引用本文： 武杰, 桂顯偉, 姜慧嬌, 梁學奇, 王二強, 徐小丹, 陳雪玲, 吳向未. 細粒棘球絳蟲原頭節促進 BMSCs 纖維化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(5): 630-636. doi: 10.7507/1002-1892.201909050 復制
包蟲病是由棘球絳蟲幼蟲階段引起的一種嚴重威脅生命的人畜共患病[1]，包括泡狀棘球蚴病和細粒棘球蚴病。細粒棘球蚴病多發于肝臟，呈世界性分布，新疆是高發區[2]。在肝細粒棘球蚴病內層纖維囊壁膨脹性形成過程中，囊周 Glisson 系統和肝靜脈系統受擠壓并不斷纖維化，形成另一層纖維囊壁（外囊壁）[3]。外囊壁的纖維化可有效控制寄生蟲的營養攝取[4]，抑制細粒棘球蚴生長，使疾病處于靜止期。成纖維細胞是細粒棘球蚴外囊壁主要組成細胞之一，由胚胎時期的 MSCs 分化而來。因此 MSCs 纖維化與細粒棘球蚴外囊壁形成密切相關。
MSCs 是一種具有自我復制和多向分化能力的成體干細胞，在體內外各種不同誘導條件下，可分化為成骨細胞、成脂細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞[5-7]。MSCs 在抑制腫瘤生長、參與免疫調節、修復損傷組織中發揮重要作用[8-10]。目前，MSCs 在細粒棘球蚴病外囊壁纖維化過程中的作用尚不明確。Ⅰ、Ⅲ 型膠原可反映纖維化進程和特點。TGF-β1 是細胞和組織纖維化的主要調節因子[11]，主要通過 TGF-β/Smad 途徑發揮生物學效應。TGF-β1 的典型信號傳導途徑涉及 Smad 家族的轉錄激活因子，磷酸化 Smad2、3 促進 TGF-β1/Smad 通路，Smad7 可抑制 TGF-β1/Smad 通路，可以與受體型 Smad 拮抗信號傳導[12]。本研究通過共培養細粒棘球絳蟲原頭節和 BMSCs，檢測 BMSCsⅠ、Ⅲ 型膠原的表達和 TGF-β1/Smad 信號通路因子的表達，明確細粒棘球蚴作用下 BMSCs 成纖維化機制，為探討細粒棘球蚴病外囊壁的形成機制提供理論基礎，以期為包蟲病的治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 4 周齡 C57BL/6 小鼠 40 只，雌雄不限，體質量 18～22 g，購于新疆醫科大學動物實驗中心。DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；Trizol（Life-invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒 Prime ScriptTM RT Reagent Kit、實時定量熒光 PCR 試劑盒 SYBR Primix Ex Tap KitTM（Thermo 公司，美國）；Ⅰ 型膠原抗體（Cell Signalte Technology 公司，美國）；Ⅲ 型膠原抗體、TGF-β1 抗體、Smad7 抗體、磷酸化 Smad2/3 抗體（Abcam 公司，美國）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，德國）；FITC 標記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Ⅰ 型膠原 ELISA 試劑盒、Ⅲ 型膠原 ELISA 試劑盒（武漢尤爾生商貿有限公司）；MUCMD-90041 小鼠成骨試劑盒、MUCMX-90031 成脂試劑盒（賽業蘇州生物科技有限公司）；Immonilon Western 化學發光試劑（Millipore 公司，德國）。倒置顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 小鼠 BMSCs 分離培養
取 C57BL/6 小鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡 5 min；無菌條件下取出雙側股骨，剃凈軟組織，剪斷股骨兩端后，用 5 mL 注射器吸取含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的 DMEM 培養液沖洗骨髓腔。將沖洗后的骨髓及細胞懸液接種于直徑 6 cm 培養皿中，37℃、5%CO2 培養箱靜置培養；4 h 后換液，去除懸浮細胞，以后每隔 2～3 d 換液；按 1∶2 比例傳代后，取第 3 代細胞進行實驗[13]。按 MUCMD-90041 小鼠成骨試劑盒和 MUCMX-90031 成脂試劑盒說明書分別進行細胞成脂及成骨分化鑒定。
1.3 細粒棘球絳蟲原頭節提取及相關觀測
1.3.1 細粒棘球絳蟲原頭節提取
從感染細粒棘球蚴病的羊肝（來自昌吉屠宰場，現場取出后無菌封閉包裝，蒸餾水清洗 3 遍，75% 乙醇消毒羊肝表面）上，無菌注射器抽取無鈣化、無污染、完整的單囊型細粒棘球蚴包囊內容物，置于無菌離心管內，原頭節自然沉淀；再用含 100 U/mL 青霉素、100 U/L 鏈霉素的無菌 PBS 漂洗 10～15 次，除去包囊碎片使其自然沉淀，即獲得細粒棘球絳蟲原頭節。
1.3.2 形態觀察
取經過無菌 PBS 漂洗 3 次后的細粒棘球絳蟲原頭節，置于含 10%FBS 的 1640 培養基中培養，倒置顯微鏡下觀察細粒棘球絳蟲原頭節的形態和活性。
1.3.3 伊紅染色觀察
取經過無菌 PBS 漂洗 3 次后的細粒棘球絳蟲原頭節，吸取 10 μL 原頭節和 PBS 混合液置于載玻片上，滴加 10 μL 0.5% 伊紅染色 5 min。記錄活原頭節（拒染色）和死原頭節（紅染）的數量，計算細粒棘球絳蟲原頭節的活性，公式為：活原頭節數量/（活原頭節數量+死原頭節數量）×100%；取活性>90% 的原頭節用于實驗。
1.4 細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 纖維化觀測
1.4.1 實驗分組
實驗分為 2 組，實驗組取 1 000 個細粒棘球絳蟲原頭節和 1×106 個第 3 代 BMSCs，于 6 孔板中共培養；對照組單純取 1×106 個第 3 代 BMSCs 于 6 孔板培養。倒置顯微鏡下觀察實驗組共培養 7 d 后 BMSCs 形態學變化，觀察是否與單獨培養的小鼠成纖維細胞[14]形態相似。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 BMSCs 中 Ⅰ、Ⅲ 型膠原和 TGF-β1 mRNA 表達水平
于培養 1、3、5、7 d，兩組均采用 Trizol 提取細胞的總 RNA，使用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA 后，使用實時定量熒光 PCR 試劑盒進行實時熒光定量 PCR 分析。反應條件：95℃、3 min 初始變性；95℃、15 s，60℃、30 s，40 個循環。以 β-actin 為內參照，采用 2?△△Ct法計算 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原和 TGF-β1 mRNA 相對表達量[15-16]。各基因引物序列及產物大小見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size for real-time fluorescent quantitative PCR
1.4.3 Western blot 檢測 BMSCs 中 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、TGF-β1、Smad7 和磷酸化 Smad2/3 蛋白表達水平
培養 1、3、5、7 d 取兩組細胞，于 1 mL 裂解液中加 10 μL PMSF 配制細胞裂解液；在培養板中加細胞裂解液，細胞刷刷取細胞后將細胞裂解液吸入 1.5 mL 無菌離心管，于 4℃、離心半徑 7 cm、12 000 r/min 離心 10 min；將上清分裝轉移至無菌離心管中。配平實驗組與對照組的樣本濃度。加入溴酚藍煮沸 10 min，保存備用。各取等量蛋白樣品行 SDS-PAGE 電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜。經封閉液封閉 2 h，分別加入小鼠 Ⅰ 型膠原抗體、Ⅲ 型膠原抗體、Smad7 抗體、磷酸化 Smad2/3 抗體、 TGF-β1 抗體一抗，4℃ 過夜；加入二抗，室溫孵育 2 h；增強化學發光試劑 ECL 顯色，膠片曝光，成像分析軟件對結果進行灰度掃描分析。以 β-actin 為內參照，以各目標蛋白條帶與內參照條帶比值作為目標蛋白的相對表達量。
1.4.4 ELISA 檢測培養上清中 Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白水平
培養 1、3、5、7 d 收集兩組細胞培養基上清，吸取上清至 1.5 mL 無菌離心管中，根據 ELISA 試劑盒操作步驟檢測 Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白含量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠 BMSCs 形態觀察及誘導鑒定
貼壁法培養的原代細胞 1 d 后可見少量細胞爬出，5 d 左右細胞達 80% 融合，將細胞消化傳代繼續培養。隨著傳代次數增加，細胞逐漸純化；第 3 代細胞以長梭形為主，呈成纖維樣、放射狀貼壁生長（圖 1a）。
圖1
小鼠 BMSCs 形態學觀察及誘導分化鑒定
a. 第 3 代細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100）；b. 成骨誘導 28 d 茜素紅染色觀察（×100）；c. 成脂誘導 15 d 油紅 O 染色觀察（×200）
Figure1. Morphological observation and differentiation identification of BMSCs of micea. Morphological observation of the 3rd generation cells (Inverted microscope×100); b. Alizarin red staining observation at 28 days after osteogenesis induction (×100); c. Oil red O staining observation at 15 days after lipogenesis induction (×200)
小鼠 BMSCs 在成骨誘導液中逐漸變成多邊形，可見細胞部分聚集生長；28 d 行茜素紅染色可在細胞密集區見紅色鈣結節（圖 1b）。小鼠 BMSCs 在成脂細胞誘導液中逐漸變成短梭形；15 d 行油紅 O 染色示細胞質中充滿紅色脂滴（圖 1c）。
2.2 細粒棘球絳蟲原頭節相關觀測
2.2.1 形態觀察
倒置顯微鏡觀察細粒棘球絳蟲原頭節的形態完整，無失活變黑，原頭節均蠕動活躍。見圖 2a。
圖2
細粒棘球絳蟲原頭節觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 形態觀察；b. 伊紅染色觀察
Figure2. Observation on protoscolex of Echinococcus granulosus (Inverted microscope×100)a. Morphological observation; b. Eosin staining observation
2.2.2 伊紅染色觀察
伊紅染色 5 min 后，細粒棘球絳蟲原頭節的活性為 95%±2%。見圖 2b。
2.3 細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 纖維化觀測
2.3.1 細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養形態觀察
實驗組細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養 7 d 觀察到 BMSCs 形態發生改變，變成梭形和不規則三角形，更接近單獨培養的成纖維細胞。見圖 3。
圖3
共培養實驗細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養 7 d 形態觀察；b. 小鼠成纖維細胞
Figure3. Cell morphological observation of co-cultured experiment (Inverted microscope×100)a. Morphological observation on protoscolex of echinococcus granulosus and BMSCs after co-cultured for 7 days; b. Fibroblasts of mouse
2.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組 TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各時間點兩組各基因相對表達量
a. TGF-β1；b. Ⅰ 型膠原；c. Ⅲ 型膠原
Figure4. The relative mRNA expression in two groups at each time point detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. TGF-β1; b. Collagen type Ⅰ; c. Collagen type Ⅲ
2.3.3 Western blot 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組 TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、磷酸化 Smad2/3 蛋白相對表達量均顯著高于對照組，Smad7 蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖5
Western blot 檢測各時間點兩組各蛋白表達電泳圖
1：對照組 2：實驗組 a. 1 d；b. 3 d；c. 5 d；d. 7 d
Figure5. Electrophoregram of the protein expression of the two groups at each time point detected by Western blot1: Experimental group 2: Control group a. One day; b. Three days; c. Five days; d. Seven days
圖6
Western blot 檢測各時間點兩組各蛋白相對表達量
a. TGF-β1；b. Ⅰ 型膠原；c. Ⅲ 型膠原；d. Smad7；e. 磷酸化 Smad2/3
Figure6. The relative protein expression in two groups at each time point detected by Western blota. TGF-β1; b. Collagen type Ⅰ; c. Collagen type Ⅲ; d. Smad7; e. Phosphorylation Smad2/3
2.3.4 ELISA 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組上清中 Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原蛋白含量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖7
ELISA 檢測各時間點兩組上清中 Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原蛋白含量
a. Ⅰ 型膠原；b. Ⅲ 型膠原
Figure7. The contents of collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ in the supernatant of the two groups at each time point detected by ELISAa. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
3 討論
在肝細粒棘球蚴疾病病程中，外囊壁是宿主免疫防御反應的結果，外囊壁的形成可以局部限制細粒棘球蚴囊腫的病程進展，宿主和蟲體則達到一種長期相互適應的動態平衡[17]。細粒棘球蚴蟲體寄生于人體實質性臟器后，蟲體囊體不斷膨脹性生長，擠壓周圍臟器，引起組織炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生、不斷纖維化，最終形成纖維性囊壁。本課題組既往研究發現，在小鼠肝細粒棘球蚴模型中，從肝細粒棘球蚴外囊壁分離培養出貼壁細胞。觀察發現該細胞具有類似于 MSCs 的生長特征，可在體外呈集落性生長形成克隆；成骨培養基誘導培養后，該細胞可形成鈣結節[18]。提示 MSCs 可能在細粒棘球蚴病纖維囊壁形成中起到重要作用。
TGF-β 是細胞和組織纖維化的經典信號通路[19]，其過表達可引起細胞外基質沉積（包括膠原的合成）[20]。膠原的合成在 MSCs 向成纖維細胞分化中起到重要作用，有實驗通過外源性 MSCs 促進膠原合成向纖維化分化，促進人體皮膚再生[21]。本課題組既往研究發現，肝細粒棘球蚴病患者外囊壁上 TGF-β 受體 Ⅰ 和 Ⅱ 表達量較高[22]；從肝細粒棘球蚴外囊壁可分離培養出具有 MSCs 生長特性的細胞[18]。在此基礎上，本實驗共培養 BMSCs 與細粒棘球絳蟲原頭節，通過基因及蛋白水平檢測共培養后 BMSCs 向成纖維化細胞分化的能力，驗證 BMSCs 是否參與肝細粒棘球蚴外囊壁的形成。結果顯示，實驗組 BMSCs 的 Smad7 表達減少，磷酸化 Smad2/3 表達增加，可能與 TGF-β1 表達增多密切相關，與 BMSCs 參與細粒棘球蚴病外囊壁的形成有密切關系。TGF-β/Smad 信號通路因子中，受體相關的 Smad 主要包括磷酸化 Smad2/3，可促進 TGF-β/Smad 信號通路受體結合；Smad7 可以與受體型 Smad 拮抗信號傳導，抑制 TGF-β/Smad 信號通路[12]。本課題組既往實驗發現，TGF-β1 在小鼠細粒棘球蚴感染早期表達增加，可能有利于細粒棘球蚴的免疫逃逸[23]。感染小鼠給予 TGF-β1 受體阻斷劑后，下游分子磷酸化 Smad2/3 蛋白表達下降，可能提高 T 淋巴細胞免疫，從而抵制細粒棘球蚴的感染[24]。近期研究發現，Smad3 抑制劑 SIS3 能抑制原頭蚴活性。因此，TGF-β/Samd 信號通路相關抑制劑可能是一類新穎的有效抗棘球絳蟲的藥物[25]。下一步可繼續深入研究 TGF-β/Smad 信號相關抑制劑對 MSCs 參與細粒棘球蚴病外囊壁形成可能起到的作用。
本研究體外共培養細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs，發現共培養 7 d 后的 BMSCs 呈梭形或不規則三角形，和單獨培養的成纖維細胞形態相似。實驗組 BMSCs 的 Smad7 蛋白表達減少，磷酸化 Smad2/3 蛋白表達增加；TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原的蛋白及 mRNA 表達均高于單獨培養的 BMSCs。上述結果可能與細粒棘球蚴外囊壁的纖維化密切相關。
綜上述，細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 通過 TGF-β/Smad 信號通路分泌 TGF-β1、Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原，促進向成纖維細胞分化，可能與細粒棘球蚴外囊壁的纖維化密切相關。本研究為細粒棘球蚴病外囊壁的纖維化提供了理論依據，為包蟲病治療提供了新思路。下一步本課題組將開展小鼠體內實驗，通過病理學切片及免疫熒光染色，觀察小鼠肝臟感染細粒棘球蚴病后病灶周圍的成纖維進展。
作者貢獻：武杰直接參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，撰寫論文；桂顯偉、梁學奇、王二強、徐小丹參與實驗實施、數據收集整理；姜慧嬌參與實驗設計及統計分析，對文章的知識性內容作批評性審閱；陳雪玲參與實驗設計；吳向未負責實驗設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：本研究動物實驗獲石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理審查委員會批準（A2017-008-01）。實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003。
包蟲病是由棘球絳蟲幼蟲階段引起的一種嚴重威脅生命的人畜共患病[1]，包括泡狀棘球蚴病和細粒棘球蚴病。細粒棘球蚴病多發于肝臟，呈世界性分布，新疆是高發區[2]。在肝細粒棘球蚴病內層纖維囊壁膨脹性形成過程中，囊周 Glisson 系統和肝靜脈系統受擠壓并不斷纖維化，形成另一層纖維囊壁（外囊壁）[3]。外囊壁的纖維化可有效控制寄生蟲的營養攝取[4]，抑制細粒棘球蚴生長，使疾病處于靜止期。成纖維細胞是細粒棘球蚴外囊壁主要組成細胞之一，由胚胎時期的 MSCs 分化而來。因此 MSCs 纖維化與細粒棘球蚴外囊壁形成密切相關。
MSCs 是一種具有自我復制和多向分化能力的成體干細胞，在體內外各種不同誘導條件下，可分化為成骨細胞、成脂細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞[5-7]。MSCs 在抑制腫瘤生長、參與免疫調節、修復損傷組織中發揮重要作用[8-10]。目前，MSCs 在細粒棘球蚴病外囊壁纖維化過程中的作用尚不明確。Ⅰ、Ⅲ 型膠原可反映纖維化進程和特點。TGF-β1 是細胞和組織纖維化的主要調節因子[11]，主要通過 TGF-β/Smad 途徑發揮生物學效應。TGF-β1 的典型信號傳導途徑涉及 Smad 家族的轉錄激活因子，磷酸化 Smad2、3 促進 TGF-β1/Smad 通路，Smad7 可抑制 TGF-β1/Smad 通路，可以與受體型 Smad 拮抗信號傳導[12]。本研究通過共培養細粒棘球絳蟲原頭節和 BMSCs，檢測 BMSCsⅠ、Ⅲ 型膠原的表達和 TGF-β1/Smad 信號通路因子的表達，明確細粒棘球蚴作用下 BMSCs 成纖維化機制，為探討細粒棘球蚴病外囊壁的形成機制提供理論基礎，以期為包蟲病的治療提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康 4 周齡 C57BL/6 小鼠 40 只，雌雄不限，體質量 18～22 g，購于新疆醫科大學動物實驗中心。DMEM 培養基、FBS（GIBCO 公司，美國）；Trizol（Life-invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒 Prime ScriptTM RT Reagent Kit、實時定量熒光 PCR 試劑盒 SYBR Primix Ex Tap KitTM（Thermo 公司，美國）；Ⅰ 型膠原抗體（Cell Signalte Technology 公司，美國）；Ⅲ 型膠原抗體、TGF-β1 抗體、Smad7 抗體、磷酸化 Smad2/3 抗體（Abcam 公司，美國）；聚偏二氟乙烯膜（Millipore 公司，德國）；FITC 標記山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Ⅰ 型膠原 ELISA 試劑盒、Ⅲ 型膠原 ELISA 試劑盒（武漢尤爾生商貿有限公司）；MUCMD-90041 小鼠成骨試劑盒、MUCMX-90031 成脂試劑盒（賽業蘇州生物科技有限公司）；Immonilon Western 化學發光試劑（Millipore 公司，德國）。倒置顯微鏡（Leica 公司，德國）。
1.2 小鼠 BMSCs 分離培養
取 C57BL/6 小鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡 5 min；無菌條件下取出雙側股骨，剃凈軟組織，剪斷股骨兩端后，用 5 mL 注射器吸取含 10%FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的 DMEM 培養液沖洗骨髓腔。將沖洗后的骨髓及細胞懸液接種于直徑 6 cm 培養皿中，37℃、5%CO2 培養箱靜置培養；4 h 后換液，去除懸浮細胞，以后每隔 2～3 d 換液；按 1∶2 比例傳代后，取第 3 代細胞進行實驗[13]。按 MUCMD-90041 小鼠成骨試劑盒和 MUCMX-90031 成脂試劑盒說明書分別進行細胞成脂及成骨分化鑒定。
1.3 細粒棘球絳蟲原頭節提取及相關觀測
1.3.1 細粒棘球絳蟲原頭節提取
從感染細粒棘球蚴病的羊肝（來自昌吉屠宰場，現場取出后無菌封閉包裝，蒸餾水清洗 3 遍，75% 乙醇消毒羊肝表面）上，無菌注射器抽取無鈣化、無污染、完整的單囊型細粒棘球蚴包囊內容物，置于無菌離心管內，原頭節自然沉淀；再用含 100 U/mL 青霉素、100 U/L 鏈霉素的無菌 PBS 漂洗 10～15 次，除去包囊碎片使其自然沉淀，即獲得細粒棘球絳蟲原頭節。
1.3.2 形態觀察
取經過無菌 PBS 漂洗 3 次后的細粒棘球絳蟲原頭節，置于含 10%FBS 的 1640 培養基中培養，倒置顯微鏡下觀察細粒棘球絳蟲原頭節的形態和活性。
1.3.3 伊紅染色觀察
取經過無菌 PBS 漂洗 3 次后的細粒棘球絳蟲原頭節，吸取 10 μL 原頭節和 PBS 混合液置于載玻片上，滴加 10 μL 0.5% 伊紅染色 5 min。記錄活原頭節（拒染色）和死原頭節（紅染）的數量，計算細粒棘球絳蟲原頭節的活性，公式為：活原頭節數量/（活原頭節數量+死原頭節數量）×100%；取活性>90% 的原頭節用于實驗。
1.4 細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 纖維化觀測
1.4.1 實驗分組
實驗分為 2 組，實驗組取 1 000 個細粒棘球絳蟲原頭節和 1×106 個第 3 代 BMSCs，于 6 孔板中共培養；對照組單純取 1×106 個第 3 代 BMSCs 于 6 孔板培養。倒置顯微鏡下觀察實驗組共培養 7 d 后 BMSCs 形態學變化，觀察是否與單獨培養的小鼠成纖維細胞[14]形態相似。
1.4.2 實時熒光定量 PCR 檢測 BMSCs 中 Ⅰ、Ⅲ 型膠原和 TGF-β1 mRNA 表達水平
于培養 1、3、5、7 d，兩組均采用 Trizol 提取細胞的總 RNA，使用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA 后，使用實時定量熒光 PCR 試劑盒進行實時熒光定量 PCR 分析。反應條件：95℃、3 min 初始變性；95℃、15 s，60℃、30 s，40 個循環。以 β-actin 為內參照，采用 2?△△Ct法計算 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原和 TGF-β1 mRNA 相對表達量[15-16]。各基因引物序列及產物大小見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 各基因引物序列及產物大小
Table1.
Primer sequences and product size for real-time fluorescent quantitative PCR
1.4.3 Western blot 檢測 BMSCs 中 Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、TGF-β1、Smad7 和磷酸化 Smad2/3 蛋白表達水平
培養 1、3、5、7 d 取兩組細胞，于 1 mL 裂解液中加 10 μL PMSF 配制細胞裂解液；在培養板中加細胞裂解液，細胞刷刷取細胞后將細胞裂解液吸入 1.5 mL 無菌離心管，于 4℃、離心半徑 7 cm、12 000 r/min 離心 10 min；將上清分裝轉移至無菌離心管中。配平實驗組與對照組的樣本濃度。加入溴酚藍煮沸 10 min，保存備用。各取等量蛋白樣品行 SDS-PAGE 電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜。經封閉液封閉 2 h，分別加入小鼠 Ⅰ 型膠原抗體、Ⅲ 型膠原抗體、Smad7 抗體、磷酸化 Smad2/3 抗體、 TGF-β1 抗體一抗，4℃ 過夜；加入二抗，室溫孵育 2 h；增強化學發光試劑 ECL 顯色，膠片曝光，成像分析軟件對結果進行灰度掃描分析。以 β-actin 為內參照，以各目標蛋白條帶與內參照條帶比值作為目標蛋白的相對表達量。
1.4.4 ELISA 檢測培養上清中 Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白水平
培養 1、3、5、7 d 收集兩組細胞培養基上清，吸取上清至 1.5 mL 無菌離心管中，根據 ELISA 試劑盒操作步驟檢測 Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白含量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 小鼠 BMSCs 形態觀察及誘導鑒定
貼壁法培養的原代細胞 1 d 后可見少量細胞爬出，5 d 左右細胞達 80% 融合，將細胞消化傳代繼續培養。隨著傳代次數增加，細胞逐漸純化；第 3 代細胞以長梭形為主，呈成纖維樣、放射狀貼壁生長（圖 1a）。
圖1
小鼠 BMSCs 形態學觀察及誘導分化鑒定
a. 第 3 代細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100）；b. 成骨誘導 28 d 茜素紅染色觀察（×100）；c. 成脂誘導 15 d 油紅 O 染色觀察（×200）
Figure1. Morphological observation and differentiation identification of BMSCs of micea. Morphological observation of the 3rd generation cells (Inverted microscope×100); b. Alizarin red staining observation at 28 days after osteogenesis induction (×100); c. Oil red O staining observation at 15 days after lipogenesis induction (×200)
小鼠 BMSCs 在成骨誘導液中逐漸變成多邊形，可見細胞部分聚集生長；28 d 行茜素紅染色可在細胞密集區見紅色鈣結節（圖 1b）。小鼠 BMSCs 在成脂細胞誘導液中逐漸變成短梭形；15 d 行油紅 O 染色示細胞質中充滿紅色脂滴（圖 1c）。
2.2 細粒棘球絳蟲原頭節相關觀測
2.2.1 形態觀察
倒置顯微鏡觀察細粒棘球絳蟲原頭節的形態完整，無失活變黑，原頭節均蠕動活躍。見圖 2a。
圖2
細粒棘球絳蟲原頭節觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 形態觀察；b. 伊紅染色觀察
Figure2. Observation on protoscolex of Echinococcus granulosus (Inverted microscope×100)a. Morphological observation; b. Eosin staining observation
2.2.2 伊紅染色觀察
伊紅染色 5 min 后，細粒棘球絳蟲原頭節的活性為 95%±2%。見圖 2b。
2.3 細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 纖維化觀測
2.3.1 細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養形態觀察
實驗組細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養 7 d 觀察到 BMSCs 形態發生改變，變成梭形和不規則三角形，更接近單獨培養的成纖維細胞。見圖 3。
圖3
共培養實驗細胞形態觀察（倒置顯微鏡×100）
a. 細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs 共培養 7 d 形態觀察；b. 小鼠成纖維細胞
Figure3. Cell morphological observation of co-cultured experiment (Inverted microscope×100)a. Morphological observation on protoscolex of echinococcus granulosus and BMSCs after co-cultured for 7 days; b. Fibroblasts of mouse
2.3.2 實時熒光定量 PCR 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組 TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原 mRNA 相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
實時熒光定量 PCR 檢測各時間點兩組各基因相對表達量
a. TGF-β1；b. Ⅰ 型膠原；c. Ⅲ 型膠原
Figure4. The relative mRNA expression in two groups at each time point detected by real-time fluorescent quantitative PCRa. TGF-β1; b. Collagen type Ⅰ; c. Collagen type Ⅲ
2.3.3 Western blot 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組 TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原、磷酸化 Smad2/3 蛋白相對表達量均顯著高于對照組，Smad7 蛋白相對表達量顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5、6。
圖5
Western blot 檢測各時間點兩組各蛋白表達電泳圖
1：對照組 2：實驗組 a. 1 d；b. 3 d；c. 5 d；d. 7 d
Figure5. Electrophoregram of the protein expression of the two groups at each time point detected by Western blot1: Experimental group 2: Control group a. One day; b. Three days; c. Five days; d. Seven days
圖6
Western blot 檢測各時間點兩組各蛋白相對表達量
a. TGF-β1；b. Ⅰ 型膠原；c. Ⅲ 型膠原；d. Smad7；e. 磷酸化 Smad2/3
Figure6. The relative protein expression in two groups at each time point detected by Western blota. TGF-β1; b. Collagen type Ⅰ; c. Collagen type Ⅲ; d. Smad7; e. Phosphorylation Smad2/3
2.3.4 ELISA 檢測
培養 1、3、5、7 d，實驗組上清中 Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原蛋白含量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 7。
圖7
ELISA 檢測各時間點兩組上清中 Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原蛋白含量
a. Ⅰ 型膠原；b. Ⅲ 型膠原
Figure7. The contents of collagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ in the supernatant of the two groups at each time point detected by ELISAa. Collagen type Ⅰ; b. Collagen type Ⅲ
3 討論
在肝細粒棘球蚴疾病病程中，外囊壁是宿主免疫防御反應的結果，外囊壁的形成可以局部限制細粒棘球蚴囊腫的病程進展，宿主和蟲體則達到一種長期相互適應的動態平衡[17]。細粒棘球蚴蟲體寄生于人體實質性臟器后，蟲體囊體不斷膨脹性生長，擠壓周圍臟器，引起組織炎性細胞浸潤、成纖維細胞增生、不斷纖維化，最終形成纖維性囊壁。本課題組既往研究發現，在小鼠肝細粒棘球蚴模型中，從肝細粒棘球蚴外囊壁分離培養出貼壁細胞。觀察發現該細胞具有類似于 MSCs 的生長特征，可在體外呈集落性生長形成克隆；成骨培養基誘導培養后，該細胞可形成鈣結節[18]。提示 MSCs 可能在細粒棘球蚴病纖維囊壁形成中起到重要作用。
TGF-β 是細胞和組織纖維化的經典信號通路[19]，其過表達可引起細胞外基質沉積（包括膠原的合成）[20]。膠原的合成在 MSCs 向成纖維細胞分化中起到重要作用，有實驗通過外源性 MSCs 促進膠原合成向纖維化分化，促進人體皮膚再生[21]。本課題組既往研究發現，肝細粒棘球蚴病患者外囊壁上 TGF-β 受體 Ⅰ 和 Ⅱ 表達量較高[22]；從肝細粒棘球蚴外囊壁可分離培養出具有 MSCs 生長特性的細胞[18]。在此基礎上，本實驗共培養 BMSCs 與細粒棘球絳蟲原頭節，通過基因及蛋白水平檢測共培養后 BMSCs 向成纖維化細胞分化的能力，驗證 BMSCs 是否參與肝細粒棘球蚴外囊壁的形成。結果顯示，實驗組 BMSCs 的 Smad7 表達減少，磷酸化 Smad2/3 表達增加，可能與 TGF-β1 表達增多密切相關，與 BMSCs 參與細粒棘球蚴病外囊壁的形成有密切關系。TGF-β/Smad 信號通路因子中，受體相關的 Smad 主要包括磷酸化 Smad2/3，可促進 TGF-β/Smad 信號通路受體結合；Smad7 可以與受體型 Smad 拮抗信號傳導，抑制 TGF-β/Smad 信號通路[12]。本課題組既往實驗發現，TGF-β1 在小鼠細粒棘球蚴感染早期表達增加，可能有利于細粒棘球蚴的免疫逃逸[23]。感染小鼠給予 TGF-β1 受體阻斷劑后，下游分子磷酸化 Smad2/3 蛋白表達下降，可能提高 T 淋巴細胞免疫，從而抵制細粒棘球蚴的感染[24]。近期研究發現，Smad3 抑制劑 SIS3 能抑制原頭蚴活性。因此，TGF-β/Samd 信號通路相關抑制劑可能是一類新穎的有效抗棘球絳蟲的藥物[25]。下一步可繼續深入研究 TGF-β/Smad 信號相關抑制劑對 MSCs 參與細粒棘球蚴病外囊壁形成可能起到的作用。
本研究體外共培養細粒棘球絳蟲原頭節與 BMSCs，發現共培養 7 d 后的 BMSCs 呈梭形或不規則三角形，和單獨培養的成纖維細胞形態相似。實驗組 BMSCs 的 Smad7 蛋白表達減少，磷酸化 Smad2/3 蛋白表達增加；TGF-β1、Ⅰ 型膠原、Ⅲ 型膠原的蛋白及 mRNA 表達均高于單獨培養的 BMSCs。上述結果可能與細粒棘球蚴外囊壁的纖維化密切相關。
綜上述，細粒棘球絳蟲原頭節誘導 BMSCs 通過 TGF-β/Smad 信號通路分泌 TGF-β1、Ⅰ 型膠原和 Ⅲ 型膠原，促進向成纖維細胞分化，可能與細粒棘球蚴外囊壁的纖維化密切相關。本研究為細粒棘球蚴病外囊壁的纖維化提供了理論依據，為包蟲病治療提供了新思路。下一步本課題組將開展小鼠體內實驗，通過病理學切片及免疫熒光染色，觀察小鼠肝臟感染細粒棘球蚴病后病灶周圍的成纖維進展。
作者貢獻：武杰直接參與實驗設計及實施，數據收集整理及統計分析，撰寫論文；桂顯偉、梁學奇、王二強、徐小丹參與實驗實施、數據收集整理；姜慧嬌參與實驗設計及統計分析，對文章的知識性內容作批評性審閱；陳雪玲參與實驗設計；吳向未負責實驗設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：本研究動物實驗獲石河子大學醫學院第一附屬醫院倫理審查委員會批準（A2017-008-01）。實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003。
