，細胞呈多角形、長梭形鋪展，伸出偽足與材料相連。其中 D 組細胞鋪展良好，伸出較少、較短的偽足；A、B、C 組細胞伸出的偽足較 D 組多且長，深入孔隙中與材料相連，細胞鋪展范圍大，呈三角形和梭形。見圖 2。
圖2
各組培養 24 h 掃描電鏡觀察（×1 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. Scanning electron microscopy observation of each group cultured for 24 hours (×1 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 CGFe 對細胞增殖的影響
各組細胞增殖曲線均呈 S 形，A、B、C 組細胞培養 2 d 進入對數生長期，D 組 3 d 開始快速增長，各組于 5 d 后進入平臺期。培養 2、3、5、7 d 時，A、B、C 組細胞 A 值顯著大于 D 組，C 組大于 A、B 組，B 組大于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
CCK-8 法檢測各組各時間點細胞增殖情況
Figure3.
CCK-8 method to detect cell proliferation at each time point in each group
2.2.3 ALP 活性檢測
隨成骨誘導時間延長，各組 ALP 活性均逐漸增高。5、7、14 d 時 A、B、C 組 ALP 活性均顯著高于 D 組，7、14 d 時 C 組顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各組成骨誘導各時間點 ALP 活性檢測
Figure4.
Detection of ALP activity at each time point of osteogenic induction
2.2.4 Western blot 檢測 OPN 蛋白表達
成骨誘導培養 14 d，A、B、C、D 組 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.54±0.01、0.56±0.03、0.60±0.01、0.38±0.01，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
成骨誘導培養 14 d Western blot 檢測各組 OPN 蛋白表達
1：C 組 2：B 組 3：A 組 4：D 組
Figure5. Western blot detection of OPN protein expression in each group after osteogenic induction cultured for 14 days1: Group C 2: Group B 3: Group A 4: Group D
2.3 體內實驗
Micro-CT 觀察示，隨時間延長，兩組體內材料逐漸降解而新生骨量不足，至 12 周時骨缺損仍未完全愈合；但各時間點實驗組骨缺損修復情況明顯優于對照組。見圖 6、7。
圖6
術后各時間點 Micro-CT 掃描觀察兩組體內新骨形成情況
從左至右分別為術后 4、8、12 周 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6. Micro-CT scanning at each time point after operation to observe the formation of new bone in the two groupsFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖7
術后各時間點 Micro-CT 掃描觀察兩組體內材料降解情況
從左至右分別為術后 4、8、12 周 a. 實驗組；b. 對照組
Figure7. Micro-CT scanning at each time point after operation to observe the degradation of the materials in the two groupsFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Experimental group; b. Control group
定量分析顯示，隨時間延長，兩組 BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均逐漸增加，而 MV、Tb.Sp、MV/TV 均逐漸減少。各時間點實驗組 BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均顯著高于對照組，MV、Tb.Sp、MV/TV 均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖8
術后各時間點兩組 Micro-CT 定量檢測
a. BV；b. BV/TV；c. Tb.N；d. Tb.Th；e. Tb.Sp；f. MV；g. MV/TV
Figure8. Micro-CT quantitative detection at each time point after operation in the two groupsa. BV; b. BV/TV; c. Tb.N; d. Tb.Th; e. Tb.Sp; f. MV; g. MV/TV
3 討論
MC 材料是一種類似人體骨等級分層結構的三維多孔骨移植材料[4]，包括充填仿生骨、骨粉、骨水泥、海綿充填塞和引導骨再生膜等多種規格形式，同時具有可塑性，可滿足臨床不同需要[15]。其作為優良植骨材料，具備良好的機械性能，與天然骨組織相似，可以滿足生物所需機械強度和彈性模量；具備生物相容性，為成骨活動提供良好微環境，有利于細胞黏附、生長；具備優良的骨傳導性和骨誘導性，其三維多孔結構間孔隙相互連通，利于細胞和血管長入，促進 BMSCs 趨化和分化，生成鈣基質和膠原，從而利于新生骨沉積；具有生物降解性，材料植入機體后在新生骨沉積同時發生吸收改建，且新生骨形成和材料改建速率相協調。MC 材料符合理想骨支架材料基本要求，能夠促進人 MSCs 成骨分化，利于骨組織再生修復，在臨床中的應用逐漸增多[5]。
目前臨床中血小板制品主要包括富血小板血漿、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）以及 CGF。PRF 是第 2 代血小板濃縮物，能提供豐富的自體細胞因子和生長因子，可作為一種新型生物材料應用于臨床[16]。CGF 制作原理與 PRF 相似，但不添加凝血酶等生物制劑，有效模擬了生理性凝血過程，同時通過改變離心轉速（2 400～2 700 r/min）促進纖維蛋白緩慢聚合，激活血小板，從而富集到相對前 2 代血小板濃縮物濃度更高的生長因子[11, 17]。同時，CGF 纖維蛋白凝膠一方面具有致密的纖維網狀結構，可以為細胞等提供良好生物支撐，誘導新生組織形成；另一方面，有研究認為 CGF 內血小板結構未完全破壞，隨著纖維蛋白不斷溶解，血小板再度激活，能長期緩慢釋放 PDGF、TGF-β 等各種生長因子，誘導成骨細胞遷移、增殖、分化，促進骨愈合[18-21]。本研究通過在細胞培養基中添加不同濃度 CGFe，觀察不同濃度 CGFe 對 MC 材料上 BMSCs 黏附、增殖和成骨分化的影響。相關研究表明[22-25]，濃度低于 10% 的 CGFe 以劑量依賴方式促進人骨髓基質細胞增殖和成熟，但濃度為 20% 時其對細胞的正向效果弱于 10%，而起到抑制作用，提示 CGFe 有一適宜的有效作用濃度。有學者[16, 22]分析存在這種雙向效應的原因可能是 CGFe 不僅含有促進細胞增殖和誘導成骨的生長因子，同時還含有白細胞及 IL-1、TNF 等炎癥因子。在高濃度 CGFe 下，抑制起主導作用，這些抑制作用可以體現在細胞增殖及成骨分化等多個方面。綜上，CGF 富含多種功能的生長因子，在不同條件、不同濃度下可產生不同作用及效果。因此本實驗通過設置 2%、5%、10% 3 種濃度，來探討 CGFe 的最適濃度。
BMSCs 是由 Friedenstein 等[26]于 20 世紀六七十年代通過骨髓培養法獲得的貼壁生長細胞，并且他首次發現該細胞具有向成骨細胞、脂肪細胞等多種細胞系轉化的潛能，還能夠跨胚層分化。已有研究表明[27]，BMSCs 能向骨細胞系發展并形成礦化基質，進而形成骨組織。本研究通過體外實驗將 hBMSCs 接種于 MC 材料上，采用經典成骨誘導機制，探究材料生物相容性和細胞成骨活性；同時，為更好修復骨缺損，增加材料臨床應用性，在培養基內加入富含誘導成骨生長因子的 CGFe。體外實驗中，hBMSCs 接種于 MC 材料表面后 24 h 掃描電鏡觀察，細胞在 MC 材料表面及孔隙中生長，有偽足黏附于材料；添加 CGFe 的 A、B、C 組細胞相對于不添加 CGFe 的 D 組伸出偽足較多，且深入到孔隙中，與材料相連。CCK-8 法檢測示，A、B、C 組細胞增殖更早進入對數生長期，A 值顯著高于 D 組，且 CGFe 濃度越高，細胞增殖能力越強。ALP 活性是干細胞向成骨細胞表型轉化早期階段的生物學標志物[28]，本研究檢測結果顯示，ALP 活性隨成骨誘導時間延長而增高，A、B、C 組 ALP 活性明顯高于 D 組，且 ALP 活性與 CGFe 濃度成正相關。OPN 表達被認為是成骨細胞分化成熟的晚期標志[13, 22]。本研究 Western blot 檢測結果表明，A、B、C 組 OPN 蛋白相對表達量較 D 組升高，且 CGFe 濃度越高，OPN 蛋白條帶灰度值越大。上述結果表明，MC 材料具有良好的生物相容性和細胞親和性，CGF 在一定程度上能促進細胞黏附、伸展、增殖，在早期成骨細胞轉化和晚期成骨礦化中也具有促進作用。同時，在一定濃度范圍內，這種促進作用隨濃度升高而增加，可認為在 10% 濃度以內 CGFe 促進作用與濃度成正相關，這與其他學者[16, 23]研究結果一致。
大量實驗研究和臨床實踐證明[29]，MC 材料可模擬松質骨的微孔結構，為骨骼生長提供自然環境，并且具有良好生物相容性、骨傳導性和骨誘導性。體內實驗證實 CGF 單獨應用或聯合骨替代材料修復骨缺損，均表現出良好的骨再生潛能，能夠促進組織愈合和新生骨形成，在骨缺損修復等手術及術后抗感染、減輕炎癥腫脹反應等方面具有良好效果[30-31]。本研究將 CGF 與 MC 材料聯合應用于兔下頜骨缺損修復，表現出良好的新骨形成和材料降解。術后 8 周 Micro-CT 結果顯示實驗組成骨效果優于對照組，實驗組 BV、BV/TV、Tb.N 及 Tb.Th 顯著高于對照組，MV、MV/TV、Tb.sp 均顯著低于對照組。但對于 CGF 和 MC 材料聯合使用增強成骨效果的機制尚不明確，有待進一步研究。本研究不足在于兩種材料混合植入動物體內后，僅通過影像學檢測評估了新骨形成情況，而植入后是否產生免疫排斥反應、組織學改變以及新骨形成后的生物力學等均需進一步探究。
綜上述，MC 材料具有良好的生物相容性，BMSCs 可以在 MC 材料上良好生長；CGF 可以促進 MC 材料上 BMSCs 的黏附、增殖和成骨分化，而且 10%CGFe 的促進作用明顯強于 5%CGFe 和 2%CGFe，在 10% 濃度以內時 CGFe 促進作用與濃度成正相關。本研究為今后 CGF 和 MC 材料在骨缺損再生修復方面的聯合應用奠定了基礎。
作者貢獻：張月直接參與實驗研究，重點進行細胞實驗、動物實驗以及數據收集和文章撰寫；劉克達參與動物實驗及統計分析；閆明指導實驗設計及實施；王蔚提供實驗設計思路并把控實驗的正確實施，文章修改，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫科大學附屬口腔醫院醫學倫理委員會批準［（2019）科倫審字（8）號］。志愿者均知情同意。動物使用許可證號：SYXK（遼）2013-0007。
腫瘤、骨髓炎、先天畸形和外傷等均可導致骨缺損，骨缺損的再生修復是近年臨床研究熱點[1]。隨著材料學和骨組織工程領域的發展，復合多種高分子的人工骨材料可以滿足多種臨床需求[2]。礦化膠原（mineralized collagen，MC）材料是一種優良的人工骨替代材料，通過仿生學技術在體外礦化制備而成，可以根據臨床需要制備不同規格和形狀[3-4]。MC 材料可廣泛應用于顱骨、頜骨及四肢骨等部位骨缺損修復、脊柱融合手術、牙周組織再生等方面。作為較理想的支架材料，MC 材料具有多孔結構和良好生物學特性，可為細胞黏附、生長和分化提供穩定支持，有利于新生骨組織形成[5]。
濃縮生長因子（concentrated growth factor，CGF）是新一代血小板濃縮提取物，它通過變速離心，最大程度激活血小板，富集到高濃度生長因子（包括 PDGF、TGF-β、IGF、VEGF、EGF、BMPs 等）并將它們緩慢釋放出來，從而起到促進組織再生等作用[6-7]。將 CGF 單獨或與植骨材料聯合應用于美容、燒傷治療以及骨增量或骨缺損修復（如口腔種植手術）、慢性骨髓炎等外科手術中，已得到臨床廣泛認可[8-13]。
為了更好修復骨缺損，提高細胞在 MC 材料上的黏附、增殖活性，加快新生骨組織沉積速度，本研究擬將 CGF 與 MC 材料聯合應用于骨組織工程中，但兩者以何種比例混合可達最佳效果尚不明確。因此，本研究制取 CGF 提取液（CGF extracts，CGFe），通過相關檢測探究不同濃度 CGFe 對 MC 材料上人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）黏附、增殖及成骨分化的影響，并將兩者復合物植入兔下頜骨缺損模型觀察新骨形成情況，以期為 CGF 和 MC 材料在骨缺損修復再生中的聯合應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料、動物及主要試劑、儀器
hBMSCs（北京裕恒豐有限公司）；MC 材料（北京奧精科技有限公司）。健康 7～12 月齡新西蘭大耳兔 18 只，體質量（3.5±0.5）kg，雌雄不限，由青島康大生物科技有限公司提供。
α-MEM 培養液（HyClone 公司，美國）；FBS（Serapro 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ALP 活性試劑盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠抗人骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、Alexa Fluor 564 標記山羊抗小鼠二抗（Abcam 公司，美國）；β-tubulin 抗體（Affinity 公司，美國）；5×蛋白上樣緩沖液（北京康為世紀生物科技有限公司）；SDS-PAGE 凝膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。MultiskanMS-352 酶標定量測試儀（Tecan 公司，瑞士）；IX50 倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）；Forma steri-cycle 371 培養箱（Thermo 公司，美國）；S4800 掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CGF 血纖維蛋白離心機（Medifuge 公司，意大利）；Tanon SDS-PAGE 蛋白電泳儀（上海天能科技有限公司）。Microview 軟件（GE Healthcare BioSciences 公司，美國）。
1.2 MC 材料表面形貌觀察
采用掃描電鏡觀察 MC 材料表面多孔形貌，并測量材料孔徑和計算孔隙率。
1.3 CGF 的獲取
篩選 10 名志愿者，年齡 20～30 歲，心、肝、腎功能正常，血常規正常，無乙肝表面抗原陽性、丙肝、梅毒、免疫系統疾病、代謝性疾病等，近期無感冒。提前設定好 CGF 制備程序[14]，抽取志愿者靜脈血 9 mL，立即放入離心機轉筒中，對側配平保證轉子平衡，變速離心（2 400～3 000 r/min）12 min，得到 CGF 凝膠。
1.4 體外實驗
1.4.1 CGFe 的制備
在超凈工作臺內，用鑷子去掉 CGF 凝膠上的紅細胞，然后放入無菌離心管中，用研磨棒研磨凝膠，擠出 CGF 滲出液；再用剪刀剪碎組織塊，置于?80℃ 冰凍 1 h，4℃ 冰箱解凍后用高速攪拌器攪拌，室溫下以 3 000×g 離心 8 min，取上清，即為 CGFe。超凈臺內用 0.22 μm 濾器過濾后分裝于?20℃ 冰箱保存，避免反復凍融[13]。
1.4.2 實驗分組
取 hBMSCs 分為 4 組，A、B、C 組分別用含 2%、5%、10%CGFe 的 α-MEM 培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗）培養；D 組用不含 CGFe 的 α-MEM 培養基（含 10%FBS 和 1% 雙抗）培養。各組所用含 CGFe 的培養基均為在含 10%FBS 培養基基礎上再加 CGFe。
1.4.3 CGFe 對細胞黏附的影響
將各組細胞懸液按照 2×104 個/孔密度接種于 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組設 3 個復孔。培養 24 h 后吸去培養液，4℃ 以 2.5% 戊二醛固定 3 h，梯度乙醇脫水，空氣中干燥，噴金，掃描電鏡觀察。
1.4.4 CGFe 對細胞增殖的影響
將各組細胞懸液按照 4×104 個/孔密度接種至 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組每個時間點設 3 個復孔。培養 1、2、3、5、7 d 后，每孔添加 100 μL CCK-8 試劑，繼續培養 1 h，每孔吸取 110 μL 反應液于 96 孔板中。根據 CCK-8 試劑盒說明書操作，于 450 nm 波長下測定各孔吸光度（A）值。
1.4.5 ALP 活性檢測
將各組細胞懸液按照 4×104 個/孔密度接種至 MC 材料表面，置于 24 孔板中，每組每個時間點設 3 個復孔，每 3 天換液。每組細胞分別采用成骨誘導培養液（含 50 mg/L 維生素 C、10 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10%FBS 的 α-MEM 培養基）誘導培養，5、7、14 d 后吸去培養液，PBS 輕柔清洗 3 次，加入 500 μL 0.1%Triton X-100，4℃、12 000 r/min 離心 5 min。收集上清液，用 BCA 法測定蛋白濃度，根據 ALP 檢測試劑盒說明書操作并計算各組 ALP 活性。
1.4.6 Western blot 檢測 OPN 蛋白表達
各組細胞同 1.4.5 方法成骨誘導培養 14 d 后，用 RIPA 提取細胞總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。取 35 μg 細胞總蛋白溶液與 5×SDS 加樣緩沖液混勻，100℃ 加熱 5 min 使蛋白變性，加樣于 10%SDS-PAGE 凝膠中，電泳 80 V、30 min，100 V、1 h，再將蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上；硝酸纖維素膜用 5% 脫脂牛奶室溫下封閉 1 h，PBST 洗膜 5 min×1 次；用小鼠抗人 OPN 抗體（1∶1 000）孵育過夜，PBST 洗膜 5 min×3 次；用山羊抗小鼠抗體（1∶10 000）孵育 1 h，PBST 洗膜 10 min×3 次。掃描成像，用 Image master VDS 成像分析系統進行灰度值檢測，以 OPN 蛋白和內參蛋白 β-tubulin 的灰度值比值作為 OPN 蛋白相對表達量。
1.5 體內實驗
取 18 只新西蘭大耳兔，耳緣靜脈注射 20% 烏拉坦（5 mL/kg）麻醉后，抽取 9 mL 靜脈血同前法離心得到 CGF 凝膠。于雙側下頜骨體部下緣 5 mm 作一長 2～3 cm 平行切口，暴露骨面；左、右側下頜骨使用中空取骨鉆分別制備一直徑 8 mm、深 4 mm 的圓形骨缺損區；左、右側骨缺損區分別植入 0.1 mL CGF 凝膠+0.05 g MC 材料（體積比 1∶1，實驗組）和 0.1 g 單純 MC 材料（對照組）。
術后 4、8、12 周分別取 6 只兔，采用空氣栓塞法處死，取材，行 Micro-CT 掃描觀察體內新骨形成及材料降解情況。通過 Microview 軟件對 Micro-CT 觀察結果進行三維重建分析，計算新生骨體積（new bone volume，BV）、新生骨體積百分比（new bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁數（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分離（trabecular separation，Tb.Sp）及材料剩余體積（residual material volume，MV）、材料剩余體積百分比（residual material volume fraction，MV/TV）。
1.6 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 MC 材料表面形貌觀察
MC 材料表面粗糙，疏松有孔。掃描電鏡觀察示材料呈三維立體多孔網狀分層結構，含有大量孔徑大小不一（50～500 μm）的孔隙，孔隙之間相互廣泛交通，孔隙率>70%。見圖 1。
圖1
MC 材料掃描電鏡觀察
a. ×500；b. ×1 000
Figure1. Scanning electron microscopy observation of MC materiala. ×500; b. ×1 000
2.2 體外實驗
2.2.1 CGFe 對細胞黏附的影響
培養 24 h 掃描電鏡觀察示，各組材料表面均有基質樣物質黏附，材料表面及孔隙內均有細胞長入，細胞呈多角形、長梭形鋪展，伸出偽足與材料相連。其中 D 組細胞鋪展良好，伸出較少、較短的偽足；A、B、C 組細胞伸出的偽足較 D 組多且長，深入孔隙中與材料相連，細胞鋪展范圍大，呈三角形和梭形。見圖 2。
圖2
各組培養 24 h 掃描電鏡觀察（×1 000）
a. A 組；b. B 組；c. C 組；d. D 組
Figure2. Scanning electron microscopy observation of each group cultured for 24 hours (×1 000)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D
2.2.2 CGFe 對細胞增殖的影響
各組細胞增殖曲線均呈 S 形，A、B、C 組細胞培養 2 d 進入對數生長期，D 組 3 d 開始快速增長，各組于 5 d 后進入平臺期。培養 2、3、5、7 d 時，A、B、C 組細胞 A 值顯著大于 D 組，C 組大于 A、B 組，B 組大于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
CCK-8 法檢測各組各時間點細胞增殖情況
Figure3.
CCK-8 method to detect cell proliferation at each time point in each group
2.2.3 ALP 活性檢測
隨成骨誘導時間延長，各組 ALP 活性均逐漸增高。5、7、14 d 時 A、B、C 組 ALP 活性均顯著高于 D 組，7、14 d 時 C 組顯著高于 A、B 組，B 組高于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
各組成骨誘導各時間點 ALP 活性檢測
Figure4.
Detection of ALP activity at each time point of osteogenic induction
2.2.4 Western blot 檢測 OPN 蛋白表達
成骨誘導培養 14 d，A、B、C、D 組 OPN 蛋白相對表達量分別為 0.54±0.01、0.56±0.03、0.60±0.01、0.38±0.01，各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
成骨誘導培養 14 d Western blot 檢測各組 OPN 蛋白表達
1：C 組 2：B 組 3：A 組 4：D 組
Figure5. Western blot detection of OPN protein expression in each group after osteogenic induction cultured for 14 days1: Group C 2: Group B 3: Group A 4: Group D
2.3 體內實驗
Micro-CT 觀察示，隨時間延長，兩組體內材料逐漸降解而新生骨量不足，至 12 周時骨缺損仍未完全愈合；但各時間點實驗組骨缺損修復情況明顯優于對照組。見圖 6、7。
圖6
術后各時間點 Micro-CT 掃描觀察兩組體內新骨形成情況
從左至右分別為術后 4、8、12 周 a. 實驗組；b. 對照組
Figure6. Micro-CT scanning at each time point after operation to observe the formation of new bone in the two groupsFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Experimental group; b. Control group
圖7
術后各時間點 Micro-CT 掃描觀察兩組體內材料降解情況
從左至右分別為術后 4、8、12 周 a. 實驗組；b. 對照組
Figure7. Micro-CT scanning at each time point after operation to observe the degradation of the materials in the two groupsFrom left to right for 4, 8, and 12 weeks after operation, respectively a. Experimental group; b. Control group
定量分析顯示，隨時間延長，兩組 BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均逐漸增加，而 MV、Tb.Sp、MV/TV 均逐漸減少。各時間點實驗組 BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 均顯著高于對照組，MV、Tb.Sp、MV/TV 均顯著低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 8。
圖8
術后各時間點兩組 Micro-CT 定量檢測
a. BV；b. BV/TV；c. Tb.N；d. Tb.Th；e. Tb.Sp；f. MV；g. MV/TV
Figure8. Micro-CT quantitative detection at each time point after operation in the two groupsa. BV; b. BV/TV; c. Tb.N; d. Tb.Th; e. Tb.Sp; f. MV; g. MV/TV
3 討論
MC 材料是一種類似人體骨等級分層結構的三維多孔骨移植材料[4]，包括充填仿生骨、骨粉、骨水泥、海綿充填塞和引導骨再生膜等多種規格形式，同時具有可塑性，可滿足臨床不同需要[15]。其作為優良植骨材料，具備良好的機械性能，與天然骨組織相似，可以滿足生物所需機械強度和彈性模量；具備生物相容性，為成骨活動提供良好微環境，有利于細胞黏附、生長；具備優良的骨傳導性和骨誘導性，其三維多孔結構間孔隙相互連通，利于細胞和血管長入，促進 BMSCs 趨化和分化，生成鈣基質和膠原，從而利于新生骨沉積；具有生物降解性，材料植入機體后在新生骨沉積同時發生吸收改建，且新生骨形成和材料改建速率相協調。MC 材料符合理想骨支架材料基本要求，能夠促進人 MSCs 成骨分化，利于骨組織再生修復，在臨床中的應用逐漸增多[5]。
目前臨床中血小板制品主要包括富血小板血漿、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）以及 CGF。PRF 是第 2 代血小板濃縮物，能提供豐富的自體細胞因子和生長因子，可作為一種新型生物材料應用于臨床[16]。CGF 制作原理與 PRF 相似，但不添加凝血酶等生物制劑，有效模擬了生理性凝血過程，同時通過改變離心轉速（2 400～2 700 r/min）促進纖維蛋白緩慢聚合，激活血小板，從而富集到相對前 2 代血小板濃縮物濃度更高的生長因子[11, 17]。同時，CGF 纖維蛋白凝膠一方面具有致密的纖維網狀結構，可以為細胞等提供良好生物支撐，誘導新生組織形成；另一方面，有研究認為 CGF 內血小板結構未完全破壞，隨著纖維蛋白不斷溶解，血小板再度激活，能長期緩慢釋放 PDGF、TGF-β 等各種生長因子，誘導成骨細胞遷移、增殖、分化，促進骨愈合[18-21]。本研究通過在細胞培養基中添加不同濃度 CGFe，觀察不同濃度 CGFe 對 MC 材料上 BMSCs 黏附、增殖和成骨分化的影響。相關研究表明[22-25]，濃度低于 10% 的 CGFe 以劑量依賴方式促進人骨髓基質細胞增殖和成熟，但濃度為 20% 時其對細胞的正向效果弱于 10%，而起到抑制作用，提示 CGFe 有一適宜的有效作用濃度。有學者[16, 22]分析存在這種雙向效應的原因可能是 CGFe 不僅含有促進細胞增殖和誘導成骨的生長因子，同時還含有白細胞及 IL-1、TNF 等炎癥因子。在高濃度 CGFe 下，抑制起主導作用，這些抑制作用可以體現在細胞增殖及成骨分化等多個方面。綜上，CGF 富含多種功能的生長因子，在不同條件、不同濃度下可產生不同作用及效果。因此本實驗通過設置 2%、5%、10% 3 種濃度，來探討 CGFe 的最適濃度。
BMSCs 是由 Friedenstein 等[26]于 20 世紀六七十年代通過骨髓培養法獲得的貼壁生長細胞，并且他首次發現該細胞具有向成骨細胞、脂肪細胞等多種細胞系轉化的潛能，還能夠跨胚層分化。已有研究表明[27]，BMSCs 能向骨細胞系發展并形成礦化基質，進而形成骨組織。本研究通過體外實驗將 hBMSCs 接種于 MC 材料上，采用經典成骨誘導機制，探究材料生物相容性和細胞成骨活性；同時，為更好修復骨缺損，增加材料臨床應用性，在培養基內加入富含誘導成骨生長因子的 CGFe。體外實驗中，hBMSCs 接種于 MC 材料表面后 24 h 掃描電鏡觀察，細胞在 MC 材料表面及孔隙中生長，有偽足黏附于材料；添加 CGFe 的 A、B、C 組細胞相對于不添加 CGFe 的 D 組伸出偽足較多，且深入到孔隙中，與材料相連。CCK-8 法檢測示，A、B、C 組細胞增殖更早進入對數生長期，A 值顯著高于 D 組，且 CGFe 濃度越高，細胞增殖能力越強。ALP 活性是干細胞向成骨細胞表型轉化早期階段的生物學標志物[28]，本研究檢測結果顯示，ALP 活性隨成骨誘導時間延長而增高，A、B、C 組 ALP 活性明顯高于 D 組，且 ALP 活性與 CGFe 濃度成正相關。OPN 表達被認為是成骨細胞分化成熟的晚期標志[13, 22]。本研究 Western blot 檢測結果表明，A、B、C 組 OPN 蛋白相對表達量較 D 組升高，且 CGFe 濃度越高，OPN 蛋白條帶灰度值越大。上述結果表明，MC 材料具有良好的生物相容性和細胞親和性，CGF 在一定程度上能促進細胞黏附、伸展、增殖，在早期成骨細胞轉化和晚期成骨礦化中也具有促進作用。同時，在一定濃度范圍內，這種促進作用隨濃度升高而增加，可認為在 10% 濃度以內 CGFe 促進作用與濃度成正相關，這與其他學者[16, 23]研究結果一致。
大量實驗研究和臨床實踐證明[29]，MC 材料可模擬松質骨的微孔結構，為骨骼生長提供自然環境，并且具有良好生物相容性、骨傳導性和骨誘導性。體內實驗證實 CGF 單獨應用或聯合骨替代材料修復骨缺損，均表現出良好的骨再生潛能，能夠促進組織愈合和新生骨形成，在骨缺損修復等手術及術后抗感染、減輕炎癥腫脹反應等方面具有良好效果[30-31]。本研究將 CGF 與 MC 材料聯合應用于兔下頜骨缺損修復，表現出良好的新骨形成和材料降解。術后 8 周 Micro-CT 結果顯示實驗組成骨效果優于對照組，實驗組 BV、BV/TV、Tb.N 及 Tb.Th 顯著高于對照組，MV、MV/TV、Tb.sp 均顯著低于對照組。但對于 CGF 和 MC 材料聯合使用增強成骨效果的機制尚不明確，有待進一步研究。本研究不足在于兩種材料混合植入動物體內后，僅通過影像學檢測評估了新骨形成情況，而植入后是否產生免疫排斥反應、組織學改變以及新骨形成后的生物力學等均需進一步探究。
綜上述，MC 材料具有良好的生物相容性，BMSCs 可以在 MC 材料上良好生長；CGF 可以促進 MC 材料上 BMSCs 的黏附、增殖和成骨分化，而且 10%CGFe 的促進作用明顯強于 5%CGFe 和 2%CGFe，在 10% 濃度以內時 CGFe 促進作用與濃度成正相關。本研究為今后 CGF 和 MC 材料在骨缺損再生修復方面的聯合應用奠定了基礎。
作者貢獻：張月直接參與實驗研究，重點進行細胞實驗、動物實驗以及數據收集和文章撰寫；劉克達參與動物實驗及統計分析；閆明指導實驗設計及實施；王蔚提供實驗設計思路并把控實驗的正確實施，文章修改，對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫科大學附屬口腔醫院醫學倫理委員會批準［（2019）科倫審字（8）號］。志愿者均知情同意。動物使用許可證號：SYXK（遼）2013-0007。
