引用本文： 王濤, 彭吾訓, 張飛, 鄭應剛, 王貞文, 袁大江. NMNAT3 調節 NAD+ 水平對兔 BMSCs 線粒體功能及其抗氧化應激能力影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(5): 621-629. doi: 10.7507/1002-1892.201910037 復制
基于細胞療法的干細胞移植技術在生物工程和醫學領域的研究日益增多，并且在基礎和臨床研究中均取得了突破性進展[1-3]。動物研究表明，BMSCs 構建的組織工程骨能用于骨缺損修復，具有一定成骨作用，是近年來骨組織工程研究熱點之一[4-6]。但是，組織工程骨可攜帶的 BMSCs 數量有限，加上骨壞死區微環境復雜，各種損傷因素常導致 BMSCs 遭受氧化應激損傷，影響了 BMSCs 的增殖分化及存活，造成修復效果欠佳[7-8]。線粒體是對內、外源性損傷因素最敏感的細胞器，也是細胞內氧化應激損傷的主要靶標[9]。氧化應激損傷導致線粒體功能障礙，使細胞內產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量 ROS 又會改變細胞內氧化還原狀態，進而導致細胞內氧化與抗氧化防御系統失衡，觸發多種凋亡信號轉導途徑，最終誘導細胞凋亡[10]。因此，保護線粒體功能是疾病治療的一個重要考慮因素[9]。
研究表明，線粒體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平對維持線粒體功能具有重要作用[11-12]。Gulshan 等[13]通過小鼠模型研究，發現過表達煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶 3（nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 3，NMNAT3）能有效增加多種組織線粒體內 NAD+ 水平，對線粒體代謝穩定和降低 ROS 水平至關重要。本研究采用 NMNAT3 基因修飾 BMSCs，觀察該方法在改善 BMSCs 氧化應激狀態下線粒體功能的作用，以及對 BMSCs 抗氧化應激能力的影響，探討將其作為一種改善線粒體功能的方法用于組織工程研究的可行性，為提高干細胞移植療效提供新思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
4～6 周齡新西蘭大白兔 16 只，體質量（2.0±0.5）kg，雌雄不限，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；北京索萊寶生物科技有限公司）；成骨誘導分化試劑盒、成脂誘導分化試劑盒、成軟骨誘導分化試劑盒 [賽業（蘇州）生物科技有限公司]；線粒體膜電位 JC-1 檢測試劑盒、ROS 檢測熒光探針-DHE、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、NAD+、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 檢測試劑盒以及衰老相關 β-半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）標記的 NMNAT3 基因過表達慢病毒（Lv-NMNAT3-EGFP）和陰性對照慢病毒（Lv-EGFP）（上海恒圓生物科技有限公司）；NMNAT3 引物、ACTB 引物、cDNA 合成試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；兔抗兔 Anti-NMNAT3、兔抗兔 Anti-β-actin（北京博奧森生物技術有限公司）；Anti-CD29/AF647、Anti-CD90/PE-CyTM7、Anti-CD106/PE、Anti-CD45/FITC、Anti-CD11b/V450（BD 公司，美國）。
1.2 兔 BMSCs 分離培養及鑒定
取新西蘭大白兔，仰臥固定于手術臺，分別于股骨遠端和脛骨近端抽取骨髓 4～5 mL，采用密度梯度離心法分離細胞后，用含 10%FBS 和 1% 青霉素-鏈霉素的完全培養基接種于 25 cm2 培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。每 2～3 天更換完全培養基 1 次，待培養瓶底細胞匯合度達 90% 以上時，按 1∶3 比例消化傳代。
取第 3 代生長良好的 BMSCs 進行鑒定。① 應用流式細胞儀檢測 BMSCs 細胞表面標記物 CD29、CD90、CD106、CD45、CD11b 的表達。② 根據各誘導分化試劑盒操作說明配制誘導分化完全培養基，對 BMSCs 進行成骨、成脂、成軟骨多向誘導分化，分別于培養 2、3、3 周后，采用茜素紅、油紅 O、阿利辛藍染色鑒定其成骨、成脂及成軟骨分化潛能。以完全培養基培養的第 3 代 BMSCs 作為對照。
1.3 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 及觀測
1.3.1 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 方法
取第 3 代生長良好的 BMSCs 接種于培養瓶，待細胞融合度達 40% 左右時，分別采用 Lv-NMNAT3-EGFP（BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP，過表達組）及 Lv-EGFP（BMSCs/Lv-EGFP，陰性對照組）進行轉染，根據預實驗結果選擇感染復數為 100；轉染 12 h 后更換為完全培養基繼續培養。3 d 后于倒置熒光顯微鏡下觀察過表達組、陰性對照組細胞綠色熒光蛋白表達情況，以未轉染 BMSCs 作為正常對照組。鏡下隨機選取 4～6 個視野，計數綠色熒光蛋白表達細胞數與細胞總數，計算轉染率。轉染率=（綠色熒光蛋白表達細胞數/細胞總數）×100%。
1.3.2 轉染后 BMSCs 內 NMNAT3 蛋白及基因水平檢測
慢病毒轉染 5 d 后，于過表達組、陰性對照組和正常對照組中加入含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養基篩選，待正常對照組細胞全部死亡后，將過表達組和陰性對照組嘌呤霉素濃度減半（1 μg/mL）維持篩選得到穩定株，分別采用實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）及 Western blot 技術檢測 BMSCs 內 NMNAT3 基因及蛋白表達情況。另取正常對照組細胞進行上述檢測。
1.3.3 轉染后 BMSCs 增殖能力檢測
取過表達組、陰性對照組和正常對照組細胞，常規胰蛋白酶消化后，完全培養基重懸，按（2～3）×103 個/孔接種于 96 孔板，每組設 4 個復孔，共計 7 板，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養 7 d 內每天固定時間取 1 板，按 CCK-8 檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀測定 450 nm 處吸光度（A）值，繪制各組細胞生長曲線。
1.4 H2O2 模擬氧化應激處理 BMSCs 方法及實驗分組
實驗分為 4 組：A 組（BMSCs）、B 組（BMSCs+H2O2）、C 組（BMSCs/Lv-EGFP+H2O2）、D 組（BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP+H2O2）。其中 A 組不加 H2O2 處理，作為正常對照。B、C、D 組分別取 BMSCs、BMSCs/Lv-EGFP 和 BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP，按照 2×104 個/孔均勻接種于 6 孔板，待細胞生長融合度達 85%～90% 時，更換為 H2O2 濃度為500 μmol/L 的培養基，模擬氧化應激處理 24 h[14]后進行觀測。
1.5 NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
1.5.1 NMNAT3 對線粒體膜電位改變的影響
取各組細胞采用 JC-1 法檢測線粒體膜電位，激光共聚焦顯微鏡下觀察，JC-1 探針進入線粒體產生紅色熒光，JC-1 探針停留于細胞質中產生綠色熒光。采用 Image 軟件計算紅/綠熒光比值，以此衡量線粒體膜電位是否下降。實驗重復 3 次。
1.5.2 NMNAT3 對線粒體 NAD+ 水平及 ATP 合成的影響
取各組細胞分別參照 NAD+ 檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒說明進行操作。采用酶標儀繪制 ATP、NAD+ 含量標準曲線，根據標準曲線計算樣品中 ATP、NAD+ 水平。實驗重復 3 次。
1.6 NMNAT3 轉染后 BMSCs 抗氧化應激能力變化
1.6.1 NMNAT3 對降低細胞內 ROS 及 MDA 的作用
取各組細胞分別參照 ROS 檢測熒光探針-DHE、MDA 檢測試劑盒說明書進行操作。使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內 ROS 紅色熒光標記情況，Image 軟件進行熒光強度量化計算 ROS 水平；用酶標儀繪制標準曲線并檢測樣品在 535 nm 波長處 A 值，根據標準曲線標化定量樣品中 MDA 含量。實驗重復 3 次。
1.6.2 NMNAT3 對抗氧化酶系 Mn-SOD 及 CAT 的影響
取各組細胞分別參照 Mn-SOD 檢測試劑盒和 CAT 檢測試劑盒說明書進行操作。用酶標儀繪制標準曲線并分別檢測樣品 Mn-SOD、CAT 在 450 nm 和 405 nm 波長處 A 值，根據標準曲線標化定量樣品中 Mn-SOD 和 CAT 相對活力。實驗重復3 次。
1.6.3 NMNAT3 對改善 BMSCs 衰老及凋亡的作用
取各組細胞置于 4% 多聚甲醛固定液，室溫下固定 15 min，根據 SA-β-gal 染色試劑盒制備染色工作溶液，按照操作說明書加入工作溶液后，37℃ 孵育過夜，光鏡下觀察細胞內呈藍染的陽性細胞。于 200 倍鏡下選擇 5～8 個視野，計數陽性細胞數及細胞總數，按以下公式計算陽性細胞比例：（陽性細胞數/細胞總數）×100%，取均值。實驗重復 3 次。
取各組細胞使用免疫染色固定液固定 30 min，根據 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，分別加入 TUNEL 和 DAPI 染液孵育細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況，紅色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為所有有核細胞。隨機選擇 5～8 個視野，計數紅色、藍色熒光細胞數，按以下公式計算細胞凋亡率：（紅色熒光細胞數/藍色熒光細胞數）×100%，取均值。實驗重復 3 次。
1.7 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 細胞形態及鑒定
采用密度梯度離心聯合貼壁培養法，體外培養第 7 天獲得大量長梭形、魚群狀分布、形態均一的原代 BMSCs；經體外連續傳代培養后，細胞形態與原代細胞相似，未見明顯改變（圖 1）。
圖1
兔 BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 原代 BMSCs 培養 7 d；b. 第 3 代 BMSCs；c. 第 5 代 BMSCs
Figure1. Morphological observation of rabbit BMSCs (Inverted microscope×100)a. Primary BMSCs cultured for 7 days; b. The third generation BMSCs; c. The fifth generation BMSCs
流式細胞儀檢測顯示，第 3 代 BMSCs 高表達 CD29、CD90、CD106，陽性率分別為 100%、100% 和 99.68%，低表達 CD45 和 CD11b，陽性率分別為 0.06% 和 0.67%（圖 2）。成骨、成脂及成軟骨分化誘導后，茜素紅染色可見橘紅色鈣結節，油紅 O 染色可見大量紅色脂滴，阿利辛藍染色可見大量藍色蛋白聚糖沉積（圖 3）。正常 BMSCs 染色均為陰性。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 BMSCs 表面抗原表達
a. CD45；b. CD11b；c. CD29；d. CD90；e. CD106
Figure2. Identification of the third generation BMSCs surface antigen by flow cytometrya. CD45; b. CD11b; c. CD29; d. CD90; e. CD106
圖3
BMSCs 不同條件誘導培養后染色觀察（×100）
a. 茜素紅染色；b. 油紅 O 染色；c. 阿利辛藍染色
Figure3. Staining observation of BMSCs under different induction conditions (×100)a. Alizarin red staining; b. Oil red O staining; c. Alcian blue staining
2.2 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 相關觀測
NMNAT3 基因轉染后 3 d，倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染細胞成功，并且穩定表達綠色熒光蛋白，轉染率達 90% 以上（圖 4a）。
圖4
NMNAT3 基因轉染 BMSCs 觀察
a. 轉染后 3 d 倒置熒光顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、過表達組；b. Western blot 檢測 NMNAT3 蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：正常對照組 2：陰性對照組 3：過表達組；c. 細胞增殖曲線
Figure4. Observation of BMSCs transfected with NMNAT3 genea. Inverted fluorescence microscope observation of BMSCs at 3 days after transfection (×100) From left to right for normal control group, negative control group, and overexpression group, respectively; b. NMNAT3 protein expression detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Normal control group 2: Negative control group 3: Overexpression group; c. Cell proliferation curve
予嘌呤霉素加壓篩選得到穩定株后，qRT-PCR 檢測結果顯示過表達組、陰性對照及正常對照組均檢測到 NMNAT3 基因表達，其相對表達量分別為 3.287±0.104、0.946±0.101、1.000±0.091。過表達組 NMNAT3 基因相對表達量明顯高于正常對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；正常對照組與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
Western blot 檢測過表達組、陰性對照組及正常對照組 NMNAT3 蛋白相對表達量分別為 0.987±0.043、0.347±0.030、0.421±0.038。過表達組 NMNAT3 蛋白相對表達量較正常對照組、陰性對照組明顯提高，差異均有統計學意義（P<0.05）；正常對照組及陰性對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
CCK-8 檢測示過表達組細胞分別經過緩慢生長期、對數生長期、生長平臺期 3 個階段，增殖曲線呈 S 形，與正常對照組及陰性對照組相比，增殖趨勢未見明顯差異，A 值差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4c。
2.3 NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
2.3.1 NMNAT3 對線粒體膜電位改變的影響
A、B 組間紅/綠熒光比值差異有統計學意義（P<0.05）；D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a、b。
圖5
NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
a. 線粒體膜電位觀察（激光共聚焦顯微鏡×100） 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. 紅/綠熒光比值；c. 線粒體 NAD+ 水平；d. 線粒體 ATP 水平
Figure5. Effect of NMNAT3 on mitochondrial function of BMSCs under oxidative stressa. Observation of mitochondrial membrane potential (Laser confocal microscope×100) From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. Red/green fluorescence ratio; c. NAD+ levels of mitochondria; d. ATP levels of mitochondria
2.3.2 NMNAT3 對線粒體 NAD+ 水平及 ATP 合成的影響
與 A 組相比，B 組 NAD+ 水平及 ATP 合成明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。D 組 NAD+ 及 ATP 水平均明顯增高，與 B、C 組相比差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間 NAD+ 及 ATP 水平差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5c、d。
2.4 NMNAT3 轉染后 BMSCs 抗氧化應激能力變化
2.4.1 NMNAT3 對降低細胞內 ROS 及 MDA 的作用
B 組 ROS 水平及 MDA 含量較 A 組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。D 組明顯高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6a～c。
圖6
NMNAT3 對 BMSCs 內 ROS、MDA 及抗氧化酶的影響
a. 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞 ROS 水平（×200） 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. ROS 水平；c. MDA 含量；d. Mn-SOD 相對活力；e. CAT 相對活力
Figure6. Effect of NMNAT3 on ROS, MDA, and antioxidant enzymes in BMSCsa. Observation of ROS level of cells by laser confocal microscope (×200) From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. ROS level; c. MDA content; d. Mn-SOD relative activity; e. CAT relative activity
2.4.2 NMNAT3 對抗氧化酶系 Mn-SOD 及 CAT 的影響
B 組 Mn-SOD、CAT 相對活力明顯低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。D 組明顯高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6d、e。
2.4.3 NMNAT3 對改善 BMSCs 衰老及凋亡的作用
A 組可見少量 SA-β-gal 染色陽性細胞，B 組陽性細胞較 A 組增多，但 D 組陽性細胞較 B、C 組減少。A、B、C、D 組陽性細胞比例分別為 15.223%±1.836%、74.584%±3.847%、81.125%±3.740%、27.258%±2.134%。A、B 組陽性細胞比例比較差異有統計學意義（P<0.05）。D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7a。
圖7
BMSCs 衰老及凋亡觀察
a. SA-β-gal 染色（×200）；b. 細胞凋亡染色（×100） 從左至右分別為 A、B、C、D 組，從上至下分別為 TUNEL、DAPI 染色及二者重疊
Figure7. Senescence and apoptosis observations of BMSCsa. SA-β-gal staining (×200); b. Apoptosis observations of BMSCs From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; From top to bottom for TUNEL staining, DAPI staining, and emerge, respectively
細胞凋亡檢測結果顯示 A、B、C、D 組細胞凋亡率分別為 12.887%±0.722%、69.285%±3.513%、75.190%±2.476%、18.353%±1.856%。 A、B 組細胞凋亡率差異有統計學意義（P<0.05）；D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7b。
3 討論
干細胞療法是再生醫學發展的核心，體外獲得大量高純度的干細胞是進行基礎和臨床研究的前提[15]。近年來隨著科技的發展、技術的成熟，已有多種體外分離和培養 BMSCs 的方法，各有優缺點，最合適的方法需要根據研究目的進行選取[16-17]。細胞質量問題是目前基于干細胞療法的主要障礙，嚴重影響其治療效果，我們總結分析了移植區病理學特征，并確定了線粒體功能障礙是影響干細胞存活的新因素[18-19]。由于移植區內環境復雜，缺血缺氧及炎癥介導造成移植的干細胞線粒體功能受損，積累大量 ROS 等類毒性物質，形成氧化應激損傷，加速細胞衰老及凋亡[20-21]。研究顯示[22-23]，線粒體內 NAD+ 水平對維持線粒體功能發揮著重要作用，線粒體功能受損常伴隨 NAD+ 水平下降，而通過調控 NAD+ 合成的關鍵酶 NMNAT3，恢復線粒體 NAD?+ 水平，進而改善線粒體功能，可能是解決移植干細胞質量問題的突破點。本研究中，我們成功使用 NMNAT3 基因修飾 BMSCs，通過經典 H2O2 誘導構建氧化應激模型，觀察到 D 組中 BMSCs 線粒體內 NAD+ 水平增加，相對于 B、C 組，能顯著改善氧化應激狀態下 BMSCs 的線粒體膜電位下降、ATP 合成減少等變化。這一結果表明，通過調控 NMNAT3 基因增加 NAD+ 水平，對于改善氧化應激狀態下線粒體功能障礙是有效的，這為以后研究線粒體損傷性疾病提供了新思路和方法。
線粒體不僅在調節細胞能量、維持細胞內氧化與抗氧化體系平衡中發揮著重要作用，還參與調控細胞的生長分化、信息傳遞和細胞凋亡等過程[24]。線粒體功能障礙是細胞損傷的最重要早期標志，及早進行有效干預可避免細胞損傷進一步加重，減少細胞凋亡[25-26]。我們進一步研究發現，NMNAT3 基因修飾不僅能有效改善氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能，還能使 BMSCs 細胞內 ROS 水平及 MDA 含量明顯降低，細胞內抗氧化酶系活性及水平升高，細胞凋亡率下降。結果提示NMNAT3 通過調節 NAD+ 水平恢復線粒體功能后，在一定程度上增強了 BMSCs 抗氧化應激能力，減少了細胞凋亡，對提高細胞存活率起到了積極作用。
綜上述，本研究結果提示 NMNAT3 對于改善線粒體功能障礙有一定積極作用，NMNAT3 基因修飾后的 BMSCs 其抗氧化應激能力有了一定增強，減少了氧化應激誘導的細胞凋亡。該結果為增強干細胞抗氧化應激能力，提高其存活率提供了一種新思路。然而，NMNAT3 調節 NAD+ 水平是通過何種機制改善線粒體功能仍不清楚。有研究報道[27]，沉默信息調節因子 3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，Sirt3）是線粒體內重要的組蛋白去乙酰化酶，它在調控線粒體能量代謝以及氧化應激等反應中具有重要作用，并且 Sirt3 生物活性依賴于細胞內 NAD+ 水平。線粒體功能障礙引起 NAD+ 水平下降是否影響 Sirt3 催化活性，限制其調節并改善線粒體功能尚不清楚。下一步需要集中于這一通路來研究 NMNAT3 調節 NAD+ 水平改善 BMSCs 線粒體功能的機制，為全面闡明 NMNAT3 作用提供實驗依據。
作者貢獻：王濤負責大部分實驗實施及數據收集整理，文章撰寫；彭吾訓、張飛負責實驗設計以及對文章的知識性內容作批評性審閱；鄭應剛、王貞文、袁大江給予實驗指導、協助實驗實施與統計分析指導。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準（1900590）。實驗動物生產許可證號：SCXK（黔）2008-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001。
基于細胞療法的干細胞移植技術在生物工程和醫學領域的研究日益增多，并且在基礎和臨床研究中均取得了突破性進展[1-3]。動物研究表明，BMSCs 構建的組織工程骨能用于骨缺損修復，具有一定成骨作用，是近年來骨組織工程研究熱點之一[4-6]。但是，組織工程骨可攜帶的 BMSCs 數量有限，加上骨壞死區微環境復雜，各種損傷因素常導致 BMSCs 遭受氧化應激損傷，影響了 BMSCs 的增殖分化及存活，造成修復效果欠佳[7-8]。線粒體是對內、外源性損傷因素最敏感的細胞器，也是細胞內氧化應激損傷的主要靶標[9]。氧化應激損傷導致線粒體功能障礙，使細胞內產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量 ROS 又會改變細胞內氧化還原狀態，進而導致細胞內氧化與抗氧化防御系統失衡，觸發多種凋亡信號轉導途徑，最終誘導細胞凋亡[10]。因此，保護線粒體功能是疾病治療的一個重要考慮因素[9]。
研究表明，線粒體內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）水平對維持線粒體功能具有重要作用[11-12]。Gulshan 等[13]通過小鼠模型研究，發現過表達煙酰胺單核苷酸腺苷轉移酶 3（nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 3，NMNAT3）能有效增加多種組織線粒體內 NAD+ 水平，對線粒體代謝穩定和降低 ROS 水平至關重要。本研究采用 NMNAT3 基因修飾 BMSCs，觀察該方法在改善 BMSCs 氧化應激狀態下線粒體功能的作用，以及對 BMSCs 抗氧化應激能力的影響，探討將其作為一種改善線粒體功能的方法用于組織工程研究的可行性，為提高干細胞移植療效提供新思路和實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑
4～6 周齡新西蘭大白兔 16 只，體質量（2.0±0.5）kg，雌雄不限，由貴州醫科大學動物實驗中心提供。
DMEM 培養基、FBS、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA（GIBCO 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；北京索萊寶生物科技有限公司）；成骨誘導分化試劑盒、成脂誘導分化試劑盒、成軟骨誘導分化試劑盒 [賽業（蘇州）生物科技有限公司]；線粒體膜電位 JC-1 檢測試劑盒、ROS 檢測熒光探針-DHE、TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，Mn-SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、NAD+、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP） 檢測試劑盒以及衰老相關 β-半乳糖苷酶（senescence associated-β-galactosidase，SA-β-gal）染色試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）標記的 NMNAT3 基因過表達慢病毒（Lv-NMNAT3-EGFP）和陰性對照慢病毒（Lv-EGFP）（上海恒圓生物科技有限公司）；NMNAT3 引物、ACTB 引物、cDNA 合成試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；兔抗兔 Anti-NMNAT3、兔抗兔 Anti-β-actin（北京博奧森生物技術有限公司）；Anti-CD29/AF647、Anti-CD90/PE-CyTM7、Anti-CD106/PE、Anti-CD45/FITC、Anti-CD11b/V450（BD 公司，美國）。
1.2 兔 BMSCs 分離培養及鑒定
取新西蘭大白兔，仰臥固定于手術臺，分別于股骨遠端和脛骨近端抽取骨髓 4～5 mL，采用密度梯度離心法分離細胞后，用含 10%FBS 和 1% 青霉素-鏈霉素的完全培養基接種于 25 cm2 培養瓶中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。每 2～3 天更換完全培養基 1 次，待培養瓶底細胞匯合度達 90% 以上時，按 1∶3 比例消化傳代。
取第 3 代生長良好的 BMSCs 進行鑒定。① 應用流式細胞儀檢測 BMSCs 細胞表面標記物 CD29、CD90、CD106、CD45、CD11b 的表達。② 根據各誘導分化試劑盒操作說明配制誘導分化完全培養基，對 BMSCs 進行成骨、成脂、成軟骨多向誘導分化，分別于培養 2、3、3 周后，采用茜素紅、油紅 O、阿利辛藍染色鑒定其成骨、成脂及成軟骨分化潛能。以完全培養基培養的第 3 代 BMSCs 作為對照。
1.3 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 及觀測
1.3.1 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 方法
取第 3 代生長良好的 BMSCs 接種于培養瓶，待細胞融合度達 40% 左右時，分別采用 Lv-NMNAT3-EGFP（BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP，過表達組）及 Lv-EGFP（BMSCs/Lv-EGFP，陰性對照組）進行轉染，根據預實驗結果選擇感染復數為 100；轉染 12 h 后更換為完全培養基繼續培養。3 d 后于倒置熒光顯微鏡下觀察過表達組、陰性對照組細胞綠色熒光蛋白表達情況，以未轉染 BMSCs 作為正常對照組。鏡下隨機選取 4～6 個視野，計數綠色熒光蛋白表達細胞數與細胞總數，計算轉染率。轉染率=（綠色熒光蛋白表達細胞數/細胞總數）×100%。
1.3.2 轉染后 BMSCs 內 NMNAT3 蛋白及基因水平檢測
慢病毒轉染 5 d 后，于過表達組、陰性對照組和正常對照組中加入含嘌呤霉素（2 μg/mL）的培養基篩選，待正常對照組細胞全部死亡后，將過表達組和陰性對照組嘌呤霉素濃度減半（1 μg/mL）維持篩選得到穩定株，分別采用實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）及 Western blot 技術檢測 BMSCs 內 NMNAT3 基因及蛋白表達情況。另取正常對照組細胞進行上述檢測。
1.3.3 轉染后 BMSCs 增殖能力檢測
取過表達組、陰性對照組和正常對照組細胞，常規胰蛋白酶消化后，完全培養基重懸，按（2～3）×103 個/孔接種于 96 孔板，每組設 4 個復孔，共計 7 板，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養 7 d 內每天固定時間取 1 板，按 CCK-8 檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀測定 450 nm 處吸光度（A）值，繪制各組細胞生長曲線。
1.4 H2O2 模擬氧化應激處理 BMSCs 方法及實驗分組
實驗分為 4 組：A 組（BMSCs）、B 組（BMSCs+H2O2）、C 組（BMSCs/Lv-EGFP+H2O2）、D 組（BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP+H2O2）。其中 A 組不加 H2O2 處理，作為正常對照。B、C、D 組分別取 BMSCs、BMSCs/Lv-EGFP 和 BMSCs/Lv-NMNAT3-EGFP，按照 2×104 個/孔均勻接種于 6 孔板，待細胞生長融合度達 85%～90% 時，更換為 H2O2 濃度為500 μmol/L 的培養基，模擬氧化應激處理 24 h[14]后進行觀測。
1.5 NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
1.5.1 NMNAT3 對線粒體膜電位改變的影響
取各組細胞采用 JC-1 法檢測線粒體膜電位，激光共聚焦顯微鏡下觀察，JC-1 探針進入線粒體產生紅色熒光，JC-1 探針停留于細胞質中產生綠色熒光。采用 Image 軟件計算紅/綠熒光比值，以此衡量線粒體膜電位是否下降。實驗重復 3 次。
1.5.2 NMNAT3 對線粒體 NAD+ 水平及 ATP 合成的影響
取各組細胞分別參照 NAD+ 檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒說明進行操作。采用酶標儀繪制 ATP、NAD+ 含量標準曲線，根據標準曲線計算樣品中 ATP、NAD+ 水平。實驗重復 3 次。
1.6 NMNAT3 轉染后 BMSCs 抗氧化應激能力變化
1.6.1 NMNAT3 對降低細胞內 ROS 及 MDA 的作用
取各組細胞分別參照 ROS 檢測熒光探針-DHE、MDA 檢測試劑盒說明書進行操作。使用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞內 ROS 紅色熒光標記情況，Image 軟件進行熒光強度量化計算 ROS 水平；用酶標儀繪制標準曲線并檢測樣品在 535 nm 波長處 A 值，根據標準曲線標化定量樣品中 MDA 含量。實驗重復 3 次。
1.6.2 NMNAT3 對抗氧化酶系 Mn-SOD 及 CAT 的影響
取各組細胞分別參照 Mn-SOD 檢測試劑盒和 CAT 檢測試劑盒說明書進行操作。用酶標儀繪制標準曲線并分別檢測樣品 Mn-SOD、CAT 在 450 nm 和 405 nm 波長處 A 值，根據標準曲線標化定量樣品中 Mn-SOD 和 CAT 相對活力。實驗重復3 次。
1.6.3 NMNAT3 對改善 BMSCs 衰老及凋亡的作用
取各組細胞置于 4% 多聚甲醛固定液，室溫下固定 15 min，根據 SA-β-gal 染色試劑盒制備染色工作溶液，按照操作說明書加入工作溶液后，37℃ 孵育過夜，光鏡下觀察細胞內呈藍染的陽性細胞。于 200 倍鏡下選擇 5～8 個視野，計數陽性細胞數及細胞總數，按以下公式計算陽性細胞比例：（陽性細胞數/細胞總數）×100%，取均值。實驗重復 3 次。
取各組細胞使用免疫染色固定液固定 30 min，根據 TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明，分別加入 TUNEL 和 DAPI 染液孵育細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞凋亡情況，紅色熒光為凋亡細胞，藍色熒光為所有有核細胞。隨機選擇 5～8 個視野，計數紅色、藍色熒光細胞數，按以下公式計算細胞凋亡率：（紅色熒光細胞數/藍色熒光細胞數）×100%，取均值。實驗重復 3 次。
1.7 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD-t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs 細胞形態及鑒定
采用密度梯度離心聯合貼壁培養法，體外培養第 7 天獲得大量長梭形、魚群狀分布、形態均一的原代 BMSCs；經體外連續傳代培養后，細胞形態與原代細胞相似，未見明顯改變（圖 1）。
圖1
兔 BMSCs 形態學觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 原代 BMSCs 培養 7 d；b. 第 3 代 BMSCs；c. 第 5 代 BMSCs
Figure1. Morphological observation of rabbit BMSCs (Inverted microscope×100)a. Primary BMSCs cultured for 7 days; b. The third generation BMSCs; c. The fifth generation BMSCs
流式細胞儀檢測顯示，第 3 代 BMSCs 高表達 CD29、CD90、CD106，陽性率分別為 100%、100% 和 99.68%，低表達 CD45 和 CD11b，陽性率分別為 0.06% 和 0.67%（圖 2）。成骨、成脂及成軟骨分化誘導后，茜素紅染色可見橘紅色鈣結節，油紅 O 染色可見大量紅色脂滴，阿利辛藍染色可見大量藍色蛋白聚糖沉積（圖 3）。正常 BMSCs 染色均為陰性。
圖2
流式細胞儀檢測第 3 代 BMSCs 表面抗原表達
a. CD45；b. CD11b；c. CD29；d. CD90；e. CD106
Figure2. Identification of the third generation BMSCs surface antigen by flow cytometrya. CD45; b. CD11b; c. CD29; d. CD90; e. CD106
圖3
BMSCs 不同條件誘導培養后染色觀察（×100）
a. 茜素紅染色；b. 油紅 O 染色；c. 阿利辛藍染色
Figure3. Staining observation of BMSCs under different induction conditions (×100)a. Alizarin red staining; b. Oil red O staining; c. Alcian blue staining
2.2 NMNAT3 基因轉染 BMSCs 相關觀測
NMNAT3 基因轉染后 3 d，倒置熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉染細胞成功，并且穩定表達綠色熒光蛋白，轉染率達 90% 以上（圖 4a）。
圖4
NMNAT3 基因轉染 BMSCs 觀察
a. 轉染后 3 d 倒置熒光顯微鏡觀察（×100） 從左至右分別為正常對照組、陰性對照組、過表達組；b. Western blot 檢測 NMNAT3 蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：正常對照組 2：陰性對照組 3：過表達組；c. 細胞增殖曲線
Figure4. Observation of BMSCs transfected with NMNAT3 genea. Inverted fluorescence microscope observation of BMSCs at 3 days after transfection (×100) From left to right for normal control group, negative control group, and overexpression group, respectively; b. NMNAT3 protein expression detected by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Normal control group 2: Negative control group 3: Overexpression group; c. Cell proliferation curve
予嘌呤霉素加壓篩選得到穩定株后，qRT-PCR 檢測結果顯示過表達組、陰性對照及正常對照組均檢測到 NMNAT3 基因表達，其相對表達量分別為 3.287±0.104、0.946±0.101、1.000±0.091。過表達組 NMNAT3 基因相對表達量明顯高于正常對照組和陰性對照組，差異有統計學意義（P<0.05）；正常對照組與陰性對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。
Western blot 檢測過表達組、陰性對照組及正常對照組 NMNAT3 蛋白相對表達量分別為 0.987±0.043、0.347±0.030、0.421±0.038。過表達組 NMNAT3 蛋白相對表達量較正常對照組、陰性對照組明顯提高，差異均有統計學意義（P<0.05）；正常對照組及陰性對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4b。
CCK-8 檢測示過表達組細胞分別經過緩慢生長期、對數生長期、生長平臺期 3 個階段，增殖曲線呈 S 形，與正常對照組及陰性對照組相比，增殖趨勢未見明顯差異，A 值差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 4c。
2.3 NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
2.3.1 NMNAT3 對線粒體膜電位改變的影響
A、B 組間紅/綠熒光比值差異有統計學意義（P<0.05）；D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a、b。
圖5
NMNAT3 對氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能的影響
a. 線粒體膜電位觀察（激光共聚焦顯微鏡×100） 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. 紅/綠熒光比值；c. 線粒體 NAD+ 水平；d. 線粒體 ATP 水平
Figure5. Effect of NMNAT3 on mitochondrial function of BMSCs under oxidative stressa. Observation of mitochondrial membrane potential (Laser confocal microscope×100) From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. Red/green fluorescence ratio; c. NAD+ levels of mitochondria; d. ATP levels of mitochondria
2.3.2 NMNAT3 對線粒體 NAD+ 水平及 ATP 合成的影響
與 A 組相比，B 組 NAD+ 水平及 ATP 合成明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。D 組 NAD+ 及 ATP 水平均明顯增高，與 B、C 組相比差異有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間 NAD+ 及 ATP 水平差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5c、d。
2.4 NMNAT3 轉染后 BMSCs 抗氧化應激能力變化
2.4.1 NMNAT3 對降低細胞內 ROS 及 MDA 的作用
B 組 ROS 水平及 MDA 含量較 A 組明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。D 組明顯高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6a～c。
圖6
NMNAT3 對 BMSCs 內 ROS、MDA 及抗氧化酶的影響
a. 激光共聚焦顯微鏡觀察細胞 ROS 水平（×200） 從左至右分別為 A、B、C、D 組；b. ROS 水平；c. MDA 含量；d. Mn-SOD 相對活力；e. CAT 相對活力
Figure6. Effect of NMNAT3 on ROS, MDA, and antioxidant enzymes in BMSCsa. Observation of ROS level of cells by laser confocal microscope (×200) From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; b. ROS level; c. MDA content; d. Mn-SOD relative activity; e. CAT relative activity
2.4.2 NMNAT3 對抗氧化酶系 Mn-SOD 及 CAT 的影響
B 組 Mn-SOD、CAT 相對活力明顯低于 A 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。D 組明顯高于 B、C 組，差異均有統計學意義（P<0.05）；B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 6d、e。
2.4.3 NMNAT3 對改善 BMSCs 衰老及凋亡的作用
A 組可見少量 SA-β-gal 染色陽性細胞，B 組陽性細胞較 A 組增多，但 D 組陽性細胞較 B、C 組減少。A、B、C、D 組陽性細胞比例分別為 15.223%±1.836%、74.584%±3.847%、81.125%±3.740%、27.258%±2.134%。A、B 組陽性細胞比例比較差異有統計學意義（P<0.05）。D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7a。
圖7
BMSCs 衰老及凋亡觀察
a. SA-β-gal 染色（×200）；b. 細胞凋亡染色（×100） 從左至右分別為 A、B、C、D 組，從上至下分別為 TUNEL、DAPI 染色及二者重疊
Figure7. Senescence and apoptosis observations of BMSCsa. SA-β-gal staining (×200); b. Apoptosis observations of BMSCs From left to right for groups A, B, C, and D, respectively; From top to bottom for TUNEL staining, DAPI staining, and emerge, respectively
細胞凋亡檢測結果顯示 A、B、C、D 組細胞凋亡率分別為 12.887%±0.722%、69.285%±3.513%、75.190%±2.476%、18.353%±1.856%。 A、B 組細胞凋亡率差異有統計學意義（P<0.05）；D 組與 B、C 組比較差異有統計學意義（P<0.05），B、C 組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 7b。
3 討論
干細胞療法是再生醫學發展的核心，體外獲得大量高純度的干細胞是進行基礎和臨床研究的前提[15]。近年來隨著科技的發展、技術的成熟，已有多種體外分離和培養 BMSCs 的方法，各有優缺點，最合適的方法需要根據研究目的進行選取[16-17]。細胞質量問題是目前基于干細胞療法的主要障礙，嚴重影響其治療效果，我們總結分析了移植區病理學特征，并確定了線粒體功能障礙是影響干細胞存活的新因素[18-19]。由于移植區內環境復雜，缺血缺氧及炎癥介導造成移植的干細胞線粒體功能受損，積累大量 ROS 等類毒性物質，形成氧化應激損傷，加速細胞衰老及凋亡[20-21]。研究顯示[22-23]，線粒體內 NAD+ 水平對維持線粒體功能發揮著重要作用，線粒體功能受損常伴隨 NAD+ 水平下降，而通過調控 NAD+ 合成的關鍵酶 NMNAT3，恢復線粒體 NAD?+ 水平，進而改善線粒體功能，可能是解決移植干細胞質量問題的突破點。本研究中，我們成功使用 NMNAT3 基因修飾 BMSCs，通過經典 H2O2 誘導構建氧化應激模型，觀察到 D 組中 BMSCs 線粒體內 NAD+ 水平增加，相對于 B、C 組，能顯著改善氧化應激狀態下 BMSCs 的線粒體膜電位下降、ATP 合成減少等變化。這一結果表明，通過調控 NMNAT3 基因增加 NAD+ 水平，對于改善氧化應激狀態下線粒體功能障礙是有效的，這為以后研究線粒體損傷性疾病提供了新思路和方法。
線粒體不僅在調節細胞能量、維持細胞內氧化與抗氧化體系平衡中發揮著重要作用，還參與調控細胞的生長分化、信息傳遞和細胞凋亡等過程[24]。線粒體功能障礙是細胞損傷的最重要早期標志，及早進行有效干預可避免細胞損傷進一步加重，減少細胞凋亡[25-26]。我們進一步研究發現，NMNAT3 基因修飾不僅能有效改善氧化應激狀態下 BMSCs 線粒體功能，還能使 BMSCs 細胞內 ROS 水平及 MDA 含量明顯降低，細胞內抗氧化酶系活性及水平升高，細胞凋亡率下降。結果提示NMNAT3 通過調節 NAD+ 水平恢復線粒體功能后，在一定程度上增強了 BMSCs 抗氧化應激能力，減少了細胞凋亡，對提高細胞存活率起到了積極作用。
綜上述，本研究結果提示 NMNAT3 對于改善線粒體功能障礙有一定積極作用，NMNAT3 基因修飾后的 BMSCs 其抗氧化應激能力有了一定增強，減少了氧化應激誘導的細胞凋亡。該結果為增強干細胞抗氧化應激能力，提高其存活率提供了一種新思路。然而，NMNAT3 調節 NAD+ 水平是通過何種機制改善線粒體功能仍不清楚。有研究報道[27]，沉默信息調節因子 3（silent mating type information regulation 2 homolog 3，Sirt3）是線粒體內重要的組蛋白去乙酰化酶，它在調控線粒體能量代謝以及氧化應激等反應中具有重要作用，并且 Sirt3 生物活性依賴于細胞內 NAD+ 水平。線粒體功能障礙引起 NAD+ 水平下降是否影響 Sirt3 催化活性，限制其調節并改善線粒體功能尚不清楚。下一步需要集中于這一通路來研究 NMNAT3 調節 NAD+ 水平改善 BMSCs 線粒體功能的機制，為全面闡明 NMNAT3 作用提供實驗依據。
作者貢獻：王濤負責大部分實驗實施及數據收集整理，文章撰寫；彭吾訓、張飛負責實驗設計以及對文章的知識性內容作批評性審閱；鄭應剛、王貞文、袁大江給予實驗指導、協助實驗實施與統計分析指導。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經貴州醫科大學動物實驗倫理委員會批準（1900590）。實驗動物生產許可證號：SCXK（黔）2008-0006，實驗動物使用許可證號：SYXK（黔）2018-0001。
