引用本文： 湯勇, 羅科宇, 陳玥琦, 高小亮, 譚玖林, 代其杰, 許建中, 董世武, 羅飛. 層粘連蛋白 α4 鏈功能肽修飾脫鈣骨基質支架誘導 H 型血管及骨生成促進骨缺損修復的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(12): 1594-1601. doi: 10.7507/1002-1892.202006081 復制
節段性骨缺損常發生在創傷、骨感染和骨腫瘤截骨術后，是臨床骨科難題之一。自體骨移植修復是臨床修復骨缺損的“金標準”，但存在自體骨量不足等明顯局限性，獲取足量的高活性骨修復材料是修復此類缺損的關鍵[1-2]。理想的骨修復材料應具有快速血管化能力和強大的骨誘導生物活性。選擇性細胞滯留（selective cell retention，SCR）技術是近年來國外學者報道的骨髓富集技術之一，可在支架材料中快速構建一個包含 BMSCs、血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和各類細胞因子的微環境，達到高效、實用的臨床效果[3]。該技術實際上是一種原位組織工程技術，滯留的細胞及因子越多，為支架提供的骨誘導微環境越好，越利于骨缺損修復。因此，對支架材料表面進行有效修飾，以期促進 SCR 技術處理時細胞和細胞因子滯留，成為當前骨再生領域的重要研究方向[4]。
骨缺損部位嚴重缺氧，骨再生過程中需要血管運輸營養物質及代謝產物，所以血管生成十分重要[5]。前期我們對支架材料的研發聚焦于促進 MSCs 的黏附、遷移、增殖和分化，而對 EPCs 的募集、增殖及分化研究不夠重視，導致很多支架材料在實際修復骨缺損中效果不佳。層粘連蛋白（laminin，LN）是一種基底膜蛋白，對維持和促進內皮細胞血管生成十分重要[6]，能夠促進內皮細胞的黏附、鋪展與增殖[7]。但是 LN 由于相對分子質量大、蛋白質四級結構復雜、體外合成不穩定，尚無相關的簡化功能肽在骨組織工程領域應用。LNα4 鏈是促進血管生成的關鍵部分，與腫瘤增殖、遷移等多種疾病的發生發展密切相關[8]。本課題組長期致力于骨缺損再生研究，本次研究擬將前期研究合成的 LNα4 鏈核心區域功能肽，與環狀 RGD（cyclic RGDfK，cRGD）和帶膠原結構域肽（collagen-binding domain，CBD）固相合成連接，然后表面修飾于脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM），構建 DBM/CBD-LNα4-cRGD（以下簡稱 DBM/LN）支架材料，并行 SCR 技術處理，通過體外細胞實驗和動物模型實驗，驗證該新型材料促進骨及血管生成的作用，以期為解決骨再生過程中血管化不足的難題提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10 周齡雄性 C57 小鼠 26 只，體質量 25～28 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。
DBM（北京大清生物技術股份有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）；RPIM1640 培養基、Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；內皮黏蛋白（endomucin，Emcn）、CD31（Santa Cruz 公司，美國）；Ki67（R&D 公司，美國）；裂解緩沖液（Roche 公司，德國）；VEGF、FAK、p-FAK、ERK1/2、p-ERK1/2 及 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）。
Quanta 200 環境掃描電鏡（FEI 公司，荷蘭）；熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；MaxQ HP 481 軌道振蕩器（Thermo Fisher 公司，美國）；LSM780 激光掃描共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss 公司，德國）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 DBM/LN 制備及觀測
1.2.1 DBM/LN 制備
采用固相合成法合成 CBD-LNα4-cRGD 多肽和 FITC 熒光標記的 CBD-LNα4-cRGD 多肽，其氨基酸序列為 TKKTLRTIND-AKYHEISIIYH-cRGDfK 和 TKKTLRTINDAK（-FITC）YHEISIIYH-cRGDfK；以質譜儀進行相對分子質量測定，以高效液相色譜儀鑒定純度均>95%；合成與鑒定均由上海強耀生物科技有限公司完成。
首先，將 CBD-LNα4-cRGD 多肽以及 FITC 熒光標記的 CBD-LNα4-cRGD 多肽分別溶于含 2% 牛血清白蛋白的 PBS 溶液中，工作濃度為 100 μmol/L。將大小為 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 的無菌異種來源 DBM 置入 CBD-LNα4-cRGD 溶液中，4℃ 浸沒修飾 6 h 后 PBS 漂洗，氮氣干燥。最終獲得無熒光標記以及 FITC 熒光標記的 DBM/LN。
1.2.2 支架材料形態特征觀察
將單純 DBM、DBM/LN 制作成 0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm 大小，分別置于環境掃描電鏡樣品掃描倉。掃描條件：低真空模式、加速電壓 25 kV、放大掃描倍數 100 倍。獲得圖像后，每個樣品取 10 個孔，測量每個孔橫向最小和最大直徑，取其均值作為孔徑。兩種支架材料各取 10 個樣本進行觀測。
1.2.3 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾的穩定性檢測
嚴格避光條件下，取 DBM 以及 FITC 熒光標記的 DBM/LN，分別置于共聚焦培養皿中。掃描條件：激發波長 488 nm，接收波長 525 nm，熒光單通道模式。采用激光掃描共聚焦顯微鏡對樣品進行三維掃描并重建清晰圖像。然后，將樣品置入干細胞富集器內；于 30℃ 條件下，加入含 10% 牛血清白蛋白的 PBS 緩沖液 50 mL，以高負荷強度模擬 SCR 技術操作 12 次；放入帶濾網離心管中，以 200×g 離心 3 min。再次以相同掃描條件對樣品進行三維掃描重建，對比模擬 SCR 技術處理前后樣品熒光強度變化，以判斷 CBD-LNα4-cRGD 修飾 DBM 的穩定性。實驗重復 4 次。
1.2.4 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾對 EPCs 黏附能力的影響
① 離心細胞黏附實驗：以 Hoechst-33342 染料標記 EPCs（Z7030031；BioChain 公司，美國）后，調整細胞密度為 5×106個/mL，接種于 6 孔板中，每孔 2.5 mL。將大小為 1.00 cm×1.00 cm×0.05 cm 的 DBM/LN 及 DBM 以醫用膠固定于蓋玻片上，分別浸沒于 6 孔板中，置入 37℃ 細胞培養箱中培養 5 min。隨機取 3 塊蓋玻片，在熒光顯微鏡下捕獲熒光圖像。另取 3 塊蓋玻片反轉置于帶濾網的離心管內，以 50×g 離心 5 min 后取出，熒光顯微鏡下再次捕獲熒光圖像。利用 Image J 軟件對離心前后圖像進行細胞計數，計算細胞密度（個/ cm2）。實驗重復 4 次。
② 振蕩細胞黏附實驗：將 EPCs 密度調整為 5×106個/mL，接種于 6 孔板中，每孔 2.5 mL。取 6 個大小為 1.00 cm×1.00 cm×0.05 cm 的 DBM/LN，浸沒于 6 孔板中，置入 37℃ 細胞培養箱中 5 min。隨機取 3 個樣品置于含 10 mL 基礎培養基（含 10% FBS 的 RPIM1640 培養基）的 50 mL 離心管中，將離心管垂直固定在軌道振蕩器，以 150 r/min 振動 2 min，除去未貼附細胞。將上述支架材料轉移至含 500 μL 基礎培養基的 48 孔板，置于 37℃ 細胞培養箱中培養 4 h；每孔加入 50 μL CCK-8 試劑，繼續培養 3 h。將試劑移入 96 孔板中，使用酶標儀獲取波長 450 nm 處的吸光度（A）值，以代表支架材料中的細胞數。
1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 EPCs 增殖
取大小為 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的 DBM、DBM/LN，分別置于干細胞富集器。調整 EPCs 密度為 1×105個/mL 后，吸取 10 mL 置入干細胞富集器，同 1.2.3 方法模擬 SCR 技術的富集過程，進行 4 個循環。取出富集 EPCs 的支架材料，置入 48 孔板，加入 500 μL 含10% FBS 的 RPIM1640 培養基后，置于 37℃ 細胞培養箱中培養。10 d 后取出支架材料常規漂洗固定 30 min，PBS 緩沖液漂洗 3 次；置于 24 孔板內，以 0.5% Triton X-100 浸泡 10 min，PBS 緩沖液漂洗；以 3% 牛血清白蛋白溶液封閉 2 h；將羅丹明標記的鬼筆環肽工作液（25 mg/mL）以每孔 1.5 mL 浸沒支架材料，4℃ 避光孵育過夜。PBS 緩沖液漂洗 3 次，DAPI 工作液染色 5 min，PBS 緩沖液漂洗 3 次，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。
1.2.6 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響
將 CBD-LNα4-cRGD 加入 RPIM 1640 培養基中，終濃度為 200 nmol/L，用此培養基體外培養 EPCs，培養 4 h 后收集細胞，調整細胞密度為 1.2×105個/mL。冰上放置 24 孔板，加入 Matrigel 基質膠（289 μL/孔），37℃ 孵育 60 min；取 EPCs 細胞懸液加至基質膠（300 μL/孔），37℃ 孵育 4 h 后，倒置顯微鏡觀察 EPCs 管腔形成，Image J 軟件測量管腔長度。以不含 CBD-LNα4-cRGD 培養基培養的 EPCs 作為空白對照。
1.2.7 Western blot 檢測
采用間接共培養方式，將 EPCs 以 1×105個/mL 密度接種于 6 孔板中，待細胞達 70% 融合時放入 Transwell 小室，DBM/LN 組上室內放入 DBM/LN，DBM 組放入 DBM，每組6 個樣品。繼續培養 12 h，使用含 1% 蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冷凍裂解緩沖液裂解 EPCs。用 SDS-PAGE 凝膠電泳法分離蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯膜。加入一抗 VEGF、p-FAK、FAK、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗體，4℃ 搖床緩慢搖動過夜；加入對應一抗來源的辣根過氧化物標記二抗，37℃ 搖床緩慢搖動 120 min。凝膠成像儀中曝光、收集圖像，使用 Image J 軟件計算目的蛋白相對表達量。p-FAK 及p-ERK1/2 蛋白相對表達量為與 FAK 和FAK1/2 的比值。
1.3 動物實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取大小為 5 mm×2 mm×2 mm 的 DBM/LN 和 DBM，分別放置于干細胞富集器內。取 10 周齡雄性 C57 小鼠 2 只，無菌條件下取小鼠股骨和脛骨，用注射器沖出全部骨髓，紅細胞裂解液裂解紅細胞后，得到骨髓有核細胞，采用磁珠分選 CD31+ 細胞，調整密度為 1×105個/mL。吸取 10 mL 細胞懸液加入干細胞富集器，用 50 mL 含 10% 牛血清白蛋白的 PBS 緩沖液，以高負荷強度模擬 SCR 技術富集過程，循環 4 次。將富集細胞后的支架放入帶濾網離心管中，以 200×g 離心 3 min，備用。
取 10 周齡雄性 C57 小鼠 24 只，腹腔注射 0.5% 戊巴比妥鈉 0.2 mL，麻醉成功后暴露右后肢股骨，在股骨中段植入 1 塊微型鋼板，兩端分別擰入 2 枚螺釘固定，電鉆制作 2 mm 節段性骨缺損模型。將股骨缺損模型隨機分為 DBM/LN 組（n=12）及 DBM 組（n=12），將上述制備的 DBM/LN 和 DBM 分別放入股骨缺損處。術后 8 周取材進行以下觀測。
1.3.2 觀測指標
① 影像學觀察：兩組小鼠骨缺損部位行 X 線片和 Micro-CT 三維重建檢查。
② 血管造影觀察[9]：兩組小鼠分別腹腔注射 0.5 mL 1% 戊巴比妥鈉處死后，打開胸腔，將頭皮針插入左心室建立流入道，右心耳建立流出道。從左心室注射 5 mL 肝素（100 U/mL）、3 mL 10% 甲醛和 3 mL 造影劑，4℃ 過夜后截取小鼠右側股骨，置于 4% 多聚甲醛固定 3 d，加入 pH7.2 的 EDTA 溶液脫鈣 21 d。采用 Micro-CT 掃描，計算血管體積和血管表面積，每組取 6 個樣本。
③ 免疫熒光染色及組織學觀察：取多聚甲醛固定、脫鈣后的股骨樣本切片（片厚 5 μm），取部分切片分別與一抗小鼠 CD31、Emcn、Ki67 抗體孵育，4℃ 過夜；37℃，熒光偶聯二抗孵育 1 h。激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，以 Image J 軟件對圖像進行定量分析，分別計數 CD31hiEmcnhi細胞以及 Ki67 和 Emcn 雙染陽性細胞并計算密度（個/mm2）。每組取 6 個樣本。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察新骨生成情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料觀測
2.1.1 支架材料形態特征
環境掃描電鏡觀察示，與 DBM 相比，DBM/LN 表面粗糙度增加（圖 1）。DBM 及 DBM/LN 孔徑分別為（433.123±21.024）、（436.256±21.172）μm，差異無統計學意義（t=0.218，P=0.835）。
圖1
環境掃描電鏡觀察支架材料形態（×100）
a. DBM；b. DBM/LN
Figure1. Representative micrographs of scaffolds by environmental scanning electron microscopy (×100)a. DBM; b. DBM/LN
2.1.2 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾的穩定性檢測
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示，模擬 SCR 技術處理前后 DBM/LN 均具有較強熒光，提示 DBM/LN 支架穩定有效；而 DBM 未檢測到熒光（圖 2）。
圖2
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架材料（×200）
左：模擬 SCR 技術處理前 右：模擬 SCR 技術處理后 a. DBM；b. DBM/LN
Figure2. Observation of scaffolds by laser scanning confocal microscope (×200)Left: Before SCR treatment Right: After SCR treatment a. DBM; b. DBM/LN
2.1.3 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾對 EPCs 黏附能力的影響
① 離心細胞黏附實驗：離心前，DBM 組及 DBM/LN 組蓋玻片上的 EPCs 密度分別為（6.421±0.323）、（6.367±0.208）×104個/cm2，差異無統計學意義（t=0.243，P=0.820）；離心后分別為（1.867±0.252）、（5.267±0.404）×104個/cm2，DBM/LN 組 EPCs 密度明顯高于 DBM 組，差異有統計學意義（t=12.368，P=0.000）。見圖 3。
圖3
熒光顯微鏡觀察離心前后支架上細胞密度（×100）左：離心前 右：離心后 a. DBM；b. DBM/LN
Figure3.
The cell density before and after centrifugation observed by fluorescence microscope (×100)
Left: Before centrifugationRight: After centrifugation a. DBM; b. DBM/LN
② 振蕩細胞黏附實驗：振蕩前，DBM 組及 DBM/LN 組 A 值分別為 1.583±0.073、1.573±0.097，差異無統計學意義（t=0.143，P=0.893）；振蕩后分別為 0.548±0.059、0.875±0.042，DBM/LN 組明顯高于 DBM 組，差異有統計學意義（t=7.821，P=0.001）。
2.1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 EPCs 增殖
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察見，DBM/LN 與 DBM 相比有更多的 EPCs，細胞的延展性和增殖能力更強。見圖 4。
圖4
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架材料上 EPCs 增殖情況（×100）
a. DBM；b. DBM/LN
Figure4. Proliferation of EPCs on different scaffolds by laser scanning confocal microscope (×100)a. DBM; b. DBM/LN
2.1.5 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響
與空白對照 EPCs 相比，加入 CBD-LNα4-cRGD 能明顯促進 EPCs 的管腔形成；前者管腔長度為（483.6±85.1） μm，后者為（1311.3±136.3） μm，差異有統計學意義（t=8.924，P=0.000）。見圖 5。
圖5
倒置顯微鏡觀察 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響（×200）
a. 含 CBD-LNα4-cRGD 的 RPIM1640 培養基培養的 EPCs；b. RPIM1640 培養基培養的 EPCs
Figure5. The effect of CBD-LNα4-cRGD on the tube formation of EPCs observed by inverted microscope (×200)a. EPCs cultured in RPIM1640 medium containing CBD-LNα4-cRGD; b. EPCs cultured in RPIM 1640 medium
2.1.6 Western blot 檢測
DBM/LN 組 EPCs 中 VEGF、p-FAK、p-ERK1/2 蛋白相對表達量分別為 0.955±0.028、0.621±0.056、0.721±0.044，較 DBM 組的 0.611±0.074、0.316±0.022、0.440±0.089 明顯增加，差異均有統計學意義（t=7.531，P=0.002；t=8.780，P=0.001；t=4.902，P=0.008）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測兩組目的蛋白相對表達量
Mr：相對分子質量 1： DBM 2：DBM/LN
Figure6. The relative expressions of target proteins in the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass1: DBM 2: DBM/LN
2.2 動物實驗觀測
2.2.1 影像學觀察
術后 8 周，X 線片和 Micro-CT 三維重建顯示兩組均有新骨形成，但 DBM/LN 組新骨形成更多。見圖 7。
圖7
術后 8 周骨缺損部位影像學觀察
左：X 線片 右：Micro-CT 三維重建 a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure7. Imaging observation of bone defect site at 8 weeks after operationLeft: X-ray film Right: Micro-CT three-dimensional reconstruction a. DBM group; b. DBM/LN group
2.2.2 血管造影觀察
術后 8 周，Micro-CT 血管造影觀察發現，與 DBM 組相比，DBM/LN 組支架血管更豐富（圖 8）。DBM/LN 組血管體積和血管表面積分別為（0.233±0.027）mm3、（15.237±1.153）mm2，較 DBM 組的（0.153±0.025）mm3、（8.615±0.917）mm2明顯增大，差異均有統計學意義（t=3.766，P=0.020；t=7.786，P=0.002）。
圖8
Micro-CT 血管造影觀察
a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure8. Angiographic analysis of Micro-CTa. DBM group; b. DBM/LN group
2.2.3 免疫熒光染色觀察
術后 8 周，DBM/LN 組中 CD31hiEmcnhi細胞密度為（10.033±1.320）個/mm2，較 DBM 組的（2.733±0.404）個/mm2明顯增加，差異有統計學意義（t=9.159，P=0.001）。DBM/LN 組中 Ki67 和 Emcn 雙染陽性細胞密度為（7.679±1.114）個/mm2，較 DBM 組（4.517±0.819）個/mm2明顯增加，差異有統計學意義（t=3.961，P=0.017）。見圖 9。
圖9
骨缺損區免疫熒光染色觀察（×400）
左：DBM 組 右：DBM/LN 組 a. CD31（紅色）和 Emcn（綠色）免疫熒光染色；b. Ki67（紅色）和 Emcn（綠色）免疫熒光染色
Figure9. Immunofluorescence staining of bone defect site (×400)Left: DBM group Right: DBM/LN group a. Immunofluorescence staining images of CD31 (red) and Emcn (green); b. Immunofluorescence staining images of Emcn (green) and Ki67 (red)2.2.4 組織學觀察
HE 染色示，DBM/LN 組新骨生成顯著多于 DBM 組。見圖 10。
圖10
骨缺損區 HE 染色觀察（×200）
a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure10. HE staining of bone defect site (×200)a. DBM group; b. DBM/LN group
3 討論
目前，骨修復支架材料臨床轉化受到限制，主要原因是體內血管化不足和成骨相關前體細胞成骨分化活性弱。因此，相關研究的熱點是賦予支架材料血管化和骨誘導的特性，例如改變生物材料的特性，使用特定生長因子來刺激血管發育、成熟以及成骨前體細胞的成骨分化。骨誘導和血管化對促進骨組織再生和重建都有重要作用，但由于機制不同，單用一種生物活性生長因子很難同時實現這兩種生物學功能[10-11]。而 SCR 技術是利用細胞黏附性的差異，實現對目標細胞的滯留。因此，基于 EPCs 和 MSCs 共同表面整合素受體，我們在 DBM 支架材料上增加額定配體的思路應運而生。
細胞外基質蛋白能夠顯著促進細胞黏附，在生物材料表面修飾中有著廣泛的應用。LN 是細胞外基質中一種可溶性大分子糖蛋白，通過整合素和蛋白聚糖介導，調節細胞黏附，在細胞生長和分化中起著至關重要的作用[12]。研究報道，LN 修飾的鈦合金材料提高了 EPCs 的黏附、鋪展、增殖及遷移能力[7]，同時還能促進 BMSCs 的黏附和分化[13]。由于 LN 是大分子量的蛋白，體外合成不僅難以保持四級空間結構，而且穩定性差、易降解，所以需要尋找其核心功能域，以期能保留其核心的黏附遷移能力。LNα4 鏈是構成 LN-8（α4β1γ1）和 LN-9（α4β2γ1）的一個組分，主要存在于腦、肌肉、骨腔等組織的血管內皮、外周神經的束膜以及發育中肌纖維周圍的基底膜，是唯一在新生與成熟血管內皮基底膜中均表達的 α 亞基[14-15]。LNα4 與其受體 αvβ3 整合素共同分布在血管內皮基底膜中且緊密連接，在內皮細胞的黏附、增殖和遷移過程中起重要作用[16]。許多整合素分子均能影響血管生成（如 αvβ3、α5β1、α2β1、α1β1 等），其中以 αvβ3 尤為重要[17]。αvβ3 整合素可同時黏附基質金屬蛋白酶和細胞外基質，并促進內皮細胞分泌和誘導基質金屬蛋白酶激活，后者可降解細胞外基質成分，并使 VEGF 從細胞外基質中釋放出來，促進內皮細胞增殖、遷移和分化[18]。LNα4 缺失會引起機體血管生成受損，而 αvβ3 整合素的抗體則能特異性抑制由于 LNα4 過表達而引起的人真皮微血管內皮細胞的伸展與遷移[6]。由此可見，LNα4 與整合素 αvβ3 的相互作用是影響血管生成過程的重要因素。同時在 MSCs 的表面也存在大量整合素 αvβ3。因此，我們將 LNα4 中核心功能結構肽與 cRGD 和 CBD 固相合成，得到 CBD-LNα4-cRGD 多肽，表面修飾于 DBM 支架。
血管生成在骨缺損修復中占據重要作用，充分的血供能夠為骨再生提供充足營養。前期文獻報道，H 型血管特征標志為 CD31hiEmcnhi，與骨再生具有密切關系[19]。本研究離心細胞黏附實驗和振蕩細胞黏附實驗結果顯示，DBM/LN 支架材料表現出更高的滯留 EPCs 能力。經羅丹明標記的鬼筆環肽工作液染色發現，與單純 DBM 相比，DBM/LN 中 EPCs 更多，細胞的延展性和增殖能力更強。小鼠骨缺損模型中，血管造影和免疫熒光染色觀察提示，DBM/LN 組基于 LNα4 鏈功能肽修飾的 DBM 支架材料上 CD31hiEmcnhi細胞密度達 DBM 組 2 倍以上，且增殖能力顯著增強。CD31hiEmcnhi血管亞型具有特定的分子、形態特征和位置，成骨祖細胞偏向定植于 CD31hiEmcnhi血管周圍，因為該部位富含成骨祖細胞生存和增殖所需的生長因子[19]。Western blot 檢測結果顯示 DBM/LN 支架處理 EPCs 后，VEGF、p-FAK 和 p-ERK1/2 蛋白表達水平顯著高于 DBM。上述實驗結果提示 LNα4 鏈功能肽能促進內皮細胞黏附、增殖和管腔形成，可能是通過激活 FAK 活性，觸發整合素下游的酪氨酸磷酸化級聯反應所致。
骨修復過程中血管不僅是營養物質擴散、細胞增殖和新骨組織生長的營養傳遞器官，同時在調節細胞和骨再生信號分子方面也起著關鍵作用。我們前期研究顯示， LNα4 鏈功能肽能促進 MSCs 在支架材料上的黏附、增殖，并且促進其成骨分化[4]。本次研究制備的 DBM/LN 攜帶 cRGD，使 DBM 修飾界面含有多個整合素配體，可分別與 MSCs 和 EPCs 上高表達的整合素亞型相結合，既能提高支架與細胞特異性黏附，又兼顧骨再生和血管生成[20]。
綜上述，DBM/LN 支架材料能促進 EPCs 的黏附，最重要的是能顯著促進 H 型血管的生成，實現骨缺損修復中血管生成和骨再生的有效耦聯，為骨缺損修復的治療提供了新的策略。
作者貢獻：羅飛、董世武、許建中負責科研設計；湯勇負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；羅科宇、陳玥琦、高小亮、譚玖林、代其杰參與實驗實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經陸軍軍醫大學西南醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0011。
節段性骨缺損常發生在創傷、骨感染和骨腫瘤截骨術后，是臨床骨科難題之一。自體骨移植修復是臨床修復骨缺損的“金標準”，但存在自體骨量不足等明顯局限性，獲取足量的高活性骨修復材料是修復此類缺損的關鍵[1-2]。理想的骨修復材料應具有快速血管化能力和強大的骨誘導生物活性。選擇性細胞滯留（selective cell retention，SCR）技術是近年來國外學者報道的骨髓富集技術之一，可在支架材料中快速構建一個包含 BMSCs、血管內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）和各類細胞因子的微環境，達到高效、實用的臨床效果[3]。該技術實際上是一種原位組織工程技術，滯留的細胞及因子越多，為支架提供的骨誘導微環境越好，越利于骨缺損修復。因此，對支架材料表面進行有效修飾，以期促進 SCR 技術處理時細胞和細胞因子滯留，成為當前骨再生領域的重要研究方向[4]。
骨缺損部位嚴重缺氧，骨再生過程中需要血管運輸營養物質及代謝產物，所以血管生成十分重要[5]。前期我們對支架材料的研發聚焦于促進 MSCs 的黏附、遷移、增殖和分化，而對 EPCs 的募集、增殖及分化研究不夠重視，導致很多支架材料在實際修復骨缺損中效果不佳。層粘連蛋白（laminin，LN）是一種基底膜蛋白，對維持和促進內皮細胞血管生成十分重要[6]，能夠促進內皮細胞的黏附、鋪展與增殖[7]。但是 LN 由于相對分子質量大、蛋白質四級結構復雜、體外合成不穩定，尚無相關的簡化功能肽在骨組織工程領域應用。LNα4 鏈是促進血管生成的關鍵部分，與腫瘤增殖、遷移等多種疾病的發生發展密切相關[8]。本課題組長期致力于骨缺損再生研究，本次研究擬將前期研究合成的 LNα4 鏈核心區域功能肽，與環狀 RGD（cyclic RGDfK，cRGD）和帶膠原結構域肽（collagen-binding domain，CBD）固相合成連接，然后表面修飾于脫鈣骨基質（demineralized bone matrix，DBM），構建 DBM/CBD-LNα4-cRGD（以下簡稱 DBM/LN）支架材料，并行 SCR 技術處理，通過體外細胞實驗和動物模型實驗，驗證該新型材料促進骨及血管生成的作用，以期為解決骨再生過程中血管化不足的難題提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
10 周齡雄性 C57 小鼠 26 只，體質量 25～28 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。
DBM（北京大清生物技術股份有限公司）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）；RPIM1640 培養基、Matrigel 基質膠（Corning 公司，美國）；內皮黏蛋白（endomucin，Emcn）、CD31（Santa Cruz 公司，美國）；Ki67（R&D 公司，美國）；裂解緩沖液（Roche 公司，德國）；VEGF、FAK、p-FAK、ERK1/2、p-ERK1/2 及 GAPDH 抗體（Abcam 公司，英國）。
Quanta 200 環境掃描電鏡（FEI 公司，荷蘭）；熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；MaxQ HP 481 軌道振蕩器（Thermo Fisher 公司，美國）；LSM780 激光掃描共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss 公司，德國）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 DBM/LN 制備及觀測
1.2.1 DBM/LN 制備
采用固相合成法合成 CBD-LNα4-cRGD 多肽和 FITC 熒光標記的 CBD-LNα4-cRGD 多肽，其氨基酸序列為 TKKTLRTIND-AKYHEISIIYH-cRGDfK 和 TKKTLRTINDAK（-FITC）YHEISIIYH-cRGDfK；以質譜儀進行相對分子質量測定，以高效液相色譜儀鑒定純度均>95%；合成與鑒定均由上海強耀生物科技有限公司完成。
首先，將 CBD-LNα4-cRGD 多肽以及 FITC 熒光標記的 CBD-LNα4-cRGD 多肽分別溶于含 2% 牛血清白蛋白的 PBS 溶液中，工作濃度為 100 μmol/L。將大小為 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 的無菌異種來源 DBM 置入 CBD-LNα4-cRGD 溶液中，4℃ 浸沒修飾 6 h 后 PBS 漂洗，氮氣干燥。最終獲得無熒光標記以及 FITC 熒光標記的 DBM/LN。
1.2.2 支架材料形態特征觀察
將單純 DBM、DBM/LN 制作成 0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm 大小，分別置于環境掃描電鏡樣品掃描倉。掃描條件：低真空模式、加速電壓 25 kV、放大掃描倍數 100 倍。獲得圖像后，每個樣品取 10 個孔，測量每個孔橫向最小和最大直徑，取其均值作為孔徑。兩種支架材料各取 10 個樣本進行觀測。
1.2.3 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾的穩定性檢測
嚴格避光條件下，取 DBM 以及 FITC 熒光標記的 DBM/LN，分別置于共聚焦培養皿中。掃描條件：激發波長 488 nm，接收波長 525 nm，熒光單通道模式。采用激光掃描共聚焦顯微鏡對樣品進行三維掃描并重建清晰圖像。然后，將樣品置入干細胞富集器內；于 30℃ 條件下，加入含 10% 牛血清白蛋白的 PBS 緩沖液 50 mL，以高負荷強度模擬 SCR 技術操作 12 次；放入帶濾網離心管中，以 200×g 離心 3 min。再次以相同掃描條件對樣品進行三維掃描重建，對比模擬 SCR 技術處理前后樣品熒光強度變化，以判斷 CBD-LNα4-cRGD 修飾 DBM 的穩定性。實驗重復 4 次。
1.2.4 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾對 EPCs 黏附能力的影響
① 離心細胞黏附實驗：以 Hoechst-33342 染料標記 EPCs（Z7030031；BioChain 公司，美國）后，調整細胞密度為 5×106個/mL，接種于 6 孔板中，每孔 2.5 mL。將大小為 1.00 cm×1.00 cm×0.05 cm 的 DBM/LN 及 DBM 以醫用膠固定于蓋玻片上，分別浸沒于 6 孔板中，置入 37℃ 細胞培養箱中培養 5 min。隨機取 3 塊蓋玻片，在熒光顯微鏡下捕獲熒光圖像。另取 3 塊蓋玻片反轉置于帶濾網的離心管內，以 50×g 離心 5 min 后取出，熒光顯微鏡下再次捕獲熒光圖像。利用 Image J 軟件對離心前后圖像進行細胞計數，計算細胞密度（個/ cm2）。實驗重復 4 次。
② 振蕩細胞黏附實驗：將 EPCs 密度調整為 5×106個/mL，接種于 6 孔板中，每孔 2.5 mL。取 6 個大小為 1.00 cm×1.00 cm×0.05 cm 的 DBM/LN，浸沒于 6 孔板中，置入 37℃ 細胞培養箱中 5 min。隨機取 3 個樣品置于含 10 mL 基礎培養基（含 10% FBS 的 RPIM1640 培養基）的 50 mL 離心管中，將離心管垂直固定在軌道振蕩器，以 150 r/min 振動 2 min，除去未貼附細胞。將上述支架材料轉移至含 500 μL 基礎培養基的 48 孔板，置于 37℃ 細胞培養箱中培養 4 h；每孔加入 50 μL CCK-8 試劑，繼續培養 3 h。將試劑移入 96 孔板中，使用酶標儀獲取波長 450 nm 處的吸光度（A）值，以代表支架材料中的細胞數。
1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 EPCs 增殖
取大小為 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的 DBM、DBM/LN，分別置于干細胞富集器。調整 EPCs 密度為 1×105個/mL 后，吸取 10 mL 置入干細胞富集器，同 1.2.3 方法模擬 SCR 技術的富集過程，進行 4 個循環。取出富集 EPCs 的支架材料，置入 48 孔板，加入 500 μL 含10% FBS 的 RPIM1640 培養基后，置于 37℃ 細胞培養箱中培養。10 d 后取出支架材料常規漂洗固定 30 min，PBS 緩沖液漂洗 3 次；置于 24 孔板內，以 0.5% Triton X-100 浸泡 10 min，PBS 緩沖液漂洗；以 3% 牛血清白蛋白溶液封閉 2 h；將羅丹明標記的鬼筆環肽工作液（25 mg/mL）以每孔 1.5 mL 浸沒支架材料，4℃ 避光孵育過夜。PBS 緩沖液漂洗 3 次，DAPI 工作液染色 5 min，PBS 緩沖液漂洗 3 次，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。
1.2.6 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響
將 CBD-LNα4-cRGD 加入 RPIM 1640 培養基中，終濃度為 200 nmol/L，用此培養基體外培養 EPCs，培養 4 h 后收集細胞，調整細胞密度為 1.2×105個/mL。冰上放置 24 孔板，加入 Matrigel 基質膠（289 μL/孔），37℃ 孵育 60 min；取 EPCs 細胞懸液加至基質膠（300 μL/孔），37℃ 孵育 4 h 后，倒置顯微鏡觀察 EPCs 管腔形成，Image J 軟件測量管腔長度。以不含 CBD-LNα4-cRGD 培養基培養的 EPCs 作為空白對照。
1.2.7 Western blot 檢測
采用間接共培養方式，將 EPCs 以 1×105個/mL 密度接種于 6 孔板中，待細胞達 70% 融合時放入 Transwell 小室，DBM/LN 組上室內放入 DBM/LN，DBM 組放入 DBM，每組6 個樣品。繼續培養 12 h，使用含 1% 蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冷凍裂解緩沖液裂解 EPCs。用 SDS-PAGE 凝膠電泳法分離蛋白，轉移到聚偏二氟乙烯膜。加入一抗 VEGF、p-FAK、FAK、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH 抗體，4℃ 搖床緩慢搖動過夜；加入對應一抗來源的辣根過氧化物標記二抗，37℃ 搖床緩慢搖動 120 min。凝膠成像儀中曝光、收集圖像，使用 Image J 軟件計算目的蛋白相對表達量。p-FAK 及p-ERK1/2 蛋白相對表達量為與 FAK 和FAK1/2 的比值。
1.3 動物實驗
1.3.1 實驗分組及方法
取大小為 5 mm×2 mm×2 mm 的 DBM/LN 和 DBM，分別放置于干細胞富集器內。取 10 周齡雄性 C57 小鼠 2 只，無菌條件下取小鼠股骨和脛骨，用注射器沖出全部骨髓，紅細胞裂解液裂解紅細胞后，得到骨髓有核細胞，采用磁珠分選 CD31+ 細胞，調整密度為 1×105個/mL。吸取 10 mL 細胞懸液加入干細胞富集器，用 50 mL 含 10% 牛血清白蛋白的 PBS 緩沖液，以高負荷強度模擬 SCR 技術富集過程，循環 4 次。將富集細胞后的支架放入帶濾網離心管中，以 200×g 離心 3 min，備用。
取 10 周齡雄性 C57 小鼠 24 只，腹腔注射 0.5% 戊巴比妥鈉 0.2 mL，麻醉成功后暴露右后肢股骨，在股骨中段植入 1 塊微型鋼板，兩端分別擰入 2 枚螺釘固定，電鉆制作 2 mm 節段性骨缺損模型。將股骨缺損模型隨機分為 DBM/LN 組（n=12）及 DBM 組（n=12），將上述制備的 DBM/LN 和 DBM 分別放入股骨缺損處。術后 8 周取材進行以下觀測。
1.3.2 觀測指標
① 影像學觀察：兩組小鼠骨缺損部位行 X 線片和 Micro-CT 三維重建檢查。
② 血管造影觀察[9]：兩組小鼠分別腹腔注射 0.5 mL 1% 戊巴比妥鈉處死后，打開胸腔，將頭皮針插入左心室建立流入道，右心耳建立流出道。從左心室注射 5 mL 肝素（100 U/mL）、3 mL 10% 甲醛和 3 mL 造影劑，4℃ 過夜后截取小鼠右側股骨，置于 4% 多聚甲醛固定 3 d，加入 pH7.2 的 EDTA 溶液脫鈣 21 d。采用 Micro-CT 掃描，計算血管體積和血管表面積，每組取 6 個樣本。
③ 免疫熒光染色及組織學觀察：取多聚甲醛固定、脫鈣后的股骨樣本切片（片厚 5 μm），取部分切片分別與一抗小鼠 CD31、Emcn、Ki67 抗體孵育，4℃ 過夜；37℃，熒光偶聯二抗孵育 1 h。激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像，以 Image J 軟件對圖像進行定量分析，分別計數 CD31hiEmcnhi細胞以及 Ki67 和 Emcn 雙染陽性細胞并計算密度（個/mm2）。每組取 6 個樣本。取部分切片行 HE 染色，光鏡下觀察新骨生成情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 支架材料觀測
2.1.1 支架材料形態特征
環境掃描電鏡觀察示，與 DBM 相比，DBM/LN 表面粗糙度增加（圖 1）。DBM 及 DBM/LN 孔徑分別為（433.123±21.024）、（436.256±21.172）μm，差異無統計學意義（t=0.218，P=0.835）。
圖1
環境掃描電鏡觀察支架材料形態（×100）
a. DBM；b. DBM/LN
Figure1. Representative micrographs of scaffolds by environmental scanning electron microscopy (×100)a. DBM; b. DBM/LN
2.1.2 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾的穩定性檢測
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察示，模擬 SCR 技術處理前后 DBM/LN 均具有較強熒光，提示 DBM/LN 支架穩定有效；而 DBM 未檢測到熒光（圖 2）。
圖2
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架材料（×200）
左：模擬 SCR 技術處理前 右：模擬 SCR 技術處理后 a. DBM；b. DBM/LN
Figure2. Observation of scaffolds by laser scanning confocal microscope (×200)Left: Before SCR treatment Right: After SCR treatment a. DBM; b. DBM/LN
2.1.3 CBD-LNα4-cRGD 表面修飾對 EPCs 黏附能力的影響
① 離心細胞黏附實驗：離心前，DBM 組及 DBM/LN 組蓋玻片上的 EPCs 密度分別為（6.421±0.323）、（6.367±0.208）×104個/cm2，差異無統計學意義（t=0.243，P=0.820）；離心后分別為（1.867±0.252）、（5.267±0.404）×104個/cm2，DBM/LN 組 EPCs 密度明顯高于 DBM 組，差異有統計學意義（t=12.368，P=0.000）。見圖 3。
圖3
熒光顯微鏡觀察離心前后支架上細胞密度（×100）左：離心前 右：離心后 a. DBM；b. DBM/LN
Figure3.
The cell density before and after centrifugation observed by fluorescence microscope (×100)
Left: Before centrifugationRight: After centrifugation a. DBM; b. DBM/LN
② 振蕩細胞黏附實驗：振蕩前，DBM 組及 DBM/LN 組 A 值分別為 1.583±0.073、1.573±0.097，差異無統計學意義（t=0.143，P=0.893）；振蕩后分別為 0.548±0.059、0.875±0.042，DBM/LN 組明顯高于 DBM 組，差異有統計學意義（t=7.821，P=0.001）。
2.1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 EPCs 增殖
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察見，DBM/LN 與 DBM 相比有更多的 EPCs，細胞的延展性和增殖能力更強。見圖 4。
圖4
激光掃描共聚焦顯微鏡觀察支架材料上 EPCs 增殖情況（×100）
a. DBM；b. DBM/LN
Figure4. Proliferation of EPCs on different scaffolds by laser scanning confocal microscope (×100)a. DBM; b. DBM/LN
2.1.5 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響
與空白對照 EPCs 相比，加入 CBD-LNα4-cRGD 能明顯促進 EPCs 的管腔形成；前者管腔長度為（483.6±85.1） μm，后者為（1311.3±136.3） μm，差異有統計學意義（t=8.924，P=0.000）。見圖 5。
圖5
倒置顯微鏡觀察 CBD-LNα4-cRGD 對 EPCs 管腔形成的影響（×200）
a. 含 CBD-LNα4-cRGD 的 RPIM1640 培養基培養的 EPCs；b. RPIM1640 培養基培養的 EPCs
Figure5. The effect of CBD-LNα4-cRGD on the tube formation of EPCs observed by inverted microscope (×200)a. EPCs cultured in RPIM1640 medium containing CBD-LNα4-cRGD; b. EPCs cultured in RPIM 1640 medium
2.1.6 Western blot 檢測
DBM/LN 組 EPCs 中 VEGF、p-FAK、p-ERK1/2 蛋白相對表達量分別為 0.955±0.028、0.621±0.056、0.721±0.044，較 DBM 組的 0.611±0.074、0.316±0.022、0.440±0.089 明顯增加，差異均有統計學意義（t=7.531，P=0.002；t=8.780，P=0.001；t=4.902，P=0.008）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測兩組目的蛋白相對表達量
Mr：相對分子質量 1： DBM 2：DBM/LN
Figure6. The relative expressions of target proteins in the two groups detected by Western blotMr: Relative molecular mass1: DBM 2: DBM/LN
2.2 動物實驗觀測
2.2.1 影像學觀察
術后 8 周，X 線片和 Micro-CT 三維重建顯示兩組均有新骨形成，但 DBM/LN 組新骨形成更多。見圖 7。
圖7
術后 8 周骨缺損部位影像學觀察
左：X 線片 右：Micro-CT 三維重建 a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure7. Imaging observation of bone defect site at 8 weeks after operationLeft: X-ray film Right: Micro-CT three-dimensional reconstruction a. DBM group; b. DBM/LN group
2.2.2 血管造影觀察
術后 8 周，Micro-CT 血管造影觀察發現，與 DBM 組相比，DBM/LN 組支架血管更豐富（圖 8）。DBM/LN 組血管體積和血管表面積分別為（0.233±0.027）mm3、（15.237±1.153）mm2，較 DBM 組的（0.153±0.025）mm3、（8.615±0.917）mm2明顯增大，差異均有統計學意義（t=3.766，P=0.020；t=7.786，P=0.002）。
圖8
Micro-CT 血管造影觀察
a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure8. Angiographic analysis of Micro-CTa. DBM group; b. DBM/LN group
2.2.3 免疫熒光染色觀察
術后 8 周，DBM/LN 組中 CD31hiEmcnhi細胞密度為（10.033±1.320）個/mm2，較 DBM 組的（2.733±0.404）個/mm2明顯增加，差異有統計學意義（t=9.159，P=0.001）。DBM/LN 組中 Ki67 和 Emcn 雙染陽性細胞密度為（7.679±1.114）個/mm2，較 DBM 組（4.517±0.819）個/mm2明顯增加，差異有統計學意義（t=3.961，P=0.017）。見圖 9。
圖9
骨缺損區免疫熒光染色觀察（×400）
左：DBM 組 右：DBM/LN 組 a. CD31（紅色）和 Emcn（綠色）免疫熒光染色；b. Ki67（紅色）和 Emcn（綠色）免疫熒光染色
Figure9. Immunofluorescence staining of bone defect site (×400)Left: DBM group Right: DBM/LN group a. Immunofluorescence staining images of CD31 (red) and Emcn (green); b. Immunofluorescence staining images of Emcn (green) and Ki67 (red)2.2.4 組織學觀察
HE 染色示，DBM/LN 組新骨生成顯著多于 DBM 組。見圖 10。
圖10
骨缺損區 HE 染色觀察（×200）
a. DBM 組；b. DBM/LN 組
Figure10. HE staining of bone defect site (×200)a. DBM group; b. DBM/LN group
3 討論
目前，骨修復支架材料臨床轉化受到限制，主要原因是體內血管化不足和成骨相關前體細胞成骨分化活性弱。因此，相關研究的熱點是賦予支架材料血管化和骨誘導的特性，例如改變生物材料的特性，使用特定生長因子來刺激血管發育、成熟以及成骨前體細胞的成骨分化。骨誘導和血管化對促進骨組織再生和重建都有重要作用，但由于機制不同，單用一種生物活性生長因子很難同時實現這兩種生物學功能[10-11]。而 SCR 技術是利用細胞黏附性的差異，實現對目標細胞的滯留。因此，基于 EPCs 和 MSCs 共同表面整合素受體，我們在 DBM 支架材料上增加額定配體的思路應運而生。
細胞外基質蛋白能夠顯著促進細胞黏附，在生物材料表面修飾中有著廣泛的應用。LN 是細胞外基質中一種可溶性大分子糖蛋白，通過整合素和蛋白聚糖介導，調節細胞黏附，在細胞生長和分化中起著至關重要的作用[12]。研究報道，LN 修飾的鈦合金材料提高了 EPCs 的黏附、鋪展、增殖及遷移能力[7]，同時還能促進 BMSCs 的黏附和分化[13]。由于 LN 是大分子量的蛋白，體外合成不僅難以保持四級空間結構，而且穩定性差、易降解，所以需要尋找其核心功能域，以期能保留其核心的黏附遷移能力。LNα4 鏈是構成 LN-8（α4β1γ1）和 LN-9（α4β2γ1）的一個組分，主要存在于腦、肌肉、骨腔等組織的血管內皮、外周神經的束膜以及發育中肌纖維周圍的基底膜，是唯一在新生與成熟血管內皮基底膜中均表達的 α 亞基[14-15]。LNα4 與其受體 αvβ3 整合素共同分布在血管內皮基底膜中且緊密連接，在內皮細胞的黏附、增殖和遷移過程中起重要作用[16]。許多整合素分子均能影響血管生成（如 αvβ3、α5β1、α2β1、α1β1 等），其中以 αvβ3 尤為重要[17]。αvβ3 整合素可同時黏附基質金屬蛋白酶和細胞外基質，并促進內皮細胞分泌和誘導基質金屬蛋白酶激活，后者可降解細胞外基質成分，并使 VEGF 從細胞外基質中釋放出來，促進內皮細胞增殖、遷移和分化[18]。LNα4 缺失會引起機體血管生成受損，而 αvβ3 整合素的抗體則能特異性抑制由于 LNα4 過表達而引起的人真皮微血管內皮細胞的伸展與遷移[6]。由此可見，LNα4 與整合素 αvβ3 的相互作用是影響血管生成過程的重要因素。同時在 MSCs 的表面也存在大量整合素 αvβ3。因此，我們將 LNα4 中核心功能結構肽與 cRGD 和 CBD 固相合成，得到 CBD-LNα4-cRGD 多肽，表面修飾于 DBM 支架。
血管生成在骨缺損修復中占據重要作用，充分的血供能夠為骨再生提供充足營養。前期文獻報道，H 型血管特征標志為 CD31hiEmcnhi，與骨再生具有密切關系[19]。本研究離心細胞黏附實驗和振蕩細胞黏附實驗結果顯示，DBM/LN 支架材料表現出更高的滯留 EPCs 能力。經羅丹明標記的鬼筆環肽工作液染色發現，與單純 DBM 相比，DBM/LN 中 EPCs 更多，細胞的延展性和增殖能力更強。小鼠骨缺損模型中，血管造影和免疫熒光染色觀察提示，DBM/LN 組基于 LNα4 鏈功能肽修飾的 DBM 支架材料上 CD31hiEmcnhi細胞密度達 DBM 組 2 倍以上，且增殖能力顯著增強。CD31hiEmcnhi血管亞型具有特定的分子、形態特征和位置，成骨祖細胞偏向定植于 CD31hiEmcnhi血管周圍，因為該部位富含成骨祖細胞生存和增殖所需的生長因子[19]。Western blot 檢測結果顯示 DBM/LN 支架處理 EPCs 后，VEGF、p-FAK 和 p-ERK1/2 蛋白表達水平顯著高于 DBM。上述實驗結果提示 LNα4 鏈功能肽能促進內皮細胞黏附、增殖和管腔形成，可能是通過激活 FAK 活性，觸發整合素下游的酪氨酸磷酸化級聯反應所致。
骨修復過程中血管不僅是營養物質擴散、細胞增殖和新骨組織生長的營養傳遞器官，同時在調節細胞和骨再生信號分子方面也起著關鍵作用。我們前期研究顯示， LNα4 鏈功能肽能促進 MSCs 在支架材料上的黏附、增殖，并且促進其成骨分化[4]。本次研究制備的 DBM/LN 攜帶 cRGD，使 DBM 修飾界面含有多個整合素配體，可分別與 MSCs 和 EPCs 上高表達的整合素亞型相結合，既能提高支架與細胞特異性黏附，又兼顧骨再生和血管生成[20]。
綜上述，DBM/LN 支架材料能促進 EPCs 的黏附，最重要的是能顯著促進 H 型血管的生成，實現骨缺損修復中血管生成和骨再生的有效耦聯，為骨缺損修復的治療提供了新的策略。
作者貢獻：羅飛、董世武、許建中負責科研設計；湯勇負責實驗實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；羅科宇、陳玥琦、高小亮、譚玖林、代其杰參與實驗實施。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經陸軍軍醫大學西南醫院醫學/動物實驗倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2017-0011。
