引用本文： 鄭詠艦, 張鳳玲, 鄧呈亮, 魏在榮. 高糖微環境對脂肪來源干細胞生物學活性影響的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(12): 1602-1606. doi: 10.7507/1002-1892.202003094 復制
脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪組織中，具有自我復制和分化為多種細胞系能力的 MSCs。ADSCs 大多處于靜止狀態，在受到內部或外部刺激下，會重新進入細胞周期進行自我更新和分化[1]。ADSCs 具有很高的可塑性，具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多向分化潛能，同時分泌大量細胞因子，誘導活化細胞免疫抑制功能[2]，亦能歸巢到損傷區域，參與局部組織重建[3]，修復慢性創面[4-5]、神經退行性疾病[6]和心血管并發癥中受損的組織[7]。糖尿病患者創面與組織損傷具有難愈合、難修復的特點，與患者體內高糖微環境對細胞功能的影響有重要聯系。但近期有文獻報道，高糖微環境中 ADSCs 神經分化能力增強，這與既往 Tomlinson 等[8]報道的高糖微環境會引起神經元毒性的結論不一致。本文就高糖微環境對 ADSCs 一般特性、分化潛能、對血管及神經再生影響等方面的研究進展進行綜述。
1 高糖微環境中 ADSCs 一般特性
1.1 細胞形態
有學者認為高糖微環境中 ADSCs 形態與正常 ADSCs（normal ADSCs，nADSCs）相似，細胞生長具有一定方向性，呈長梭形、魚群狀排列[9]，但隨著培養時間延長，高糖微環境中 ADSCs 的生長速度明顯低于 nADSCs，圓形及多角形細胞也出現得更早、更多。Chen 等[10]研究中 ADSCs 經糖基化誘導處理 6 d 后，細胞形態開始出現“煎蛋”樣和多邊形改變，數量隨誘導時間延長而增加。Cheng 等[11]和 Stolzing 等[12]實驗結果表明，相較于低糖培養基處理的 nADSCs，糖尿病 ADSCs（diabetes ADSCs，dADSCs）與經過高糖培養基處理的 nADSCs 形態出現明顯變化，從紡錘形變為扁平形，細胞體積變大，細胞質面積變大。許言文等[13]認為這種形態學上的差異可能與糖尿病潰瘍難以愈合有很大聯系。
1.2 細胞增殖和遷移
研究顯示，高糖微環境中的 ADSCs 表現出更低的細胞增殖與體外遷移能力，以及更高水平的細胞衰老和凋亡[11, 14-15]，促凋亡基因 Caspase-3 和 p53 的表達高于 nADSCs[16]，細胞凋亡基因活性明顯增加；TNF 在細胞凋亡中也發揮重要作用，而在高糖培養基條件下 ADSCs 中 TNF-α 水平更高，TNF-α 可以進一步增強 Caspase 活性[17]；高濃度葡萄糖可通過 Akt /mTOR 信號通路誘導 MSCs 衰老[18]。Bufalo 等[19]以及 Alikhani 等[20]研究表明高糖微環境中晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）持續累積，其通過結合特定的受體激活炎癥和細胞內活性氧相關反應，導致細胞內一氧化氮合酶和神經酰胺增加，進而激活 p38 和 JNK，活化的 p38 和 JNK 又激活級聯反應，從而導致 FoxO1 的激活，而 FoxO1 的激活導致 MAPK 信號傳導通路誘導細胞凋亡。而 Davies 等[21]研究顯示 dADSCs 增殖與遷移能力較 nADSCs 無明顯改變；金鑫等[22]用鹽藻糖酶糖基化處理人 ADSCs，發現細胞增殖能力無明顯變化。
1.3 細胞表面標記物
目前尚未發現 ADSCs 的特異性細胞表面標記物，普遍采用相對特異的細胞表面標記物聯合多向誘導分化進行細胞鑒定。而表面標記物的差異也與細胞的來源、提取、分離、培養及細胞代數有關。有研究顯示，未分化的 dADSCs 和 nADSCs 其細胞表面標志物的表達與 MSCs 相似且具有特征性，CD13、CD44、CD73、CD90、CD105 表達呈陽性，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR 表達呈陰性，且表達量相近[23-24]。Liu 等[25]報道高糖微環境中 ADSCs 的免疫表型發生變化，其中 dADSCs 細胞表面標志物 CD105 表達量升高，同時利用糖尿病血管基質成分上清液處理 nADSCs 后，細胞表型也產生了變化。與 nADSCs 相比，高糖微環境中的 ADSCs 獲得了一種促炎免疫表型，CD40、CD80 表達量升高[26-27]。
2 細胞分化潛能
高糖微環境中的 ADSCs 與 nADSCs 均能分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，其中 dADSCs 相比 nADSCs 具有較弱的成骨和成軟骨分化能力，以及更強的成脂分化能力[16, 28]。Cramer 等[16]和 Keats 等[29]的研究表明，dADSCs 和高糖培養基處理后的 ADSCs 中，與成骨分化潛能相關的 ALP 活性均降低，導致成骨能力減弱；成軟骨分化的譜系特異性基因 BMP-6、COL2A1、COL10A1 和 Sox6 的表達明顯降低，導致成軟骨能力減弱；而成脂能力增強，其成脂標志物（如過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 和脂蛋白脂肪酶）的表達上調[16, 30]。Zhang 等[31]認為成骨能力下降可能還與 AGEs 上調了糖基化 ADSCs 中的 DNA 甲基化水平相關。Li 等[32]研究顯示高糖培養基與 AGEs 通過刺激硫氧環蛋白相互作用蛋白，對 MSCs 成骨能力產生負面影響。但是，楊卉馨等[33]及 García-Hernández 等[34]的研究結果提示高糖培養基增強了小鼠 ADSCs 成骨能力，可能與高糖培養基在成骨分化過程中激活骨鈣素及 ALP 活性有關。也有學者認為相對于 nADSCs，dADSCs 成骨、成脂能力均較弱，因為 dADSCs 不能分化為成熟的功能性脂肪細胞[35]。有研究表明，高糖培養基會損害Ⅱ型膠原蛋白的合成和增加活性氧的活性，通過炎癥介質介導軟骨破壞，同時抑制了 ADSCs 的成軟骨能力[36]。Tareck 等[37]與 Cheng 等[11]的研究結果表明，高糖微環境可引起細胞內活性氧水平升高，而低濃度的活性氧并不產生細胞毒性，并可使 dADSCs 與高糖培養基誘導培養后的 ADSCs 中巢蛋白和微管相關蛋白 2 兩種神經源性分化標記蛋白表達增加，表現出更強的神經源細胞分化潛能。
3 促進血管再生能力
ADSCs 廣泛分布于外周血管周圍，具有分化為內皮細胞、平滑肌細胞等血管相關細胞的潛能，同時又能分泌大量血管再生相關細胞因子及生長因子，如 VEGF、PDGF、基質細胞衍生因子 1、肝細胞生長因子以及血管生成素 1、2 等，這些因子在血管發生及血管生成過程中都起到了重要作用。Rennert 等[38]和 Harris 等[39]研究表明高糖微環境中 ADSCs 分泌的 VEGF、FGF、PDGF、基質細胞衍生因子 1 等細胞因子及其相關受體表達量均降低，且促血管再生能力也較 nADSCs 減弱，這可能與高糖微環境選擇性消耗相應功能的細胞亞群有關。同時，伍鋒等[40]和王哲等[41]研究表明 AGEs 會抑制 ADSCs 分泌 VEGF、肝細胞生長因子 1 和 IGF-1 蛋白的能力，且呈濃度依賴效應，分析原因為 AGEs 能引起細胞內活性氧上調，增強氧化應激，破壞細胞內環境穩定性，從而影響 ADSCs 旁分泌功能。Gu 等[42]發現缺氧環境刺激 dADSCs 與 nADSCs 后，其分泌 VEGF、肝細胞生長因子能力均有所提升，但 nADSCs 促血管再生能力仍較強，可能因缺氧提高了缺氧誘導因子 1 的水平，從而增加了與抗凋亡和血管生成因子相關基因的表達。由于血管再生在促進創面愈合中起到關鍵性作用，大量研究顯示高糖微環境會損傷 ADSCs 促血管再生與創面愈合的能力[43-44]。但 Lafosse 等[45]和 Policha 等[46]研究表明 dADSCs 與 nADSCs 在分泌 VEGF、增強內皮細胞分化與促進血管再生方面無明顯差異。上述研究結果差異可能與細胞來源于不同年齡段糖尿病患者有關，也可能因 dADSCs 的促血管再生能力變化在體內無法準確檢測所致[47]。
4 促神經再生能力
周圍神經受損后近端回縮，遠端軸突和髓鞘膨脹、分解成碎片，發生 Wallerian 變性。神經再生主要目的是使軸突恢復連續性。神經損傷后其近端殘端和遠端整個軸突中的雪旺細胞均分化為祖細胞樣細胞，并迅速增殖，與巨噬細胞共同協調炎癥反應，清除碎片并重塑局部微環境[48]。ADSCs 可以通過促進損傷神經周圍新生血管再生，調節炎癥反應及調節免疫來促進周圍神經再生；同時 ADSCs 可分泌神經修復相關的 NGF、人腦源性神經因子、人神經營養因子 3，并且在自行或在特定情況下誘導分化成為雪旺細胞樣細胞，參與軸突的髓鞘化[49-51]。大量研究表明，高糖微環境下胰島素相關信號受損，多種葡萄糖毒性途徑激活，包括多元醇旁路激活、蛋白質的非酶糖基化、己糖胺途徑和蛋白激酶 C 活性改變，這些代謝途徑的激活可能最終導致神經元和鄰近微血管系統的氧化和炎癥應激，引起周圍神經性病變。高糖微環境下 AGEs 積累，引起 AGEs 受體上調，相互作用后引起 Sirt1、Nrf2 蛋白下調，導致促氧化劑和促炎信號通路的激活，引起神經退行性病變[8, 10, 52]。Chen 等[53]進一步研究表明上調 MSCs 中的 Nrf2 蛋白可促進雪旺細胞增殖、抑制細胞凋亡，對抗氧化應激和炎癥反應，使損傷坐骨神經中血管與神經形成增加。在糖尿病早期，患者往往出現“痛覺敏感”時期，隨著病程延長逐漸出現感覺減退，這可能與早期少量 AGEs 可引起低水平的炎癥與氧化應激反應，從而造成神經相關營養因子與炎癥因子分泌增多有關[54-55]；同時缺氧會刺激缺氧誘導因子 1 上調，促進 ADSCs 分泌 VEGF，誘導周圍神經血管新生來恢復神經血流，并可能促進周圍神經存活[56]。Cheng 等[11]發現 dADSCs 具有更強的神經源細胞分化潛能，其巢蛋白和微管相關蛋白 2 兩種神經源性分化標記蛋白表達量增加。而 Xiao 等[57]通過小鼠創面局部移植 dADSCs 與 nADSCs 研究，發現 dADSCs 在促進小鼠創面神經再生能力方面與 nADSCs 相比無明顯差異。
5 小結與展望
關于高糖微環境對 ADSCs 生物學活性及功能影響的研究結論尚不完全一致，但研究者普遍認為高糖微環境中 AGEs 積累后會通過多種途徑導致 ADSCs 的生物學活性改變，包括細胞表面標記物、增殖、遷移、多譜系分化、分泌功能及組織修復能力等方面。所以，在移植受高糖微環境影響的 ADSCs 前，應充分考慮其細胞功能的改變。目前，高糖微環境中 ADSCs 促進周圍神經及血管再生的能力存在爭議，相關機制還需進一步研究。
作者貢獻：鄭詠艦負責綜述構思及設計、文章撰寫；張鳳玲負責資料收集整理；魏在榮、鄧呈亮負責觀點形成及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金經費支持沒有影響文章觀點。
脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪組織中，具有自我復制和分化為多種細胞系能力的 MSCs。ADSCs 大多處于靜止狀態，在受到內部或外部刺激下，會重新進入細胞周期進行自我更新和分化[1]。ADSCs 具有很高的可塑性，具有向脂肪、軟骨、成骨、成肌等多向分化潛能，同時分泌大量細胞因子，誘導活化細胞免疫抑制功能[2]，亦能歸巢到損傷區域，參與局部組織重建[3]，修復慢性創面[4-5]、神經退行性疾病[6]和心血管并發癥中受損的組織[7]。糖尿病患者創面與組織損傷具有難愈合、難修復的特點，與患者體內高糖微環境對細胞功能的影響有重要聯系。但近期有文獻報道，高糖微環境中 ADSCs 神經分化能力增強，這與既往 Tomlinson 等[8]報道的高糖微環境會引起神經元毒性的結論不一致。本文就高糖微環境對 ADSCs 一般特性、分化潛能、對血管及神經再生影響等方面的研究進展進行綜述。
1 高糖微環境中 ADSCs 一般特性
1.1 細胞形態
有學者認為高糖微環境中 ADSCs 形態與正常 ADSCs（normal ADSCs，nADSCs）相似，細胞生長具有一定方向性，呈長梭形、魚群狀排列[9]，但隨著培養時間延長，高糖微環境中 ADSCs 的生長速度明顯低于 nADSCs，圓形及多角形細胞也出現得更早、更多。Chen 等[10]研究中 ADSCs 經糖基化誘導處理 6 d 后，細胞形態開始出現“煎蛋”樣和多邊形改變，數量隨誘導時間延長而增加。Cheng 等[11]和 Stolzing 等[12]實驗結果表明，相較于低糖培養基處理的 nADSCs，糖尿病 ADSCs（diabetes ADSCs，dADSCs）與經過高糖培養基處理的 nADSCs 形態出現明顯變化，從紡錘形變為扁平形，細胞體積變大，細胞質面積變大。許言文等[13]認為這種形態學上的差異可能與糖尿病潰瘍難以愈合有很大聯系。
1.2 細胞增殖和遷移
研究顯示，高糖微環境中的 ADSCs 表現出更低的細胞增殖與體外遷移能力，以及更高水平的細胞衰老和凋亡[11, 14-15]，促凋亡基因 Caspase-3 和 p53 的表達高于 nADSCs[16]，細胞凋亡基因活性明顯增加；TNF 在細胞凋亡中也發揮重要作用，而在高糖培養基條件下 ADSCs 中 TNF-α 水平更高，TNF-α 可以進一步增強 Caspase 活性[17]；高濃度葡萄糖可通過 Akt /mTOR 信號通路誘導 MSCs 衰老[18]。Bufalo 等[19]以及 Alikhani 等[20]研究表明高糖微環境中晚期糖基化終末產物（advanced glycosylation end products，AGEs）持續累積，其通過結合特定的受體激活炎癥和細胞內活性氧相關反應，導致細胞內一氧化氮合酶和神經酰胺增加，進而激活 p38 和 JNK，活化的 p38 和 JNK 又激活級聯反應，從而導致 FoxO1 的激活，而 FoxO1 的激活導致 MAPK 信號傳導通路誘導細胞凋亡。而 Davies 等[21]研究顯示 dADSCs 增殖與遷移能力較 nADSCs 無明顯改變；金鑫等[22]用鹽藻糖酶糖基化處理人 ADSCs，發現細胞增殖能力無明顯變化。
1.3 細胞表面標記物
目前尚未發現 ADSCs 的特異性細胞表面標記物，普遍采用相對特異的細胞表面標記物聯合多向誘導分化進行細胞鑒定。而表面標記物的差異也與細胞的來源、提取、分離、培養及細胞代數有關。有研究顯示，未分化的 dADSCs 和 nADSCs 其細胞表面標志物的表達與 MSCs 相似且具有特征性，CD13、CD44、CD73、CD90、CD105 表達呈陽性，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR 表達呈陰性，且表達量相近[23-24]。Liu 等[25]報道高糖微環境中 ADSCs 的免疫表型發生變化，其中 dADSCs 細胞表面標志物 CD105 表達量升高，同時利用糖尿病血管基質成分上清液處理 nADSCs 后，細胞表型也產生了變化。與 nADSCs 相比，高糖微環境中的 ADSCs 獲得了一種促炎免疫表型，CD40、CD80 表達量升高[26-27]。
2 細胞分化潛能
高糖微環境中的 ADSCs 與 nADSCs 均能分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞，其中 dADSCs 相比 nADSCs 具有較弱的成骨和成軟骨分化能力，以及更強的成脂分化能力[16, 28]。Cramer 等[16]和 Keats 等[29]的研究表明，dADSCs 和高糖培養基處理后的 ADSCs 中，與成骨分化潛能相關的 ALP 活性均降低，導致成骨能力減弱；成軟骨分化的譜系特異性基因 BMP-6、COL2A1、COL10A1 和 Sox6 的表達明顯降低，導致成軟骨能力減弱；而成脂能力增強，其成脂標志物（如過氧化物酶體增殖物激活受體 γ 和脂蛋白脂肪酶）的表達上調[16, 30]。Zhang 等[31]認為成骨能力下降可能還與 AGEs 上調了糖基化 ADSCs 中的 DNA 甲基化水平相關。Li 等[32]研究顯示高糖培養基與 AGEs 通過刺激硫氧環蛋白相互作用蛋白，對 MSCs 成骨能力產生負面影響。但是，楊卉馨等[33]及 García-Hernández 等[34]的研究結果提示高糖培養基增強了小鼠 ADSCs 成骨能力，可能與高糖培養基在成骨分化過程中激活骨鈣素及 ALP 活性有關。也有學者認為相對于 nADSCs，dADSCs 成骨、成脂能力均較弱，因為 dADSCs 不能分化為成熟的功能性脂肪細胞[35]。有研究表明，高糖培養基會損害Ⅱ型膠原蛋白的合成和增加活性氧的活性，通過炎癥介質介導軟骨破壞，同時抑制了 ADSCs 的成軟骨能力[36]。Tareck 等[37]與 Cheng 等[11]的研究結果表明，高糖微環境可引起細胞內活性氧水平升高，而低濃度的活性氧并不產生細胞毒性，并可使 dADSCs 與高糖培養基誘導培養后的 ADSCs 中巢蛋白和微管相關蛋白 2 兩種神經源性分化標記蛋白表達增加，表現出更強的神經源細胞分化潛能。
3 促進血管再生能力
ADSCs 廣泛分布于外周血管周圍，具有分化為內皮細胞、平滑肌細胞等血管相關細胞的潛能，同時又能分泌大量血管再生相關細胞因子及生長因子，如 VEGF、PDGF、基質細胞衍生因子 1、肝細胞生長因子以及血管生成素 1、2 等，這些因子在血管發生及血管生成過程中都起到了重要作用。Rennert 等[38]和 Harris 等[39]研究表明高糖微環境中 ADSCs 分泌的 VEGF、FGF、PDGF、基質細胞衍生因子 1 等細胞因子及其相關受體表達量均降低，且促血管再生能力也較 nADSCs 減弱，這可能與高糖微環境選擇性消耗相應功能的細胞亞群有關。同時，伍鋒等[40]和王哲等[41]研究表明 AGEs 會抑制 ADSCs 分泌 VEGF、肝細胞生長因子 1 和 IGF-1 蛋白的能力，且呈濃度依賴效應，分析原因為 AGEs 能引起細胞內活性氧上調，增強氧化應激，破壞細胞內環境穩定性，從而影響 ADSCs 旁分泌功能。Gu 等[42]發現缺氧環境刺激 dADSCs 與 nADSCs 后，其分泌 VEGF、肝細胞生長因子能力均有所提升，但 nADSCs 促血管再生能力仍較強，可能因缺氧提高了缺氧誘導因子 1 的水平，從而增加了與抗凋亡和血管生成因子相關基因的表達。由于血管再生在促進創面愈合中起到關鍵性作用，大量研究顯示高糖微環境會損傷 ADSCs 促血管再生與創面愈合的能力[43-44]。但 Lafosse 等[45]和 Policha 等[46]研究表明 dADSCs 與 nADSCs 在分泌 VEGF、增強內皮細胞分化與促進血管再生方面無明顯差異。上述研究結果差異可能與細胞來源于不同年齡段糖尿病患者有關，也可能因 dADSCs 的促血管再生能力變化在體內無法準確檢測所致[47]。
4 促神經再生能力
周圍神經受損后近端回縮，遠端軸突和髓鞘膨脹、分解成碎片，發生 Wallerian 變性。神經再生主要目的是使軸突恢復連續性。神經損傷后其近端殘端和遠端整個軸突中的雪旺細胞均分化為祖細胞樣細胞，并迅速增殖，與巨噬細胞共同協調炎癥反應，清除碎片并重塑局部微環境[48]。ADSCs 可以通過促進損傷神經周圍新生血管再生，調節炎癥反應及調節免疫來促進周圍神經再生；同時 ADSCs 可分泌神經修復相關的 NGF、人腦源性神經因子、人神經營養因子 3，并且在自行或在特定情況下誘導分化成為雪旺細胞樣細胞，參與軸突的髓鞘化[49-51]。大量研究表明，高糖微環境下胰島素相關信號受損，多種葡萄糖毒性途徑激活，包括多元醇旁路激活、蛋白質的非酶糖基化、己糖胺途徑和蛋白激酶 C 活性改變，這些代謝途徑的激活可能最終導致神經元和鄰近微血管系統的氧化和炎癥應激，引起周圍神經性病變。高糖微環境下 AGEs 積累，引起 AGEs 受體上調，相互作用后引起 Sirt1、Nrf2 蛋白下調，導致促氧化劑和促炎信號通路的激活，引起神經退行性病變[8, 10, 52]。Chen 等[53]進一步研究表明上調 MSCs 中的 Nrf2 蛋白可促進雪旺細胞增殖、抑制細胞凋亡，對抗氧化應激和炎癥反應，使損傷坐骨神經中血管與神經形成增加。在糖尿病早期，患者往往出現“痛覺敏感”時期，隨著病程延長逐漸出現感覺減退，這可能與早期少量 AGEs 可引起低水平的炎癥與氧化應激反應，從而造成神經相關營養因子與炎癥因子分泌增多有關[54-55]；同時缺氧會刺激缺氧誘導因子 1 上調，促進 ADSCs 分泌 VEGF，誘導周圍神經血管新生來恢復神經血流，并可能促進周圍神經存活[56]。Cheng 等[11]發現 dADSCs 具有更強的神經源細胞分化潛能，其巢蛋白和微管相關蛋白 2 兩種神經源性分化標記蛋白表達量增加。而 Xiao 等[57]通過小鼠創面局部移植 dADSCs 與 nADSCs 研究，發現 dADSCs 在促進小鼠創面神經再生能力方面與 nADSCs 相比無明顯差異。
5 小結與展望
關于高糖微環境對 ADSCs 生物學活性及功能影響的研究結論尚不完全一致，但研究者普遍認為高糖微環境中 AGEs 積累后會通過多種途徑導致 ADSCs 的生物學活性改變，包括細胞表面標記物、增殖、遷移、多譜系分化、分泌功能及組織修復能力等方面。所以，在移植受高糖微環境影響的 ADSCs 前，應充分考慮其細胞功能的改變。目前，高糖微環境中 ADSCs 促進周圍神經及血管再生的能力存在爭議，相關機制還需進一步研究。
作者貢獻：鄭詠艦負責綜述構思及設計、文章撰寫；張鳳玲負責資料收集整理；魏在榮、鄧呈亮負責觀點形成及文章修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金經費支持沒有影響文章觀點。