兒童顱骨缺損修復是神經外科領域的世界性難題。臨床上常見的顱骨修補材料無法滿足兒童顱骨不斷長大和變形的需求。理想的兒童顱骨修補材料應具有良好的誘導成骨能力，實現新骨再生和骨整合；具有匹配生長發育的可降解性能和順應性，不限制正常骨骼生長；在修復過程中維持足夠力學強度，保護顱內組織；易于塑形，滿足美學需求。仿生礦化膠原骨材料是一種在微納尺度上模擬天然骨最小結構單元的納米復合材料，因其具有良好成骨活性而被成功應用于各種骨缺損修復。近年來，礦化膠原骨材料成功應用于顱骨再生修復，并取得了令人滿意的修復效果。該綜述重點介紹仿生礦化膠原骨材料的基本特點，及其用于兒童顱骨缺損再生修復的優勢及相關研究進展。
引用本文： 李博, 王碩, 趙勇剛, 王秀梅. 仿生礦化膠原骨材料用于兒童顱骨再生修復的最新研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(3): 278-285. doi: 10.7507/1002-1892.202009078 復制
顱骨缺損是神經外科臨床常見疾病。造成顱骨缺損的原因大多為后天獲得性損傷，如意外事故造成的開放性缺失、顱骨病變（骨髓炎、骨腫瘤）以及治療腦中風時采取的去骨瓣減壓手術等；也可能是先天顱骨閉合不全、顱骨發育畸形。顱骨缺損如不及時修補，會引發顱骨缺損綜合征甚至誘發腦損傷，嚴重威脅患者生命安全，導致心理疾病和社交障礙等[1-3]。值得一提的是，兒童頭部意外損傷位于各種意外損傷之首，且將近半數病例為 3 歲以下嬰幼兒[4]。
臨床上對于直徑超過 3 cm 的成人顱骨缺損，采用顱骨成形術進行治療，即通過覆蓋合適的修補材料來修補缺損，實現顱內部相對密閉，從而在生理上維持穩定顱內壓，減輕顱骨缺損綜合征，同時還可實現外觀美容效果[2, 5-6]。這種治療手段有較長發展歷史，至今尚不完善，手術時機是影響治療效果的重要因素之一。對于成人，在保證損傷恢復良好前提下，應適時接受顱骨成形術治療[7-9]。而對于兒童，情況則更為復雜，兒童顱骨成形術的手術時機一直存在廣泛爭議。若即刻修補，術后可能會伴隨感染、材料損壞、外圍正常骨吸收、顱骨材料限制周圍骨生長導致骨畸變，甚至顱腦損傷等風險；但若待患兒生長發育到一定年齡再進行手術，由于生長發育中大腦缺乏保護，很可能會導致腦萎縮、神經功能障礙等問題[1, 10-11]。因此，兒童顱骨缺損修復是神經外科領域的世界性難題，亟需有效的臨床解決方案。
本文綜述了顱骨解剖學結構以及兒童顱骨生長發育的特點，將目前臨床常用的顱骨修復材料性能進行了細致對比；結合本研究團隊研發的具有成骨活性的仿生礦化膠原與可降解高分子材料構建的適用于顱骨再生修復的骨材料支架在生物體內的應用，分別制備了仿松質骨和密質骨系列骨材料，二者具有不同的降解速率和力學強度；同時，展望了 3D 打印技術在生物材料領域的突出特點，以及復合結構支架在顱骨修復中的潛在優勢。
1 顱骨生長發育及損傷修復
1.1 顱骨的解剖學特點
人的大腦外側主要由顱骨及其周圍組織構成，自上而下包括頭皮、顱骨以及腦膜[12]。顱骨由 23 塊形狀和大小不同的扁骨及不規則骨組成，除了下頜骨和舌骨以外，其余 21 塊骨經由骨縫結合或者軟骨結合形成一穩固整體，實現對顱內組織的保護作用。顱分為腦顱和面顱兩部分，腦顱位于顱的后上部，包括成對的頂骨、顳骨以及不成對的額骨、蝶骨、枕骨和篩骨共 8 塊，承擔著支撐大腦所在空間、保護腦組織的關鍵任務；根據相對位置，又可將腦顱分解成兩部分：顱底骨與顱蓋骨。面顱為顱的前下部分，包含成對的上頜骨、顴骨、鼻骨、下頜骨、舌骨等 15 塊，構成面部和五官的骨性支架。
顱蓋骨分為 3 層，即外骨板、板障層以及內骨板。在顱蓋骨與大腦之間的腦膜包括 3 層，自上而下依次是硬腦膜、蛛網膜以及軟腦膜。硬腦膜為 3 種軟組織中最強韌的部分，在顱骨下方輔助保護大腦。蛛網膜為一層很薄的半透明結締組織，其中幾乎沒有神經或血管；其下方存在較大空腔，稱為蛛網膜下腔，其中充斥著腦脊液。軟腦膜同樣是薄且透明的一層膜，但其中含有豐富的微血管網絡，是為大腦提供養分的重要途徑之一。在顱蓋骨與腦膜相鄰的內側，存在大量不規則溝槽結構，為硬腦膜上血管行走的痕跡，于人體發育過程中自然形成。
1.2 顱骨生長發育特點
不同年齡階段顱骨生長發育速度不同，相關量化指標包括顱腔容積、頭圍長度以及顱骨形狀。多項研究采取 X 線數據計算機重構數學模型的方式估算兒童顱腔容積[13]。印度一項相關研究[14]測量了 1 800 名印度 0～16 歲兒童及青少年的顱腔容積，結果表明，男嬰剛出生時的平均顱腔容積為 370 mL，僅僅是印度成年男性平均值的 28%；而出生 6 個月的嬰兒顱腔容積顯著增加，男性和女性個體分別占成年后的 65% 和 59%；而 5 歲左右的兒童在正常發育前提下，顱腔容積可達最終大小的 80%。根據此項研究結果，兒童顱骨發育按照生長速度大體可分為 3 個時期。第 1 個為極快速增長期，對應階段為出生后至 1 歲，顱腔容積呈現大幅度變化；第 2 個為快速增長期，對應階段為 1 歲以后至 5、6 歲，顱腔容積快速持續增長；第 3 個為慢速增長期，對應階段為 6 歲以后直至成熟，顱腔容積緩慢增長并最終趨于平穩。此外，兒童的頭圍增長變化也被用來評估顱骨生長速度。國內一項研究表明，處于快速增長期的兒童，每月頭圍生長速度在 1.2～1.3 cm[15]。此外，由于骨縫在 3 歲之前尚未閉合，顱骨的外形也時刻發生變化[16]。
1.3 顱骨缺損再生修復
顱骨的形成屬于膜內成骨方式，骨形成過程沒有軟骨出現。首先由未分化的間充質細胞聚集、多層排列成膜狀，這些細胞分泌松散的基質，其中含血管、成纖維細胞、骨前體細胞等；成骨細胞分化形成并分泌針狀或島狀骨基質，骨基質隨即鈣化，成骨細胞覆蓋在這些島狀骨基質表面并繼續增加骨基質；被骨基質包埋的成骨細胞轉變為骨細胞。最早出現成群的成骨細胞部位被稱為骨化中心，原始的骨小梁從原發骨化中心向周圍擴展。
骨損傷發生后，人體會啟動相應生理機制實現對缺損處的修復再生。顱骨再生修復路徑主要有 3 個：骨膜成骨、板障層成骨、硬腦膜成骨[17-18]。骨材料植入后，與這 3 種不同宿主組織發生接觸，由其提供相應的血供和干細胞來源。其中，板障結構的松質骨有層間血管分布，能夠提供維持組織再生的營養，同時有造血干細胞存在。而硬腦膜相較于板障層血供更加充足，且具有除造血干細胞以外的骨膜干細胞等 MSCs[19]，更有利于細胞募集以及向支架內部遷移。而外骨膜一側干細胞源則較少，且損傷或手術時容易缺失。在骨材料支架引導下，顱骨重構主要依靠這 3 條途徑實現新生組織的爬行替代。
2 顱骨成形術材料
2.1 臨床常用顱骨修補材料
采用顱骨成形術重建顱骨時，填補材料對最終修復效果起關鍵作用。從來源上分，顱骨成形術材料可以分為天然骨材料及其衍生產品和人工合成材料兩大類。其中，自體骨是臨床骨修復的“金標準”，自體骨和同種異體骨在各種骨科治療中廣泛應用。同樣，對于顱骨缺損修復，可使用減壓手術中取出的顱骨骨瓣或體內其他部位的健康扁骨。人工合成材料可分為金屬類、無機非金屬類以及有機高分子類 3 大類[20-22]。鈦及其合金在顱骨成形術中較常見，是制備醫用型鈦網的材料，其中使用較多的是 Ti-6Al-4V 合金。而無機非金屬材料以具有生物活性的陶瓷類材料最為典型，包括純羥基磷灰石材料、磷酸鈣型骨水泥以及生物活性玻璃等[23-25]。近年來，有機高分子材料因具有良好的生物相容性和與顱骨匹配的生物力學性能受到了越來越多的關注，如聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）、多孔聚乙烯材料等[26-27]。
2.2 現有顱骨修補材料的不足
上述各種材料能夠一定程度上滿足顱骨成形術要求，但也存在不容忽視的缺點，見表 1。并非所有患者都有自體骨瓣可用，且人體內很難找出與大尺寸顱骨缺損形狀匹配的自體扁骨。有研究表明，對于面積超過 75 cm2的缺損，采用自體骨重構的失敗率可達 60% 以上[28]。鈦合金材料由于彈性模量過高，可能導致嚴重周圍骨吸收；射線的屏蔽作用也不利于患者影像學檢查；此外還存在導熱過高的問題[29-30]。PMMA 材料脆性較大，且不易與周圍組織形成骨性結合。PEEK 材料造價較高、成型復雜，無明顯成骨活性或者骨整合能力[31-32]。
表1
常用顱骨修補材料的優缺點
Table1.
Advantages and disadvantages of commonly used cranioplasty materials in clinic
2.3 兒童顱骨修補材料的特殊性和基本要求
上述臨床常用顱骨修補材料應用于兒童顱骨缺損修補時問題更為突出。兒童自體骨來源更加有限，且取材會對兒童生長發育造成不可恢復的影響。而人工合成材料均不可降解，不可變形，無法匹配兒童顱骨不斷長大和變形的需求。兒童顱骨成形術所用材料必須考慮兒童發育期的生長特點，不僅能滿足暫時的填補和維持顱內穩定，同時應能夠隨顱骨生長發育而產生變化[33-35]。因此，理想的兒童顱骨修補材料應以再生修復為出發點進行設計，植入材料作為組織再生支架，在體內能夠促進顱骨再生，且實現再生與生長發育的平衡[36-38]。這類材料要滿足以下基本要求：① 形狀匹配，可通過適當工藝進行塑形，實現顱腔密閉、維持內壓穩定、保證外表美觀；② 在植入后及新骨形成前維持符合要求的機械性能，在整個修復周期內對顱腦組織起保護作用；③ 具有較好的新骨誘導能力，促進快速骨整合及骨再生；④ 適宜的降解能力，在完成初期支撐及干細胞募集作用后，逐漸被新生組織替代并最終完全降解；⑤ 具有射線穿透能力，不影響修復過程中的各種常規影像檢查。
3 基于仿生礦化膠原骨材料的顱骨再生修復研究
3.1 組織工程策略修復顱骨缺損
組織工程和再生醫學修復骨組織損傷策略已成功應用于臨床。骨再生修復的核心是開發理想的生物材料支架，構建促進骨再生修復的微環境。組織工程支架材料不僅為缺損區提供結構支撐，同時還遞送多種生物物理、生物化學信號，例如材料彈性模量、拓撲結構、無機離子、生長因子等，調控細胞的增殖、分化等生物學功能，激活組織再生潛能[39-41]。此外，還可以通過 3D 打印或模具塑形方式構建與缺損區形狀匹配的支架，實現個性化定制，同時滿足修復功能與美學要求[42-44]。例如，Kim 等[45]研發了一種 3D 打印的具有宏觀/微觀復合孔隙結構的磷酸鎂陶瓷，并采用兔頂骨 6 mm 直徑圓形缺損模型評價修復效果。結果顯示支架在體內發生了生物降解，降解速率能通過調節孔徑大小來控制，能夠觀察到新生骨組織長入；但是研究缺乏對支架強度的評價，陶瓷材料具有較強脆性，難以保證在顱內環境中的穩定性。Yao 等[46]制備了聚己內酯/聚乳酸靜電紡絲支架（具有高達 95.8% 的孔隙率，以模擬天然細胞外基質的作用），使用小鼠頂骨左側 5 mm 直徑圓形缺損模型評價修復效果。結果顯示，支架中存在大量原位遷移的細胞并向骨細胞分化；但該材料的力學性能過低，抗壓強度不足 0.2 MPa。Prananingrum 等[47]通過造孔方法改變了鈦金屬的微觀結構，形成具有特定尺寸連通孔隙的支架，并將支架應用于新西蘭白兔 5 mm 直徑顱骨缺損模型，進行為期 5 個月的評價。結果表明，通過改善結構能夠提升金屬支架的骨親和性，可以觀察到骨組織長入；但鈦金屬造孔后仍具有較高彈性模量，且無明顯降解性。此外，眾多研究團隊選擇在機械強度、化學組成以及微觀結構方面對骨組織進行模擬，構建能夠誘導骨再生的顱骨材料。值得一提的是，這些研究中針對發育期顱骨缺損修復的較少，均采用的是成年動物模型。
3.2 仿生礦化膠原骨材料修復顱骨缺損及相關機制
天然骨具有復雜的分級結構，其中最小結構單元為礦化膠原微纖維，由有序排列的膠原纖維模板以及在其特有化學位點結合的納米羥基磷灰石晶體自組裝而成。自組裝的礦化膠原微纖維是天然骨組織形成的第 2 級結構[48-49]。清華大學崔福齋團隊于 2003 年首次實現了礦化膠原的體外仿生合成[50-53]。與天然礦化膠原相比，仿生礦化膠原不僅具有一致的化學組成，還在微納結構上具有極高相似性。多年來，大量關于仿生礦化膠原的研究證明其具有優異的骨相容性以及成骨誘導能力。以仿生礦化膠原為主要活性成分的多種骨修復產品已廣泛應用于臨床，并取得了良好修復效果[54-55]。
組成仿生礦化膠原骨材料的納米羥基磷灰石和膠原蛋白對成骨均具有良好促進作用。鈣磷體系作為人骨組成成分，可對干細胞的成骨分化起到調節作用[56-58]。許多研究顯示，鈣磷體系材料不僅能提高包括骨肉瘤細胞、人 BMSCs 在內的多種骨相關細胞的黏附與增殖，還能通過釋放鈣磷離子改變細胞微環境成分、氫離子濃度指數等，實現對細胞成骨分化的調節[59-63]。已有研究表明，仿生礦化膠原能夠顯著促進 MSCs 的成骨分化，激活相關信號通路，調節成骨相關基因表達。其中，TGF-β、BMP 兩種信號在胚胎骨形成以及骨平衡的維持中起到基礎性作用。二者所啟動的是經典 Smad 蛋白依賴型信號通路以及非經典的 p38 激酶依賴型信號通路，兩條信號通路最后都是通過開啟 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2），實現前體細胞向成骨細胞或成軟骨細胞分化。有研究者通過體外培養人 BMSCs，對比了仿生礦化膠原與納米羥基磷灰石促進成骨分化的效果。結果表明仿生礦化膠原能夠通過調節成骨細胞相關基因表達，誘導干細胞成骨分化[52-53]。相比于化學組成相近的納米羥基磷灰石，仿生礦化膠原特有的微納復合結構能夠促進基因的表達。
3.3 仿生礦化膠原顱骨修復體用于顱骨損傷再生修復
近幾年，具有成骨誘導性骨材料的開發是骨組織研究重點。越來越多骨材料被用于顱骨再生修復，或采用顱骨損傷模型評價其成骨能力[64-66]。例如，Kim 等[45]研發了一種具有多孔結構的磷酸鎂陶瓷支架，該支架使用 3D 打印技術制備，且具有宏觀/微觀孔隙復合結構；兔顱骨頂部缺損模型評價結果表明，支架具有一定降解能力，同時能夠促進更多新生骨組織長入。Shao 等[67]設計制備了一種鎂摻雜硅酸鈣生物陶瓷，該材料具有良好的抗壓強度和抗彎強度，在兔顱骨直徑 8 mm 缺損修復中顯示出良好的骨整合能力，大量新生骨組織進入支架間隙中，且材料能夠實現很好的支撐作用。但該材料降解速度慢，新生骨不是置換型再生，而是在材料孔隙間形成。Cui 等[68]和 Tang 等[69]研究表明，支架的力學性能和孔隙特點與其成骨能力密切相關。除了生物陶瓷材料外，近年來高性能的高分子材料和水凝膠材料也被用于骨再生修復[70]。盡管當前顱骨再生修復的研究很多，但關注發育期兒童顱骨缺損修復，特別是對大面積顱骨缺損的研究較少。而對于臨床顱骨缺損而言，其面積往往在 70 cm2 以上，有時甚至會超過 100 cm2，這對誘導再生的骨材料力學穩定性提出了更高要求。
本研究團隊采用具有成骨活性的仿生礦化膠原與可降解高分子材料構建了適用于顱骨再生修復的骨材料支架。通過不同成型工藝和孔隙調控制備了仿松質骨和仿密質骨的系列骨材料，具有不同的降解速率和力學強度[71]。仿松質骨的多孔骨材料微觀形貌為典型的連通孔結構，抗壓強度與天然松質骨相當。體外細胞相容性評價表明，成骨相關細胞（如 MC3T3-E1 細胞、人 MSCs 細胞）在材料表面處于良好黏附狀態，細胞均能正常增殖，顯示出骨材料良好的生物相容性。此外，仿生礦化膠原骨材料能夠促使 BMP-2 和 Runx2 兩種成骨相關基因高表達，同時也能檢測到骨細胞形成過程中的關鍵基因（Ⅰ型膠原和骨橋蛋白）表達活躍[71]。
多孔礦化膠原骨材料的孔徑特性對其在顱骨再生的修復中發揮著重要作用。支架材料的孔徑大小和孔隙率可通過溶劑含量調節，孔徑和孔隙率的增大更有利于支架內部營養交換和新陳代謝過程，有助于周圍骨組織長入；但同時材料強度明顯下降。由于顱骨修復支架要保障顱骨損傷區的結構穩定性和支撐保護作用，因此合適的顱骨修補材料要具有適宜的孔徑特性，達到再生修復和結構支撐相協調。本團隊采用大鼠顱骨缺損模型評價了不同孔徑分布特性的多孔骨材料，結果表明，盡管各組多孔材料均能誘導新骨組織再生，但其再生效率和修復結果卻有明顯差異。隨著孔徑增大，再生骨量出現了逐漸增大又下降的趨勢；孔徑分布為 20～100 μm 的骨支架具有最大成骨面積、骨橋厚度以及定量化成骨體積；當孔徑進一步增大時，支架力學強度明顯下降，骨再生效率也隨之下降。說明顱骨再生修復材料存在著材料降解與組織修復之間的平衡，也存在著力學強度和組織修復之間的平衡[71]。
優化的仿松質骨多孔骨材料雖然具有良好成骨誘導能力，但其力學性能仍不能滿足臨床上大面積顱骨缺損需求。顱骨很薄，但損傷面積往往很大，因此薄板樣的多孔骨材料不能滿足植入時的力學性能要求，更難抵抗高顱內壓，難以保證整個修復周期過程中顱腦內環境相對穩定。因此，本團隊研發了仿密質骨的高強骨材料，具有接近皮質骨量級的強度。在成年小尾寒羊顱骨缺損修復過程中，仿密質骨高強骨材料表現出了優秀的骨整合能力和一定成骨誘導能力。植入后 6 個月 CT 三維重建和組織學評價結果顯示，骨材料與周圍骨之間充分融合，優于作為對照組的 PMMA 和鈦網。材料未發生明顯降解，但與外圍骨形成了骨性結合，在其下方與硬腦膜之間也觀察到明顯新骨形成。可見，該材料能夠提供充分的力學保護，在骨融合前不發生明顯降解和碎裂，起到穩定顱內環境的作用[72]。
兒童顱骨缺損修復具有和成年顱骨缺損修復不同的特殊性，除了要考慮再生能力和力學保護作用，還要求骨材料能夠匹配發育中顱骨的生長變化需求。本團隊研究中，根據羊的生長特征構建了 1 月齡小尾寒羊大尺寸（直徑 3 cm）顱骨缺損模型，能夠在一定程度上模擬 2～3 歲處于快速生長期兒童的顱骨變化。影像學檢查結果表明，1 月齡羊顱骨尺寸在術后 3 個月期間明顯增大。采用仿松質骨多孔骨材料的實驗組從術后不顯影狀態，轉變為術后 3 個月的高骨密度狀態；仿密質骨高強骨材料實驗組與外圍骨之間發生明顯融合，邊界變得模糊，X 線不顯影。樣本的新鮮斷面顯示，仿松質骨材料已基本降解，被新生組織替代，且與周圍骨組織充分融合，無法辨識邊界和材料輪廓，表明通過板障層成骨路徑成骨顯著；而仿密質骨高強骨材料形態完整，但與外圍骨組織充分融合，且無宏觀裂痕，材料底部有明顯新生骨組織，表明其能夠通過誘導硬腦膜成骨路徑促進新骨再生。上述結果表明，多孔骨材料的誘導再生效率能夠匹配其自身降解速率，新組織形成與材料降解同步進行；致密型骨材料維持初始力學強度的時間與骨融合形成時間匹配，牢固結合的同時維持自身完整性。此外，1 月齡羊顱骨在明顯長大過程中，會受到來自植入材料的影響。傳統鈦板具有明顯限制作用，出現了十分嚴重的周圍顱骨畸變。而仿生礦化膠原骨材料未出現這一問題，多孔骨材料因可隨骨長入而逐漸降解，勢必會協同修復和生長過程；而高強骨材料的力學性能和天然顱骨相適應，展示出良好的順應性，能夠促進骨融合同時不限制骨生長[73]。因此，本團隊開發了仿松質骨/仿密質骨雙相復合結構顱骨修復體，多孔骨材料部分快速誘導骨長入，高強骨材料部分提供初始支撐強度。初步研究結果表明，該復合結構顱骨修復體具有理想的顱骨再生修復效果，同時對顱腦的保護作用增強。有關雙相復合結構的設計優化及對顱骨生長/再生的影響正在進一步研究中。
4 小結與展望
兒童顱骨缺損修復一直是世界性難題，特別是關于兒童顱骨成形術的手術時機爭議不斷。但不可否認的是，兒童具有很強的顱骨再生修復能力，是顱骨再生修復的黃金時期。而且，顱骨缺損若不修補，對兒童生理、心理健康都不利。目前，不建議兒童進行顱骨修補的原因主要是現有顱骨修補材料會限制顱骨生長，造成顱骨畸變和顱腦損傷。可見，有關兒童顱骨成形術的爭議焦點在于顱骨修補材料。因此，開發出不限制顱骨生長或能促進顱骨再生修復的修補材料，是兒童顱骨成形術的重中之重。
傳統顱骨成形術材料更偏向于形狀修補，幾乎不具有誘導組織再生潛力，同時材料也多不降解。開發理想修補材料的關鍵在于生長發育和再生修復、結構支撐之間的平衡。仿生礦化膠原骨材料以顱骨的再生修復為出發點，構建了較為適宜的發育期顱骨再生修復微環境，通過調整材料制備工藝以滿足修復中的不同需求。從仿生學角度出發，在微納米結構上礦化膠原微纖維是天然骨的最微小結構單元，其成分和微觀結構都能起到刺激細胞的調控信號作用。仿松質骨材料的微米多孔結構提供了細胞遷移、營養物質以及廢物代謝的物理空間，力學強度與天然松質骨相仿，并且會伴隨組織再生發生降解。而仿密質骨材料則考慮到修復過程中對支架本身力學強度的要求，能夠在不限制外圍骨生長前提下，快速實現與外圍骨的融合，并且在足夠長時間內保持材料自身完整性，維持顱內環境相對穩定。盡管兩種類型礦化膠原骨材料在匹配組織再生降解和維持修復過程穩定兩方面均表現出了適宜性能，但對于發育期大尺寸顱骨缺損修復而言，這兩方面需要兼而有之。因此，設計仿松質骨/仿密質骨雙相復合結構的礦化膠原骨材料，能夠結合二者優點，實現更為良好的修復效果。但復合結構的圖案化設計值得深入研究，應在保障足夠力學支撐前提下實現骨再生最大化。
顱骨缺損修復不同于其他骨骼，往往缺損形狀不規則，且要滿足美學需求，需要具備和患者顱腦輪廓一致的結構，因此對顱骨修補材料提出了更高要求。3D 打印技術為實現顱骨修補材料的個性化制備提供了可能。對于仿生礦化膠原骨材料，開發新的 3D 打印技術能夠實現多孔和致密骨材料的打印，保證礦化膠原的穩定性和生物活性，以及骨材料的強度，是當前研究的重點。
作者貢獻：李博、王碩負責撰稿、文章邏輯；趙勇剛負責撰稿、校稿；王秀梅負責實驗經費、實驗思路、文章構架、撰稿。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持未影響文章觀點。
顱骨缺損是神經外科臨床常見疾病。造成顱骨缺損的原因大多為后天獲得性損傷，如意外事故造成的開放性缺失、顱骨病變（骨髓炎、骨腫瘤）以及治療腦中風時采取的去骨瓣減壓手術等；也可能是先天顱骨閉合不全、顱骨發育畸形。顱骨缺損如不及時修補，會引發顱骨缺損綜合征甚至誘發腦損傷，嚴重威脅患者生命安全，導致心理疾病和社交障礙等[1-3]。值得一提的是，兒童頭部意外損傷位于各種意外損傷之首，且將近半數病例為 3 歲以下嬰幼兒[4]。
臨床上對于直徑超過 3 cm 的成人顱骨缺損，采用顱骨成形術進行治療，即通過覆蓋合適的修補材料來修補缺損，實現顱內部相對密閉，從而在生理上維持穩定顱內壓，減輕顱骨缺損綜合征，同時還可實現外觀美容效果[2, 5-6]。這種治療手段有較長發展歷史，至今尚不完善，手術時機是影響治療效果的重要因素之一。對于成人，在保證損傷恢復良好前提下，應適時接受顱骨成形術治療[7-9]。而對于兒童，情況則更為復雜，兒童顱骨成形術的手術時機一直存在廣泛爭議。若即刻修補，術后可能會伴隨感染、材料損壞、外圍正常骨吸收、顱骨材料限制周圍骨生長導致骨畸變，甚至顱腦損傷等風險；但若待患兒生長發育到一定年齡再進行手術，由于生長發育中大腦缺乏保護，很可能會導致腦萎縮、神經功能障礙等問題[1, 10-11]。因此，兒童顱骨缺損修復是神經外科領域的世界性難題，亟需有效的臨床解決方案。
本文綜述了顱骨解剖學結構以及兒童顱骨生長發育的特點，將目前臨床常用的顱骨修復材料性能進行了細致對比；結合本研究團隊研發的具有成骨活性的仿生礦化膠原與可降解高分子材料構建的適用于顱骨再生修復的骨材料支架在生物體內的應用，分別制備了仿松質骨和密質骨系列骨材料，二者具有不同的降解速率和力學強度；同時，展望了 3D 打印技術在生物材料領域的突出特點，以及復合結構支架在顱骨修復中的潛在優勢。
1 顱骨生長發育及損傷修復
1.1 顱骨的解剖學特點
人的大腦外側主要由顱骨及其周圍組織構成，自上而下包括頭皮、顱骨以及腦膜[12]。顱骨由 23 塊形狀和大小不同的扁骨及不規則骨組成，除了下頜骨和舌骨以外，其余 21 塊骨經由骨縫結合或者軟骨結合形成一穩固整體，實現對顱內組織的保護作用。顱分為腦顱和面顱兩部分，腦顱位于顱的后上部，包括成對的頂骨、顳骨以及不成對的額骨、蝶骨、枕骨和篩骨共 8 塊，承擔著支撐大腦所在空間、保護腦組織的關鍵任務；根據相對位置，又可將腦顱分解成兩部分：顱底骨與顱蓋骨。面顱為顱的前下部分，包含成對的上頜骨、顴骨、鼻骨、下頜骨、舌骨等 15 塊，構成面部和五官的骨性支架。
顱蓋骨分為 3 層，即外骨板、板障層以及內骨板。在顱蓋骨與大腦之間的腦膜包括 3 層，自上而下依次是硬腦膜、蛛網膜以及軟腦膜。硬腦膜為 3 種軟組織中最強韌的部分，在顱骨下方輔助保護大腦。蛛網膜為一層很薄的半透明結締組織，其中幾乎沒有神經或血管；其下方存在較大空腔，稱為蛛網膜下腔，其中充斥著腦脊液。軟腦膜同樣是薄且透明的一層膜，但其中含有豐富的微血管網絡，是為大腦提供養分的重要途徑之一。在顱蓋骨與腦膜相鄰的內側，存在大量不規則溝槽結構，為硬腦膜上血管行走的痕跡，于人體發育過程中自然形成。
1.2 顱骨生長發育特點
不同年齡階段顱骨生長發育速度不同，相關量化指標包括顱腔容積、頭圍長度以及顱骨形狀。多項研究采取 X 線數據計算機重構數學模型的方式估算兒童顱腔容積[13]。印度一項相關研究[14]測量了 1 800 名印度 0～16 歲兒童及青少年的顱腔容積，結果表明，男嬰剛出生時的平均顱腔容積為 370 mL，僅僅是印度成年男性平均值的 28%；而出生 6 個月的嬰兒顱腔容積顯著增加，男性和女性個體分別占成年后的 65% 和 59%；而 5 歲左右的兒童在正常發育前提下，顱腔容積可達最終大小的 80%。根據此項研究結果，兒童顱骨發育按照生長速度大體可分為 3 個時期。第 1 個為極快速增長期，對應階段為出生后至 1 歲，顱腔容積呈現大幅度變化；第 2 個為快速增長期，對應階段為 1 歲以后至 5、6 歲，顱腔容積快速持續增長；第 3 個為慢速增長期，對應階段為 6 歲以后直至成熟，顱腔容積緩慢增長并最終趨于平穩。此外，兒童的頭圍增長變化也被用來評估顱骨生長速度。國內一項研究表明，處于快速增長期的兒童，每月頭圍生長速度在 1.2～1.3 cm[15]。此外，由于骨縫在 3 歲之前尚未閉合，顱骨的外形也時刻發生變化[16]。
1.3 顱骨缺損再生修復
顱骨的形成屬于膜內成骨方式，骨形成過程沒有軟骨出現。首先由未分化的間充質細胞聚集、多層排列成膜狀，這些細胞分泌松散的基質，其中含血管、成纖維細胞、骨前體細胞等；成骨細胞分化形成并分泌針狀或島狀骨基質，骨基質隨即鈣化，成骨細胞覆蓋在這些島狀骨基質表面并繼續增加骨基質；被骨基質包埋的成骨細胞轉變為骨細胞。最早出現成群的成骨細胞部位被稱為骨化中心，原始的骨小梁從原發骨化中心向周圍擴展。
骨損傷發生后，人體會啟動相應生理機制實現對缺損處的修復再生。顱骨再生修復路徑主要有 3 個：骨膜成骨、板障層成骨、硬腦膜成骨[17-18]。骨材料植入后，與這 3 種不同宿主組織發生接觸，由其提供相應的血供和干細胞來源。其中，板障結構的松質骨有層間血管分布，能夠提供維持組織再生的營養，同時有造血干細胞存在。而硬腦膜相較于板障層血供更加充足，且具有除造血干細胞以外的骨膜干細胞等 MSCs[19]，更有利于細胞募集以及向支架內部遷移。而外骨膜一側干細胞源則較少，且損傷或手術時容易缺失。在骨材料支架引導下，顱骨重構主要依靠這 3 條途徑實現新生組織的爬行替代。
2 顱骨成形術材料
2.1 臨床常用顱骨修補材料
采用顱骨成形術重建顱骨時，填補材料對最終修復效果起關鍵作用。從來源上分，顱骨成形術材料可以分為天然骨材料及其衍生產品和人工合成材料兩大類。其中，自體骨是臨床骨修復的“金標準”，自體骨和同種異體骨在各種骨科治療中廣泛應用。同樣，對于顱骨缺損修復，可使用減壓手術中取出的顱骨骨瓣或體內其他部位的健康扁骨。人工合成材料可分為金屬類、無機非金屬類以及有機高分子類 3 大類[20-22]。鈦及其合金在顱骨成形術中較常見，是制備醫用型鈦網的材料，其中使用較多的是 Ti-6Al-4V 合金。而無機非金屬材料以具有生物活性的陶瓷類材料最為典型，包括純羥基磷灰石材料、磷酸鈣型骨水泥以及生物活性玻璃等[23-25]。近年來，有機高分子材料因具有良好的生物相容性和與顱骨匹配的生物力學性能受到了越來越多的關注，如聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）、多孔聚乙烯材料等[26-27]。
2.2 現有顱骨修補材料的不足
上述各種材料能夠一定程度上滿足顱骨成形術要求，但也存在不容忽視的缺點，見表 1。并非所有患者都有自體骨瓣可用，且人體內很難找出與大尺寸顱骨缺損形狀匹配的自體扁骨。有研究表明，對于面積超過 75 cm2的缺損，采用自體骨重構的失敗率可達 60% 以上[28]。鈦合金材料由于彈性模量過高，可能導致嚴重周圍骨吸收；射線的屏蔽作用也不利于患者影像學檢查；此外還存在導熱過高的問題[29-30]。PMMA 材料脆性較大，且不易與周圍組織形成骨性結合。PEEK 材料造價較高、成型復雜，無明顯成骨活性或者骨整合能力[31-32]。
表1
常用顱骨修補材料的優缺點
Table1.
Advantages and disadvantages of commonly used cranioplasty materials in clinic
2.3 兒童顱骨修補材料的特殊性和基本要求
上述臨床常用顱骨修補材料應用于兒童顱骨缺損修補時問題更為突出。兒童自體骨來源更加有限，且取材會對兒童生長發育造成不可恢復的影響。而人工合成材料均不可降解，不可變形，無法匹配兒童顱骨不斷長大和變形的需求。兒童顱骨成形術所用材料必須考慮兒童發育期的生長特點，不僅能滿足暫時的填補和維持顱內穩定，同時應能夠隨顱骨生長發育而產生變化[33-35]。因此，理想的兒童顱骨修補材料應以再生修復為出發點進行設計，植入材料作為組織再生支架，在體內能夠促進顱骨再生，且實現再生與生長發育的平衡[36-38]。這類材料要滿足以下基本要求：① 形狀匹配，可通過適當工藝進行塑形，實現顱腔密閉、維持內壓穩定、保證外表美觀；② 在植入后及新骨形成前維持符合要求的機械性能，在整個修復周期內對顱腦組織起保護作用；③ 具有較好的新骨誘導能力，促進快速骨整合及骨再生；④ 適宜的降解能力，在完成初期支撐及干細胞募集作用后，逐漸被新生組織替代并最終完全降解；⑤ 具有射線穿透能力，不影響修復過程中的各種常規影像檢查。
3 基于仿生礦化膠原骨材料的顱骨再生修復研究
3.1 組織工程策略修復顱骨缺損
組織工程和再生醫學修復骨組織損傷策略已成功應用于臨床。骨再生修復的核心是開發理想的生物材料支架，構建促進骨再生修復的微環境。組織工程支架材料不僅為缺損區提供結構支撐，同時還遞送多種生物物理、生物化學信號，例如材料彈性模量、拓撲結構、無機離子、生長因子等，調控細胞的增殖、分化等生物學功能，激活組織再生潛能[39-41]。此外，還可以通過 3D 打印或模具塑形方式構建與缺損區形狀匹配的支架，實現個性化定制，同時滿足修復功能與美學要求[42-44]。例如，Kim 等[45]研發了一種 3D 打印的具有宏觀/微觀復合孔隙結構的磷酸鎂陶瓷，并采用兔頂骨 6 mm 直徑圓形缺損模型評價修復效果。結果顯示支架在體內發生了生物降解，降解速率能通過調節孔徑大小來控制，能夠觀察到新生骨組織長入；但是研究缺乏對支架強度的評價，陶瓷材料具有較強脆性，難以保證在顱內環境中的穩定性。Yao 等[46]制備了聚己內酯/聚乳酸靜電紡絲支架（具有高達 95.8% 的孔隙率，以模擬天然細胞外基質的作用），使用小鼠頂骨左側 5 mm 直徑圓形缺損模型評價修復效果。結果顯示，支架中存在大量原位遷移的細胞并向骨細胞分化；但該材料的力學性能過低，抗壓強度不足 0.2 MPa。Prananingrum 等[47]通過造孔方法改變了鈦金屬的微觀結構，形成具有特定尺寸連通孔隙的支架，并將支架應用于新西蘭白兔 5 mm 直徑顱骨缺損模型，進行為期 5 個月的評價。結果表明，通過改善結構能夠提升金屬支架的骨親和性，可以觀察到骨組織長入；但鈦金屬造孔后仍具有較高彈性模量，且無明顯降解性。此外，眾多研究團隊選擇在機械強度、化學組成以及微觀結構方面對骨組織進行模擬，構建能夠誘導骨再生的顱骨材料。值得一提的是，這些研究中針對發育期顱骨缺損修復的較少，均采用的是成年動物模型。
3.2 仿生礦化膠原骨材料修復顱骨缺損及相關機制
天然骨具有復雜的分級結構，其中最小結構單元為礦化膠原微纖維，由有序排列的膠原纖維模板以及在其特有化學位點結合的納米羥基磷灰石晶體自組裝而成。自組裝的礦化膠原微纖維是天然骨組織形成的第 2 級結構[48-49]。清華大學崔福齋團隊于 2003 年首次實現了礦化膠原的體外仿生合成[50-53]。與天然礦化膠原相比，仿生礦化膠原不僅具有一致的化學組成，還在微納結構上具有極高相似性。多年來，大量關于仿生礦化膠原的研究證明其具有優異的骨相容性以及成骨誘導能力。以仿生礦化膠原為主要活性成分的多種骨修復產品已廣泛應用于臨床，并取得了良好修復效果[54-55]。
組成仿生礦化膠原骨材料的納米羥基磷灰石和膠原蛋白對成骨均具有良好促進作用。鈣磷體系作為人骨組成成分，可對干細胞的成骨分化起到調節作用[56-58]。許多研究顯示，鈣磷體系材料不僅能提高包括骨肉瘤細胞、人 BMSCs 在內的多種骨相關細胞的黏附與增殖，還能通過釋放鈣磷離子改變細胞微環境成分、氫離子濃度指數等，實現對細胞成骨分化的調節[59-63]。已有研究表明，仿生礦化膠原能夠顯著促進 MSCs 的成骨分化，激活相關信號通路，調節成骨相關基因表達。其中，TGF-β、BMP 兩種信號在胚胎骨形成以及骨平衡的維持中起到基礎性作用。二者所啟動的是經典 Smad 蛋白依賴型信號通路以及非經典的 p38 激酶依賴型信號通路，兩條信號通路最后都是通過開啟 Runt 相關轉錄因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2），實現前體細胞向成骨細胞或成軟骨細胞分化。有研究者通過體外培養人 BMSCs，對比了仿生礦化膠原與納米羥基磷灰石促進成骨分化的效果。結果表明仿生礦化膠原能夠通過調節成骨細胞相關基因表達，誘導干細胞成骨分化[52-53]。相比于化學組成相近的納米羥基磷灰石，仿生礦化膠原特有的微納復合結構能夠促進基因的表達。
3.3 仿生礦化膠原顱骨修復體用于顱骨損傷再生修復
近幾年，具有成骨誘導性骨材料的開發是骨組織研究重點。越來越多骨材料被用于顱骨再生修復，或采用顱骨損傷模型評價其成骨能力[64-66]。例如，Kim 等[45]研發了一種具有多孔結構的磷酸鎂陶瓷支架，該支架使用 3D 打印技術制備，且具有宏觀/微觀孔隙復合結構；兔顱骨頂部缺損模型評價結果表明，支架具有一定降解能力，同時能夠促進更多新生骨組織長入。Shao 等[67]設計制備了一種鎂摻雜硅酸鈣生物陶瓷，該材料具有良好的抗壓強度和抗彎強度，在兔顱骨直徑 8 mm 缺損修復中顯示出良好的骨整合能力，大量新生骨組織進入支架間隙中，且材料能夠實現很好的支撐作用。但該材料降解速度慢，新生骨不是置換型再生，而是在材料孔隙間形成。Cui 等[68]和 Tang 等[69]研究表明，支架的力學性能和孔隙特點與其成骨能力密切相關。除了生物陶瓷材料外，近年來高性能的高分子材料和水凝膠材料也被用于骨再生修復[70]。盡管當前顱骨再生修復的研究很多，但關注發育期兒童顱骨缺損修復，特別是對大面積顱骨缺損的研究較少。而對于臨床顱骨缺損而言，其面積往往在 70 cm2 以上，有時甚至會超過 100 cm2，這對誘導再生的骨材料力學穩定性提出了更高要求。
本研究團隊采用具有成骨活性的仿生礦化膠原與可降解高分子材料構建了適用于顱骨再生修復的骨材料支架。通過不同成型工藝和孔隙調控制備了仿松質骨和仿密質骨的系列骨材料，具有不同的降解速率和力學強度[71]。仿松質骨的多孔骨材料微觀形貌為典型的連通孔結構，抗壓強度與天然松質骨相當。體外細胞相容性評價表明，成骨相關細胞（如 MC3T3-E1 細胞、人 MSCs 細胞）在材料表面處于良好黏附狀態，細胞均能正常增殖，顯示出骨材料良好的生物相容性。此外，仿生礦化膠原骨材料能夠促使 BMP-2 和 Runx2 兩種成骨相關基因高表達，同時也能檢測到骨細胞形成過程中的關鍵基因（Ⅰ型膠原和骨橋蛋白）表達活躍[71]。
多孔礦化膠原骨材料的孔徑特性對其在顱骨再生的修復中發揮著重要作用。支架材料的孔徑大小和孔隙率可通過溶劑含量調節，孔徑和孔隙率的增大更有利于支架內部營養交換和新陳代謝過程，有助于周圍骨組織長入；但同時材料強度明顯下降。由于顱骨修復支架要保障顱骨損傷區的結構穩定性和支撐保護作用，因此合適的顱骨修補材料要具有適宜的孔徑特性，達到再生修復和結構支撐相協調。本團隊采用大鼠顱骨缺損模型評價了不同孔徑分布特性的多孔骨材料，結果表明，盡管各組多孔材料均能誘導新骨組織再生，但其再生效率和修復結果卻有明顯差異。隨著孔徑增大，再生骨量出現了逐漸增大又下降的趨勢；孔徑分布為 20～100 μm 的骨支架具有最大成骨面積、骨橋厚度以及定量化成骨體積；當孔徑進一步增大時，支架力學強度明顯下降，骨再生效率也隨之下降。說明顱骨再生修復材料存在著材料降解與組織修復之間的平衡，也存在著力學強度和組織修復之間的平衡[71]。
優化的仿松質骨多孔骨材料雖然具有良好成骨誘導能力，但其力學性能仍不能滿足臨床上大面積顱骨缺損需求。顱骨很薄，但損傷面積往往很大，因此薄板樣的多孔骨材料不能滿足植入時的力學性能要求，更難抵抗高顱內壓，難以保證整個修復周期過程中顱腦內環境相對穩定。因此，本團隊研發了仿密質骨的高強骨材料，具有接近皮質骨量級的強度。在成年小尾寒羊顱骨缺損修復過程中，仿密質骨高強骨材料表現出了優秀的骨整合能力和一定成骨誘導能力。植入后 6 個月 CT 三維重建和組織學評價結果顯示，骨材料與周圍骨之間充分融合，優于作為對照組的 PMMA 和鈦網。材料未發生明顯降解，但與外圍骨形成了骨性結合，在其下方與硬腦膜之間也觀察到明顯新骨形成。可見，該材料能夠提供充分的力學保護，在骨融合前不發生明顯降解和碎裂，起到穩定顱內環境的作用[72]。
兒童顱骨缺損修復具有和成年顱骨缺損修復不同的特殊性，除了要考慮再生能力和力學保護作用，還要求骨材料能夠匹配發育中顱骨的生長變化需求。本團隊研究中，根據羊的生長特征構建了 1 月齡小尾寒羊大尺寸（直徑 3 cm）顱骨缺損模型，能夠在一定程度上模擬 2～3 歲處于快速生長期兒童的顱骨變化。影像學檢查結果表明，1 月齡羊顱骨尺寸在術后 3 個月期間明顯增大。采用仿松質骨多孔骨材料的實驗組從術后不顯影狀態，轉變為術后 3 個月的高骨密度狀態；仿密質骨高強骨材料實驗組與外圍骨之間發生明顯融合，邊界變得模糊，X 線不顯影。樣本的新鮮斷面顯示，仿松質骨材料已基本降解，被新生組織替代，且與周圍骨組織充分融合，無法辨識邊界和材料輪廓，表明通過板障層成骨路徑成骨顯著；而仿密質骨高強骨材料形態完整，但與外圍骨組織充分融合，且無宏觀裂痕，材料底部有明顯新生骨組織，表明其能夠通過誘導硬腦膜成骨路徑促進新骨再生。上述結果表明，多孔骨材料的誘導再生效率能夠匹配其自身降解速率，新組織形成與材料降解同步進行；致密型骨材料維持初始力學強度的時間與骨融合形成時間匹配，牢固結合的同時維持自身完整性。此外，1 月齡羊顱骨在明顯長大過程中，會受到來自植入材料的影響。傳統鈦板具有明顯限制作用，出現了十分嚴重的周圍顱骨畸變。而仿生礦化膠原骨材料未出現這一問題，多孔骨材料因可隨骨長入而逐漸降解，勢必會協同修復和生長過程；而高強骨材料的力學性能和天然顱骨相適應，展示出良好的順應性，能夠促進骨融合同時不限制骨生長[73]。因此，本團隊開發了仿松質骨/仿密質骨雙相復合結構顱骨修復體，多孔骨材料部分快速誘導骨長入，高強骨材料部分提供初始支撐強度。初步研究結果表明，該復合結構顱骨修復體具有理想的顱骨再生修復效果，同時對顱腦的保護作用增強。有關雙相復合結構的設計優化及對顱骨生長/再生的影響正在進一步研究中。
4 小結與展望
兒童顱骨缺損修復一直是世界性難題，特別是關于兒童顱骨成形術的手術時機爭議不斷。但不可否認的是，兒童具有很強的顱骨再生修復能力，是顱骨再生修復的黃金時期。而且，顱骨缺損若不修補，對兒童生理、心理健康都不利。目前，不建議兒童進行顱骨修補的原因主要是現有顱骨修補材料會限制顱骨生長，造成顱骨畸變和顱腦損傷。可見，有關兒童顱骨成形術的爭議焦點在于顱骨修補材料。因此，開發出不限制顱骨生長或能促進顱骨再生修復的修補材料，是兒童顱骨成形術的重中之重。
傳統顱骨成形術材料更偏向于形狀修補，幾乎不具有誘導組織再生潛力，同時材料也多不降解。開發理想修補材料的關鍵在于生長發育和再生修復、結構支撐之間的平衡。仿生礦化膠原骨材料以顱骨的再生修復為出發點，構建了較為適宜的發育期顱骨再生修復微環境，通過調整材料制備工藝以滿足修復中的不同需求。從仿生學角度出發，在微納米結構上礦化膠原微纖維是天然骨的最微小結構單元，其成分和微觀結構都能起到刺激細胞的調控信號作用。仿松質骨材料的微米多孔結構提供了細胞遷移、營養物質以及廢物代謝的物理空間，力學強度與天然松質骨相仿，并且會伴隨組織再生發生降解。而仿密質骨材料則考慮到修復過程中對支架本身力學強度的要求，能夠在不限制外圍骨生長前提下，快速實現與外圍骨的融合，并且在足夠長時間內保持材料自身完整性，維持顱內環境相對穩定。盡管兩種類型礦化膠原骨材料在匹配組織再生降解和維持修復過程穩定兩方面均表現出了適宜性能，但對于發育期大尺寸顱骨缺損修復而言，這兩方面需要兼而有之。因此，設計仿松質骨/仿密質骨雙相復合結構的礦化膠原骨材料，能夠結合二者優點，實現更為良好的修復效果。但復合結構的圖案化設計值得深入研究，應在保障足夠力學支撐前提下實現骨再生最大化。
顱骨缺損修復不同于其他骨骼，往往缺損形狀不規則，且要滿足美學需求，需要具備和患者顱腦輪廓一致的結構，因此對顱骨修補材料提出了更高要求。3D 打印技術為實現顱骨修補材料的個性化制備提供了可能。對于仿生礦化膠原骨材料，開發新的 3D 打印技術能夠實現多孔和致密骨材料的打印，保證礦化膠原的穩定性和生物活性，以及骨材料的強度，是當前研究的重點。
作者貢獻：李博、王碩負責撰稿、文章邏輯；趙勇剛負責撰稿、校稿；王秀梅負責實驗經費、實驗思路、文章構架、撰稿。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持未影響文章觀點。
